CN116888153A - 与γ-δT细胞受体结合的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够与人Vγ9Vδ2T细胞受体结合的抗体。本发明进一步涉及包括本发明的抗体的药物组合物以及本发明的抗体用于医学治疗的用途。

Description

与γ-δT细胞受体结合的抗体
技术领域
本发明涉及能够与人Vγ9Vδ2T细胞受体的Vδ2链结合的新型抗体。本发明进一步涉及包括本发明的抗体的药物组合物以及本发明的抗体用于医学治疗的用途。
背景技术
γ-δT细胞是表达由γ链和δ链构成的T细胞受体(TCR)的T细胞。大多数γδT细胞表达包括Vγ9和Vδ2区的TCR。Vγ9Vδ2T细胞可以对多种病原体和肿瘤细胞作出反应。这种广泛的反应性被认为是由能够以TCR依赖性方式特异性地激活此T细胞亚群的磷酸化抗原(phosphoantigen)赋予的。Vγ9Vδ2T细胞的广泛抗微生物和抗肿瘤反应性表明其直接参与了癌症和感染的免疫控制。
激活Vγ9Vδ2T细胞的药剂可以用于治疗感染或癌症，因为这些药剂可以促进Vγ9Vδ2T细胞对病原体或感染细胞或癌症细胞的反应性。WO2015156673描述了与Vγ9Vδ2TCR结合并且能够激活Vγ9Vδ2T细胞的抗体。WO2020060405描述了双特异性抗体，其与Vγ9Vδ2T细胞和肿瘤细胞靶标两者结合，并且因此具有将Vγ9Vδ2T细胞募集到肿瘤并因此刺激治疗效果的潜力。
在宿主细胞中重组产生抗体通常会产生异质性产物，包括具有不同类型和程度的多肽链的翻译后修饰的不同形式的抗体。这种异质性对于用于医疗用途的抗体产品是不期望的，因为翻译后修饰可能改变抗体的功能性质，例如在对靶向抗原的亲和力方面、在药代动力学性质、产品稳定性、聚集性等方面。
本发明提供了改进的Vγ9Vδ2TCR结合抗体序列，其在宿主细胞中产生时产生更均质的产物，但在靶结合和对靶细胞的功能作用方面保持良好的功能性质，以及良好的结构特性，如稳定性。
发明内容
发明人惊讶地发现，WO2015156673中描述的抗体5C8在抗体中的某个位点处经历硫酸化，而所述位点预计不会经受此翻译后修饰。硫酸化部分发生在各种宿主细胞中，从而得到异质性抗体产物。
令人惊讶的是，经受硫酸化的酪氨酸残基可以突变为苯丙氨酸或丝氨酸，而不影响抗体的抗原结合性质，即使氨基酸位于CDR3区中也是如此，已知CDR3区是抗体的抗原结合区中的抗原结合特异性的主要决定因素。
通过突变去除硫酸化位点得到更均质的抗体产物。
因此，在第一方面，本发明提供了一种抗体，其包括能够与人Vδ2结合的第一抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包括SEQ ID NO:1中所示的CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示的CDR2序列和SEQ ID NO:3中所示的CDR3序列。
在一另外的方面，本发明提供了双特异性抗体，所述双特异性抗体包括能够与本文所定义的人Vδ2结合的第一结合区和能够与第二抗原结合的第二抗原结合区，其中第二抗原优选地为人EGFR。在另外的方面，本发明涉及包括本发明的抗体的药物组合物、本发明的抗体在医学治疗中的用途，以及核酸构建体、用于产生本发明的抗体的表达载体和包括此类核酸构建体或表达载体的宿主细胞。此外，本发明涉及用于产生本发明的抗体的方法，所述方法避免了硫酸化并产生更均质的产物。
下文描述了本发明的进一步方面和实施例。
附图说明
图1：使用Superdex-75柱的蛋白-A纯化的LAVA化合物(示出了VHH 5C8)的尺寸排除曲线的代表性色谱图。显性单体峰的级分(级分1E11-1G2)合并并定量。
图2：纯化的VHH 5C8的实验室芯片(labchip)聚丙烯酰胺凝胶电泳的代表性实例。左：非还原条件；右：还原条件。
图3：纯化的VHH 5C8(A)和VHH 5C8var1(B)的HP-SEC曲线。
图4：纯化的双特异性VHH(bsVHH)1D12var5-5C8var1的代表性HP-SEC曲线。A：bsVHH 1D12var5-5C8var1批次，其通过蛋白-A亲和色谱法从毕赤酵母(Pichia pastoris)的上清液中表达和纯化。B：bsVHH1D12var5-5C8var1批次，其通过蛋白-A和尺寸排阻色谱法从HEK-293E细胞中表达和纯化。
图5：在非还原条件下纯化的VHH 5C8var1-Y105F和5C8var1-Y105S的实验室芯片分析。
图6：VHH 5C8var1-Y105F(A)和5C8var1-Y105S(B)的HP-SEC分析。
图7：使用BLI测量VHH片段与重组Vγ9Vδ2-TCR蛋白结合的亲和力。蛋白质质量(应答，以nm为单位)被绘制为时间的函数。竖直虚线将缔合期(左)与解离期(右)分开。A：VHH5C8var1；B：VHH 5C8var1-Y105F；C：VHH 5C8var1-Y105S。黑色直线表示相对于测得的实际应答的拟合数据。
图8：bsVHH 7D12var8-5C8var1-Y105F和bsVHH 7D12-5C8两者诱导有效的Vγ9Vδ2T细胞激活，并且引起Vγ9Vδ2T细胞介导的肿瘤细胞裂解。A：4小时脱粒测定：CD107A(LAMP-1)+Vγ9Vδ2T细胞的百分比被绘制为所使用的抗体浓度的函数。左：7D12-5C8(非人源化)；右：7D12var8-5C8var1-Y105F。B：24小时细胞毒性测定示出A431肿瘤细胞杀伤的百分比随所使用的抗体浓度而变化。左：7D12-5C8(非人源化)；右：7D12var8-5C8var1-Y105F。
图9：使用流式细胞术将7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc与从健康人PBMC分离的原代γδT细胞结合。两个小图表示两个不同供体。
图10：通过基于细胞的ELISA将7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc与肿瘤细胞上的EGFR结合。
图11：依赖于A431细胞系的7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc诱导的γδT细胞的脱粒。
图12：A-388细胞与γδT细胞和7D12-5C8共培养的活力。
图13：用健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞(1:1E:T比)和7D12-5C8(50nM)或培养基对照培养解离肿瘤细胞悬浮液(原发性CRC：n＝10，腹膜CRC转移瘤：n＝5，肝脏CRC转移瘤：n＝3，原发性HNSCC：n＝5，以及原发性NSCLC：n＝4)4小时后的裂解肿瘤细胞。
图14：用健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞(1:1E:T比)和7D12-5C8var1(Y105S)-Fc(50nM)、gp120-5C8var1(Y105S)-Fc(50nM)或培养基对照培养解离的肿瘤细胞悬浮液(腹膜CRC转移瘤：n＝4)24小时后的裂解肿瘤细胞。
图15：用于非人灵长类动物研究的构建体的结构。
图16：7A5-7D12var8-Fc与抗原靶标的结合。
图17：7A5-7D12var8-Fc介导的脱粒和细胞毒性。
图18：三种经处理的动物的血液中的7A5-7D12var8-Fc浓度的PK分析。示出浓度-时间曲线，其证明分子具有IgG样PK。
图19：经处理的动物的血液中的T细胞总数(CD3+，左图)和Vγ9阳性细胞数(占CD3+群体的百分比)。箭头指示化合物的注射。图例中的数字是经处理的猴的数量。
图20：经过一段时间处理的动物的血液中IL-6细胞因子的水平。仅观察到低水平的细胞因子，并且释放在很大程度上限于在第一次注射之后。箭头指示处理时刻。
具体实施方式
定义
术语“人Vδ2”当在本文中使用时是指Vγ9Vδ2-T细胞受体(TCR)的重排δ2链。UniProtKB-A0JD36(A0JD36_人)给出了可变TRDV2序列的实例。Vδ2是Vγ9Vδ2-TCR的δ链的一部分。能够与人Vδ2结合的抗体可以与完全位于可变区内的表位结合或者与位于恒定区内的表位结合或者与作为δ链的可变区和恒定区的残基的组合的表位结合。
术语“人Vγ9”当在本文中使用时是指Vγ9Vδ2-T细胞受体(TCR)的重排y9链。UniProtKB-Q99603_人给出了可变TRGV9序列的实例。
术语“EGFR”当在本文中使用时是指人EGFR蛋白(UniProtKB-P00533(EGFR_人))。
术语“抗体”是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其中任一者的衍生物，所述抗体具有在典型的生理条件下与抗原特异性结合的能力，其中半衰期为相当长的时间段，如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约一小时、至少约两小时、至少约四小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更长、约48小时或更长、约3天、4天、5天、6天、7天或更多天，等等，或者其它相关功能定义的时间段(如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗体与抗原结合相关的生理应答的时间和/或足以使抗体募集效应活性的时间)。与抗原相互作用的抗原结合区(或抗原结合结构域)可以包括免疫球蛋白分子的重链和轻链两者的可变区，或者可以是单结构域抗原结合区，例如仅重链可变区。抗体的恒定区(如果存在的话)可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的各种细胞(如效应细胞和T细胞)和补体系统的组分，如经典补体激活途径中的第一组分C1q。
免疫球蛋白的Fc区被定义为通常在用木瓜蛋白酶消化抗体后产生的抗体片段，其包含免疫球蛋白的两个CH2-CH3区和连接区，例如铰链区。抗体重链的恒定结构域限定抗体同种型，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。Fc区使用被称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的蛋白质介导抗体的效应子功能。
如本文所使用术语“铰链区”是指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如，人IgG1抗体的铰链区与根据EU编号的氨基酸216-230相对应。
如本文所使用术语“CH2区”或“CH2结构域”是指免疫球蛋白重链的CH2区。因此，例如，人IgG1抗体的CH2区与根据EU编号的氨基酸231-340相对应。然而，CH2区也可以是如本文所描述的其它亚型中的任一者。
如本文所使用术语“CH3区”或“CH3结构域”是指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如，人IgG1抗体的CH3区与根据EU编号的氨基酸341-447相对应。然而，CH3区也可以是如本文所描述的其它亚型中的任一者。
本发明中的Fc区/Fc结构域中的氨基酸位置的参考是根据EU编号(Edelman等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A.)》1969年5月；63(1):78-85；Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of proteins of immunologicalinterest)》.第5版-1991NIH出版号91-3242)。
如上文所指示的，除非另有说明或与上下文明确矛盾，否则如本文中使用的术语抗体包含保留与抗原特异性结合的能力的抗体的片段。已经证明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。术语“抗体”内涵盖的结合片段的实例包含：(i)Fab'或Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或如WO2007059782中所描述的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，即包括通过位于铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；以及(iv)基本上由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是这两个结构域可以使用重组方法通过使这两个结构域能够成为单个蛋白链的合成接头来连接，在所述单个蛋白链中，VL区和VH区配对以形成单价分子(被称为单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如，Bird等人,《科学(Science)》242,423-426(1988)和Huston等人,《美国国家科学院院刊》85,5879-5883(1988))。除非上下文另有指示，否则这些单链抗体涵盖在术语抗体内。尽管此类片段通常包含在抗体的含义内，但其共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物学性质和效用。除非另有指示，否则术语抗体还包含多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体和人源化抗体，以及通过任何已知技术，如酶切割、肽合成和重组技术提供的抗体片段。
在本发明的抗体的一些实施例中，第一抗原结合区或第二抗原结合区或两者都为单结构域抗体。单结构域抗体是本领域技术人员熟知的，参见例如，Hamers-Casterman等人(1993)《自然(Nature)》363:446，Roovers等人(2007)《分子治疗学新见(Curr Opin MolTher)》9:327和Krah等人(2016)《免疫药理学与免疫毒理学(ImmunopharmacolImmunotoxicol)》38:21。单结构域抗体包括单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3。单结构域抗体的实例是仅重链抗体的可变片段、天然不包括轻链的抗体、来源于常规抗体的单结构域抗体和工程化抗体。单结构域抗体可以来源于任何物种，包含小鼠、人类、骆驼、美洲驼、鲨鱼、山羊、兔和牛。例如，单结构域抗体可以来源于骆驼科物种，例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和原驼中产生的抗体。与整个抗体一样，单结构域抗体能够选择性地与特定抗原结合。单结构域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，即CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。此类抗体也被称为纳米抗体或VHH。
如本文所使用的术语“免疫球蛋白”旨在指代一类结构相关的糖蛋白，其由两对多肽链、一对轻(L)链和一对重(H)链组成，通过二硫键使全部四对潜在地相互连接。如本文所使用的术语“免疫球蛋白重链”、“免疫球蛋白的重链”或“重链”旨在指代免疫球蛋白的链之一。重链通常包含限定免疫球蛋白的同种型的重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区(本文中缩写为CH)。重链恒定区通常包含三个结构域CH1、CH2和CH3。重链恒定区进一步包括铰链区。在免疫球蛋白(例如IgG)的结构中，两条重链通过铰链区中的二硫键相互连接。与重链相同，每个轻链通常包含若干个区；轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。此外，VH和VL区可以被细分为高变区(或在序列上可以是高变的和/或形成结构上限定的环的高变区)，也被称为互补决定区(CDR)，所述高变区散布有更保守的区，被称为框架区(FR)。每个VH和VL通过由按以下顺序从氨基端到羧基端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR序列可以通过使用各种方法来测定，例如，Chothia和Lesk(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901或Kabat等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列》,第五版.NIH出版提供的方法。用于CDR测定和氨基酸编号的各种方法可以在www.abysis.org(UCL)上进行比较。
如本文所使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白(亚)类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)或其任何同种异型，如IgG1m(za)和IgG1m(f)。每个重链同种型都可以与κ(kappa)或λ(lambda)轻链组合。本发明的抗体可以具有任何同种型。
术语“亲本抗体”应理解为与根据本发明的抗体相同的抗体，但其中所述亲本抗体不具有特定突变中的一种或多种。本发明的“变体”、“抗体变体”或“亲本抗体的变体”是与“亲本抗体”相比包括一个或多个突变的抗体分子。氨基酸取代可以将天然氨基酸交换为另一种天然存在的氨基酸，或者交换为非天然存在的氨基酸衍生物。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在本发明的上下文中，保守取代可以通过以下三个表中的一个或多个表中所反映的氨基酸类内的取代来定义：
保守取代的氨基酸残基类别
替代性保守氨基酸残基取代类别
1 A S T
2 D E
3 N Q
4 R K
5 I L M
6 F Y W
氨基酸残基的替代性物理和功能分类
在本发明的上下文中，变体中的取代指示为：
原始氨基酸-位置-经取代的氨基酸；
使用三个字母代码或一个字母代码，包含用于指示氨基酸残基的代码Xaa和X。因此，符号“T366W”意指变体包括在变体氨基酸位置用色氨酸取代苏氨酸，所述变体氨基酸位置与亲本抗体中位置366的氨基酸相对应。
此外，术语“取代”包括对其它十九种天然氨基酸中的任一种的取代，或对其它氨基酸，如非天然氨基酸的取代。例如，位置366中的氨基酸T的取代包含以下取代中的每一个：366A、366C、366D、366G、366H、366F、366I、366K、366L、366M、366N、366P、366Q、366R、366S、366E、366V、366W和366Y。
术语“全长抗体”当在本文中使用时是指含有所有重链和轻链恒定和可变结构域的抗体，这些结构域与通常在此同种型的野生型抗体中发现的那些结构域相对应。
术语“嵌合抗体”是指其中可变区来源于非人类物种(例如来源于啮齿动物)并且恒定区来源于不同物种(如人类)的抗体。嵌合抗体可以通过基因工程化生成。开发用于治疗应用的嵌合单克隆抗体是为了降低抗体免疫原性。
术语“人源化抗体”是指基因工程化的非人抗体，其含有人抗体恒定结构域和经修饰的非人可变结构域，以含有与人可变结构域的高度序列同源性。这可以通过将共同形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人受体框架区(FR)上来实现。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将亲本抗体(即非人抗体)的框架残基取代到人框架区(反向突变)中。结构同源性建模可以有助于鉴定对抗体的结合性质重要的框架区中的氨基酸残基。因此，人源化抗体可以包括非人CDR序列，主要是任选地包括非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸反突变的人框架区，以及任选地全人恒定区。任选地，可以引入不一定是反突变的另外的氨基酸修饰，以获得具有优选特性(如亲和力和生物化学性质)的人源化抗体。进行非人治疗性抗体的人源化是为了使其在人类中的免疫原性最小化，同时这种人源化抗体保持非人类来源抗体的特异性和结合亲和力。
术语“多特异性抗体”是指对至少两个不同的表位，如至少三个通常不重叠的表位具有特异性的抗体。此类表位可以在相同或不同的靶抗原上。如果表位在不同的靶标上，则此类靶标可以在相同的细胞或不同的细胞或细胞类型上。在一些实施例中，多特异性抗体可以包括一种或多种单结构域抗体。
术语“双特异性抗体”是指对两个不同的通常不重叠的表位具有特异性的抗体。此类表位可以在相同或不同的靶标上。如果表位在不同的靶标上，则此类靶标可以在相同的细胞或不同的细胞或细胞类型上。在一些实施例中，双特异性抗体可以包括一种或两种单结构域抗体。
不同类别的多特异性抗体，如双特异性抗体的实例包含但不限于：(i)具有互补CH3结构域以迫使进行异源二聚化的IgG样分子；(ii)重组IgG样双重靶向分子，其中所述分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的一部分；(iii)IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的一部分融合；(iv)Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起，与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；以及(vi)基于ScFv和基于双抗体的和重链抗体(例如，结构域抗体，)，其中不同的单链Fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如，结构域抗体，/>)彼此融合，或者与和重链恒定结构域、Fc区或其部分融合的另一种蛋白质或载体分子融合。
具有互补CH3结构域分子的IgG样分子的实例包含但不限于(TrionPharma公司(Trion Pharma)/费森尤斯生物技术公司(Fresenius Biotech))、杵臼(Knobs-into-Holes)(基因泰克公司(Genentech))、CrossMAb(罗氏公司(Roche))和静电匹配(electrostatically-matched)(安进公司(Amgen)、中外制药(Chugai)、安可医疗(Oncomed))、LUZ-Y(基因泰克公司，Wranik等人《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》2012,287(52):43331-9,doi:10.1074/jbc.M112.397869.电子版2012年11月1日)、DIG体(DIG-body)和PIG体(PIG-body)(Pharmabcine公司(Pharmabcine)，WO2010134666、WO2014081202)、链交换工程化结构域体(SEEDbody)(默克雪兰诺公司(EMD Serono))、双克隆(Biclonics)(梅鲁斯公司(Merus)，WO2013157953)、FcΔAdp(再生元公司(Regeneron))、双特异性IgG1和IgG2(辉瑞公司(Pfizer)/Rinat公司(Rinat))、Azymetric支架(Zymeworks公司(Zymeworks)/默克公司(Merck))、mAb-Fv(Xencor公司(Xencor))、二价双特异性抗体(罗氏公司，WO2009080254)和/>分子(Genmab公司(Genmab))。
重组IgG样双重靶向分子的实例包含但不限于双重靶向(DT)-Ig(葛兰素史克(GSK)/Domantis公司(Domantis)，WO2009058383)、二合一抗体(基因泰克公司，Bostrom等人2009.《科学(Science)》323,1610–1614)、交联Mab(卡马诺斯癌症中心(Karmanos CancerCenter))、mAb2(F-Star公司(F-Star))、ZybodiesTM(Zyngenia公司(Zyngenia)，LaFleur等人《单克隆抗体(MAbs)》2013年3月-4月；5(2):208-18)、普通轻链方法、κλ体(κλBodies)(NovImmune公司(NovImmune)，WO2012023053)和(CovX公司(CovX)/辉瑞公司，Doppalapudi,V.R.等人2007.《生物有机与药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)》17,501-506)。
IgG融合分子的实例包含但不限于双可变结构域(DVD)(雅培公司(Abbott))、双结构域双头抗体(联合利华公司(Unilever)；赛诺菲公司(Sanofi Aventis))、IgG样双特异性(英克隆公司(ImClone)/礼来公司(Eli Lilly)，Lewis等人《自然生物技术(NatBiotechnol.)》2014年2月；32(2):191-8)、Ts2Ab(医学免疫公司(MedImmune)/AZ，Dimasi等人《分子生物学杂志(J Mol Biol.)》2009年10月30日；393(3):672-92)和BsAb(Zymogenetics公司(Zymogenetics)，WO2010111625)、HERCULES(百健艾迪公司(BiogenIdec))、scFv融合(诺华公司(Novartis))、scFv融合(常州亚当生物技术有限公司(Changzhou Adam Biotech Inc))和TvAb(罗氏公司)。
Fc融合分子的实例包含但不限于ScFv/Fc融合(学术机构，Pearce等人《国际生物化学与分子生物学(Biochem Mol Biol Int.)》1997年9月；42(6):1179)、SCORPION(Emergent BioSolutions公司(Emergent BioSolutions)/Trubion公司(Trubion)，Blankenship JW等人2009年AACR第100届年会(文摘#5465)；Zymogenetics公司/BMS，WO2010111625)、双重亲和重定位技术(Fc-DARTTM)(MacroGenics公司(MacroGenics))和双重(ScFv)2-Fab(抗体医学国家研究中心-中国)。
Fab融合双特异性抗体的实例包含但不限于F(ab)2(Medarex公司(Medarex)/安进公司(AMGEN))、双重作用或双Fab(基因泰克公司)、(DNL)(ImmunoMedics公司(ImmunoMedics))、二价双特异性(Biotecnol公司(Biotecnol))和Fab-Fv(UCB-希尔泰克公司(UCB-Celltech))。
基于ScFv-、基于双抗体和结构域抗体的实例包含但不限于双特异性T细胞衔接子(钠钙偏磷酸盐聚合物(Micromet))、串联双抗体(Tandab)(Affimed公司(Affimed))、双重亲和力重靶向技术(DARTTM)(MacroGenics公司)、单链双抗体(Academic公司(Academic)，Lawrence《FEBS快报(FEBS Lett.)》1998年4月3日；425(3):479-84)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics公司(ReceptorLogics))、人血清白蛋白-ScFv融合(Merrimack公司(Merrimack)，WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech公司(Epigen Biotech)，Zhu等人《免疫学与细胞生物学(Immunol Cell Biol.)》2010年8月；88(6):667-75)、双重靶向/>(Ablynx公司(Ablynx)，Hmila等人,《FASEB杂志(FASEB J.)》2010)、双靶向仅重链结构域抗体。
在抗体与抗原结合的上下文中，术语“结合”或“特异性结合”是指抗体与预定抗原或靶标(例如，人Vδ2或人EGFR)的结合，其结合通常具有与约10-6M或更少，例如10-7M或更少，如约10-8M或更少，如约10-9M或更少、约10-10M或更少、或约10-11M或甚至更少的KD相对应的表观亲和力，例如当使用如本文的实例中所描述的流式细胞术测定时。可替代地，KD值可以使用例如BIAcore T200中的表面等离子体共振(SPR)技术或使用抗原作为配体和结合部分或结合分子作为分析物的Octet RED96仪器中的生物层干涉技术(BLI)来测定。特异性结合意指抗体以与KD相对应的亲和力与预定抗原结合，所述亲和力是其与预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力的至多十分之一，如至多1/100，例如至多1/1,000，如至多1/10,000，例如至多1/100,000。亲和力较低的程度取决于结合部分或结合分子的KD，使得当结合部分或结合分子的KD非常低(即，结合部分或结合分子是高度特异性的)时，对抗原的亲和力可以是对非特异性抗原的亲和力的程度的至多1/10,000。如本文所使用的，术语“KD”(M)是指抗原与结合部分或结合分子之间的特定相互作用的解离平衡常数。
在本发明的上下文中，“竞争(competition)”或“能够竞争”或者“竞争(competes)”是指在存在与结合伴侣结合的另一个分子(例如，不同的EGFR抗体)的情况下，特定结合分子(例如，EGFR抗体)与特定结合伴侣(例如，EGFR)结合的倾向的任何可检测的显著降低。通常，竞争意指由另一个分子(如，抗体)的存在引起的结合减少至少约25％，如至少约50％，例如至少约75％，如至少减少90％，如通过例如ELISA分析或流式细胞术使用足量的两种或更多种竞争分子(例如，抗体)测定的。通过竞争性抑制测定结合特异性的其它方法可以在例如Harlow等人,《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港(Cold SpringHarbor),纽约,1988，Colligan等人编辑,《免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)》,格林出版社(Greene Publishing Assoc)和威利-国际科学出版社(WileyInterScience),纽约,(1992,1993)以及Muller,《酶学方法(Meth.Enzymol.)》92,589-601(1983)中找到。
在一个实施例中，本发明的抗体与EGFR上与抗体7D12相同的表位和/或与Vδ2上与抗体5C8相同的表位结合。本领域已知有若干种方法可用于绘制靶抗原上的抗体表位，包含但不限于：交联偶联质谱法，允许鉴定作为表位的一部分的肽，以及X射线晶体学，鉴定抗原上形成表位的单个残基。表位残基可以被确定为来自抗体的至少一个原子小于或等于的所有氨基酸残基。选择/>作为表位截止距离，以允许范德瓦耳斯半径(van der Waalsradius)内的原子加上可能的水介导的氢键。接下来，表位残基可以被确定为至少一个原子小于或等于/>的所有氨基酸残基。选择小于或等于/>作为表位截止距离，以允许延伸的精氨酸氨基酸的长度。交联偶联质谱法通过用质量标记的化学交联剂与抗体和抗原结合开始。接下来，使用高质量MALDI检测来确认复合物的存在。因为在交联化学之后，Ab/Ag复合物是非常稳定的，许多各种的酶和消化条件可以应用于复合物以提供许多不同的重叠肽。使用高分辨率质谱法和MS/MS技术进行这些肽的鉴定。使用与交联试剂连接的质量标签来确定交联肽的鉴定。在MS/MS片段化和数据分析之后，交联并衍生自抗原的肽是表位的一部分，而衍生自抗体的肽是互补位的一部分。来自找到的单个交联肽的大多数N端与C端交联残基之间的所有残基被认为是表位或互补位的一部分。抗体7D12的表位已通过X射线晶体学测定，在Schmitz等人(2013)《结构(Structure)》21:1214中描述，并且由结构域III上的平坦表面(残基R353、D355、F357、Q384、N420)组成，其与结构域III配体结合位点相对应。
术语“第一”和“第二”抗原结合区当在本文中使用时不是指其在抗体中的朝向/位置，即其对N端或C端没有意义。术语“第一”和“第二”仅用于正确和一致地指代权利要求书和说明书中的两个不同抗原结合区。
“序列同一性％”当在本文中使用时是指不同序列共享的相同核苷酸或氨基酸位置的数量(即，同一性％＝相同位置的#/位置的总#x 100)，考虑了需要针对最佳比对而引入的空位的数量和每个空位的长度。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比可以例如使用E.Meyers和W.Miller,《计算机在生物科学中的应用(Comput.Appl.Biosci)》4,11-17(1988)的算法(其已合并到ALIGN程序(第2.0版)中)，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12以及空位罚分4来确定。
本发明的进一步方面和实施例
如上文所描述的，在第一方面，本发明涉及一种抗体，其包括能够与人Vδ2结合的第一抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包括SEQ ID NO:1中所示的CDR1序列、SEQ IDNO:2中所示的CDR2序列和SEQ ID NO:3中所示的CDR3序列。
在一个实施例中，SEQ ID NO:1中的X1为S(Ser)。在另一个实施例中，SEQ ID NO:1中的X1为G(Gly)。
在一个实施例中，SEQ ID NO:3中的X2为F(Phe)。在另一个实施例中，SEQ ID NO:3中的X2为S(Ser)。
在一个实施例中，SEQ ID NO:1中的X1为S(Ser)，并且SEQ ID NO:3中的X2为F(Phe)。
在一个实施例中，SEQ ID NO:1中的X1为S(Ser)，并且SEQ ID NO:3中的X2为S(Ser)。
在一个实施例中，SEQ ID NO:1中的X1为G(Gly)，并且SEQ ID NO:3中的X2为F(Phe)。
在一个实施例中，SEQ ID NO:1中的X1为G(Gly)，并且SEQ ID NO:3中的X2为S(Ser)。
在优选实施例中，抗体能够激活人Vγ9Vδ2T细胞。Vγ9Vδ2T细胞的激活可以通过测量基因表达和/或(表面)标志物表达(例如，激活标志物，如CD25、CD69或CD107a)和/或分泌蛋白(例如，细胞因子或趋化因子)谱的变化来测量。在一优选实施例中，抗体能够诱导激活(例如CD69和/或CD25表达的上调)，引起以由Vγ9Vδ2T细胞增加CD107a表达和/或细胞因子产生(例如TNF、IFNγ)为标志的脱粒。
在一另外的优选实施例中，当如本文实例9所描述的例如以1nM、优选地100pM、优选地10pM、优选1pM、甚至更优选地100fM的浓度进行测试时，抗体能够将对CD107a呈阳性的细胞的数量增加至少2倍，如至少5倍。在另一个优选实施例中，当使用如本文实例9所描述的Vγ9Vδ2T细胞和A431靶细胞进行测试时，本发明的抗体的增加CD107a阳性细胞的百分比的EC50值为100pM或更小，如50pM或更小，例如25pM或更小，如20pM或更小，例如15pM或更小。
在一个实施例中，第一抗原结合区为单结构域抗体。因此，在一个实施例中，本发明的抗体包括能够与Vδ2结合的单结构域抗体，其中所述第一抗原结合区包括SEQ ID NO:1中所示的CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示的CDR2序列和SEQ ID NO:3中所示的CDR3序列。
在另一个实施例中，第一抗原结合区是人源化的，其中优选地抗原结合区包括以下或由以下组成：
●SEQ ID NO:4中所示的序列，或者
●与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少90％，如至少92％，例如至少94％，如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。
在一个实施例中，SEQ ID NO:4中的X1为S(Ser)。在另一个实施例中，SEQ ID NO:4中的X1为G(Gly)。在一个实施例中，SEQ ID NO:4中的X2为F(Phe)。在另一个实施例中，SEQID NO:4中的X2为S(Ser)。在一个实施例中，SEQ ID NO:4中的X1为S(Ser)，并且SEQ ID NO:4中的X2为F(Phe)。在一个实施例中，SEQ ID NO:4中的X1为S(Ser)，并且SEQ ID NO:4中的X2为S(Ser)。在一个实施例中，SEQ ID NO:4中的X1为G(Gly)，并且SEQ ID NO:4中的X2为F(Phe)。在一个实施例中，SEQ ID NO:4中的X1为G(Gly)，并且SEQ ID NO:4中的X2为S(Ser)。
在一些实施例中，本发明的抗体是多特异性抗体，如双特异性抗体。因此，在一个实施例中，抗体进一步包括第二抗原结合区。在一个实施例中，第二抗原结合区为单结构域抗体。
在一另外的实施例中，抗体为双特异性抗体，其中第一抗原-抗原结合区和第二抗原结合区两者为单结构域抗体。在一另外的实施例中，多特异性抗体为双特异性抗体，其中第一抗原结合区为单结构域抗体，并且第二抗原结合区为单结构域抗体。
在一个实施例中，本发明的抗体包括第二抗原结合区，并且所述第二抗原结合区能够与人EGFR结合。靶向Vγ9Vδ2-T细胞和EGFR两者的双特异性抗体已被证明在体外和体内小鼠异种移植模型中均诱导有效的Vγ9Vδ2T细胞激活和肿瘤细胞裂解(de Bruin等人(2018)《肿瘤免疫学(Oncoimmunology)》1,e1375641)。
在一另外的实施例中，抗体包括第二抗原结合区，并且所述第二抗原结合区包括SEQ ID NO:5中所示的CDR1序列、SEQ ID NO:6中所示的CDR2序列和SEQ ID NO:7中所示的CDR3序列。
在一个实施例中，第二抗原结合区是人源化的。
在一另外的实施例中，抗体包括第二抗原结合区，并且所述第二抗原结合区包括以下或由以下组成：
●SEQ ID NO:8中所示的序列，或者
●与SEQ ID NO:8中所示的序列具有至少90％，如至少92％，例如至少94％，如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。
在一另外的实施例中，抗体与具有SEQ ID NO:8中所示的序列的抗体竞争(即，能够竞争)与人EGFR结合，优选地所述抗体与具有SEQ ID NO:8中所示的序列的抗体一样与人EGFR上的相同表位结合。
在一另外的实施例中，本发明的抗体包括第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包括SEQ ID NO:1中所示的CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示的CDR2序列和SEQ ID NO:3中所示的CDR3序列，并且其中所述第二抗原结合区包括SEQ ID NO:5中所示的CDR1序列、SEQ ID NO:6中所示的CDR2序列和SEQ ID NO:7中所示的CDR3序列。
在一另外的实施例中，本发明的抗体包括第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包括SEQ ID NO:4中所示的序列，并且所述第二抗原结合区包括SEQID NO:8中所示的序列。在本文的另外的实施例中：
SEQ ID NO:4中的X1为S(Ser)，并且SEQ ID NO:4中的X2为F(Phe)，或者
SEQ ID NO:4中的X1为S(Ser)，并且SEQ ID NO:4中的X2为S(Ser)，或者
SEQ ID NO:4中的X1为G(Gly)，并且SEQ ID NO:4中的X2为F(Phe)，或者
SEQ ID NO:4中的X1为G(Gly)，并且SEQ ID NO:4中的X2为S(Ser)。
在一另外的实施例中，抗体能够介导人EGFR表达细胞的杀伤。在一优选实施例中，当如本文实例9中所描述进行测试时，抗体能够使Vγ9Vδ2T细胞介导的对EGFR表达细胞(例如，A431细胞)的杀伤增加至少25％，如至少50％，例如至少2倍。
在一另外的实施例中，抗体无法介导EGFR阴性细胞，如EGFR阴性人细胞的杀伤。
在一个实施例中，抗体包括第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区通过肽接头，例如长度为1至20个氨基酸，例如1至10个氨基酸，如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或10个氨基酸的接头共价连接。在一个实施例中，肽接头包括SEQ ID NO:9中所示的序列GGGGS或由其组成。
在另一个实施例中，抗体包括第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中能够与人Vδ2结合的所述第一抗原结合区位于能够与人EGFR结合的所述第二抗原结合区的C端。
在本发明的一个实施例中，抗体进一步包括半衰期延长结构域。在一个实施例中，当向人类受试者施用时，抗体的终末半衰期超过约168小时。最优选地，终末半衰期为336小时或更长。抗体的“终末半衰期”当在本文中使用时是指在体内消除的最后阶段，多肽的血清浓度降低50％所需的时间。
在一个实施例中，抗体进一步包括半衰期延长结构域，并且所述半衰期延长结构域是Fc区。在一另外的实施例中，抗体是多特异性抗体，如包括Fc区的双特异性抗体。本领域已经描述了用于制备双特异性抗体的各种方法，例如由Brinkmann和Kontermann(2017)《单克隆抗体》9:182综述。在本发明的一个实施例中，Fc区是包括两种Fc多肽的异源二聚体，其中所述第一抗原结合区与第一Fc多肽融合，并且所述第二抗原结合区与第二Fc多肽融合，并且其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包括不对称氨基酸突变，相较于形成同源二聚体，所述不对称氨基酸突变更倾向于形成异源二聚体。(参见例如，Ridgway等人(1996)用于重链异源二聚化的抗体CH3结构域的‘杵臼’工程化('Knobs-into-holes'engineering of antibody CH3domains for heavy chain heterodimerization).《蛋白质工程(Protein Eng)》9:617)。在其一另外的实施例中，Fc多肽的CH3区包括所述不对称氨基酸突变，优选地所述第一Fc多肽包括T366W取代并且所述第二Fc多肽包括T366S、L368A和Y407V取代，或者所述第二Fc多肽包括T366W取代并且所述第一Fc多肽包括T366S、L368A和Y407V取代，其中根据EU编号系统，氨基酸位置与人IgG1相对应。在一另外的实施例中，第一Fc多肽和第二Fc多肽中的位置220处的半胱氨酸残基已缺失或被取代，其中氨基酸位置与根据EU编号系统的人IgG1相对应。在一另外的实施例中，所述区包括SEQ ID NO:10中所示的铰链序列。
在一些实施例中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽含有使抗体惰性的突变，即无法介导效应子功能或介导效应子功能的能力降低。在一个实施例中，惰性Fc区还无法与C1q结合。在一个实施例中，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包括位于位置234和/或235处的突变，优选地所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包括L234F和L235E取代，其中根据EU编号系统，氨基酸位置与人IgG1相对应。在另一个实施例中，抗体含有L234A突变、L235A突变和P329G突变。在另一个实施例中，抗体含有L234F突变、L235E突变和D265A突变。
在一优选实施例中，第一抗原结合区包括SEQ ID NO:4中所示的序列，第二抗原结合区包括SEQ ID NO:8中所示的序列，并且
-所述第一Fc多肽包括SEQ ID NO:11中所示的序列，并且所述第二Fc多肽包括SEQID NO:12中所示的序列，或者
-所述第一Fc多肽包括SEQ ID NO:11中所示的序列，并且所述第二Fc多肽包括SEQID NO:12中所示的序列。
在一另外的优选实施例中，抗体包括SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中所示的序列或由其组成。
在一另外的优选实施例中，抗体包括SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18中所示的序列或由其组成。
在一另外的主要方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包括如本文所描述的根据本发明的抗体和药学上可接受的赋形剂。
抗体可以根据常规技术，例如Rowe等人2012《药用赋形剂手册(Handbook ofPharmaceutical Excipients)》,ISBN 9780857110275中公开的技术与药学上可接受的赋形剂一起调配。药学上可接受的赋形剂以及任何其它载体、稀释剂或佐剂应适于抗体和所选择的施用方式。赋形剂和药物组合物的其它组分的适用性是基于对所选择的本发明的抗体或药物组合物的期望的生物性质没有显著负面影响(例如，小于对抗原结合的重大影响(10％或更少相关抑制、5％或更少相关抑制等))来测定的。
药物组合物可以包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如，非离子洗涤剂，如吐温-20或吐温-80)、稳定剂(例如，糖或不含蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或其它适于包含在药物组合物中的材料。另外的药学上可接受的赋形剂包含与本发明的抗体在生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。
在一另外的主要方面，本发明涉及如本文所描述的用作药物的根据本发明的抗体。
根据本发明的抗体使得能够产生有利于Vγ9Vδ2T细胞杀死肿瘤细胞的微环境。因此，在优选实施例中，抗体用于治疗癌症。
在一个实施例中，抗体用于治疗原发性或转移性结肠癌或结直肠癌。在另一个实施例中，抗体用于治疗腹膜的癌症。在另一个实施例中，抗体用于治疗肝癌。在另一个实施例中，抗体用于治疗头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。在另一个实施例中，抗体用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施例中，抗体用于治疗皮肤的鳞状细胞癌。
类似地，本发明涉及治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的人类受试者施用本文所描述的根据本发明的多特异性抗体。在一个实施例中，所述疾病是癌症。
在一些实施例中，所述抗体作为单一疗法施用。然而，本发明的抗体也可以在组合疗法中施用，即，与和要治疗的疾病或病症相关的其它治疗剂组合施用。
“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指施用有效量的本发明的抗体，目的是缓解、改善、阻止、消除(治愈)或预防症状或疾病状态。“有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现所希望的治疗结果的有效的量。多肽，如抗体的有效量可以根据如个体的疾病阶段、年龄、性别和重量等因素以及抗体在个体中引发期望应答的能力而变化。有效量还是治疗有益效果超过抗体的任何毒性或有害效果的量。施用可以通过任何合适的途径进行，但通常将是非肠道施用，如静脉内、肌肉内或皮下施用。
本发明的多特异性抗体通常是重组产生的，即通过在合适的宿主细胞中表达编码抗体的核酸构建体，随后从细胞培养物中纯化所产生的重组抗体。核酸构建体可以通过本领域熟知的标准分子生物学技术来产生。通常使用表达载体将构建体引入到宿主细胞中。合适的核酸构建体和表达载体是本领域已知的。适于抗体的重组表达的宿主细胞在本领域是众所周知的，并且包含CHO、HEK-293、Expi293F、PER-C6、NS/0和Sp2/0细胞。
因此，在一另外的方面，本发明涉及编码根据本发明的抗体的核酸构建体。在一个实施例中，构建体是DNA构建体。在另一个实施例中，构建体是RNA构建体。
在一另外的方面，本发明涉及表达载体，所述表达载体包括编码根据本发明的抗体的核酸构建体。
在一另外的方面，本发明涉及包括一个或多个编码根据本发明的抗体的核酸构建体的宿主细胞或包括编码根据本发明的抗体的核酸构建体的表达载体。
在一另外的方面，本发明涉及用于制备本发明的抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达一种或多种编码根据本发明的抗体的核酸。
在一另外的方面，本发明涉及用于制备临床批次的本发明的抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达一种或多种编码根据本发明的抗体的核酸。“临床批次”当在本文中使用时是指适于在人类中使用的产品组合物。
在一另外的方面，本发明涉及用于制备不含酪氨酸硫酸化的抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达一种或多种编码根据本发明的抗体的核酸。
在一另外的方面，本发明涉及用于避免能够激活人Vγ9Vδ2T细胞的抗体的酪氨酸硫酸化的方法，所述方法包括构建编码本发明的抗体的核酸，以及通过在宿主细胞中表达所述核酸来产生所述抗体。
在一另外的方面，本发明涉及用于产生能够激活人Vγ9Vδ2T细胞的抗体的均质抗体制剂的方法，所述方法包括构建编码本发明的抗体的核酸，以及通过在宿主细胞中表达所述核酸来产生所述抗体。
在一个实施例中，上述制造方法中的宿主细胞是哺乳动物细胞，如CHO细胞或HEK细胞，或酵母细胞，如毕赤酵母细胞。
表1：序列表。
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出于所有目的，本文中引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请均通过引用的方式完全并入本文。然而，对本文中的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不被视为并且不应当被视为对其构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。
实例
实例1|VHH化合物的产生和纯化
VHH化合物主要通过在HEK293-E 253细胞中瞬时转染编码质粒，并且通过蛋白-A亲和色谱法从条件培养基中纯化蛋白质(在产生一周后)，随后进行制备型凝胶过滤来产生。将使用Superdex-75柱在制备型尺寸排除中观察到的主单体峰(级分1E11-1G2)纯化：图1。
经纯化的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示出在还原和非还原条件下作为单一条带迁移：图2示出了代表性的实例。
实例2|经纯化的VHH化合物的HP-SEC分析
Waters Acquity ARC生物系统用于经纯化的VHH化合物的HP-SEC分析。将10μg的抗体(10μL的抗体，浓度为1mg/mL)进料到Waters BEH200SEC柱上(珠粒大小为2.5μm，柱尺寸为7.8x 300mm)。运行使用由50mM磷酸钠、0.2M氯化钠缓冲液(pH 7.0)组成的流动相，并且缓冲速度为0.8毫升/分钟。通过测量在214nm波长下的吸收来检测蛋白质。总分析时间为每进料15分钟。如实例1中所描述制备和纯化VHH化合物。令人惊讶的是，当在HP-SEC分析中测试VHH 5C8(SEQ ID NO:13)(先前在WO2015156673中描述)和5C8var1(SEQ ID NO:14)(先前在WO2020060405中描述)的完整性和单体性时，观察到两个峰：图3。
实例3|5C8的质谱分析揭示另外的80Da的质量
为了测定5C8的两种异构体在质量上是否不同，通过LC-ESI-MS质谱法分析5C8的蛋白质制剂。在此分析中发现的主要物种是不含翻译后修饰或信号肽的5C8。第二物种是质量差为+80.3道尔顿(Da)的蛋白质，这指示可能存在硫酸化或磷酸化。这通过用磷酸酶或硫酸酯酶处理以及随后的蛋白水解消化后肽的LC-ESI-MS质谱分析来进一步研究。结果表明，硫酸酯酶处理使含有CDR3(SEQ ID NO:15)的第7个残基Y105的肽的质量减少了80Da，而磷酸酶处理没有作用。这证明了5C8中的Y105是通过硫酸化进行翻译后修饰的。这种硫酸化存在于约30％的蛋白质制剂中。
实例4|1D12var5-5C8var1含有相同的抗Vγ9Vδ2VHH，在HP-SEC中显示出相同的异质性和相同的80Da的额外质量
1D12var5-5C8var1是由抗CD1d VHH构成的双特异性VHH化合物，其通过柔性接头与5C8var1偶联(在WO2020060405中的SEQ ID NO:87中描述)。如上文所描述的，此蛋白质在HEK 293E细胞中表达。此外，从不同的表达系统中获得了蛋白质制剂：双特异性VHH也在毕赤酵母细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。当在HP-SEC分析中测试不同的蛋白质制剂时，系统地观察到前峰：图4。
观察到的前峰指示此蛋白质的显著百分比再次是不同的同种型。由于5C8 VHH被证明是经硫酸化的，并且5C8var1含有完全相同的CDR3序列，同样通过质谱法分析1D12var5-5C8var1批次的分子量。根据蛋白质批次，发现15％至40％之间含有80Da的另外的质量。这与如针对VHH 5C8观察到的硫酸化一致。
实例5|VHH 5C8和5C8var1的计算机模拟分析
使用Maestro(公司/>)基于PDB ID 5M2W建立了5C8和5C8var1的同源性模型。需要使用Prime(/>公司)通过从头循环预测对CDR1和CDR3进行细化。所产生的模型表明，CDR3残基Y105在5C8var1的模型中显示出/>并且在5C8的模型中显示出/>的高溶剂可及性表面积，并且因此预计有助于抗原结合。随后，对模型进行反应性残基分析，指示残基倾向于翻译后修饰(PTM)。接下来，使用基于序列的PTM预测工具ModPred分析蛋白质序列。表2中列出了在结构和序列两者中预测的修饰。个体预测的PTM不能解释HP-SEC分析中观察到的质量差异。
表2|Maestro和ModPred中针对5C8和5C8var1的预测PTM。类型描述了通过Maestro预测的PTM。*Q13脱酰胺化仅针对5C8进行预测。
实例6|5C8var1 VHH CDR3突变体Y105F和Y105S的设计和产生
如实例5中所描述的，同源性模型用于引入将阻止5C8和5C8var1中的Y105的硫酸化的突变。基于VHH的模型结构设计了两种不同的突变体：Y105S(保留醇官能团)和Y105F(保留芳香族环)。残基Y105是CDR3的第7个残基；通过引入突变，预计会对结合产生影响。两种突变都是在人源化VHH序列5C8var1中设计的，并且两种蛋白质都是在HEK293E细胞中产生的，并且如上文所描述进行纯化。人源化VHH的CDR3氨基酸序列与非人源化的VHH保持相同。
5C8var1-Y105F和5C8var1-Y105S两者均良好地产生，并且在制备型尺寸排阻中以单体蛋白的形式出现(数据未示出)。两种蛋白质都是高纯度的(图5)，并且在聚丙烯酰胺凝胶电泳中作为单一物种迁移。
实例7|含有设计CDR3突变的经纯化的VHH的HP-SEC分析
如针对5C8所描述的进行HP-SEC分析。对5C8var1-Y105F和5C8var1-Y105S两者进行了分析(图6)。
如从含有设计的CDR3突变的经纯化的VHH分子的HP-SEC分析中可以得出结论，对于任何突变都没有观察到异质性。这指示所观察到的Y105翻译后修饰不存在，并且蛋白质是均质的。
实例8|使用生物层干涉技术(BLI)对5C8var1、5C8var1-Y105F和5C8va1-Y105S的亲和力测量显示亲和力没有差异
使用Octet RED96仪器(ForteBio公司(ForteBio))通过生物层干涉技术测量5C8var1 VHH抗体片段和变体5C8var1-Y105F和5C8var1-Y105S与Vγ9Vδ2TCR的结合。在抗人Fc捕获生物传感器上捕获重组人Vγ9Vδ2-Fc融合蛋白(20μg/ml)作为配体。当配体捕获的生物传感器与稀释系列的VHH抗体片段(40至0.63nM)在10X动力学缓冲液(ForteBio公司)中一起温育时，记录传感器图。使用符合1:1结合模型的全局数据来估计kon(缔合速率常数)和koff(离解速率常数)的值。这些值用于使用KD＝koff/kon计算KD(平衡离解常数)。
如从图7和表3可以得出结论，两个不同Y105 VHH突变体的KD值与中针对5C8var1发现的值没有显著差异。特别是Y105F突变体具有与针对5C8var1发现的亲和力相当的亲和力。
表3|在VHH与重组Vγ9Vδ2 TCR蛋白结合的BLI测量中发现的亲和力值。所描绘的值为至少三次独立测量的平均值/-标准偏差。
VHH化合物 KD(nM)+/-SD
5C8var1 0.81+/-0.02
5C8var1-Y105F 0.78+/-0.23
5C8var1-Y105S 1.59+/-0.31
实例9|含有Y105F突变的抗(EGFR x Vγ9Vδ2 TCR)双特异性VHH的功能被完全保留
为了测定与5C8var1的亲和力相比，VHH 5C8var1-Y105F的同等亲和力是否可以转化为可比较的功能，设计了双特异性7D12var8-5C8var1-Y105F：人源化抗EGFR VHH7D12var8(基于Gainkam等人(2008)《核医学杂志(J Nucl Med)》49(5)：788中描述的VHH)通过G4S接头与5C8var1-Y105F VHH偶联，形成7D12var8-5C8var1-Y105F。两个VHH分子通过柔性G4S接头序列分离。如上文所描述制备和纯化此分子，并且然后测试其诱导依赖于EGFR阳性肿瘤细胞系(A431)的Vγ9Vδ2 T细胞激活和引起T细胞介导的肿瘤细胞裂解的能力。简而言之，根据标准化程序，使用磁性激活的细胞分选(MACS)与抗Vδ2抗体组合从健康供体的血液中分离Vγ9Vδ2 T细胞。然后使用细胞因子和辐照饲养细胞的混合物：JY细胞系和来自不同供体的PBMC的混合物将这些细胞扩增一周。当用于测定时，Vγ9Vδ2 T细胞总是＞90％纯(在FACS中对Vγ9和Vδ2染色呈双阳性)。根据供应商的建议培养A431细胞系(ATCC，目录号CRL-1555)。对于激活或细胞毒性测定，在测定前一天将50,000个肿瘤靶细胞铺板在96孔组织培养板中。第二天，将50,000个经扩增的纯化的Vγ9Vδ2 T细胞与一定浓度范围的双特异性VHH化合物一起添加到培养基中。在激活测定中，使用添加到混合物中的标记的抗CD3和抗CD107A抗体的混合物来评估V γ 9Vδ2-T细胞脱粒。4小时后，收获细胞，洗涤并通过FACS分析脱粒标志物CD107A的表达。对于细胞毒性测定，在第二天使用Cytox-Glo细胞毒性测定试剂盒：(普洛麦格公司(Promega)G9290)检查共培养物的上清液中是否存在蛋白酶(指示细胞死亡)。使用洗涤剂的细胞裂解用于在测定结束时设定100％的杀伤。图8示出了数据。
图8示出，7D12var8-5C8var1-Y105F以及非人源化的7D12-5C8诱导了有效的Vγ9Vδ2 T细胞激活和肿瘤细胞裂解。这些结果与不含Y105突变7D12wt-5C8的非人源化“前体”分子的效力一致。表4示出了在曲线拟合之后获得的EC50值。7D12var8-5C8var1-Y105F与7D12-5C8相比在细胞毒性测定中具有略低的EC50。
表4|使用GraphPad软件对图8中所示的数据进行曲线拟合后发现的EC50值。
所使用的抗体 EC50脱粒(pM) EC50细胞毒性(pM)
7D12-5C8 10 9
7D12var8-5C8var1-Y105F 11 2.5
与针对7D12-5C8观察到的肿瘤细胞杀伤水平相比，在7D12var8-5C8var1-Y105F的情况下，肿瘤细胞杀伤的最大水平略低。然而，这是使用两种不同的Vγ9Vδ2 T细胞供体的两种不同测量，并且这种最大水平的细胞毒性可能尤其是供体依赖性的。
实例10|含有Y105突变的VHH 5C8var1的温度稳定性没有改变
为了确定不同变体中引入的突变是否影响VHH折叠的热稳定性，使用NanoDSF(差示扫描荧光测定法)测量突变体的熔融温度。使用PBS稀释抗体样品，直到其与具有最低浓度的样品相等为止。随后将抗体样品填充在nanoDSF级毛细管中，并用Prometheus NT.48进行测量。在实验期间，温度从20℃上升至95℃。在350和330nm处检测蛋白质的固有荧光，并与反射光的量一起记录。根据这些测量结果，测定了表观熔融温度(Tm)和聚集开始(Tagg)。对于所有三种抗体片段，报告了VHH完全展开时的起始熔融温度(Ton)和熔融温度(Tm)(表4)。测量的5C8var1-Y105F和5C8var1-Y105S的熔融温度与5C8var1的熔融温度一致：表4。
表4|5C8var1-Y105F和5C8var1-Y105S显示出与5C8var1类似的熔融温度，指示引入的突变不会损害稳定性。
Ton(℃) 温度(℃)
5C8var1 61.8 86.7
5C8var1-Y105F 64.5 85.5
5C8var1-Y105S 63.9 86.6
实例11|半衰期延长的(含Fc)的双特异性构建体
为了获得具有较长体内血浆半衰期的分子，将7D12var8-5C8var1-Y105F双特异性VHH重新格式化为含有人Fc的治疗性抗体形式。两种VHH结构域与具有以下特性的人IgG1Fc(即CH2和CH3)结构域偶联：VHH与经修饰的铰链(AAA，随后是SDKTHTCPPCP，半胱氨酸220缺失)以及人CH2和CH3结构域偶联。CH2结构域被LFLE突变对(L234F、L235E)Fc沉默，并且CH3结构域被“杵臼”突变(杵：T366W和臼：T366S、L368A和Y407V)突变，当两条链在同一细胞中共表达时，这些突变会迫使异源二聚化。科学文献中已经描述了这种突变对(Ridgway等人(1996)《蛋白质工程》9:617)。构建体的序列在SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中示出。所得到的具有Fc区的抗体构建体7D12var8-5C8var1(Y105F)被称为7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc。类似地，制备构建体，其中用S(7D12var8-5C8var1(Y105S)-Fc)替代位置105处的Y。此构建体的序列在SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18中示出。
如实例1所描述，通过在HEK293E细胞中共转染编码两种表达载体并且通过蛋白-A亲和色谱法，然后通过制备型尺寸排阻色谱法从培养上清液中进行纯化来制备蛋白质。这产生了高度单体的蛋白质制剂。
实例12|7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc与从健康人PBMC分离的原代Vγ9Vδ2T细胞的结合
为了证明7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc与Vγ9Vδ2T细胞受体(TCR)的结合，通过磁激活的细胞分选(MACS)从健康的外周血单核细胞(PBMC)中分离出人Vγ9Vδ2T细胞，并且随后如所描述的进行扩增(de Bruin等人,《临床免疫学(Clin.Immunology)》169(2016),128-138；de Bruin等人,《免疫学杂志(J.Immunology)》198(1)(2017),308-317)。然后以50000个细胞/孔的浓度接种扩增的多克隆和纯(>95％)Vγ9Vδ2T细胞，并在4℃下在以100nM开始的半对数滴定中与7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc抗体或GP120-5C8var1(Y105F)-Fc抗体作为阳性对照一起温育一小时。使用荧光标记的次级抗IgG1抗体通过流式细胞术观察抗体与Vγ9Vδ2TCR的结合。图9示出了通过流式细胞术测量的两种不同PBMC供体(D336和D339)的抗IgG1抗体染色的平均荧光强度(MFI)信号。S形曲线强调了7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc与Vγ9Vδ2T细胞的显著结合，其半数最大有效浓度(EC50)在低纳摩尔范围内(约3nM)。
实例13|通过基于细胞的ELISA检测7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc与EGFR阳性肿瘤细胞的结合
使用表达EGFR的肿瘤细胞系A-431、HCT-116和HT-29在基于细胞的酶联免疫吸附测定(ELISA)中测试7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc与表皮生长因子受体(EGFR)的结合。为此，首先在第-1天以不同浓度接种肿瘤细胞，以在第0天达到大约50000个细胞/孔的浓度。在第0天，在37℃下将7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc抗体或GP120-5C8var1(Y105F)-Fc抗体的半对数滴定作为阴性对照，以100nM开始添加到肿瘤细胞中，持续一小时。然后在37℃下用抗IgG1-HRP在二次温育步骤中标记结合的抗体，持续一小时。然后通过添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺和HRP诱导的比色变化来分解次级抗体结合，随后添加H2SO4以停止反应。然后在波长为450nm的UV光谱仪中测量光密度(OD)。图10显示，7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc与A-431、HCT-116和HT-29肿瘤细胞强结合，其中EC50为约7nM，而非靶向对照抗体未与测试的细胞系中的任何细胞系可测量地结合。
实例14|7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc诱导依赖A-431细胞的Vγ9Vδ2T细胞脱粒
为了研究7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc激活Vγ9Vδ2T细胞的潜力，如前所描述的首先分离和扩增Vγ9Vδ2T细胞。接下来，在存在不同浓度的7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc抗体和PE标记的抗CD107a荧光抗体的情况下，将Vγ9Vδ2T细胞与A-431肿瘤细胞以1:1E:T比率一起培养。24小时后，采集细胞并用荧光标记的抗Vγ9和抗CD3抗体染色，以区分Vγ9Vδ2T细胞与肿瘤细胞。使用流式细胞术研究了CD107a在Vγ9Vδ2T细胞上的表达程度，反映了靶向依赖性脱粒。图11显示，随着7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc浓度的增加，Vγ9Vδ2T细胞被有效诱导进行依赖于A-431细胞的脱粒。7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc诱导的Vγ9Vδ2T细胞脱粒的EC50在皮摩尔范围内(约40-90pM)。
实例15|抗体7D12-5C8诱导T细胞介导的靶细胞细胞毒性
为了研究双特异性VHH 7D12-5C8是否有效诱导Vγ9Vδ2T细胞介导的针对靶细胞的细胞毒性，在与Vγ9Vδ2T细胞和bsVHH抗体片段的共培养环境中评估了A-388表皮样肿瘤细胞系(ATCC，CRL-7905)的活力。在此测定中，使用了如先前所描述的从健康PBMC中分离的Vγ9Vδ2T细胞，但随后在-150℃下冷冻并储存。将冷冻的Vγ9Vδ2T细胞解冻并在补充IL-2的培养基中静置过夜。将A-388肿瘤细胞单独接种或与静置的Vγ9Vδ2T细胞以1:1或1:0.1的比率接种，含有或不含7D12-5C8(10nM)。作为另外的对照，单独接种含有或不含抗体7D12-5C8(10nM)的Vγ9Vδ2T细胞。72小时后，通过添加ATP-Lite(珀金埃尔默公司(Perkin-Elmer)，6016731)并用微孔板读取器读取发光信号来测定细胞的活力。图12显示了ATP衍生的荧光信号，表示活细胞的代谢活性，并且由此表示活细胞的数量。在1:1E:T比率下，可以观察到抗体诱导活细胞减少约50％，而A-388和Vγ9Vδ2T细胞的未经处理的共培养物不受影响，这突出了其诱导T细胞介导的细胞毒性的潜力。
实例16|7D12-5C8和7D12-5C8var1(Y105S)-Fc激活的Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤细胞的杀伤
为了研究bsVHH 7D12-5C8和抗体7D12-5C8var1(Y105S)-Fc是否能够诱导Vγ9Vδ2T细胞介导的对患者来源的肿瘤细胞的细胞毒性，在Vγ9Vδ2T细胞和抗体的共培养环境中评估了这种肿瘤细胞的活力。测试了各种不同类型的肿瘤细胞。
在获得书面知情同意后，从阿姆斯特丹UMC(位置VUmc)的癌症患者身上收集组织样品(即来自结肠、腹膜和肝脏、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和非小细胞肺癌(NSCLC)的原发性和转移性肿瘤材料)。用手术刀片(大小编号22；Swann Morton有限责任公司(SwannMorton Ltd))将组织切成小块，重悬浮于由补充有0.1％ DNA酶I、0.14％胶原蛋白酶A、5％FCS、100IU/ml青霉素钠、100μg/ml硫酸链霉素和2.0mM L谷氨酰胺的IMDM构成的分离培养基中，转移到带搅拌棒的无菌烧瓶中，并在37℃水浴中在磁力搅拌器上温育45分钟。温育后，使细胞悬浮液通过100μM细胞滤网。将肿瘤解离三次，之后用台盼蓝排除法洗涤细胞以进行活细胞计数。
将解离的患者来源的肿瘤细胞与健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞(1:1E:T比率)在存在或不存在50nM 7D12-5C8的情况下温育4小时，或在存在或不存在7D12-5C8var1(Y105S)-Fc或gp120-5C8var1(Y105S)-Fc的情况下温育24小时。
如果需要的话，在培养期后使用胰蛋白酶-EDTA分离粘附的细胞，并将其重悬于FACS缓冲液(补充有0.5％牛血清白蛋白和20μg/ml NaN3的PBS)中，与荧光染料标记的抗体在4度下温育30分钟，之后使用LSR Fortessa XL-20(BD)通过流式细胞术测量染色。
根据制造商的说明书，使用生/死标志物7AAD与123计数eBeadsTM组合鉴定活细胞。使用Kaluza Analysis第1.3版(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))和FlowJo第10.6.1和10.7.2版(贝迪医疗(Becton Dickinson))分析流式细胞术数据。
通过将扩增的健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞与各种恶性肿瘤(原发性CRC、腹膜和肝脏中的CRC转移、头颈部鳞状细胞癌和非小细胞肺癌)的单细胞悬浮液一起温育，评估7D12-5C8和7D12-5C8var1(Y105S)-Fc诱导的Vγ9Vδ2T细胞介导的肿瘤细胞毒性。
如图13所展示的，7D12-5C8诱导Vγ9Vδ2T细胞对患者肿瘤细胞的大量裂解(7D12-5C8诱导的平均裂解％：CRC原发性52.3％并且p值为0.0003，CRC腹膜46.0％并且p值为0.0052，CRC肝脏31.8％并且p值为0.0360，头颈部鳞状细胞癌46.1％并且p值为0.0187，以及非小细胞肺癌64.1％并且p值为0.0153)。
此外，如图14所示，7D12-5C8var1(Y105S)-Fc诱导Vγ9Vδ2T细胞对患者肿瘤细胞的大量裂解(7D12-5C8var1(Y105S)Fc诱导的平均裂解％：71.2％，并且p<0.0001和0.0012)。对照化合物gp120-5C8var1(Y105S)-Fc没有诱导任何可测量的肿瘤细胞裂解。
实例17|用于非人灵长类动物研究的构建体的设计、产生和纯化
对于在非人类灵长类动物中进行的体内研究，产生了具有与猕猴Vγ9TCR链交叉反应的结合结构域的构建体(图15)。此结合结构域基于TCR Vγ9特异性抗体-抗体7A5(Janssen等人,《免疫学杂志》146(1)(1991),35-39)。已经发现基于7A5的抗体与猕猴Vγ9Vδ2T细胞结合(参见WO2021052995的实例1)。构建了包括7A5和抗EGFR VHH 7D12var8的双特异性Fc的抗体。此分子含有人IgG1 Fc尾部，所述尾部是使用杵臼技术工程化用于异源二聚化的(KiH；Carter等人,2001《免疫方法(Imm.Meth.)》2001:248,7；杵：T366W；臼：T366S、L368A和Y407V)。7A5抗体的Vγ9结合scFv与“杵”链偶联；EGFR结合的VHH 7D12var8与KiH-Fc对的“臼”链一起被克隆在框架中。此外，上部铰链被工程化为‘AAASDKTHTCPPCP’，以去除通常与CL桥接的半胱氨酸(C220)，并通过将‘EPK’改为‘AAA’来引入更多的灵活性。CH2的N端部分被工程化为消除Fc受体(CD16、-32和-64)相互作用(沉默突变L234F、L235E)，同时维持FcRN结合。所得到的构建体被称为7A5-7D12var8-Fc。
通过在HEK293E细胞中瞬时共转染编码两个不同链的两个质粒产生分子，并通过蛋白-A亲和色谱法，随后通过制备型尺寸排阻色谱法从培养上清液中进行纯化(实例1)。使用ELISA和两种抗原的重组形式，分子显示出以约3纳摩尔(nM)的表观亲和力与任一靶标结合(图16)。分子的功能通过显示其引起体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞的靶标依赖性激活(CD107a表达)和随后的T细胞介导的肿瘤细胞裂解来证明(图17)。
实例18|在一项探索性多剂量非人灵长类动物(NHP：猕猴)研究中，双特异性抗体7A5-7D12var8-Fc良好耐受
在一项多剂量探索性NHP研究中，对三只雌性猕猴分别施用1mg/kg、5mg/kg和23mg/kg剂量的7A5-7D12var8-Fc。抗体以5mL/kg分半小时输注；施用4次每周输注。前两个剂量组(每个剂量1只动物)同时给药1和5mg/kg，并且三个(每周)剂量后，第三个剂量组接受第一剂量(23mg/kg)。定期从动物身上抽取血液，用于PK分析、临床化学参数分析、细胞因子水平测量以及通过流式细胞术分析血细胞亚群。在给予最后剂量之后一天，对动物实施安乐死，并且采集组织并准备进行组织病理学检查和免疫组织化学(IHC)。
经处理的动物的血液中7A5-7D12var8-Fc浓度的药代动力学分析(在ELISA中测量，图18)揭示，抗体呈现出IgG样PK，其中半衰期的范围为84至127小时。在以1mg/kg给药的动物中，抗体在第三次注射后显示出较短的半衰期，这可能是由于此动物可能存在抗药物抗体(ADA)应答。
发现的清除值介于0.36与0.72毫升/小时/千克之间，并且分布体积介于58.5与115.2mL/kg之间。全身暴露在1至23mg/kg之间剂量成比例地增加。然而，在重复给药后没有观察到累积。
通过IHC可以在不同组织(淋巴结、肌肉、皮肤和结肠)中检测到此化合物；如预期的那样，在这些组织中存在与剂量成比例的化合物染色强度(数据未示出)。血细胞的流式细胞术分析显示了淋巴细胞中的若干次短暂的减少(图19)，这在这类多剂量研究中经常观察到，并且与程序有关。图19示出了给药后2小时每个时间点T细胞计数的短暂减少。然而，T细胞的数量在注射后两天恢复到基线水平。
相比之下，Vγ9阳性T细胞在外周血中的数量减少，并且没有恢复到以前的频率。在整个研究过程中，这些细胞几乎不存在，证明了此化合物的特定药效动力学作用。对经处理的动物的血液中细胞因子的测量显示，处理引起的细胞因子释放非常少，并且这几乎仅限于第一次化合物注射。图20示出了作为实例测量的IL-6水平。
总之，用7A5-7D12var8-Fc处理的NHP是非常良好的耐受的，并且没有显示出毒性的临床迹象。此外，在组织病理学中没有发现任何检查器官的宏观或微观畸变(数据现已示出)。相比之下：抗EGFR x CD3 BiTE在连续输注31μg/kg/天的剂量下对于NHP是致命的(Lutterbuese等人,《美国国家科学院院刊》2010:107(28),12605)。
序列表
<110> 熔岩疗法公司
<120> 与γ-δ T细胞受体结合的抗体
<130> P008WO1
<160> 18
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X为S或G
<400> 1
Asn Tyr Ala Met Xaa
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 2
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X为F或S
<400> 3
Gln Phe Ser Gly Ala Asp Xaa Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile Arg Gly
1 5 10 15
Tyr Glu Tyr Asp Tyr
20
<210> 4
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X为S或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (105)..(105)
<223> X为F或S
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Xaa Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Asp Xaa Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile
100 105 110
Arg Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 5
Ser Tyr Gly Met Gly
1 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 6
Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 7
Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 8
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 10
Ala Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 11
Ala Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 12
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 12
Ala Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 13
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Pro Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Asp Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile
100 105 110
Arg Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 14
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Asp Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile
100 105 110
Arg Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 15
Gln Phe Ser Gly Ala Asp Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile Arg Gly
1 5 10 15
Tyr Glu Tyr Asp Tyr
20
<210> 16
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ser
115 120 125
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
165 170 175
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
225 230 235 240
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
245 250 255
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
325 330 335
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
340 345 350
Pro Gly Lys
355
<210> 17
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Asp Phe Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile
100 105 110
Arg Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
145 150 155 160
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
165 170 175
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
180 185 190
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
195 200 205
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
210 215 220
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
225 230 235 240
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
245 250 255
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
260 265 270
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
275 280 285
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
290 295 300
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
325 330 335
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
340 345 350
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 18
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Asp Ser Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile
100 105 110
Arg Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
145 150 155 160
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
165 170 175
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
180 185 190
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
195 200 205
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
210 215 220
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
225 230 235 240
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
245 250 255
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
260 265 270
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
275 280 285
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
290 295 300
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
325 330 335
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
340 345 350
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360

Claims (21)

1.一种抗体，其包括能够与人Vδ2结合的第一抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包括SEQ ID NO:1中所示的CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示的CDR2序列和SEQ ID NO:3中所示的CDR3序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中
●SEQ ID NO:1中的X1为S(Ser)，并且SEQ ID NO:3中的X2为F(Phe)，或者
●SEQ ID NO:1中的X1为S(Ser)，并且SEQ ID NO:3中的X2为S(Ser)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合区为单结构域抗体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合区包括以下或由以下组成：
●SEQ ID NO:4中所示的序列，或者
●与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少90％，如至少92％，例如至少94％，如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体进一步包括第二抗原结合区，并且其中所述第二抗原结合区优选地为单结构域抗体。
6.根据权利要求4所述的抗体，其中所述抗体为双特异性抗体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括第二抗原结合区，并且其中所述第二抗原结合区能够与人EGFR结合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括第二抗原结合区，并且其中所述第二抗原结合区包括SEQ ID NO:5中所示的CDR1序列、SEQ ID NO:6中所示的CDR2序列和SEQ ID NO:7中所示的CDR3序列，并且
其中优选地，所述第二抗原结合区包括以下或由以下组成：
●SEQ ID NO:8中所示的序列，或者
●与SEQ ID NO:8中所示的序列具有至少90％，如至少92％，例如至少94％，如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括第二抗原结合区，并且其中所述第一抗原结合区包括SEQ ID NO:1中所示的CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示的CDR2序列和SEQ ID NO:3中所示的CDR3序列，并且其中所述第二抗原结合区包括SEQ ID NO:5中所示的CDR1序列、SEQ ID NO:6中所示的CDR2序列和SEQ ID NO:7中所示的CDR3序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够介导人EGFR表达细胞的杀伤。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区通过肽接头共价连接。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体进一步包括半衰期延长结构域，如Fc区。
13.根据权利要求5至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括Fc区，其中所述Fc区是包括两种Fc多肽的异源二聚体，其中所述第一抗原结合区与第一Fc多肽融合，并且所述第二抗原结合区与第二Fc多肽融合，并且其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包括不对称氨基酸突变，相较于形成同源二聚体，所述不对称氨基酸突变更倾向于形成异源二聚体。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述Fc多肽的CH3区包括所述不对称氨基酸突变，优选地所述第一Fc多肽包括T366W取代并且所述第二Fc多肽包括T366S、L368A和Y407V取代，或者所述第二Fc多肽包括T366W取代并且所述第一Fc多肽包括T366S、L368A和Y407V取代，其中根据EU编号系统，氨基酸位置与人IgG1相对应。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的抗体，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包括位于位置234和/或235处的突变，优选地所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包括L234F和L235E取代，其中根据EU编号系统，氨基酸位置与人IgG1相对应。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括第二抗原结合区，并且其中所述第一抗原结合区包括SEQ ID NO:4中所示的序列，所述第二抗原结合区包括SEQID NO:8中所示的序列，并且
-所述第一Fc多肽包括SEQ ID NO:11中所示的序列，并且所述第二Fc多肽包括SEQ IDNO:12中所示的序列，或者
-所述第一Fc多肽包括SEQ ID NO:11中所示的序列，并且所述第二Fc多肽包括SEQ IDNO:12中所示的序列。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括SEQ ID NO:16和SEQID NO:17中所示的序列或由其组成，或者包括SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18中所示的序列或由其组成。
18.一种药物组合物，其包括根据前述权利要求中任一项所述的抗体以及药学上可接受的赋形剂。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体，其用作药物，优选地用于治疗癌症。
20.一种编码根据权利要求1至17中任一项所述的抗体的核酸构建体、包括所述核酸的表达载体或包括一个或多个编码根据权利要求1至17中任一项所述的抗体的核酸构建体的宿主细胞。
21.一种用于制备不含酪氨酸硫酸化的抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达一种或多种编码根据权利要求1至17中任一项所述的抗体的核酸，其中所述宿主细胞优选地为中国仓鼠卵巢细胞、人胚胎肾细胞或毕赤酵母细胞(Pichia pastoris cell)。
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WO2010111625A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for using multispecific-binding proteins comprising an antibody-receptor combination
KR101224468B1 (ko) 2009-05-20 2013-01-23 주식회사 파멥신 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도
ES2537207T3 (es) 2010-08-16 2015-06-03 Novimmune S.A. Métodos para la generación de anticuerpos multiespecíficos y multivalentes
ES2743399T3 (es) 2012-04-20 2020-02-19 Merus Nv Métodos y medios para la producción de moléculas heterodiméricas similares a Ig
CA2892193C (en) 2012-11-21 2018-06-19 Pharmabcine Inc. Dual-target antibody targeting vegfr-2 and dll4, and pharmaceutical composition including the same
JP6617138B2 (ja) * 2014-04-10 2019-12-11 ラヴァ・セラピューティクス・ベー・フェー ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体と結合する免疫グロブリン
US20210371525A1 (en) 2018-09-19 2021-12-02 Lava Therapeutics B.V. Novel bispecific antibodies for use in the treatment of hematological malignancies
WO2020159368A1 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 Lava Therapeutics B.V. Novel cd40-binding antibodies
EP3792283A1 (en) 2019-09-16 2021-03-17 Lava Therapeutics B.V. Treatment of cancer comprising administration of vgamma9vdelta2 t cell receptor binding antibodies

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