CN116437949A - 剪切速率降低的抗原结合结构域 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含第一靶抗原结合结构域的多肽或多肽构建体，其中所述第一靶抗原结合结构域包含通过肽接头连接的VH和VL可变区，其中该肽接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。本发明还涉及用于改善多肽或多肽构建体的稳定性的方法。此外，本发明涉及对本发明的多肽或多肽构建体进行编码的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、以及经所述多核苷酸或所述载体转化或转染的宿主细胞。此外，本发明还提供了用于产生所述多肽或多肽构建体的工艺以及包含本发明的所述多肽或多肽构建体的药物组合物。另外，本发明涉及所述多肽或多肽构建体的医学用途和包含所述多肽或多肽构建体的试剂盒。

Description

剪切速率降低的抗原结合结构域
本发明涉及包含第一靶抗原结合结构域的多肽或多肽构建体，其中所述第一靶抗原结合结构域包含通过肽接头连接的VH和VL可变区，其中该肽接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。本发明还涉及用于改善多肽或多肽构建体的稳定性的方法。此外，本发明涉及对本发明的多肽或多肽构建体进行编码的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、以及经所述多核苷酸或所述载体转化或转染的宿主细胞。此外，本发明还提供了用于产生所述多肽或多肽构建体的工艺以及包含本发明的所述多肽或多肽构建体的药物组合物。另外，本发明涉及所述多肽或多肽构建体的医学用途和包含所述多肽或多肽构建体的试剂盒。
在液体储存期间，配制的、纯化的生物分子(例如抗体、T细胞衔接抗体等)的剪切(又称为碎片化)是广泛观察到的不利因素。取决于剪切发生的速率，在稳定性以及因此生物分子的组成方面不作妥协的情况下，液体配制可能是不可行的。此类妥协并不总是一种选项，特别是在高度管制的环境中，例如像在制药行业，提供具有功能性、均匀性和稳定性的药物是至关重要的。由于生物分子有各种各样的形状、结构和功能，因此不断需要通过降低剪切速率(即剪切发生的速率)来改善它们的稳定性。例如，试图减少剪切的一种方式是将生物分子冻干。然而，对冻干配制的需求可能会显著影响商业生产的灵活性，并从而可能导致更高的商品制造成本(COGM)。另一个选项是操纵生物分子本身，使它变得不那么容易剪切并且尤其是允许生物分子的液体配制。例如，与冻干相比，生物分子的液体配制消除了对易出错的冻干材料重构工艺的需求，从而提升了安全性和操作舒适度。特别地，剪切还发生在包含抗体衍生的结合结构域(例如像，scFv)的多肽或多肽构建体中。因此，不断需要降低相应生物分子的剪切速率。
本发明涉及包含第一靶抗原结合结构域的多肽或多肽构建体，其中所述第一靶抗原结合结构域包含通过肽接头连接的VH和VL可变区，其中该肽接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。所述肽接头取代连接所述VH和VL可变区的S(G4S)n或(G4S)n接头，其中所述取代优选为保守取代，即接头长度在取代的结合结构域和未修饰的结合结构域中保持相同。与没有取代，即具有S(G4S)n或(G4S)n接头的抗原结合结构域相比，所述取代降低了具有取代的所述抗原结合结构域的剪切速率。可以通过本领域熟知的方法(优选如下文和实例部分中描述的还原毛细管电泳(rCE-SDS))分析剪切速率，以评估低分子量(LMW)物质的量作为剪切速率的读数。
术语“多肽构建体”(在本文替代性地也称为“化合物”)是指抗原结合(或表位结合)分子，该分子包含本身包含互补位的结合结构域。在本发明的上下文中，将多肽构建体理解为有机聚合物，该有机聚合物包含至少一条连续的、无支链的氨基酸链，该氨基酸链非天然发生，而是经工程化所得。作为单一多肽的多肽构建体的示例以及优选的实施例是
Figure BDA0004188881320000021
分子，该分子包含核心结构，该核心结构在单一多肽链上包含至少一个功能性靶抗原结合结构域以及至少一个完整的功能性CD3结合结构域，其中这些结构域通过柔性肽(“接头”)直接连接，无任何进一步插入的不相似结构域，例如，在不同多肽链上包含靶结合物和CD3结合物的Xmab。在本发明的上下文中，同样设想包含多于一条氨基酸链的这种多肽构建体。优选的是将术语“多肽”与本发明化合物的单链形式结合使用，而优选地，“多肽构建体”可能更适合于还描述包含多于一条多肽链(例如两条、三条或四条多肽链)的多肽。然而，除非本文明确指定，否则这两个术语在本文中可互换使用。优选地，本发明的多肽或多肽构建体是单链多肽或多肽构建体。另外，术语“多肽构建体”也适合于描述包含一种或多种非基于氨基酸的成分的本发明化合物。多肽氨基酸链典型地包含至少50个氨基酸，优选地至少100、200、300、400或500个氨基酸。在本发明的上下文中还设想，聚合物的氨基酸链与不由氨基酸构成的实体连接。
多肽包含基于抗体的结构和/或功能(例如，全长免疫球蛋白分子的结构和/或功能)的结构和/或功能特征。因此，多肽构建体特异性地并优选地、选择性地或免疫特异性地与其靶标或抗原结合，更确切而言与所述靶标或靶抗原的表位结合，并且它包含天然发现于抗体中的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，或包含由此衍生的结构域。因此，可以将这些构建体替代性地视为包含互补位结构化的和结合表位的结构，如在天然抗体或其片段中发现的那些。根据本发明的多肽构建体包含抗体的允许免疫特异性靶标结合的最低结构要求，即，免疫特异性地或免疫选择性地识别靶抗原上的表位的互补位，除非另有指定。这种最低要求可以例如通过至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3，又称为CDR-L1、CDRL2、和CDR-L3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3，又称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)、优选全部六个CDR的存在来定义。因此，多肽构建体的特征可能在于在结合结构域中存在三个或优选地六个CDR，并且技术人员知道那些CDR在互补位结合结构内位于哪里(以什么顺序)。根据本发明，且关于多肽或多肽构建体的第一靶抗原结合结构域，所述互补位结合结构被指定为靶抗原结合结构域，该结合结构域的特征在于存在VH和VL区，因此，该VH和VL区包含CDR。因此，根据本发明的多肽/多肽构建体包含至少一个互补位结合结构，该互补位结合结构作为结合结构域选择性地、免疫特异性地和/或免疫选择性地结合到包含VH和VL可变区(具有CDR)的靶抗原。因此，根据本发明的多肽/多肽构建体包含选择性地、免疫特异性地和/或免疫选择性地结合到靶抗原的互补位。如本文所用，术语“抗原结合结构”是指包含抗原结合结构的任何多肽/多肽构建体或与指定靶抗原具有结合活性的任何分子。所述抗原结合结构或分子不限于衍生自活生物体的那些，并且例如，它们可以是从人工设计的序列中产生的多肽。它们也可以是天然发生的多肽、合成多肽、重组多肽等中的任一种。由于根据本发明的抗原结合结构与抗原的部分特异性结合，因此在本文中也可以将抗原(表位)结合结构广义地定义为“互补位结构”。因此，也可以将根据本发明的多肽/多肽构建体定义为如下结构域：该结构域包含互补位，该互补位优选免疫特异性地或免疫选择性地结合到靶抗原/靶表位；并且在某些实施例中，该结构域包含至少一个另外的互补位，该互补位优选免疫特异性地或免疫选择性地结合到另外的、不同的或相同的靶抗原/靶表位。因此，当本描述是指本发明的构建体或分子的结构域时，如本文所指定的，特别是根据所附权利要求中的任一项，该构建体包含与靶抗原(如，优选地，CD3和/或肿瘤抗原)结合的至少一个互补位结构(或互补位)。在某些实施例中，所述构建体包含与本文所定义的另外的靶抗原结合的至少一个另外的互补位/结合结构域。
如根据本发明使用的术语“抗体”包括全长抗体，还包括通过生物技术或蛋白质工程方法或工艺产生的骆驼抗体和其他免疫球蛋白。这些全长抗体可以是例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫化(deimmunized)抗体、人源化抗体和人抗体，以及来自其他物种(如小鼠、仓鼠、兔、大鼠、山羊或非人灵长类动物)的抗体。
本发明的“多肽/多肽构建体”包含将结合结构域的VH和VL区连接的接头，优选地结果是scFv，和/或在其他实施例中，包含含有互补位的至少一个另外的结合结构域，它们不是天然发生的，并且它们在功能上与天然发生的产物明显不同。因此，本发明的多肽或多肽构建体是人工“杂交”分子，该分子包含scFv和/或在一些实施例中具有不同特异性和/或选择性的不同的互补位/结合结构域。
如上文所述，本发明的多肽/多肽构建体可以包含多于一条多肽链，即包含两条或更多条多肽链的多肽也属于本发明的范畴，特别是形成允许与至少一个靶抗原免疫特异性结合的三维类蛋白结构的多肽。因此，术语“多肽构建体”的定义包括由仅一条多肽链组成的分子以及由两条、三条、四条、或更多条多肽链组成的分子，这些链可以是相同的(同源二聚体、同源三聚体或同源寡聚物)或不同的(异源二聚体、异源三聚体或异源寡聚物)。上述鉴定的抗体及其片段、变体、衍生物和由其衍生的构建体的示例尤其描述于Harlow和Lane,Antibodies:Alaboratory manual[抗体：实验室手册],CSHL Press[冷泉港实验室出版社](1988)；Kontermann和Dübel,Antibody Engineering[抗体工程],Springer[斯普林格出版社],第2版2010；以及Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy[用于免疫疗法的重组抗体],Cambridge University Press[剑桥大学出版社]2009。
本发明的“多肽/多肽构建体”还可以包含全长抗体的片段，如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、轻链(VL-CL)、Fd(VH-CH1)、重链、Fab、Fab’、F(ab')2或“rIgG”(由重链和轻链组成的“半抗体”)，然而显然并非所有的前述片段都适用于第一靶结合结构域，因为它被定义为包含通过肽接头连接的VH和VL区，但适用于关于该至少一个另外的结合结构域的实施例。根据本发明的多肽/多肽构建体还可以包含抗体的经修饰片段，也称为抗体变体或抗体衍生物。示例包括但不限于scFv、di-scFv或bi(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链(zipper)、scFab、Fab2、Fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tandab)、串联di-scFv、串联tri-scFv、，，微型抗体“，其由如下结构示例：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2、((scFv)2-CH3+CH3)、((scFv)2-CH3)或(scFv-CH3-scFv)2、多抗体(如三抗体或四抗体)和单结构域抗体(如纳米抗体或单可变结构域抗体)(仅包含一个可变区，其可以是VHH、VH或VL)，这些结构独立于其他可变区或结构域选择性地且优选地，特异性地与抗原或靶标结合，然而并非所有的前述片段都适用于第一靶抗原结合结构域，因为它被定义为包含VH和VL区，但适用于关于该至少一个另外的结合结构域的实施例。根据本发明的多肽/多肽构建体中包括的另外可能形式是交叉体(cross bodies)、最大体、杂Fc构建体、单Fc构建体和scFc构建体。那些形式的示例将在下文进行描述。
此外，术语“多肽构建体”的定义包括通过不同的结合结构域选择性地且优选地，特异性地结合两个、三个或更多个抗原结构(表位)的二价和多价/复价(polyvalent/multivalent)多肽/多肽构建体以及双特异性和多特异性/复特异性(polyspecific/multispecific)多肽/多肽构建体。多肽构建体可以具有比特异性更多的结合价，例如在其中两个结合结构域针对一个靶标(CD3ε)并且一个结合结构域针对另一个靶标(例如本文中下文描述的那些)或反之亦然的情况下，在这种情况下，多肽构建体是三价的和双特异性的。一般而言，术语“双特异性”包括多肽构建体与至少两种不同抗原(如，优选地CD3和另外的靶抗原，优选地肿瘤抗原，例如本文中下文所指定的那些)结合的含义。
术语“互补位”、“抗原结合结构域”、“表位结合结构域”、“结合结构域”或“与……结合的结构域”与本发明相关地表征构建体的结构域，该结构域选择性地且优选地，特异性地或免疫特异性地与靶标或靶抗原上的表位结合/相互作用/识别该表位。就关于本文所述的“构建体”而言，术语“结合结构域”或“与……结合的结构域”或“结构域”与本发明相关地表征构建体的结构域，该结构域免疫特异性地与靶标或靶抗原上的表位结合/相互作用/识别该表位。第一结合结构域(在多肽/多肽构建体包含另外的(因此第二、第三等)结合结构域的情况下称为第一结合结构域)的结构和功能，以及优选地还有任何另外的结合结构域(例如与靶抗原，如细胞表面抗原，优选地肿瘤抗原结合)的结构和/或功能基于抗体(例如全长免疫球蛋白多肽)的结构和/或功能。因此，“结合结构域”或“与……结合的结构域”可以包含允许免疫特异性靶标结合的抗体的最低结构要求。虽然第一结合结构域的结构要求被指定为包含每区具有相应的三个CDR的VH和VL区，但任何另外的结合结构域中的所述最低结构要求可以例如通过至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)、优选地全部六个CDR的存在来定义。“与……结合的结构域”(或“结合结构域”)典型地可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，它并非必须包含两者，但可以包含VH或VL中的仅一者，如果没有另外定义的话。例如，Fd片段通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。如本文所用，术语“互补位”、“抗原结合结构”和“表位结合结构”还指抗体(或根据本发明的分子)的部分，该部分包含与抗原或其一部分的全部或部分特异性结合且与其互补的区，即抗体仅能与抗原的特定部分结合。将该特定部分称为“表位”。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域提供。优选地，抗原结合结构域含有抗体可变区，该可变区包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。此类优选的抗原结合结构域包括例如“单链Fv(scFv)”、“单链抗体”、“Fv”、“单链Fv2(scFv2)”、“Fab”和“F(ab’)2”。根据本发明，第一结合结构域采用scFv的形式。
“与……结合的结构域”、“包含互补位的结构域”(或“结合结构域”、“抗原结合结构”、“表位结合结构”)的形式的示例包括(除非另外定义)但不限于全长抗体、全长抗体的片段(如VH、VHH、VL)、(s)dAb、Fv、轻链(VL-CL)、Fd(VH-CH1)、重链、Fab、Fab’、F(ab')2或“rIgG”(“半抗体”))、抗体变体或衍生物(如scFv、二-scFv或联(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链、scFab、Fab2、Fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tandab)、串联二-scFv、串联三-scFv、“微型抗体”(选自形式如(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2、((scFv)2-CH3+CH3))、((scFv)2-CH3)或(scFv-CH3-scFv)2、多抗体(如三抗体或四抗体)、以及单结构域抗体(如纳米抗体或单可变结构域抗体)(仅包含一个可变区，其可以是VHH、VH或VL)。在本文应当理解的是，将第一结合结构域定义为scFv，因此上述形式中的一些可以仅与本发明的多肽或多肽构建体中可能包含的该至少另外的结合结构域有关。“与……结合的结构域”(或“结合结构域”)的形式的另外的示例包括(1)包含VL、VH、CL和CH1的抗体片段或变体(如Fab)；(2)包含两个连接的Fab片段的抗体片段或变体(如F(ab')2)；(3)包含VH和CH1的抗体片段或变体(如Fd)；(4)包含VL和CL的抗体片段或变体(如轻链)；(5)包含VL和VH的抗体片段或变体(如Fv)；(5)具有VH结构域的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-546)；(6)包含重链和/或轻链的至少三个分离的CDR的抗体变体；和(7)单链Fv(scFv)。根据本发明的构建体或结合结构域的实施例的示例例如描述于以下中：WO 00/006605、WO 2005/040220、WO2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910和WO 2015/048272。在本发明的上下文中，互补位理解为作为如本文所述的多肽的一部分并且识别抗原并与其结合的抗原结合位点。互补位典型地是约至少5个氨基酸的小区域。如本文理解的互补位典型地包含抗体衍生的重链(VH)和轻链(VL)序列的部分。根据本发明的多肽的各个结合结构域提供了包含一组6个互补决定区(CDR环)(其中每三个分别包含在抗体衍生的VH和VL序列内)的互补位。
针对化合物，特别是针对本发明的构建体设想以下：a)构建体是单链多肽或单链多肽构建体，b)第一结合结构域呈scFv的形式，c)任何另外的结构域，如第二结合结构域和/或第三结构域呈scFv的形式，d)第一结构域和所述另外的结构域，如所述第二和/或第三结构域经由接头(优选地肽接头，如本文所定义的甘氨酸/谷氨酰胺接头)连接，和/或e)构建体包含提供延长的血清半衰期的结构域，如基于Fc的结构域或人血清白蛋白(HSA)。相应化合物的具体形式在下文进行描述。在后一种情况下，即关于HLE结构域(它的存在是优选的实施例)，术语“多肽构建体”表明它可包含多于单条肽链。使血清半衰期延长的优选的基于Fc的结构域(又称为“HLE”结构域)包含两个多肽单体(各自包含铰链、CH2结构域和CH3结构域)，其中所述两个多肽单体经由肽接头彼此融合；形式以N末端到C末端顺序是：铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。
本发明的构建体优选地是“体外产生的构建体”和/或“重组构建体”。在本发明的上下文中，术语“体外产生的”是指根据上述定义的构建体，其中结合结构域或可变区的全部或部分(例如，至少一个CDR)在非免疫细胞选择中(例如，在体外噬菌体展示中、在蛋白质芯片上或在其中可以测试候选氨基酸序列结合抗原的能力的任何其他方法中)产生。因此，这个术语优选地排除仅由动物免疫细胞中的基因组重排产生的序列。设想构建体的第一和/或第二结构域是通过噬菌体展示或文库筛选方法产生或可通过其获得的，而不是通过将来自预先存在的(单克隆)抗体的CDR序列移植到支架中产生或可通过其获得的。“重组构建体”是使用(尤其)重组DNA技术或基因工程产生或生产的构建体。
设想本发明的构建体是单克隆的。如本文所用，命名为“单克隆”(mAb)的多肽或构建体获得自基本上均质的抗体/构建体的群体，即除了能以少量存在的可能的天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，在群体中包含的各个抗体/构建体是相同的(具体地，关于它们的氨基酸序列)。与典型地包括针对不同决定簇(或表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体/构建体针对抗原内的单一表位具有高度特异性。除了它们的特异性之外，单克隆抗体还在它们通过杂交瘤培养物合成，因此不被其他免疫球蛋白污染方面是有优势的。修饰语“单克隆”指示获得自基本上均质的抗体群体的抗体/构建体的特征，并且不应理解为要求通过任何特定方法产生抗体。
对于单克隆抗体的制备，可以使用提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。例如，有待使用的单克隆抗体可以通过Koehler等人,Nature[自然],256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法，或可以通过重组DNA方法(参见，例如美国专利号4,816,567)制备。用于产生人单克隆抗体的另外技术的示例包括三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor,Immunology Today[今日免疫学]4(1983),72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法],Alan R.Liss,Inc.[Alan R.Liss公司](1985),77-96)。
然后可以使用标准方法(如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振(BIACORETM)分析筛选杂交瘤，以鉴定产生与指定抗原选择性地且优选地，特异性地或免疫特异性地结合的抗体的一种或多种杂交瘤。任何形式的相关抗原可用作免疫原，例如，重组抗原、天然发生的形式、其任何变体或片段及其抗原肽。如在BIAcoreTM系统中采用的表面等离子体共振可以用于增加与靶抗原的表位结合的噬菌体抗体/构建体的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas[人抗体杂交瘤]7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]183(1995),7-13)。
另一种制备构建体或结合结构域的示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体展示或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于例如以下中：Ladner等人,美国专利号5,223,409；Smith(1985)Science[科学]228:1315-1317、Clackson等人,Nature[自然],352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],222:581-597(1991)。
除了使用展示文库之外，还可以使用相关抗原来免疫非人动物，例如啮齿动物(如小鼠、仓鼠、兔或大鼠)。在一个实施例中，非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可能利用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段来对小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系进行工程化。使用杂交瘤技术，可以产生并选择衍生自具有所希望的特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如XenomouseTM；Green等人(1994)Nature Genetics[自然遗传学]7:13-21；US 2003-0070185；WO 96/34096和WO 96/33735。
单克隆抗体也可以获得自非人动物，然后使用本领域已知的重组DNA技术进行修饰，例如人源化、去免疫、呈现嵌合等。经修饰的构建体或结合结构域的示例包括非人抗体/构建体的人源化变体、“亲和力成熟”构建体或结合结构域(参见，例如Hawkins等人J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]254,889-896(1992)以及Lowman等人,Biochemistry[生物化学]30,10832-10837(1991))以及具有改变的一种或多种效应细胞功能的抗体变体或突变体(参见，例如美国专利5,648,260；Kontermann和Dübel(2010),上述引文；以及Little(2009),上述引文)。
在免疫学中，亲和力成熟是这样的过程：通过该过程，在免疫应答的过程中B细胞产生与抗原的亲和力增加的抗体。反复暴露于相同的抗原后，宿主将产生亲和力依次更大的抗体。与天然原型类似，体外亲和力成熟基于突变和选择的原理。体外亲和力成熟已成功用于优化抗体、抗体片段、抗体变体、构建体或结合结构域。使用辐射、化学诱变剂或易错PCR在CDR内引入随机突变。此外，遗传多样性可以通过链改组来增加。使用展示方法(如噬菌体展示)进行两轮或三轮突变和选择通常产生具有低纳摩尔范围内的亲和力的抗体、抗体片段、抗体变体、构建体或结合结构域。
本发明的构建体或结合结构域的氨基酸取代变化的优选类型涉及取代亲本抗体结构(例如人源化或人抗体结构)的高变区内的一个或多个残基。一般而言，选择用于进一步开发的一种或多种所得变体相对于产生它们的亲本抗体结构将具有改善的生物特性。用于产生此类取代变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，将高变区的几个位点(例如6-7个位点)突变以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合物。然后如本文所披露那样筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴定对抗原结合有显著贡献的候选高变区位点(用于修饰的候选者)，还可以进行丙氨酸扫描诱变。替代性地或另外地，分析在抗原与构建体或结合结构域之间的复合物的晶体结构以鉴定在结合结构域与其特异性抗原之间的接触点可能是有益的。根据本文阐述的技术，此类接触残基和相邻残基是用于取代的候选者。一旦产生了此类变体，就如本文所述对这组变体进行筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体、其抗原结合片段、构建体或结合结构域用于进一步的开发。
本发明的构建体和结合结构域具体地包括“嵌合”版本(其中重链和/或轻链的部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源)，以及此类抗体的片段或变体，只要它们表现出期望的生物活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合构建体或结合结构域包括“灵长类化”构建体，这些构建体包含衍生自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列、和人恒定区序列。已经描述了多种用于制备嵌合抗体或构建体的方法。参见，例如Morrison等人,Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.[美国国家科学院院刊]81:6851,1985；Takeda等人,Nature[自然]314:452,1985；Cabilly等人,美国专利号4,816,567；Boss等人,美国专利号4,816,397；Tanaguchi等人,EP 0171496；EP 0173494；和GB 2177096。
抗体、多肽构建体、抗体片段、抗体变体或结合结构域还可以通过使用例如在WO98/52976或WO 00/34317中所披露的方法将人T细胞表位特异性缺失(称为“去免疫”的方法)来进行修饰。简言之，可以针对与MHC II类结合的肽对抗体、构建体或结合结构域的重链和轻链可变区进行分析；这些肽代表潜在的T细胞表位(如例如在WO 98/52976和WO 00/34317中所定义的)。为了检测潜在T细胞表位，可以应用称为“肽穿线”的计算机建模方法，并且此外针对VH和VL序列中存在的基序，可以搜索人MHC II类结合肽的数据库，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序与18种主要的MHC II类DR同种异型中的任一种结合，并且因此构成潜在T细胞表位。检测到的潜在T细胞表位可以通过取代可变结构域或可变区中的少量氨基酸残基，或者优选地通过单个氨基酸取代来消除。典型地，进行保守取代。通常但不排他地，可以使用与人种系抗体序列中的位置共有的氨基酸。人种系序列披露于例如以下中：Tomlinson等人(1992)J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]227:776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today[今日免疫学]第16卷(5):237-242；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]14:14:4628-4638。V BASE目录(www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php)提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson,LA.等人汇编MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK[英国剑桥MRC蛋白质工程中心])。这些序列可用作例如框架区和CDR的人序列的来源。也可以使用共有的人框架区，例如如美国专利号6,300,064中所述。
“人源化”抗体、其变体或片段、构建体和结合结构域基于主要人序列的免疫球蛋白，这些主要人序列含有一种或多种衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体、其变体或片段、构建体和结合结构域基于人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自高变区或CDR的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所希望的特异性、亲和力、能力和/或生物活性的啮齿动物(例如，小鼠、仓鼠、大鼠、或兔))的高变区或CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，如本文所用，“人源化”抗体、其变体或片段、构建体和结合结构域还可以包含在受体抗体或供体抗体中均未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善和优化抗体性能。人源化抗体、其变体或片段、构建体和结合结构域还可以包含免疫球蛋白恒定区(如Fc)的至少部分，典型地人免疫球蛋白的恒定区的至少部分。对于更多的细节，参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学新见],2:593-596(1992)。
人源化抗体、其变体或片段、构建体和结合结构域可以通过用人(Fv)可变区的等效序列替代不直接参与抗原结合的(Fv)可变区的序列来产生。用于产生此类分子的示例性方法由以下提供：Morrison(1985)Science[科学]229:1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques[生物技术]4:214；以及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；以及US 6,407,213。这些方法包括分离、操纵和表达对来自重链或轻链中的至少一者的全部或部分免疫球蛋白(Fv)可变区进行编码的核酸序列。此类核酸可以获得自如上所述的产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤，以及其他来源。然后可以将编码人源化抗体、其变体或片段、构建体或结合结构域的重组DNA克隆到适当的表达载体中。
人源化抗体、其变体或片段、构建体和结合结构域还可以使用转基因动物(如表达人重链和轻链基因但不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的小鼠)来产生。Winter描述了可用于制备本文所述的人源化分子的示例性CDR移植方法(美国专利号5,225,539)。给定人序列的全部CDR可以用至少一部分非人CDR替代，或者仅一些CDR可以用非人CDR替代。仅需要替代用于将人源化分子与预定抗原结合所需的CDR数量。
可以通过引入保守取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变来优化人源化抗体、其变体或片段、构建体或结合结构域。此类改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的几种技术中的任何一种来制备(例如，Teng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊],80:7308-7312,1983；Kozbor等人,Immunology Today[今日免疫学],4:7279,1983；Olsson等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],92:3-16,1982，以及EP 239 400)。
人抗小鼠抗体(HAMA)应答已经导致该行业制备嵌合或其他人源化抗体/构建体。然而，据预期，特别是在抗体或构建体的长期或多剂量利用中，会观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)应答。因此，期望提供构建体，这些构建体包含针对靶标的人结合结构域以便消除HAMA或HACA应答的问题和/或效应。
因此，根据一个实施例，多肽构建体具有至少一个另外的结合结构域，所述一个或多个结合结构域是“人”的。术语“人抗体”、“人构建体”和“人结合结构域”分别包括具有抗体衍生区域的抗体、构建体和结合结构域，这些抗体衍生区域是如基本上与本领域中已知的人种系免疫球蛋白序列对应的可变和恒定区或结构域，包括例如由Kabat等人(1991)(上述引文)描述的那些。本发明的人构建体或结合结构域可以包含例如CDR中且特别是CDR3中不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人构建体或结合结构域可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个被不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替代的位置。如本文所用的人抗体、构建体和结合结构域的定义还涵盖仅包括非人工和/或遗传改变的人抗体序列(如可以通过使用技术或系统(如Xenomouse)衍生的那些)的完全人抗体、构建体和结合结构域。
包含至少一个人结合结构域的多肽/多肽构建体可以避免与具有非人(如啮齿动物(例如鼠、大鼠、仓鼠或兔))可变区和/或恒定区的抗体或构建体相关的一些问题。此类啮齿动物衍生的蛋白质的存在可以导致抗体或构建体的快速清除或可以导致患者产生针对抗体或构建体的免疫应答。为了避免使用啮齿动物衍生的构建体，可以通过将人抗体功能引入啮齿动物中以便使啮齿动物产生完全人抗体来产生人源化或完全人构建体。
在YAC中克隆和重组兆碱基大小的人基因座并将它们引入到小鼠种系中的能力为阐明非常大或粗略定位的基因座的功能组分以及产生有用的人疾病模型提供了强有力的方法。此外，使用这种技术将小鼠基因座取代为其人等效物，可以提供关于人基因产物在发育过程中的表达和调控、其与其他系统的通信以及其参与疾病诱导和进展的独特见解。
这种策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入到其中内源性Ig基因已经失活的小鼠中，提供了研究抗体的程序化表达和组装的根本机制以及其在B细胞发育中的作用的机会。此外，这种策略可以为完全人单克隆抗体(mAb)的产生提供理想来源-这是有助于实现抗体疗法在人疾病中的前景的重要里程碑。预期完全人抗体或由其衍生的构建体将小鼠或小鼠衍生的mAb所固有的免疫原性和变应性应答最小化，并且由此增加施用的抗体/构建体的功效和安全性。可以预期使用完全人抗体或构建体在治疗需要重复施用化合物的慢性和复发性人疾病(如炎症、自体免疫和癌症)中提供显著的优势。
实现这一目标的一种方法是用人Ig基因座的大片段对小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系进行工程化，预期此类小鼠在不存在小鼠抗体的情况下将产生大的人抗体组库。大的人Ig片段将保持大的可变基因多样性以及对抗体产生和表达的适当调控。通过利用小鼠机构实现抗体多样化和选择以及缺乏对人蛋白质的免疫耐受性，在这些小鼠品系中再生的人抗体组库应产生针对任何目的抗原(包括人抗原)的高亲和力抗体。使用杂交瘤技术，可以容易地产生和选择具有所希望特异性的抗原特异性人mAb。结合第一XenoMouse小鼠品系的产生证明了这个一般策略(参见Green等人Nature Genetics[自然遗传学]7:13-21(1994))。用酵母人工染色体(YAC)对XenoMouse品系进行工程化，这些酵母人工染色体分别含有人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构型片段，这些片段含有核心可变区和恒定区序列。证明含有人Ig的YAC与小鼠系统相容以重排和表达抗体，并且能够取代失活的小鼠Ig基因。这通过其诱导B细胞发育、产生完全人抗体的成人样人组库和产生抗原特异性人mAb的能力来证明。这些结果还表明，引入含有更多数量的V基因、另外的调控元件和人Ig恒定区的更大部分的人Ig基因座可以基本上再现作为对感染和免疫的人体液应答的特征的完整组库。Green等人的工作扩展到通过分别引入兆碱基大小的人重链基因座和κ轻链基因座的种系构型YAC片段来引入大于大约80％的人抗体组库。参见Mendez等人Nature Genetics[自然遗传学]15:146-156(1997)和美国专利申请序列号08/759,620。
XenoMouse模型的产生进一步论述和描述于以下中：美国专利申请序列号07/466,008、序列号07/610,515、序列号07/919,297、序列号07/922,649、序列号08/031,801、序列号08/112,848、序列号08/234,145、序列号08/376,279、序列号08/430,938、序列号08/464,584、序列号08/464,582、序列号08/463,191、序列号08/462,837、序列号08/486,853、序列号08/486,857、序列号08/486,859、序列号08/462,513、序列号08/724,752、序列号08/759,620；和美国专利号6,162,963；6,150,584；6,114,598；6,075,181和5,939,598以及日本专利号3 068 180B2、3 068 506B2、和3 068507B2。还参见Mendez等人Nature Genetics[自然遗传学]15:146-156(1997)以及Green和Jakobovits J.Exp.Med.[实验医学杂志]188:483-495(1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和WO03/47336。
在替代性的方法中，包括真药物国际公司(GenPharm International,Inc.)的其他公司利用了“微基因座”方法。在微基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的碎片(单独的基因)来模拟外源性Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、mu恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)形成为用于插入到动物中的构建体。此方法描述于以下中：Surani等人的美国专利号5,545,807和美国专利号5,545,806；5,625,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；5,770,429；5,789,650；5,814,318；5,877,397；5,874,299；和6,255,458(各自为Lonberg和Kay)、Krimpenfort和Berns的美国专利号5,591,669和6,023.010、Berns等人的美国专利号5,612,205；5,721,367和5,789,215、以及Choi和Dunn的美国专利号5,643,763、以及真药物(GenPharm)国际美国专利申请序列号07/574,748、序列号07/575,962、序列号07/810,279、序列号07/853,408、序列号07/904,068、序列号07/990,860、序列号08/053,131、序列号08/096,762、序列号08/155,301、序列号08/161,739、序列号08/165,699、序列号08/209,741。还参见EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美国专利号5,981,175。进一步参见Taylor等人(1992)，Chen等人(1993)，Tuaillon等人(1993)，Choi等人(1993)，Lonberg等人(1994)，Taylor等人(1994)，以及Tuaillon等人(1995)，Fishwild等人(1996)。
Kirin也展示了从通过微细胞融合引入大段染色体或整个染色体的小鼠产生人抗体。参见欧洲专利申请号773 288和843 961。Xenerex Biosciences正在开发用于人抗体的潜在产生的技术。在这种技术中，用人淋巴细胞(例如B和/或T细胞)重构SCID小鼠。然后将小鼠用抗原免疫并且可产生针对抗原的免疫应答。参见美国专利号5,476,996；5,698,767；和5,958,765。
在一些实施例中，本发明的构建体是“分离的”或“基本上纯的”构建体。当用于描述本文所披露的构建体时，“分离的”或“基本上纯的”意味着构建体已经从其产生环境的组分鉴定、分离和/或回收。优选地，构建体不与或基本上不与来自其产生环境的所有其他组分缔合。其产生环境的污染组分，如由重组转染细胞产生的污染组分，是可能干扰构建体的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质化合物。应当理解，根据情况，分离的或基本上纯的构建体可以构成给定样品中总蛋白质/多肽含量的以重量计从5％至99.9％。使用诱导型启动子或高表达启动子，能以显著更高的浓度产生所期望的构建体。该定义包括在本领域已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生构建体。在某些实施例中，将构建体(1)通过使用旋杯式序列分析仪纯化至足以获得至少15个N末端或内部氨基酸序列的残基的程度，或(2)通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染色纯化至均质。然而，通常将通过至少一个纯化步骤来制备分离的构建体。
根据一个实施例，整个构建体和/或结合结构域呈一种或多种多肽的形式或呈蛋白质的形式。除了蛋白质部分以外，此类多肽或蛋白质可以包括非蛋白质部分(例如化学接头或化学交联剂如戊二醛)。
肽是通过共价肽(酰胺)键连接的氨基酸单体的短链。因此，肽属于生物寡聚物和聚合物的广泛化学类别。作为肽或多肽链的一部分的氨基酸被称为“残基”并且可以被连续编号。除环肽外的所有肽在肽的一端具有N-末端残基，并且在另一端具有C-末端残基。寡肽仅由少数氨基酸(通常在两个至二十个之间)组成。多肽是更长、连续且无支链的肽链。基于大小，肽与蛋白质不同；并且作为任意基准，肽可以理解为含有大约50个或更少的氨基酸。蛋白质由一种或多种多肽组成，通常以生物功能方式排列。虽然应用于肽与多肽和蛋白质的实验室技术的各方面不同(例如，电泳、色谱等的特性)，但是区分肽与多肽和蛋白质的大小边界不是绝对的。因此，在本发明的上下文中，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且术语“多肽”通常是优选的。
多肽可以进一步形成多聚体(如二聚体、三聚体和更高级的寡聚物)，这些多聚体由多于一个多肽分子组成，如上文所提及的。形成此类二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此，此类多聚体的相应高阶结构被称为同源或异源二聚体、同源或异源三聚体等。异源多聚体的示例是抗体或免疫球蛋白分子，其天然发生的形式由两条相同的轻多肽链和两条相同的重多肽链组成。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”还指天然修饰的肽/多肽/蛋白质，其中修饰例如通过翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)来实现。当在本文中提及时，“肽”、“多肽”或“蛋白质”也可以是化学修饰的，如聚乙二醇化的。此类修饰在本领域中是熟知的并且在下文进行描述。
术语“选择性地”和“优选地，选择性地”、“与……(特异性地或免疫特异性地)结合”、“(特异性地或免疫特异性地)识别”、或“与……(特异性地或免疫特异性地)反应”根据本发明意指构建体或结合结构域与靶分子(抗原)(例如：CD3)上的给定表位选择性地相互作用或(免疫)特异性地相互作用。这种选择性的相互作用或缔合在特定靶(例如：CD3ε)上的表位中比在替代性物质(非靶分子，例如，此处的CD3γ等)中更频繁、更快速地发生，具有更长的持续时间、具有更大的亲和力、或者具有这些参数的一些组合。但是，由于不同物种中同源蛋白质之间的序列相似性，与其靶标(如人靶标)选择性地和/或免疫特异性地结合的构建体或结合结构域可以与来自不同物种(如，来自非人灵长类动物)的同源靶分子交叉反应。因此，术语“与……选择性地结合”、“特异性/免疫特异性结合”等可以包括构建体或结合结构域与多于一个物种中的表位或结构相关表位的结合。在本发明的上下文中，本发明的多肽以特定的方式与其对应的靶结构结合。优选地，根据本发明的多肽的每个结合结构域包含一个互补位，该结合结构域“特异性地或免疫特异性地”结合其对应的靶结构、“(特异性地或免疫特异性地)识别”其对应的靶结构、或与其对应的靶结构“(特异性地或免疫特异性地)反应”。这意味着根据本发明，多肽或其结合结构域与靶分子(抗原)(例如，CD3ε)上的给定表位相互作用或(免疫)特异性地相互作用，并且在某些实施例中与至少一个另外的靶分子(如第二和/或第三靶分子)上的给定表位相互作用或(免疫)特异性地相互作用。这种相互作用或缔合在特定靶上的表位中比在替代性物质(非靶分子)中更频繁、更快速地发生，具有更长的持续时间、具有更大的亲和力、或者具有这些参数的一些组合。但是，由于不同物种中同源蛋白质之间的序列相似性，与其靶标(如人靶标)免疫特异性地结合的抗体构建体或结合结构域可以与来自不同物种(如，来自非人灵长类动物)的同源靶分子交叉反应。因此，术语“特异性/免疫特异性结合”可以包括抗体构建体或结合结构域与多于一种物种中的表位和/或结构相关表位的结合。术语“(免疫)选择性地结合”不包括与一个物种内的结构相关表位的结合。
在本发明的上下文中，术语“表位”是指由结合结构(即互补位)选择性地识别/免疫特异性地识别的抗原的部分或区域。“表位”是抗原性的，并且因此术语表位有时也称为“抗原结构”或“抗原决定簇”。与表位结合的结合结构域部分被称为互补位。认为特异性结合是通过结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特定基序实现的。因此，由于它们的一级、二级和/或三级结构以及所述结构的潜在二次修饰的结果，结合得以实现。互补位与其抗原决定簇的特异性相互作用可以导致所述位点与抗原的简单结合。在一些情况下，特异性相互作用可以替代性地或另外地导致信号的引发，例如由于诱导抗原构象的变化、抗原的寡聚化等。
基于蛋白抗原的表位的结构和与互补位的相互作用，蛋白抗原的表位分为两类(构象表位和线性表位)。构象表位由抗原氨基酸序列的不连续部分构成。这些表位基于抗原的三维表面特征和形状或三级结构(折叠)与互补位相互作用。确定表位构象的方法包括但不限于x射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)光谱学和定点自旋标记和电子顺磁共振(EPR)光谱学。相反，线性表位基于其一级结构与互补位相互作用。线性表位由来自抗原的连续氨基酸序列形成，并且典型地在独特的序列中包含至少3个或至少4个、且更通常地至少5个或至少6个或至少7个，例如约8个至约10个氨基酸。
以下描述了用于给定人靶蛋白的表位作图的方法：所述给定人靶蛋白内的预定义区域(连续氨基酸延伸)与靶蛋白旁系同源物(只要结合结构域不与所使用的旁系同源物发生交叉反应即可)的相应区域交换/被其替代。这些人靶/旁系同源嵌合体在宿主细胞(如CHO细胞)的表面上表达。可以经由FACS分析对抗体或构建体的结合进行测试。当完全消除抗体或构建体与嵌合分子的结合时，或当观察到显著的结合降低时，可以得出结论，从此嵌合分子中去除的人靶标的区域与免疫特异性表位-互补位识别相关。与人(野生型)靶标的结合相比，所述结合降低优选地为至少10％、20％、30％、40％、或50％；更优选地为至少60％、70％、或80％；并且最优选地为90％、95％或甚至100％，由此将与人靶标的结合设定为100％。替代性地，可通过将一个或多个点突变引入人靶标的序列来修饰上文所述表位作图分析。这些点突变可以例如反映人靶标与其旁系同源物之间的差异。
确定靶抗原的特定残基对构建体或结合结构域的识别的贡献的另一种方法是丙氨酸扫描(参见，例如Morrison KL和Weiss GA.Curr Opin Chem Biol.[化学生物学新见]2001年6月；5(3):302-7)，其中有待分析的每个残基例如经由定点诱变被丙氨酸替代。丙氨酸的使用是因为其具有非巨大的、化学惰性的甲基官能团，但仍然模拟许多其他氨基酸所具有的二级结构参考。在需要保守突变残基的大小的情形下，有时可以使用巨大的氨基酸(如缬氨酸或亮氨酸)。
结合结构域与靶抗原的表位之间的相互作用意味着结合结构域对表位/靶抗原表现出相当可观或显著的亲和力，并且通常对除靶抗原以外的蛋白质或抗原不表现出显著的亲和力——尽管上文论述过与例如来自其他物种的同源靶标的交叉反应。“显著的亲和力”包括以≤10-6M的亲和力(解离常数，KD)结合。优选地，当结合亲和力为≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、或甚至≤10-11M、或≤10-12M时，结合被认为是特异性的。例如通过比较所述结合结构域对其期望的靶蛋白质或抗原的亲和力与所述结合结构域对非靶蛋白质或抗原的亲和力，可以容易地测试结合结构域是否与靶标(免疫)特异性地反应或结合。优选地，本发明的构建体不与除靶抗原以外的蛋白质或抗原显著结合——除非针对另外的靶标的任何一种或多种另外的结合结构域被刻意引入本发明的构建体中，在这种情况下，本发明还提供该结合结构域与其特异性靶标的结合。
设想第一结构域的亲和力为≤100nM、≤90nM、≤80nM、≤70nM、≤60nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、或≤20nM。优选地在基于细胞的测定(如斯卡查德(Scatchard)测定)中测量这些值。确定亲和力的其他方法也是熟知的。优选地在表面等离子体共振测定(如Biacore测定)中测量这些值。
术语“不显著结合”和“不选择性地结合”意指当所述蛋白质或抗原在细胞表面上表达时，本发明的构建体或结合结构域不与除所述靶抗原以外的蛋白质或抗原结合。因此，构建体显示出与除所述靶抗原以外的蛋白质或抗原(当所述蛋白质或抗原在细胞表面上表达时)≤30％、优选地≤20％、更优选地≤10％、特别优选地≤9％、≤8％、≤7％、≤6％、≤5％、≤4％、≤3％、≤2％或≤1％的反应性，由此，分别与所述靶抗原的结合被设定为100％。“反应性”可以例如以亲和力值表示(参见上文)。
设想本发明的构建体(并且更具体地包含与所述第一靶抗原结合的互补位/结合结构域的结构域)不与靶抗原旁系同源物结合或不与其显著地结合。还设想构建体不与靶细胞表面上的(人或猕猴/食蟹猴)靶抗原旁系同源物结合或不与其显著地结合。
肽接头是S(G4X)n和(G4X)n，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。优选地，X选自具有极性不带电的侧链的氨基酸(即Q、T、N)和具有疏水侧链的氨基酸(即A、V、I、L、和M)。在另一个优选实施例中，X选自Q、T和N。整数n优选地选自1至18、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至3、1至2范围内的任何整数，如整数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、和18，优选地整数1、3和6。相应的接头序列在SEQ ID NO:2至77中定义。优选的接头有SEQ ID NO:15、34、53、和72，如下文还概述的。
观察到在scFv背景下作为本领域中标准肽接头(即连接VH和VL区)使用的(G4S)n或S(G4S)n接头(其中n具有如上文所叙述的相同定义)易于剪切并因此会损害这些分子或包含相应scFv的分子的稳定性。用如本文所定义的接头(优选地S(G4Q)n或(G4Q)n接头)取代所述G4S接头(即，一个或多个所述(G4S)n或S(G4S)n接头)会使剪切速率降低(参见实例部分，例如，实例2，图5，表1)。在包含通过接头连接的多于一个VH和VL区的较大分子中，还有其他接头(例如像将结合结构域连接的那些)，例如在双抗体或(scFv)2中，如
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分子，可以被交换并促使剪切速率进一步降低，如实例部分所示。更具体地，/>
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分子的分子评估数据已经显示，在40℃下孵育四周后(模拟4℃下两年的液体储存)，针对两种示例性
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分子，通过还原毛细管电泳(rCE-SDS)测量的低分子量(LMW)种类的百分比(作为用于评估剪切速率的优选手段)范围为16.6％至24.1％。取决于所得LMW片段，BiTE分子的药代动力学，如在体内观察到的半衰期或BiTE分子的功效和安全性，可能会受到影响，降低了对患者的效用。为了更好地理解影响观察到的剪切水平的因素，利用以下修饰产生了示例性BiTE分子(分别靶向PSMA和CD33)：G4Q接头(相比于标准BiTE HLE分子中的G4S接头)、稳定的CD3结合结构域(相比于标准CD3结合结构域)、在CD3结合结构域内引入工程化的Cys钳(相比于无Cys钳)、以及/或者去除某些单链Fc(scFc)D-P和铰链位点(相比于标准scFc)。对所有变体的体外活性进行了测试，并与参考对照进行了比较，以确定序列变体对效力的影响。另外，将BiTE分子变体在40℃下孵育四周，并用rCE-SDS监测LMW种类的总百分比。使用肽作图对位点特异性剪切进行了监测。可以看出，引入的修饰显著降低了整体剪切(引入G4Q接头使LMW的百分比降低了7.1％)。这些修饰的组合表明，热降解后的BiTE分子的整体剪切可以被显著降低。另外，稳定的CD3结合结构域、G4Q接头的插入和CD3 Cys钳修饰都有助于减少接头结构域中的剪切。因此，可以证明，如本文所定义的接头以及进一步的修饰减少了由于剪切导致的LMW的出现，即降低了剪切速率。因此，由于降低了剪切速率，本发明的多肽或多肽构建体的液体配制是有效的选项。
在下文，将进一步概述哪些接头应该具有如本文所定义的接头的形式，以通过降低剪切速率改善给定多肽或多肽的稳定性，不仅包括scFv结合结构域，还包括可作为本发明多肽或多肽构建体的部分的延长半衰期的结构域。因此，并且换言之，本发明涉及包含第一靶抗原结合结构域的单链多肽或多肽构建体，其中所述第一靶抗原结合结构域包含通过肽接头连接的VH和VL可变区，其中该肽接头包含S(G4X)n和(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数，并且其中所述接头替代S(G4S)n和(G4S)n接头。
在本发明的多肽或多肽构建体的优选实施例中，整数n是1、2、3、4、5或6。整数n优选地是2、3、4、5或6，或者更优选是1、3或6。
根据本发明，S(G4X)n或(G4X)n中的X优选地是Q。因此，肽接头是S(G4Q)n或(G4Q)n。贯穿如本文所述的本发明，氨基酸Q是针对X的优选氨基酸。例如，接头可以是S(G4Q)、S(G4Q)3、S(G4Q)6或(G4Q)、(G4Q)3或(G4Q)6。
在优选实施例中，本发明的多肽或多肽构建体的肽接头是S(G4X)n或(G4X)n，n是3，并且X是Q。因此，肽接头具有(G4Q)3(SEQ ID NO:15)或S(G4Q)3的形式。
根据本发明，本发明的多肽或多肽构建体可以包含与靶抗原结合的至少一个另外的结合结构域。如上文所概述的，本发明的多肽或多肽构建体可以包含至少一个另外的靶抗原结合结构域并且其因此是至少双特异性分子。根据一个实施例，本发明的多肽构建体是“单链构建体”或“单链多肽”。在另外的结合结构域的情况下，还设想第一结合结构域或另外的(又称为“第二”)结合结构域或两个结合结构域可以呈“单链Fv”(scFv)的形式。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但使用重组方法可以将这两个结构域通过人工接头接合，如上文所述，该人工接头使它们能够制成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子；参见例如，Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且按照与全长抗体或IgG相同的方式评价片段的功能。因此，单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，通常并且根据本发明用短接头肽连接。为了灵活性，接头通常富含甘氨酸，以及为了溶解性通常富含丝氨酸或还有苏氨酸，并且可以连接VH的N末端和VL的C末端，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白质保留了原始免疫球蛋白的特异性。
双特异性单链分子在本领域中是已知的并描述于以下中：WO 99/54440；Mack,J.Immunol.[免疫学杂志](1997),158,3965-3970；Mack,PNAS[美国国家科学院院刊],(1995),92,7021-7025；Kufer,Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学免疫治疗],(1997),45,193-197；
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Blood[血液],(2000),95,6,2098-2103；/>
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Immunol.[免疫学],(2001),166,2420-2426；Kipriyanov,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],(1999),293,41-56。描述的用于产生单链构建体的技术(尤其参见美国专利4,946,778；Kontermann和
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(2010),上述引文，以及Little(2009),上述引文)可以适用于产生选择性地并且优选地，特异性地识别一种或多种所选择的靶标的单链构建体。
二价(bivalent)(也称为双价(divalent))或双特异性单链可变片段(具有形式(scFv)2的二-scFv或双-scFv)可以通过连接两个scFv分子(利用如本文所述的接头)来工程化。连接可以通过产生具有两个VH区和两个VL区的单一多肽链从而产生串联scFv来进行(参见，例如Kufer P.等人,(2004)Trends in Biotechnology[生物技术趋势]22(5):238-244)。另一种可能性是产生具有接头肽的scFv分子，这些接头肽对于两个可变区来说太短以致于不能折叠在一起(例如约五个氨基酸；少于12个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。在这种情况下，结合结构域(与第一靶抗原或另外的靶抗原结合)的VH和VL不经由肽接头直接连接。因此，第一靶抗原结合结构域的VH可以例如经由如本文所定义的肽接头与另外的靶抗原结合结构域的VL融合，并且另外的靶抗原结合结构域的VH经由这种肽接头与第一结合结构域的VL融合。这种类型被称为双抗体(参见，例如Hollinger,Philipp等人,(1993年7月)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica[美国国家科学院院刊]90(14):6444-8)。在本文应理解的是，在这种场景下，主要实施例的第一靶抗原结合结构域仅包含针对所述第一靶抗原的结合结构域(例如VH区)的一半，而所述结合结构域的其余部分包含针对第二靶抗原的结合结构域(例如VL区)的一半，这符合本发明涉及包含至少两个结合结构域的多肽或多肽构建体，其中所述结合结构域如本文所定义，即具有VH和VL区，并且包含如本文所定义的将VH和VL区连接的至少一个肽接头，即该肽接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。
根据本发明，该至少一个另外的靶抗原结合结构域包含与第一靶抗原结合结构域相同的组分。根据该实施例，多肽或多肽构建体包含两个结合结构域，这两个结合结构域各自具有VH/VL-肽接头-VH/VL的形式。如上文所概述的，相应的多肽或多肽构建体包含例如双抗体和(scFv)2分子。在本文应理解的是，名称VH/VL-肽接头-VH/VL意味着两种构型均被涵盖。即，以氨基至羧基顺序，形式VH-肽接头-VL、和VL-肽接头-VH为本发明所涵盖。
根据本发明，每个靶抗原结合结构域与一个靶抗原结合。在该实施例中，每个结合结构域包含允许与仅一个靶抗原结合的所有组分，因此，每个结合结构域包含VH和VL区。换言之，一个靶抗原结合结构域的VH和VL可变区与靶标结合，而所述至少一个另外的靶抗原结合结构域的VH和VL可变区与靶标结合。因此，该实施例不延伸至双特异性双抗体，其中两个scFv二聚化以形成由两个多肽链(如主要实施例中所定义的)的所述二聚化产生的两个结合结构域。相反，优选的是，本发明的多肽或多肽构建体是(scFv)2。以下实施例涉及根据本发明的基于scFv的多肽或多肽构建体的不同形式。在所有这些实施例中并且根据本发明，至少一个结合结构域的特征在于存在如本文所定义的接头，即包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成的所述肽接头，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数，并且其优选实施例如上文所阐述。同样如上文所阐述的，所述S(G4X)n或(G4X)n取代下文描述的所述不同形式的基于scFv的多肽或多肽构建体中的S(G4S)n或(G4S)n。此外，优选的是本发明的多肽或多肽构建体中包含的多于两个、三个，或更优选所有的结合结构域包含所述接头。如上文所概述的，与具有目前工艺水平的丝氨酸/甘氨酸接头的相应(即，相同)多肽或多肽构建体相比，本发明的相应多肽或多肽构建体表现出降低的剪切速率。
在优选实施例中，本发明的多肽或多肽构建体包含：结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)。该实施例涉及包含两个结合结构域的单链多肽，其中一个或两个肽接头如上文所定义，即所述肽接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。如上文所概述的，优选地，肽接头是(G4Q)3，优选地结合结构域内的两个肽接头均是(G4Q)3。换言之，结合结构域1和/或结合结构域2包含通过肽接头连接的VH和VL可变区，其中该肽接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数，即如上文所定义的结合结构域。如本文所理解的，括号中的特征，即(VH/VL肽接头-VH/VL)定义了一个或多个结合结构域的结构。
优选地，第一结合结构域还有所述至少一个另外的结合结构域与细胞表面抗原(作为靶抗原)结合。如本文所用，术语“细胞表面抗原”指在细胞表面上显示的分子。在大多数情况下，该分子将位于细胞的质膜中或细胞的质膜上，使得该分子的至少部分仍可从细胞外以三级形式可及。位于质膜中的细胞表面分子的非限制性示例是跨膜蛋白，该跨膜蛋白呈三级构象时包含亲水区和疏水区。此处，至少一个疏水区允许细胞表面分子被嵌入或插入到细胞的疏水质膜中，而亲水区则分别在质膜的两侧延伸到细胞质和细胞外空间中。位于质膜上的细胞表面分子的非限制性示例是已经在半胱氨酸残基处被修饰以带有棕榈酰基团的蛋白质、在C末端半胱氨酸残基处被修饰以带有法呢基基团的蛋白质、或已经在C末端处被修饰以带有糖基磷脂酰肌醇(“GPI”)锚的蛋白质。
根据包含本文所述的互补位的结合结构域的一个实施例，VH区位于接头的N末端，并且VL区位于接头的C末端。换言之，在包含本文所述的互补位的结合结构域的一个实施例中，scFv从N末端至C末端包含：VH-接头-VL。根据本发明，包含本文所述的构建体的互补位的结合结构域经由根据本发明的如本文所定义的肽接头连接。构建体可以例如包含以一个结合结构域-接头-另外的结合结构域的顺序(从N末端至C末端)的结构域。逆序(另外的结合结构域-接头-第一结合结构域)也是可能的。
根据本发明，所述多肽或多肽或多肽构建体包含：结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-结合结构域3(VH/VL-肽接头-VH/VL)。
在本发明的多肽或多肽构建体的优选实施例中，C末端结合结构域与CD3结合，并且其中所述剩余的一个或多个N末端结合结构域与细胞表面抗原结合。优选地，本发明的多肽或多肽构建体是T细胞衔接器。因此，优选的是本发明的多肽或多肽构建体包含如下文所定义的至少CD3结合结构域和细胞表面抗原(其优选地为肿瘤抗原)结合结构域。因此，根据本发明，所述多肽或多肽或多肽构建体包含(优选地以氨基至羧基顺序)：结合结构域1(肿瘤抗原结合结构域：VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(CD3结合结构域：VH/VL-肽接头-VH/VL)，其中结合结构域1与细胞表面抗原(优选地肿瘤抗原)结合，并且结合结构域2与CD3(优选地人CD3，更优选人CD3ε)结合；或结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-结合结构域3(CD3结合结构域：VH/VL-肽接头-VH/VL)；其中结合结构域1和2与相同或不同的细胞表面抗原(优选地相同或不同的肿瘤抗原)结合，并且结合结构域3与CD3(优选地人CD3，更优选人CD3ε)结合。优选地，结合结构域2经由如本文所定义的接头连接到结合结构域3，其形式为：结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域3(VH/VL-肽接头-VH/VL)。
如上文所阐述的，本发明的多肽构建体优选地包含与T细胞表面上的CD3结合的结合结构域。“CD3”(分化簇3)是由四条链构成的T细胞共受体。在哺乳动物中，CD3蛋白质复合物含有CD3γ(伽马)链、CD3δ(德尔塔)链和两条CD3ε(伊普西龙)链。这四条链与T细胞受体(TCR)和所谓的ζ(截塔)链缔合以形成“T细胞受体复合物”并在T淋巴细胞中产生激活信号。CD3γ(伽马)、CD3δ(德尔塔)和CD3ε(伊普西龙)链是免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白，并且各自含有单一细胞外免疫球蛋白结构域。CD3分子的细胞内尾含有对于TCR的信号传导能力所必需的单一保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。CD3ε分子是多肽，该多肽在人中由位于染色体11上的CD3ε基因编码。在本发明的上下文中，将CD3理解为蛋白质复合物和T细胞共受体，该T细胞共受体参与激活细胞毒性T细胞(CD8+初始T细胞)和T辅助细胞(CD4+初始T细胞)。它典型地由四条不同的链构成。特别是在哺乳动物中，复合物含有CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与T细胞受体(TCR)和ζ链缔合以在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR、ζ链和CD3分子一起构成TCR复合物。
通过与T细胞上的CD3和与靶细胞上的靶蛋白结合的构建体募集T细胞来将靶细胞重定向裂解通常涉及溶细胞突触形成以及穿孔素和颗粒酶的递送。接合的T细胞能够进行连续靶细胞裂解，并且不受干扰肽抗原加工和呈递或克隆T细胞分化的免疫逃逸机制的影响；参见例如WO 2007/042261。
能以多种方式测量由给定肿瘤抗原xCD3构建体介导的细胞毒性。“半数最大有效浓度”(EC50)通常用作生物活性分子(如本发明的构建体)的效力的量度。它能以摩尔单位表示。在测量细胞毒性的当前情况下，EC50值是指在基线和最大值之间的中途诱导细胞毒性反应(靶细胞裂解)的构建体的浓度。细胞毒性测定中的效应细胞可以例如是刺激的富集的(人)CD8阳性T细胞或未刺激的(人)外周血单核细胞(PBMC)。与未刺激的PBMC相比，当将刺激的/富集的CD8+T细胞用作效应细胞时，典型地可以预期EC50值较低。如果靶细胞是猕猴来源的或者表达给定猕猴肿瘤抗原或经给定猕猴肿瘤抗原转染，则效应细胞应该也是猕猴来源的，如猕猴T细胞系，例如4119LnPx。靶细胞应对细胞表面上的所述肿瘤抗原进行表达。靶细胞可以是用所述肿瘤抗原稳定或瞬时转染的细胞系(如CHO)。替代性地，靶细胞可以是肿瘤抗原阳性天然表达细胞系，如人癌细胞系。通常，与具有较低靶标表达率的靶细胞相比，当使用在细胞表面上表达较高水平的所述肿瘤抗原的靶细胞时，预期EC50值较低。
在细胞毒性测定中效应细胞与靶细胞(E:T)比率通常为约10:1，但也可以改变。肿瘤抗原xCD3构建体的细胞毒活性可以在51-铬释放测定(例如，具有约18小时的孵育时间)中或在基于FACS的细胞毒性测定(例如，具有约48小时的孵育时间)中测量。还设想了孵育时间(细胞毒性反应)的修饰。其他测量细胞毒性的方法是熟知的，并且包括MTT或MTS测定、基于ATP的测定(包括生物发光测定)、磺基罗丹明B(SRB)测定、WST测定、克隆生成测定和ECIS技术。
根据一个实施例，在基于细胞的细胞毒性测定中对由本发明的肿瘤抗原xCD3构建体介导的细胞毒活性进行测量。它也可以在51-铬释放测定中进行测量。设想本发明的构建体的EC50值为≤300pM、≤280pM、≤260pM、≤250pM、≤240pM、≤220pM、≤200pM、≤180pM、≤160pM、≤150pM、≤140pM、≤120pM、≤100pM、≤90pM、≤80pM、≤70pM、≤60pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤15pM、≤10pM或≤5pM。
可以在不同的测定中和在不同条件下测量上述给定的EC50值。例如，当将人PBMC用作效应细胞并且将肿瘤抗原转染细胞(如CHO细胞)用作靶细胞时，设想肿瘤抗原xCD3构建体的EC50值为≤500pM、≤400pM、≤300pM、≤280pM、≤260pM、≤250pM、≤240pM、≤220pM、≤200pM、≤180pM、≤160pM、≤150pM、≤140pM、≤120pM、≤100pM、≤90pM、≤80pM、≤70pM、≤60pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤15pM、≤10pM或≤5pM。当将人PBMC用作效应细胞并且当靶细胞是CLDN6阳性细胞系时，例如，可以设想CLDN6xCD3构建体的EC50值为≤300pM、≤280pM、≤260pM、≤250pM、≤240pM、≤220pM、≤200pM、≤180pM、≤160pM、≤150pM、≤140pM、≤120pM、≤100pM、≤90pM、≤80pM、≤70pM、≤60pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤15pM、≤10pM或≤5pM。
根据一个实施例，本发明的抗原xCD3多肽/多肽构建体不诱导/不介导不在其表面上表达所述给定肿瘤抗原的细胞(肿瘤抗原阴性细胞)如CHO细胞的裂解或基本上不诱导/不介导这些细胞的裂解。术语“不诱导裂解”、“基本上不诱导裂解”、“不介导裂解”或“基本不介导裂解”意指本发明的构建体不诱导或不介导超过30％、优选不超过20％、更优选不超过10％、特别优选不超过9％、8％、7％、6％或5％的肿瘤抗原阴性细胞的裂解，由此表达肿瘤抗原的靶细胞(如用所述肿瘤抗原转化或转染的细胞或天然表达细胞系如人癌细胞系)的裂解被设定为100％。这通常适用于浓度高达500nM的构建体。细胞裂解测量是常规技术。此外，本说明书教导了如何测量细胞裂解的具体说明。
单个的肿瘤抗原xCD3多肽/多肽构建体的单体与二聚体同种型之间的细胞毒活性的差异被称为“效力差距”。该效力差距可以例如计算为分子的单体与二聚体形式的EC50值之间的比率。在确定该差距的一种方法中，如下文所述的用纯化的构建体单体和二聚体进行了18小时51-铬释放测定或48h基于FACS的细胞毒性测定。效应细胞是刺激的富集的人CD8+T细胞或未刺激的人PBMC。靶细胞是hu肿瘤抗原转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E:T)的比率为10:1。本发明的肿瘤抗原xCD3构建体的效力差距优选为≤5、更优选≤4、甚至更优选≤3、甚至更优选≤2，并且最优选≤1。
本发明的多肽构建体的一个或多个结合结构域优选地对于灵长类哺乳动物目的成员(如猕猴)具有跨物种特异性。根据一个实施例，除了与人肿瘤抗原结合之外，另外的一个或多个结合结构域还将与灵长类动物的所述肿瘤抗原结合，这些灵长类动物包括(但不限于)新大陆灵长类动物(如普通狨(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(SaguinusOedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus))、旧大陆灵长类动物(如狒狒和猕猴)、长臂猿、猩猩和非人类人科(homininae)。设想本发明的与在T细胞表面上的人CD3结合的结构域还至少与猕猴CD3结合。优选的猕猴是食蟹猴(Macaca fascicularis)。还设想了猕猴(Macacamulatta/Rhesus)。本发明的多肽或多肽构建体包含与T细胞表面上的人CD3ε和至少猕猴CD3结合的结构域。
在一个实施例中，根据本发明的构建体对于结合猕猴CD3相比于结合人CD3的亲和力差距[KD ma CD3:KD hu CD3](如通过例如BiaCore或斯卡查德分析确定的)为在0.01与100之间、优选地在0.1与10之间、更优选地在0.2与5之间、更优选地在0.3与4之间、甚至更优选地在0.5与3之间或在0.5与2.5之间，并且最优选地在0.5与1之间。
如上文详细说明的，本发明的多肽或多肽构建体的所述结合结构域与人CD3ε(或T细胞表面上的人CD3ε)并且优选地与普通狨或松鼠猴CD3ε结合。更具体地，所述结构域与人CD3ε的细胞外表位结合。还设想所述结构域与人和猕猴属(Macaca)CD3ε链的细胞外表位结合。CD3ε的所述细胞外表位包含在人CD3ε细胞外结构域的氨基酸残基1-27内(参见SEQ IDNO:847；SEQ ID NO:848中的氨基酸残基1-27)。甚至更特别地，表位包含至少氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。普通狨是属于狨猴科(Callitrichidae)的新大陆灵长类动物，而松鼠猴是属于悬猴科(Cebidae)的新大陆灵长类动物。具有此类特征的结合物在WO 2008/119567中有详细描述。
针对(人)CD3或选择性地并且优选地，特异性地针对CD3ε的抗体或双特异性构建体是本领域已知的，并且它们的CDR、VH和VL序列可以作为本发明的多肽构建体的结合结构域的基础。例如，Kung等人在1979年报道了OKT3(Ortho Kung T3)的开发，这是识别人T细胞上的CD3(具体地，CD3的ε链)的第一个mAb。OKT3(莫罗单抗(muromonab))是第一种可用于人疗法的鼠源性单克隆抗体。更新的抗CD3单克隆抗体包括奥特昔珠单抗(otelixizumab)(TRX4)、特普利珠单抗(teplizumab)(MGA031)、弗雷鲁单抗(foralumab)和威司利珠单抗(visilizumab)，均靶向CD3的ε链。针对(癌症)靶标和CD3的双特异性构建体也正在进行开发和(预)临床测试，并且它们的CD3结合结构域(CDR、VH、VL)可以用作本发明的构建体的第二结合结构域的基础。示例包括但不限于博纳吐单抗(Blinatumomab)、索利托单抗(Solitomab)(MT110、AMG 110)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、度妥昔珠单抗(Duvortuxizumab)、厄妥玛索单抗(Ertumaxomab)、洛莫索珠单抗(Mosunetuzumab)、FBTA05(Bi20、TPBs05)、CEA-TCB(RG7802、RO6958688)、AFM11、和MGD006(S80880)。例如在US 7,994,289 B2、US 7,728,114 B2、US 7,381,803 B1、US 6,706,265B1中披露了CD3结合结构域的其他示例。
CD3结合结构域的VL区的CDR-L1至L3序列的优选组合和CD3结合结构域的VH区的CDR-H1至H3序列的优选组合列于下表中。
Figure BDA0004188881320000291
/>
Figure BDA0004188881320000301
优选地，CDR-L1至L3组合的上文所列组合中的任一个与上文所列组合CDR-H1至H3中的任一个组合，作为与人CD3ε链的细胞外结合的结合结构域的部分。换言之，VL区包含以下或由以下组成，作为CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3序列，顺序如下：
GSSTGAVTSGYYPN，GTKFLAP，ALWYSNRWV；
RSSTGAVTSGYYPN，ATDMRPS，ALWYSNRWV；
GSSTGAVTSGNYPN，GTKFLAP，VLWYSNRWV；
ASSTGAVTSGNYPN，GTKFLVP，TLWYSNRWV；或
RSSTGAVTTSNYAN，GTNKRAP，ALWYSNLWV；并且
VL区包含以下或由以下组成，作为CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3序列，顺序如下：
IYAMN，RIRSKYNNYATYYADSVKS，HGNFGNSYVSFFAY；
KYAMN，RIRSKYNNYATYYADSVKD，HGNFGNSYISYWAY；
SYAMN，RIRSKYNNYATYYADSVKG，HGNFGNSYLSFWAY；
RYAMN，RIRSKYNNYATYYADSVKG，HGNFGNSYLSYFAY；
VYAMN，RIRSKYNNYATYYADSVKK，HGNFGNSYLSWWAY；
KYAMN，RIRSKYNNYATYYADSVKS，HGNFGNSYTSYYAY；
GYAMN，RIRSKYNNYATYYADSVKE，HRNFGNSYLSWFAY；
VYAMN，RIRSKYNNYATYYADSVKK，HGNFGNSYISWWAY；
SYAMN，RIRSKYNNYATYYADSVKG，HGNFGNSYVSWWAY；
KYAIN，RIRSKYNNYATYYADQVKD，HANFGNSYISYWAY；或
TYAMN，RIRSKYNNYATYYADSVKD，HGNFGNSYVSWFAY。
根据本发明，VH和VL区的优选CDR序列组合(按CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3的顺序列出)如以下中所定义：SEQ ID NO:82至87；88至93；94至99；100至105；106至111；112至117；118至123；124至129；130至135；136至141；142至147；148至153；154至159；160至165；166至171；172至177；178至183；184至189；190至195；196至201；202至207；208至213；214至219；以及220至225。
最优选的是VL区包含如以下中所描绘的作为CDR组合：SEQ ID NO:106至111；112至117；118至123；124至129；178至183；184至189；190至195；196至201；202至207；208至213；214至219；以及220至225；按CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3序列的顺序列出。优选地，CDR的取向为VH至VL，即可变区的取向为从N末端至C末端VH至VL。
包含在本发明的多肽或多肽构建体中的CD3结合结构域的优选VH和VL区序列组合发现于以下中：SEQ ID NO(按VH+VL序列的顺序列出)：550+551；552+553；554+555；556+557；558+559；560+561；562+563；564+565；566+567；568+569；570+571；572+573；574+575；576+577；578+579；580+581；582+583；584+585；586+587；588+589；590+591；592+593；594+595；596+597。优选的CD3结合结构域选自以下：SEQ ID NO:558+559；560+561；562+563；564+565；582+583；584+585；586+587；588+589；590+591；592+593；594+595；以及596+597。
在另一个优选实施例中，将本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域连接的一个或多个接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。如上文所概述的，如果本发明的多肽或多肽构建体中的接头中的多于一个如上文所定义，则是有优势的。因此，优选的是结合结构域连接的接头也如上文所定义。最优选的是，连接结合结构域的一个或多个接头以及连接结合结构域内的VH和VL可变区的一个或多个接头是如本文所定义的S(G4Q)n或(G4Q)n接头，其中所述接头取代含有丝氨酸代替谷氨酰胺的接头，即S(G4S)n或(G4S)n接头。
优选地，将本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域连接的所述接头是S(G4X)n，n是1且X是Q。换言之，将本发明的多肽或多肽构建体的优选所有的结合结构域连接的接头是S(G4Q)(SEQ ID NO:34)。
在进一步优选的实施例中，本发明的多肽或多肽构建体包含延长半衰期的结构域。还设想本发明的多肽构建体除了具有与所述一种或多种靶抗原结合的功能(优选地，当多肽或多肽构建体包含CD3结合结构域和与肿瘤抗原结合的至少一种另外的结合结构域时)外还具有另外的功能。在这种形式中，通过肿瘤抗原结合靶向靶细胞，通过CD3结合介导细胞毒性T细胞活性，并且提供另外的功能(如增强或延长血清半衰期的手段或结构域、通过募集效应细胞介导细胞毒性的完全功能或经修饰的Fc恒定结构域、标记(荧光等)、治疗剂如毒素或放射性核素等)，构建体可以是三功能或多功能构建体。
延长本发明的多肽/多肽构建体的血清半衰期的手段或结构域的示例包括与多肽/多肽构建体融合或以其他方式附接的肽、蛋白质或蛋白质的结构域。肽、蛋白质或蛋白质结构域的组包括在人体中以优选药代动力学特征与其他蛋白质结合的肽，如血清白蛋白(参见WO 2009/127691)。此类延长半衰期的肽的替代性概念包括与新生儿Fc受体(FcRn，参见WO 2007/098420)结合的肽，其也可用于本发明的构建体中。附接较大蛋白质结构域或完整蛋白质的概念包括人血清白蛋白、人血清白蛋白的变体或突变体(参见WO 2011/051489、WO 2012/059486、WO 2012/150319、WO 2013/135896、WO 2014/072481、WO 2013/075066)或其结构域的融合，以及免疫球蛋白恒定区(Fc结构域)及其变体的融合。Fc结构域的此类变体被称为基于Fc的结构域，并且可以例如被优化/修饰以允许期望的二聚体或多聚体配对，以消除Fc受体结合(例如避免ADCC或CDC)或出于其他原因。本领域中已知的延长物质或分子在人体内的半衰期的另外的概念是那些分子(如本发明的构建体)的聚乙二醇化。
在一个实施例中，例如为了延长构建体的血清半衰期，根据本发明的多肽/多肽构建体与融合配偶体(如蛋白质、多肽或肽)连接(例如经由肽键)。这些融合配偶体可以选自人血清白蛋白(“HSA”或“HALB”)以及其序列变体、与HSA结合的肽、与FcRn结合的肽(“FcRnBP”)、或包含(抗体衍生的)Fc区的构建体。通常，融合配偶体可以直接(例如经由肽键)或通过肽接头如(GGGGQ)n、(GGGGS)n或GGGG(其中“n”是2或更大的整数，例如2或3或4)与根据本发明的构建体的N末端或C末端连接。具体合适的肽接头在上文进行了论述。
优选的是，所述延长半衰期的结构域(HLE结构域)包含两个多肽单体或由其组成，每个单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域，其中所述两个多肽单体经由肽接头彼此融合，按氨基至羧基顺序包含：铰链-CH2-CH3-肽接头-铰链-CH2-CH3。所述HLE结构域的优选多肽单体包含SEQ ID NO:78或79的序列或由其组成；其中整个HLE结构域的序列在SEQ ID NO:849中定义。所述HLE结构域单体的序列优选地通过N末端处“DKTHT”序列基序的缺失和/或通过用氨基酸E取代SEQ ID NO:78或79的位置55处的氨基酸D来修饰。优选地，所有的修饰(即DKTHT基序的缺失以及在位置55处的所述取代)都存在于经由肽接头彼此融合的每个HLE结构域单体中。优选的是所述肽接头为(GGGGQ)n或(GGGGS)n(其中“n”为2或更大的整数，例如2或3或4或5或6，优选6)。特别优选的接头是(G4Q)6。后面的特征/修饰中的每一个都有助于进一步降低剪切速率。因此，作为将所述HLE结构域单体(其通过N末端处“DKTHT”序列基序的缺失和通过用氨基酸E取代SEQ ID NO:78或79的位置55处的氨基酸D来修饰)融合的接头的(G4Q)6的组合是本发明的优选实施例(如SEQ ID NO:80和81)。相应的优选的HLE结构域包含SEQ ID NO:850中所定义的序列或由其组成。
根据本发明，所述多肽或多肽构建体包含(以氨基至羧基顺序)：结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-HLE结构域。HLE结构域优选通过肽接头如(GGGGQ)n、(GGGGS)n或GGGG(其中“n”是2或更大的整数，例如2或3或4)与根据本发明的多肽或多肽构建体连接。更优选地，接头是GGGG。
还根据本发明，所述多肽或多肽构建体包含(以氨基至羧基顺序)：结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域3(VH/VL-肽接头-VH/VL)-HLE结构域。
进一步根据本发明，所述多肽或多肽构建体包含(以氨基至羧基顺序)：结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-HLE结构域-接头-结合结构域3(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域4(VH/VL-肽接头-VH/VL)，其中结合结构域1与第一细胞表面抗原结合，结合结构域2和3与CD3结合，其中结合结构域4与第二细胞表面抗原结合。进一步优选的是，结合结构域内的肽接头是(G4Q)3，并且HLE结构域内的肽接头是(G4Q)6，连接所述结合结构域的接头是S(G4Q)，并且其中将HLE结构域与结合结构域连接的接头是G4接头。甚至更优选的是，HLE结构域包含SEQ ID NO:850的序列或由其组成。进一步优选的是，与CD3结合的结合结构域包含如SEQ ID NO:582和583、584和585、586和587、或588和589中所定义的VH和VL序列，或由其组成。
根据本发明，将HLE结构域与结合结构域连接的接头为本发明的多肽或多肽构建体中的G4接头。
根据前述内容，因此设想根据本发明的多肽或多肽构建体包含单链多肽，该单链多肽是至少双特异性的，具有与CD3结合的至少一个结合结构域和与细胞表面抗原(优选是肿瘤抗原)结合的至少一个结合结构域，任选地具有HLE结构域，其中所述多肽以从N末端至C末端的以下顺序包含以下或由以下组成：
a)VL(包含细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VH(包含细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VH(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)；
b)VH(包含细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VH(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)；
c)VL(包含细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VH(包含细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VH(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-肽接头(G4)-Fc单体(上文所述的优选的HLE结构域的部分)-(G4Q)6-Fc单体(上文所述的优选的HLE结构域的互补部分)；
d)VH(包含细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VH(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-肽接头(G4)-Fc单体(HLE结构域的部分)-(G4Q)6-Fc单体(HLE结构域的部分)；
e)VH(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-((G4Q)3-VL(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VL(包含第二细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VH(包含第二细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VH(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-肽接头(G4)-Fc单体(HLE结构域的部分)-(G4Q)6或-Fc单体(HLE结构域的部分)；
f)VH(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VH(包含第二细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含第二细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VH(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-肽接头(G4)-Fc单体(HLE结构域的部分)-(G4Q)6或-Fc单体(HLE结构域的部分)；
g)VL(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VH(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VL(包含第二细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VH(包含第二细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VH(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-肽接头(G4)-Fc单体(HLE结构域的部分)-(G4Q)6或-Fc单体(HLE结构域的部分)
h)VL(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VH(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VH(包含第二细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含第二细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-肽接头(SG4Q)-VH(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含CD3ε结合结构域/互补位的部分)-肽接头(G4)-Fc单体(HLE结构域的部分)-(G4Q)6或-Fc单体(HLE结构域的部分)；或
i)结合结构域1((VL(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VH(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分))或(VH(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)))-肽接头(G4Q)-CD3结合结构域1(VH(包含第一CD3ε结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含第一CD3ε结合结构域/互补位的部分))-肽接头(G4)-Fc单体(HLE结构域的部分)-(G4Q)6-Fc单体(HLE结构域的部分)-肽接头(G4)-结合结构域2((VL(包含第二细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VH(包含第一细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分))或(VH(包含第二细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含第二细胞表面抗原结合结构域/互补位的部分)))-肽接头(G4Q)-CD3结合结构域2(VH(包含第二CD3ε结合结构域/互补位的部分)-(G4Q)3-VL(包含第二CD3ε结合结构域/互补位的部分))。
从上文可以明显地看出，细胞表面抗原的一个或多个结合结构域的VH和VL区序列取向可以是VH-VL或VL-VH。优选地，细胞表面抗原是如下文详细说明的肿瘤抗原。由Fc单体和如本文详细说明的连接接头构成的HLE结构域序列优选地选自分别如SEQ ID NO:80、81、72中所定义的序列，其中优选的HLE结构域序列如SEQ ID NO:850中所定义。第i)项中多肽构建体的两个CD3结合结构域优选是相同的CD3结合结构域，如，优选是具有SEQ ID NO:582+583；584+585；586+587；和588+589的VH和VL区序列的CD3结合结构域；优选是如SEQ IDNO:722至725中所定义的CD3结合结构域，其中724和725是甚至更优选的，因为它们具有将VH和VL区连接的(G4Q)3接头。虽然肽接头(SG4Q)在指定的位置是优选的，但它们也可以被(G4Q)接头或SG4S接头替代。
在进一步优选的实施例中，在本发明的多肽或多肽构建体中的细胞表面抗原(优选肿瘤抗原)结合结构域中VH区在VL区之前的情况下，优选的是氨基酸“EI”存在于VL区之前以及将VH与VL区连接的接头之前，作为进一步降低本发明的多肽或多肽构建体的剪切速率的手段。序列表包含单独的或作为本发明的较长多肽或多肽构建体的部分的相应的结合结构域。
多肽/多肽构建体的共价修饰也包括在本发明的范围内，并且通常但不总是在翻译后进行。例如，通过使构建体的特定氨基酸残基与可以与选择的侧链或与N末端或C末端残基反应的有机衍生剂反应，将构建体的若干种类型的共价修饰引入到分子中。用双功能剂衍生化可用于将本发明的构建体交联到水不溶性支持基质或表面以用于多种方法中。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基通常分别脱酰胺成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。替代性地，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。这些残基的任一形式都属于本发明的范围。其他修饰包括对脯氨酸和赖氨酸的羟基化，对丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，对赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and MolecularProperties[蛋白质：结构和分子特性],W.H.Freeman&Co.[W.H.弗里曼公司],旧金山,1983,第79-86页)，对N末端胺的乙酰化和对任何C末端羧基基团的酰胺化。
包括在本发明范围内的构建体的另一种类型的共价修饰包括改变蛋白质的糖基化模式。如本领域中已知的，糖基化模式可以取决于蛋白质的序列(例如，下文论述的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)或其中产生蛋白质的宿主细胞或生物体。下面论述特定表达系统。多肽的糖基化典型地是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列中的任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种附接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列以使得它含有上述三肽序列中的一者或多者，从而方便地完成向构建体添加糖基化位点(对于N-连接的糖基化位点)。还可以通过向起始序列添加或取代为一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来作出改变(对于O-连接的糖基化位点)。为了方便起见，构建体的氨基酸序列可以通过DNA水平上的变化来改变，特别是通过在预选碱基处突变编码多肽的DNA，以使得产生将翻译成所希望氨基酸的密码子。
增加构建体上的碳水化合物部分的数量的另一种手段是通过将糖苷化学或酶促偶联至蛋白质。这些程序的有利之处在于，它们不需要在具有用于N-连接和O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。取决于所使用的偶联方式，可将一种或多种糖附接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基基团，(c)游离巯基基团，如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基基团，如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述于WO 87/05330以及Aplin和Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.[CRC生物化学关键评论],第259-306页中。
存在于起始构建体上的碳水化合物部分的去除可以通过化学或酶促方式完成。化学去糖基化要求将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸，或等效化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大多数或所有糖裂解，同时使多肽保持完整。化学去糖基化由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.[生物化学与生物物理学集刊]259:52以及Edge等人,1981,Anal.Biochem.[分析生物化学]118:131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶实现，如由Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol.[酶学方法]138:350所述的。可以使用化合物衣霉素预防潜在糖基化位点处的糖基化，如由Duskin等人,1982,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]257:3105所述的。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。
本文还考虑构建体的其他修饰。例如，构建体的另一种类型的共价修饰包括以在美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所阐述的方式将构建体与各种非蛋白质聚合物(包括多元醇)连接。另外，如本领域中已知的，可以在构建体内的不同位置进行氨基酸取代，例如以有利于添加聚合物如聚乙二醇(PEG)。
在一些实施例中，本发明的构建体的共价修饰包括添加一个或多个标记。标记基团可以经由各种长度的间隔臂与构建体偶联以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的并且可以用于进行本发明。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测的标记。通常，标记属于多种类别，这取决于将检测它们的测定-以下示例包括但不限于：
a)同位素标记，这些同位素标记可以是放射性同位素或重同位素，如放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)
b)磁性标记(例如磁性颗粒)
c)氧化还原活性部分
d)光学染料(包括但不限于，生色团、磷光体和荧光团)，如荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、化学发光基团和荧光团，这些荧光团可以是“小分子”荧光剂或蛋白质荧光剂
e)酶促基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)
f)生物素化基团
g)由第二报道基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。
“荧光标记”意指可经由其固有荧光特性加以检测的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石绿、二苯乙烯、萤光黄、瀑布蓝J、德克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC红640、Cy5、Cy5.5、LC红705、俄勒冈绿、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、AlexaFluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布蓝、瀑布黄和R-藻红蛋白(PE)(俄勒冈州尤金市分子探针公司(Molecular Probes,Eugene,OR))、FITC、罗丹明和德克萨斯红(伊利诺伊州罗克福德皮尔斯公司(Pierce,Rockford,IL))、Cy5、Cy5.5、Cy7(宾夕法尼亚州匹兹堡市阿默舍姆生命科学公司(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA))。合适的光学染料(包括荧光团)描述于Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook[分子探针手册]中。
合适的蛋白质荧光标记还包括但不限于，绿色荧光蛋白，包括GFP的海肾(Renilla)、海笔(Ptilosarcus)或水母物种(Chalfie等人,1994,Science[科学]263:802-805)、EGFP(克罗泰克实验室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.)，
Figure BDA0004188881320000391
登录号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，量子生物技术公司(Quantum Biotechnologies,Inc.)，加拿大魁北克省蒙特利尔市迈松纳夫大道西1801号第8层(邮编：H3H 1J9)(1801deMaisonneuve Blvd.West,8th Floor,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9)；Stauber,1998,Biotechniques[生物技术]24:462-471；Heim等人,1996,Curr.Biol.[当代生物学]6:178-182)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP，克罗泰克实验室有限公司)、萤光素酶(Ichiki等人,1993,J.Immunol.[免疫学杂志]150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]85:2603-2607)和海肾(WO 92/15673、WO 95/07463、WO 98/14605、WO 98/26277、WO 99/49019、美国专利号5,292,658、5,418,155、5,683,888、5,741,668、5,777,079、5,804,387、5,874,304、5,876,995、5,925,558)。
亮氨酸拉链结构域是促进在其中发现它们的蛋白质的寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在几种DNA结合蛋白中被鉴定(Landschulz等人,1988,Science[科学]240:1759)，并且自此以后已经在多种不同的蛋白质中发现。已知的亮氨酸拉链包括天然发生的肽及其二聚化或三聚化的衍生物。适合用于产生可溶性寡聚蛋白质的亮氨酸拉链结构域的示例描述于PCT申请WO 94/10308中，并且从肺表面活性蛋白D(SPD)衍生的亮氨酸拉链描述于Hoppe等人,1994,FEBS Letters[欧洲生物化学会联盟通讯]344:191中。允许与其融合的异源蛋白质的稳定三聚化的经修饰的亮氨酸拉链的使用描述于Fanslow等人,1994,Semin.Immunol.[免疫学研讨文辑]6:267-78中。
本发明的多肽构建体还可以包含另外的结构域，这些结构域例如有助于分离分子或涉及分子的适应性药代动力学分布。有助于分离构建体的结构域可以选自肽基序或辅助性地引入的部分，这些部分可以在分离方法(例如分离柱)中捕获。此类另外的结构域的非限制性实施例包括称为Myc-标签、HAT-标签、HA-标签、TAP-标签、GST-标签、几丁质结合结构域(CBD-标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP-标签)、Flag-标签、Strep-标签以及其变体(例如StrepII-标签)和His-标签的肽基序。以鉴定的CDR为特征的所有本文所披露的构建体都可以包含His-标签结构域，该His-标签结构域通常称为分子的氨基酸序列中的连续His残基的重复，例如五个His残基或六个His残基(六聚组氨酸)的重复。His-标签可以位于例如构建体的N末端或C末端。在一个实施例中，六聚组氨酸标签(HHHHHH)经由肽键连接至根据本发明的构建体的C末端。组氨酸标签是优选的，特别是6x His标签。
根据本发明，当本发明的多肽或多肽构建体包含另外的结合结构域(即是至少双特异性的)时，优选的是与靶抗原结合结构域结合的所述细胞表面抗原是肿瘤抗原。优选地，本发明的多肽或多肽构建体是T细胞衔接器。因此，优选的是本发明的多肽或多肽构建体包含至少CD3结合结构域和肿瘤抗原结合结构域。
在优选实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：BCMA(B细胞成熟抗原)、CD123(白介素-3受体α链(IL-3R))、CD19(B淋巴细胞抗原CD19)、CD20(B淋巴细胞抗原CD20)、CD22(分化簇22)、CD33(Siglec-3)、CD70(分化簇70)、CDH19(钙粘蛋白19)、CDH3(钙粘蛋白3)、CLL1(C型凝集素结构域家族12成员A)、CS1(CCND3子集1)、CLDN6(密封蛋白6)、CLDN18.2(密封蛋白18.2)、DLL3(δ样配体3)、EGFRvIII(表皮生长因子受体vIII)、FLT3(fms样酪氨酸激酶3)、MAGEB2(黑色素瘤相关抗原B2)、MART1(由T细胞识别的黑色素瘤抗原1)、MSLN(间皮素)、MUC17(粘蛋白17)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、和STEAP1(金属还原酶STEAP1)。这些肿瘤抗原因它们在肿瘤细胞上的表达而为本领域所熟知。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的BCMA结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有BCMA结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:238至243；244至249；602+603；604+605；732；733；784；794中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的CD123结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有CD123结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:250至255；256至261；608+609；735中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的CD19结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有CD19结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:268至273；612+613；737；797中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的CD33结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有CD33结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:286至291；298至303；304至309；618+619；622+623；624+625；740；742；743；786；799中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的CD70结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有CD70结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:316至321；628+629；745；801中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的CDH19结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有CDH19结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:328至333；632+633；747；803中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的CDH3结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有CDH3结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:340至345；346至351；358至363；642+643；749；750；752；805；844；846中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的CLDN18.2结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有CLDN18.2结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:370至375；646+647；754；812中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的CLL1结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有CLL1结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:328至387；650+651；756；806中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的CLDN6结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有CLDN6结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:394至399；654+655；758；810中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的CS1结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有CS1结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:412至417；660+661；761；839；840中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的DLL3结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有DLL3结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:424至429；664+665；763；814中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的EGFRvIII结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有EGFRvIII结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:436至441；668+669；765；789中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的FLT3结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有FLT3结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:448至453；672+673；767；818；843中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的MAGEB2结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有MAGEB2结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:460至465；472至477；676+677；680+681；769；771；823；825中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的MSLN结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有MSLN结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:484至489；490至495；502至507；684+685；686+687；690+691；773；774；776；827中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的MUC17结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有MUC17结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:514至519；694+695；778；829中所定义的。
对于作为本发明的多肽或多肽构建体的结合结构域的PSMA结合结构域而言的优选CDR序列和VH/VL区序列及其组合，以及具有PSMA结合结构域作为结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体的双特异性单链分子序列是SEQ ID NO:532至537；538至543；544至549；700+701；702+703；781；782；783；790；831中所定义的。
本发明还涉及用于改善多肽或多肽构建体的稳定性的方法，该多肽或多肽构建体包含第一靶抗原结合结构域，其中所述第一靶抗原结合结构域包含通过肽接头连接的VH和VL可变区，其中该肽接头包含S(G4S)n和(G4S)n或由其组成，其中n是选自整数1至20的整数，该方法包括用肽接头取代所述S(G4S)n或(G4S)n接头的步骤，其中该肽接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。在本发明的方法的优选实施例中，整数n是1、2、3、4、5或6。根据本发明，S(G4X)n或(G4X)n中的X优选地是Q。因此，肽接头是S(G4Q)n或(G4Q)n。在优选实施例中，肽接头是(G4X)n，n是3，并且X是Q。因此，肽接头具有(G4Q)3的形式。上文关于本发明的多肽或多肽构建体所述的所有优选实施例也适用于用于改善稳定性的方法。因此，根据本发明的方法，当本文所叙述的多肽或多肽构建体包含S(G4S)n和(G4S)n接头(这些接头然后被所述肽接头取代)时，本发明的方法可用于改善所述多肽或多肽构建体中的任一种的稳定性，其中该肽接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。更确切地，本发明涉及用于改善多肽或多肽的稳定性的方法，该多肽或多肽呈以下形式：结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)。结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-HLE结构域(以氨基至羧基顺序)；结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域3(VH/VL-肽接头-VH/VL)-HLE结构域(以氨基至羧基顺序)；或结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-HLE结构域-接头-结合结构域3(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域4(VH/VL-肽接头-VH/VL)(以氨基至羧基顺序)，其中将VH和VL区连接的肽接头、将结合结构域连接的接头、或HLE结构域(如上文所定义的所述HLE结构域)内的接头包含S(G4S)n和(G4S)n或由其组成，其中n是选自整数1至20的整数，该方法包括用肽接头取代所述S(G4S)n或(G4S)n接头的步骤，其中该肽接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。在本发明的方法的优选实施例中，整数n是1、2、3、4、5或6。根据本发明，S(G4X)n或(G4X)n中的X优选地是Q。因此，肽接头是S(G4Q)n或(G4Q)n。上文关于本发明的多肽或多肽构建体(也适用于本实施例)描述了用于多肽或多肽构建体形式的不同形式的每个位置的优选接头。
如本文所用，“改善稳定性”涉及降低剪切速率。因此也可以将该方法称为用于降低多肽或多肽构建体的剪切速率的方法，该多肽或多肽构建体包含第一靶抗原结合结构域，其中所述第一靶抗原结合结构域包含通过肽接头连接的VH和VL可变区，其中该肽接头包含S(G4S)n和(G4S)n或由其组成，其中n是选自整数1至20的整数。用于确定剪切速率的优选方法描述于实例中。
本发明还涉及对本发明的多肽或多肽构建体进行编码的多核苷酸。核酸分子是由核苷酸构成的生物聚合物。多核苷酸是由共价键合在链中的13个或更多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(如cDNA)和RNA(如mRNA)是具有不同生物功能的多核苷酸/核酸分子的示例。核苷酸是充当核酸分子如DNA或RNA的单体或亚单位的有机分子。本发明的核酸分子或多核苷酸可以是双链的或单链的、线性的或环状的。设想核酸分子或多核苷酸被包含在载体中。此外，设想这样的载体被包含在宿主细胞中。所述宿主细胞例如在用本发明的载体或多核苷酸/核酸分子转化或转染后能够表达构建体。为此目的，将多核苷酸或核酸分子可操作地连接至控制序列。
遗传密码是将遗传物质(核酸)内编码的信息翻译成蛋白质的一组规则。活细胞中的生物解码是通过以由mRNA指定的顺序连接氨基酸的核糖体，使用tRNA分子携带氨基酸并一次读出mRNA三个核苷酸来完成。该密码定义了这些核苷酸三联体的序列(称为密码子)如何指定在蛋白质合成期间接下来将添加哪种氨基酸。除了一些例外，核酸序列中的三核苷酸密码子指定单一氨基酸。因为绝大多数基因都使用完全相同的密码进行编码，所以该特定密码通常称为规范或标准遗传密码。
密码子的简并性是遗传密码的冗余，表现为指定氨基酸的三碱基对密码子组合的多重性。简并性发生是因为存在比可编码的氨基酸更多的密码子。编码一种氨基酸的密码子在它们的三个位置中的任何一个都可以不同；然而，通常这种差异是在第二或第三位置。例如，密码子GAA和GAG都指定谷氨酸并表现出冗余；但是，都没有指定任何其他氨基酸，并因此没有表现出歧义。不同生物体的遗传密码可能偏向于使用编码相同氨基酸的几个密码子之一而不是其他密码子-也就是说，将发现比偶然预期具有更大频率的一个。例如，亮氨酸由六种不同的密码子指定，其中一些很少被使用。可获得详细说明大多数生物体的基因组密码子使用频率的密码子使用表。重组基因技术通常通过实施称为密码子优化的技术来利用这种效应，其中将那些密码子用于设计被各自宿主细胞(如人仓鼠起源的细胞、大肠杆菌(Escherichia coli)细胞或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞)偏好的多核苷酸，例如以增加蛋白质表达。因此，设想本披露的多核苷酸/核酸分子是密码子优化的。然而，可以使用编码所希望的氨基酸的任何密码子来设计编码本发明的构建体的多核苷酸/核酸分子。
根据一个实施例，编码本发明的多肽构建体的本发明的多核苷酸/核酸分子呈一个单一分子的形式或两个或更多个分开的分子的形式。如果本发明的构建体是单链构建体，则编码这种构建体的多核苷酸/核酸分子将最可能也呈一个单一分子的形式。然而，还设想多肽构建体的不同组分(如不同结构域，例如与细胞表面抗原结合的包含互补位(抗原结合(表位结合)结构)的结构域、与CD3结合的包含互补位(抗原结合(表位结合)结构)的结构域、和/或另外的结构域如抗体恒定结构域)位于分开的多肽链上，在这种情况下，多核苷酸/核酸分子最可能呈两个或更多个分开的分子的形式。
这同样适用于包含本发明的多核苷酸/核酸分子的载体。如果本发明的构建体是单链构建体，则一个载体可以在一个单一位置(作为一个单一开放阅读框，ORF)包含对构建体进行编码的多核苷酸。一个载体还可以在分开的位置(具有单独的ORF)包含两个或更多个多核苷酸/核酸分子，它们中的每一个编码本发明的构建体的不同组分。设想包含本发明的多核苷酸/核酸分子的载体呈一个单一载体的形式或呈两个或更多个分开的载体的形式。在一个实施例中，并且出于在宿主细胞中表达构建体的目的，本发明的宿主细胞应包含编码构建体的多核苷酸/核酸分子或包含这种多核苷酸/核酸分子的载体全部，这意味着构建体的所有组分——无论是编码为一个单一分子还是在单独的分子/位置编码——将在翻译之后组装并一起形成本发明的生物活性构建体。
本发明进一步涉及包含本发明的多核苷酸/核酸分子的载体。载体是用作将(外来)遗传物质转移到细胞中的运载体的核酸分子(通常为了确保遗传物质的复制和/或表达)。术语“载体”涵盖但不限于质粒、病毒、粘粒和人工染色体。一些载体专门设计用于克隆(克隆载体)，其他载体设计用于蛋白质表达(表达载体)。所谓的转录载体主要用于扩增其插入物。通常在含有其在大肠杆菌中维持所需的元件的大肠杆菌载体上进行DNA操作。然而，载体也可以具有允许它们维持在另一种生物体如酵母、植物或哺乳动物细胞中的元件，并且这些载体被称为穿梭载体。将载体插入靶标或宿主细胞中通常被称为转化(对于细菌细胞)和转染(对于真核细胞)，而病毒载体的插入通常被称为转导。
一般而言，工程化载体包含复制起点、多克隆位点和选择性标记。载体本身通常是包含插入物(转基因)和充当载体“骨架”的较大序列的核苷酸序列(通常为DNA序列)。虽然遗传密码决定了给定编码区的多肽序列，但其他基因组区域可能会影响这些多肽产生的时间和地点。因此，现代载体可以涵盖除转基因插入物和骨架之外的另外的特征：启动子、遗传标记、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体尤其用于在靶细胞中表达转基因，并且通常具有控制序列。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号、Kozak序列和增强子。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果将前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌前导序列的DNA可操作地连接至该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至该序列；或者如果核糖体结合位点被定位成有助于翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。一般来讲，“可操作地连接”意指所连接的核苷酸序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情形下是连续的并处于阅读相(readingphase)中。然而，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行接合来完成。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
“转染”是有意将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入到靶细胞中的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。转导通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染典型地涉及打开细胞膜中的瞬时孔或“洞”，以允许摄取物质。转染可以使用生物粒子(如病毒转染，也称为病毒转导)、基于化学的方法(如使用磷酸钙、脂质转染、Fugene、阳离子聚合物、纳米粒子)或物理处理(如电穿孔、显微注射、基因枪、细胞挤压、磁转染、静水压力、穿刺转染(impalefection)、超声波、光学转染、热休克)进行。
术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中，和向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，该基因改变是因通过一个或多个细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传物质(核酸分子)而产生。转化可以通过人为手段来实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态，这可能作为对如饥饿等环境条件和细胞密度的时间限制反应而发生，并且也可以被人工诱导。
此外，本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞经本发明的多核苷酸/核酸分子或本发明的载体转化或转染。
如本文所用，术语“宿主细胞”或“受体细胞”旨在包括可以是或已经是载体、外源性核酸分子和/或编码本发明的构建体的多核苷酸的受体、和/或构建体本身的受体的任何单个细胞或细胞培养物。通过转化、转染等方式将对应的材料引入细胞中(参见上文)。术语“宿主细胞”还旨在包括单细胞的后代或潜在后代。因为某些改变可能由于天然的、意外的或有意的突变或由于环境影响而在随后世代中发生，所以这种后代事实上可能不会与亲本细胞完全相同(在形态或基因组或全部DNA补体中)，但仍包括在本文所用术语的范围内。合适的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，并且包括但不限于细菌(如大肠杆菌)、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞，如昆虫细胞和哺乳动物(例如仓鼠、鼠类、大鼠、猕猴或人)细胞。
除了原核生物之外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)是本发明的构建体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、物种和菌株通常可获得并且可用于本文中，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyce)宿主，如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、瓦尔提鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.Marxianus)；耶氏酵母属(EP 402226)；毕赤酵母(EP 183 070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(EP 244 234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达糖基化构建体的合适宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的示例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了来自如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)(蚕蛾(silkmoth))的宿主的许多杆状病毒株和变体以及相应的许可性昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒株是公众可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且根据本发明，此类病毒可以用作本文的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。可用于在植物细胞培养物中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见，例如Hiatt等人,Nature[自然](1989)342:76-78；Owen等人(1992)Bio/Technology[生物/技术]10:790-794；Artsaenko等人(1995)The Plant J[植物杂志]8:745-750和Fecker等人(1996)Plant Mol Biol[植物分子生物学]32:979-986。
然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，并且培养物(细胞培养物)中脊椎动物细胞的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的示例是由SV40(如COS-7，ATCC CRL1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(如293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.[普通病毒学杂志]36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(如BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(如CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216(1980))；小鼠塞托利细胞(sertoli cell)(如TM4,Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学]23:243-251(1980))；猴肾细胞(如CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(如VERO-76，ATCC CRL1587)；人宫颈癌细胞(如HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(如MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(如BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(如W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(如Hep G2,1413 8065)；小鼠乳腺肿瘤(如MMT 060562,ATCC CCL-51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y Acad.Sci.[纽约科学院年刊](1982)383:44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(如Hep G2)。
在另外的实施例中，本发明提供了用于产生本发明的多肽或多肽构建体的工艺，所述工艺包括在允许表达本发明的构建体的条件下培养本发明的宿主细胞并且从该培养物中回收所产生的构建体。
如本文所用，术语“培养”是指细胞在合适的条件下在培养基中的体外维持、分化、生长、增殖和/或繁殖。使细胞在适当的温度和气体混合物下在细胞生长培养基中生长并维持。对于每种细胞类型，培养条件变化很大。典型的生长条件是约37℃的温度、约5％的CO2浓度和约95％的湿度。生长培养基的配方可以例如在pH值、碳源(如葡萄糖)浓度、生长因子的性质和浓度、以及其他营养素(如氨基酸或维生素)的存在方面变化。用于补充培养基的生长因子通常衍生自动物血液的血清，如胎牛血清(FBS)、牛小牛血清(FCS)、马血清和猪血清。细胞可以在悬浮液中生长或作为贴壁培养物生长。还存在如下细胞系，这些细胞系已经被修饰以能够在悬浮培养物中存活，因此它们可以按比贴壁条件将允许的更高密度生长。
术语“表达”包括涉及产生本发明的构建体的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、折叠、翻译后修饰、靶向特定亚细胞或细胞外位置、和分泌。术语“回收”是指旨在从细胞培养物中分离构建体的一系列过程。“回收”或“纯化”过程可以分离细胞培养物的蛋白质和非蛋白质部分，并最终将所希望的构建体与所有其他多肽和蛋白质分离。分离步骤通常利用蛋白质大小、物理化学特性、结合亲和力和生物活性的差异。制备型纯化旨在产生相对大量的纯化蛋白质供后续使用，而分析型纯化产生相对少量的蛋白质用于各种研究或分析目的。
当使用重组技术时，构建体可以在周质空间中细胞内产生，或直接分泌到培养基中。如果构建体是在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除宿主细胞或裂解片段的微粒状碎片。本发明的构建体可以例如在如大肠杆菌等细菌中产生。在表达之后，将构建体从可溶性级分中的细菌细胞糊中分离出来，并且可以例如经由亲和色谱和/或尺寸排阻进行纯化。最终纯化能以与用于纯化在哺乳动物细胞中表达并分泌到培养基中的构建体的工艺类似的方式进行。Carter等人(Biotechnology[生物技术](NY)1992年2月；10(2):163-7)描述了用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间中的抗体的程序。
在抗体分泌到培养基中的情况下，通常首先使用可商购的蛋白质浓缩滤器(例如，超滤单元)从此类表达系统的上清液进行浓缩。
可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱回收或纯化从宿主细胞制备的本发明的构建体。根据待回收的抗体构建体，也可获得用于蛋白质纯化的其他技术，如离子交换柱上分级分离、混合模式离子交换、HIC、乙醇沉淀、尺寸排阻色谱、反相HPLC、在二氧化硅上进行的色谱、在肝素琼脂糖上进行的色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行的色谱、免疫亲和(如蛋白质A/G/L)色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、超速离心和硫酸铵沉淀。
蛋白酶抑制剂可以被包括在任何前述步骤中以便抑制蛋白水解，并且抗生素可以被包括来防止污染物的生长。
此外，本发明提供了药物组合物或配制品，该药物组合物或配制品包含本发明的多肽或多肽构建体或根据本发明的工艺产生的多肽或多肽构建体。如本文所用，术语“药物组合物”涉及适合施用给患者，优选人患者的组合物。本发明的特别优选的药物组合物包含优选治疗有效量的一种或多种本发明的构建体。优选地，药物组合物进一步包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的合适配制品。组合物的可接受成分优选在所使用的剂量和浓度下是对接受者无毒性的。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
这些组合物可以包含药学上可接受的载剂。通常，如本文所用，“药学上可接受的载剂”意指与药物施用、特别是肠胃外施用相容的所有的水性和非水性溶液、无菌溶液、溶剂、缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液)、水、悬浮液、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、脂质体、分散介质和包衣。此类介质和药剂在药物组合物中的使用在本领域中是熟知的，并且包含此类载剂的组合物可以通过熟知的常规方法配制。
某些实施例提供了药物组合物，这些药物组合物包含本发明的构建体和另外一种或多种赋形剂，如在本部分和本文其他地方说明性描述的那些赋形剂。赋形剂在本发明中可用于多种目的，如调整配制品的物理、化学或生物特性，如调整粘度和/或本发明的工艺以改善有效性和/或稳定此类配制品和工艺，以防止例如由于在制造、运输、存储、使用前制备、施用和其后过程中发生的应力而导致的降解和腐坏。通常将赋形剂以其最低有效浓度使用。
在某些实施例中，为了改变、保持或保存组合物的某些特征(如pH、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附性或渗透性)，药物组合物可以含有配制材料(参见Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明登氏药学全书],第18版,1990,Mack Publishing Company[马克出版公司])。在此类实施例中，适合的配制材料可以包括但不限于：
·氨基酸
·抗微生物剂，例如抗细菌剂和抗真菌剂
·抗氧化剂
·用于将组合物维持在生理pH或稍低的pH下(通常在约5至约8或9的范围内)的缓冲液、缓冲系统和缓冲剂
·非水性溶剂、植物油和可注射的有机酯
·水性载剂包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质
·可生物降解聚合物，如聚酯
·增积剂
·螯合剂
·等渗剂和吸收延迟剂
·络合剂
·填充剂
·碳水化合物
·(低分子量)蛋白质、多肽或蛋白质载剂，优选人起源的
·着色剂和调味剂
·含硫还原剂
·稀释剂
·乳化剂
·亲水性聚合物
·成盐抗衡离子
·防腐剂
·金属络合物
·溶剂和助溶剂
·糖和糖醇
·悬浮剂
·表面活性剂或润湿剂
·稳定性增强剂
·张力增强剂
·肠胃外递送运载体
·静脉内递送运载体
众所周知，例如，药物组合物的不同成分可以具有不同的效应，并且氨基酸可以充当缓冲液、稳定剂和/或抗氧化剂；甘露醇可以充当膨胀剂和/或张力增强剂；氯化钠可以充当递送媒介物和/或张力增强剂；等。
在本发明的上下文中，药物组合物可以包含：
(a)如本文所述的多肽或多肽构建体，
(b)至少一种缓冲剂，
(c)至少一种糖，以及
(d)至少一种表面活性剂；
其中该药物组合物的pH在3.5至6的范围内。
在上面所述的组合物中，第一结构域优选地具有在4至9.5的范围内的等电点(pI)；第二结构域具有在8至10(优选地8.5至9.0)的范围内的pI；并且构建体任选地包含第三结构域，该第三结构域包含两个多肽单体，每个多肽单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域，其中所述两个多肽单体经由肽接头彼此融合。
在上面所述的组合物中，进一步设想该至少一种缓冲剂以5mM至200mM的浓度范围、更优选地以10mM至50mM的浓度范围存在。还设想该至少一种糖选自由以下组成的组：单糖、二糖、环状多糖、糖醇、线性支链葡聚糖或线性非支链葡聚糖。还设想该二糖选自由以下组成的组：蔗糖、海藻糖和甘露糖醇、山梨糖醇及其组合。进一步设想该糖醇是山梨糖醇。还设想该至少一种糖以1％至15％(m/V)的范围内的浓度存在，优选地以9％至12％(m/V)的浓度范围存在。进一步设想该构建体以0.1mg/ml至8mg/ml、优选0.2-2.5mg/ml、更优选0.25-1.0mg/ml的浓度范围存在。
根据上面所述的组合物的一个实施例，该至少一种表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、普朗尼克F68、曲拉通X-100、聚氧乙烯(polyoxyethylen)、PEG 3350、PEG 4000及其组合。进一步设想该至少一种表面活性剂以在0.004％至0.5％(m/V)的范围内(优选地在0.001％至0.01％(m/V)的范围内)的浓度存在。设想该组合物的pH在4.0至5.0的范围内，优选地4.2。还设想该药物组合物具有150mOsm至500mOsm的摩尔渗透压浓度。进一步设想该药物组合物进一步包含选自由以下组成的组的赋形剂：一种或多种多元醇和一种或多种氨基酸。在本发明的上下文中，设想所述一种或多种赋形剂以0.1％至15％(w/V)的浓度范围存在。
本发明还提供了包含以下的药物组合物：(a)如本文所述的构建体，优选在0.1至8mg/ml、优选0.2-2.5mg/ml、更优选0.25-1.0mg/ml的浓度范围内；(b)10mM谷氨酸盐或乙酸盐，(c)9％(m/V)蔗糖或6％(m/V)蔗糖和6％(m/V)羟丙基-β-环糊精，(d)0.01％(m/V)聚山梨醇酯80；其中该液体药物组合物的pH为4.2。
设想除了本文所定义的本发明的构建体之外，本发明的组合物可以包含另外的生物活性剂，这取决于组合物的预期用途。此类药剂可以是作用于胃肠系统的药物、充当细胞抑制剂的药物、预防高尿酸血症的药物、抑制免疫反应的药物、调节炎性响应的药物、作用于循环系统的药物和/或本领域中已知的药剂如细胞因子。还设想将本发明的多肽构建体应用于共疗法中，即与另一种抗癌药物组合。
在这个背景下，设想本发明的药物组合物(其包含构建体，该构建体包含CD3结合结构域和与细胞表面靶抗原(优选地靶细胞表面上的肿瘤抗原)结合的至少另外的结合结构域，如上文更详细描述的)此外包含与免疫检查点途径的蛋白质(如PD-1或CTLA-4)或与共刺激免疫检查点受体(如4-1BB)结合的药剂(优选地抗体或构建体)。本发明还涉及根据本发明的多肽构建体(其包含构建体，该构建体包含CD3结合结构域和与细胞表面靶抗原(优选地靶细胞表面上的肿瘤抗原)结合的至少另外的结合结构域，如上文更详细描述的)和与免疫检查点途径的蛋白质(如PD-1或CTLA-4)或与共刺激免疫检查点受体(如4-1BB)结合的药剂(优选抗体或多肽构建体)的组合。由于该组合的至少两种成分的性质，即它们的药物活性，该组合也可以被称为治疗性组合。在一些实施例中，该组合可以呈药物组合物或试剂盒的形式。根据一个实施例，该药物组合物或该组合包含本发明的构建体和与PD-1结合的抗体或构建体。例如在PCT/US2019/013205(通过引用并入本文)中详细描述了可用于该目的的抗PD-1结合蛋白。
在某些实施例中，最佳药物组合物将根据例如预期施用途径、递送形式和所希望的剂量来确定。参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明登氏药学全书]，同上。在某些实施例中，此类组合物可以影响本发明的构建体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施例中，药物组合物中的主要媒介物或载剂本质上可以是水性的或非水性的。例如，合适的媒介物或载剂可以是注射用水或生理盐水溶液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他物质。在某些实施例中，包含本发明的构建体的组合物可以通过将具有所希望纯度的所选择组合物与任选的配制剂(Remington’sPharmaceutical Sciences[雷明登氏药学全书]，同上)以冻干饼或水性溶液的形式混合来制备用于储存。此外，在某些实施例中，可以使用适当的赋形剂将本发明的构建体配制成冻干物。
当考虑肠胃外施用时，用于本发明的治疗组合物能以无热原的肠胃外可接受的水性溶液的形式提供，该水性溶液在药学上可接受的媒介物中包含本发明的所希望构建体。用于肠胃外注射的特别适合的媒介物是无菌蒸馏水，其中将本发明的构建体配制成适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施例中，制剂可以包括用可以提供产品的控制释放或持续释放的试剂配制所希望的分子，该产品可以经由积存注射递送，或者可以促进在循环中持久的持续时间。在某些实施例中，可植入药物递送装置可用于引入所希望的构建体。
另外的药物组合物对于本领域技术人员将是明显的，包括涉及持续或控制递送配制品中的本发明的构建体的配制品。用于配制各种持续或控制递送手段的技术对本领域技术人员而言是已知的。构建体也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中、在胶体药物递送系统中或在粗乳液中。在Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明登氏药学全书]，同上中披露了此类技术。
用于体内施用的药物组合物典型地以无菌制剂提供。灭菌可以通过无菌滤膜过滤完成。当组合物冻干时，可以在冻干和重构之前或之后进行使用该方法的灭菌。用于肠胃外施用的组合物能以冻干形式或于溶液中储存。通常将肠胃外组合物置于具有无菌进入口的容器(例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)中。
本发明的另一个方面包括包含本发明的构建体的自缓冲配制品，这些自缓冲配制品可以用作药物组合物，如在国际专利申请WO 2006/138181中所述。关于可用于这方面的蛋白质稳定化和配制材料和方法，有多种出版物可用，如Arawaka T.等人,Pharm Res.[药物研究]1991年3月；8(3):285-91；Kendrick等人,“Physical stabilization of proteinsin aqueous solution[蛋白质在水溶液中的物理稳定]”,Rational Design of StableProtein Formulations:Theory and Practice[稳定的蛋白质制剂的合理设计：理论与实践],Carpenter和Manning编辑Pharmaceutical Biotechnology[药物生物技术].13:61-84(2002)；以及Randolph和Jones,Pharm Biotechnol.[药物生物技术]2002；13:159-75，特别参见与用于自缓冲蛋白质配制品的赋形剂和工艺有关的部分，尤其是关于用于兽医和/或人类医学用途的蛋白质药物产品和工艺。
根据本发明的某些实施例，可以使用盐例如以调整组合物或配制品的离子强度和/或等渗性和/或改善根据本发明的组合物的构建体或其他成分的溶解度和/或物理稳定性。离子可以通过与蛋白质表面上的带电荷的残基结合并通过屏蔽蛋白质中的带电荷基团和极性基团并降低其静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子还可以通过特别地与蛋白质的变性肽键(--CONH)结合来稳定蛋白质的变性状态。此外，与蛋白质中的带电荷基团和极性基团的离子相互作用还可以减少分子间静电相互作用，并且从而防止或减少蛋白质聚集和不溶解。
离子种类对蛋白质的作用显著不同。已经开发了几种对可用于配制根据本发明的药物组合物的离子及其对蛋白质的作用的分类评级。一个示例是Hofmeister系列，该系列通过对溶液中蛋白质的构象稳定性的作用来对离子和极性非离子溶质进行评级。稳定溶质称为“亲液的”。不稳定溶质称为“离液的”。通常使用高浓度的亲液剂以从溶液中沉淀蛋白质(“盐析”)。通常使用离液剂来使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性限定了其在Hofmeister系列中的位置。
根据本发明的各种实施例，游离氨基酸可用于包含本发明的构建体的配制品或组合物中，以作为增积剂、稳定剂和抗氧化剂以及用于其他标准用途。可以将某些氨基酸用于稳定配制品中的蛋白质，其他氨基酸可用于冻干过程中以确保正确饼结构和活性成分的特性。可以将一些氨基酸用于抑制液体和冻干配制品中的蛋白质聚集，而其他氨基酸可用作抗氧化剂。
多元醇是亲液的，并且可用作液体和冻干配制品中的稳定剂，以保护蛋白质免受物理和化学降解工艺的影响。多元醇还可用于调节配制品的张力并且用于防止在运输过程中的冷冻-解冻应力或防止在制造过程中制备团块。在本发明的上下文中，多元醇也可以用作冷冻保护剂。
包含本发明的构建体的配制品或组合物的某些实施例可以包含表面活性剂。蛋白质可能易于吸附在表面上并且易于变性和在空气-液体、固体-液体和液体-液体界面处产生聚集。这些有害的相互作用通常与蛋白质浓度成反比，并且典型地因物理振荡(如在产品运输和处理过程中产生的物理振荡)而加剧。常规使用表面活性剂来防止、最小化或减少表面吸附。表面活性剂也常用于控制蛋白质构象稳定性。在这方面使用表面活性剂是蛋白质特异性的，因为一种特定的表面活性剂典型地会稳定一些蛋白质并使其他蛋白质不稳定。
包含本发明的构建体的配制品或组合物的某些实施例可以包含一种或多种抗氧化剂。通过保持适当水平的环境氧气和温度并避免暴露于光下，可以在某种程度上防止药物配制品中蛋白质的有害氧化。抗氧化赋形剂也可以用于防止蛋白质的氧化降解。设想用于在根据本发明的治疗性蛋白质配制品中使用的抗氧化剂可以是水溶性的并且在产品(包含构建体的组合物)的整个保质期内保持其活性。抗氧化剂也可能破坏蛋白质，并且因此应该除了别的之外以一种方式选择，以消除或充分降低抗氧化剂破坏配制品中的构建体或其他蛋白质的可能性。
包含本发明的构建体的配制品或组合物的某些实施例可以包含一种或多种防腐剂。例如，当开发涉及从相同容器中进行多于一次提取的多剂量肠胃外配制品时，防腐剂是必需的。其主要功能是抑制微生物生长并确保在药物产品的整个保质期或使用期限内的产品无菌性。尽管防腐剂与小分子肠胃外药物一起使用有很长的历史，但是开发包括防腐剂的蛋白质配制品可能具有挑战性。防腐剂通常对蛋白质具有不稳定效应(聚集)，并且这已成为限制其在多剂量蛋白质配制品中使用的主要因素。迄今为止，大部分蛋白质药物仅配制用于一次性使用。然而，当多剂量配制品是可能时，它们具有使患者方便的附加优势和增加的可销售性。良好的示例是人生长激素(hGH)，其中防腐配制品的开发已经促成更方便、多次使用的注射笔展示的商业化。在防腐剂型的配制和开发期间需要考虑若干个方面。必须优化药物产品中有效的防腐剂浓度。这需要以赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性的浓度范围测试剂型中给定的防腐剂。
正如可以预期的那样，含有防腐剂的液体配制品的开发比冻干配制品更具挑战性。冷冻干燥的产品可以在没有防腐剂的情况下冻干，并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂重构。这缩短了防腐剂与构建体接触的时间，从而显著最小化相关的稳定性风险。在液体配制品的情况下，应在整个产品保质期内保持防腐剂有效性和稳定性。要指出的重要点是，防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终配制品中得到证实。一旦配制了药物组合物，可以将它作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类配制品能以即用形式或以在施用前重构的形式(例如，冻干形式)储存。
本文所定义的药物组合物的生物活性可以例如通过体外细胞毒性测定来确定，如以下实例、WO 99/54440或由Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学免疫治疗]20(2005),1-12)所述。如本文所用，“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化NCI应答标准对本发明的药物组合物或配制品疗法的应答。使用本发明的药物组合物的疗法的成功或体内功效是指组合物对于其预期用途的有效性，即组合物引起其所希望效应，即耗尽病理细胞(例如肿瘤细胞)的能力。可以通过针对各个疾病实体的已建立的标准方法监测体内功效，这些标准方法包括但不限于白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选、骨髓抽吸。另外，可以使用各种疾病特异性临床化学参数和其他建立的标准方法。此外，可以使用计算机辅助断层摄影、X射线、核磁共振断层摄影、正电子发射断层摄影扫描、淋巴结活组织检查/组织学和其他已建立的标准方法。
开发药物(如本发明的药物组合物)的另一主要挑战是药代动力学特性的可预测调节。为此，可以建立候选药物的药代动力学曲线，即影响特定药物治疗给定病状的能力的药代动力学参数的曲线。影响药物治疗某种疾病实体的能力的药物的药代动力学参数包括但不限于：半衰期、分布容量、肝脏首过代谢和血清结合程度。给定药剂的功效可以受到上文提及的每个参数的影响。
“半衰期”是将量减少到其初始值的一半所需的时间。医学科学是指物质或药物在人体内的半衰期。在医学背景下，半衰期可以是指物质/药物失去其活性(例如药理学、生理学或放射学活性)的一半所花费的时间。半衰期还可以描述药物或物质(例如，本发明的构建体)在血浆/血清中的浓度达到其稳态值的一半所花费的时间(“血清半衰期”)。典型地，所施用的物质/药物的清除或去除是指通过如代谢、排泄等生物过程(还涉及肾脏和肝脏的功能)进行身体清洁。“首过代谢”是药物代谢、由此在药物到达循环之前使药物浓度降低的现象。它是吸收过程中药物损失的部分。因此，“肝脏首过代谢”意指药物在首次与肝脏接触时(即在其首次通过肝脏期间)被代谢的倾向。“分布容量”(VD)意指药物在身体组织而非血浆中分布的程度，较高的VD表示较大的组织分布量。药物的保留可以发生在遍布身体的各个隔室，如细胞内和细胞外空间、组织和器官等。“血清结合程度”意指药物与血清蛋白(如白蛋白)相互作用并结合的倾向，从而导致药物生物活性的降低或丧失。
药代动力学参数还包括就所施用的给定量的药物而言的生物利用度、滞后时间(T滞后)、Tmax、吸收速率、和/或Cmax。“生物利用度”是指到达体循环(血液隔室)的所施用药物/物质剂量的分数。当静脉内施用药物时，其生物利用度被认为是100％。然而，当经由其他途径(如口服地)施用药物时，其生物利用度通常会降低。“滞后时间”意指药物施用与其在血液或血浆中的检测和可测量性之间的时间延迟。Cmax是药物在其施用之后(以及在施用第二剂量之前)达到的最大血浆浓度。Tmax是达到Cmax的时间。达到其生物效应所需的药物的血液或组织浓度的时间受到所有参数的影响。如上文所概述和例如在Schlereth等人(同上)中所阐述的，可以在非黑猩猩灵长类动物的临床前动物测试中确定表现出跨物种特异性的构建体的药代动力学参数。
一个实施例提供了本发明的构建体(或根据本发明的工艺产生的构建体)，用于用作药物，特别地用于在预防、治疗或缓解(优选地治疗)疾病(优选肿瘤性疾病，更优选赘生物、癌症或肿瘤)中使用。另一个实施例提供了本发明的构建体(或根据本发明的工艺产生的构建体)在制造用于预防、治疗或缓解疾病(优选肿瘤性疾病，更优选赘生物、癌症或肿瘤)的药物中的用途。还设想提供用于预防、治疗或缓解疾病(优选肿瘤性疾病，更优选赘生物、癌症或肿瘤)的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明的构建体(或根据本发明的工艺产生的构建体)的步骤。术语“有需要的受试者”、“患者”或“需要治疗”的那些包括已经患有该疾病的那些，以及将要预防该疾病的那些。这些术语还包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
本发明的多肽/多肽构建体和本文描述的配制品/药物组合物可用于治疗、缓解和/或预防有需要的患者中的如本文所述的医学病症。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。治疗包括将多肽/多肽构建体/药物组合物应用或施用至患有如本文所述的疾病/障碍、具有这种疾病/障碍的症状或具有患这种疾病/障碍的倾向的患者或有需要的受试者的体内、分离组织或细胞，目的是治愈、痊愈、缓和、减轻、改变、补救、缓解、改善或影响该疾病、该疾病症状或患该疾病的倾向。如本文所用，术语“缓解”是指通过将根据本发明的多肽构建体施用至此类患者或有需要的受试者而对患者的疾病状态的任何改善。这样的改善可以被视为减缓或停止患者的疾病进展、和/或疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率或持续时间增加、或由于疾病导致的损害或残疾的防止。如本文所用，术语“预防”意指通过将根据本发明的构建体施用至有需要的受试者来避免如本文所指定的疾病的发生或复发。
术语“疾病”是指将受益于用本文所述的构建体或药物组合物治疗的任何病症。这包括慢性和急性障碍或疾病，包括使哺乳动物易患所考虑疾病的那些病理病症。该疾病优选是肿瘤性疾病，更优选是赘生物、癌症或肿瘤。该疾病、赘生物、癌症或肿瘤优选地对肿瘤抗原(优选地如上文所定义的那些)呈阳性，即其特征为肿瘤抗原(优选地如上文所定义的那些)的表达或过表达。肿瘤抗原的过表达意味着存在至少10％，特别地至少25％、至少50％、至少100％、至少250％、至少500％、至少750％、至少1000％或甚至更多的增加。优选地，表达仅发现于患病组织中，而在相应的健康组织中的表达不可检测到或不可显著地检测到。根据本发明，与表达肿瘤抗原的细胞相关的疾病，优选地如上文所定义的那些，包括癌症疾病。此外，根据本发明，癌症疾病优选为其中癌细胞表达肿瘤抗原的那些。根据本发明，疾病(优选肿瘤性疾病，更优选赘生物、肿瘤或癌症)的特征优选为存在BCMA阳性、CD123阳性、CD19阳性、CD20阳性、CD22阳性、CD33阳性、CD70阳性、CDH19阳性、CDH3阳性、CLL1阳性、CS1阳性、CLDN6阳性、CLDN18.2阳性、DLL3阳性、EGFRvIII阳性、FLT3阳性、MAGEB2阳性、MART1阳性、MSLN阳性、MUC17阳性、PSMA阳性、或STEAP1阳性细胞。换言之，肿瘤性疾病(更优选赘生物、肿瘤或癌症)优选地与以下的存在相关：BCMA阳性、CD123阳性、CD19阳性、CD20阳性、CD22阳性、CD33阳性、CD70阳性、CDH19阳性、CDH3阳性、CLL1阳性、CS1阳性、CLDN6阳性、CLDN18.2阳性、DLL3阳性、EGFRvIII阳性、FLT3阳性、MAGEB2阳性、MART1阳性、MSLN阳性、MUC17阳性、PSMA阳性、或STEAP1阳性细胞；因此，可以将肿瘤性疾病(更优选赘生物、肿瘤或癌症)称为BCMA阳性、CD123阳性、CD19阳性、CD20阳性、CD22阳性、CD33阳性、CD70阳性、CDH19阳性、CDH3阳性、CLL1阳性、CS1阳性、CLDN6阳性、CLDN18.2阳性、DLL3阳性、EGFRvIII阳性、FLT3阳性、MAGEB2阳性、MART1阳性、MSLN阳性、MUC17阳性、PSMA阳性、或STEAP1阳性赘生物、肿瘤或癌症。在本文应理解的是，可以使用包含针对如下肿瘤抗原的结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体来预防、治疗或缓解所述肿瘤抗原阳性赘生物、肿瘤或癌症中的每一种，该肿瘤抗原由与所述赘生物、肿瘤或癌症相关的细胞表达。可以使用包含分别针对以下的结合结构域的根据本发明的多肽或多肽构建体来预防、治疗或缓解BCMA阳性、CD123阳性、CD19阳性、CD20阳性、CD22阳性、CD33阳性、CD70阳性、CDH19阳性、CDH3阳性、CLL1阳性、CS1阳性、CLDN6阳性、CLDN18.2阳性、DLL3阳性、EGFRvIII阳性、FLT3阳性、MAGEB2阳性、MART1阳性、MSLN阳性、MUC17阳性、PSMA阳性、或STEAP1阳性赘生物、肿瘤或癌症：BCMA(针对BCMA阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CD123(针对CD123阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CD19(针对CD19阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CD20(针对CD20阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CD22(针对CD22阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CD33(针对CD33阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CD70(针对CD70阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CDH19(针对CDH19阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CDH3(针对CDH3阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CLL1(针对CLL1阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CS1(针对CS1阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CLDN6(针对CLDN6阳性赘生物、肿瘤或癌症)、CLDN18.2(针对CLDN18.2阳性赘生物、肿瘤或癌症)、DLL3(针对DLL3阳性赘生物、肿瘤或癌症)、EGFRvIII(针对EGFRvIII阳性赘生物、肿瘤或癌症)、FLT3(针对FLT3阳性赘生物、肿瘤或癌症)、MAGEB2(针对MAGEB2阳性赘生物、肿瘤或癌症)、MART1(针对MART1阳性赘生物、肿瘤或癌症)、MSLN(针对MSLN阳性赘生物、肿瘤或癌症)、MUC17(针对MUC17阳性赘生物、肿瘤或癌症)、PSMA(针对PSMA阳性赘生物、肿瘤或癌症)、和STEAP1(针对STEAP1阳性赘生物、肿瘤或癌症)。
“赘生物”是组织的异常生长，通常但不总是形成肿块。当也形成肿块时，通常称之为“肿瘤”。赘生物或肿瘤可以是良性的、潜在恶性的(癌前)、或恶性的(癌性)。恶性赘生物/肿瘤通常被称为癌症它们通常侵入并破坏周围组织，并可能形成转移，即它们扩散到身体的其他部分、组织或器官。“原发性肿瘤”是在肿瘤进展开始并且继续产生癌性肿块的解剖部位生长的肿瘤。大多数癌症在其原发部位发展，但然后继续转移或扩散至身体的其他部分(例如组织和器官)。这些另外的肿瘤是“继发性肿瘤”。大多数癌症在它们的原发部位之后、甚至在它们已经扩散到身体的其他部分之后继续被调用。
淋巴瘤和白血病是淋巴赘生物。出于本发明的目的，它们也涵盖在术语“肿瘤”和“癌症”中。出于本发明的目的，术语“赘生物”、“肿瘤”和“癌症”可互换地使用，并且它们既包含原发性肿瘤/癌症又包含继发性肿瘤/癌症(或“转移瘤”)、连同肿块形成赘生物(肿瘤)和淋巴赘生物(如淋巴瘤和白血病)以及微小残留病(MRD)。
术语“微小残留病”(MRD)是指在癌症治疗之后，例如当患者处于缓解期(没有疾病症状或体征)时，留在患者体内的少量残留癌细胞存在的证据。通过常规手段通常不能检测到极少量的剩余癌细胞，因为用于评估或检测癌症的标准测试不够敏感以检测MRD。如今，对于MRD非常敏感的分子生物学测试是可用的，如流式细胞术、PCR和下一代测序。这些测试可以测量组织样品中最低水平的癌细胞，有时低至百万个正常细胞中的一个癌细胞。在本发明的上下文中，设想术语癌症的“预防”、“治疗”或“缓解”还涵盖“MRD的预防、治疗或缓解”，无论是否检测到MRD。
本发明的构建体通常设计用于特定施用途径和方法、特定施用剂量和施用频率、特定疾病的特定治疗、生物利用度和持久性范围等。组合物的材料优选以对于施用位点可接受的浓度配制。因此可以根据本发明对配制品和组合物进行设计，以通过任何合适的施用途径递送。在本发明的上下文中，施用途径包括但不限于局部途径、肠内途径和肠胃外途径。
如果已将药物组合物冻干，则在施用之前首先将冻干物质在适当液体中重构。可以将冻干材料在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与冷冻干燥前蛋白质所处于的相同配制品中重构。本发明的药物组合物和构建体特别可用于肠胃外施用，例如静脉内递送，例如通过注射或输注。药物组合物可以使用医疗装置来施用。用于药物组合物施用的医疗装置的示例描述在美国专利号4,475,196；4,439,196；4,447,224；4,447,233；4,486,194；4,487,603；4,596,556；4,790,824；4,941,880；5,064,413；5,312,335；5,312,335；5,383,851；和5,399,163中。
本发明的组合物能以合适的剂量施用给受试者，该剂量可以例如在剂量递增研究中确定。如上文所阐述的，表现出如本文所述的跨物种特异性的本发明的构建体还可以有利地用于非黑猩猩灵长类动物的临床前测试。剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如在医学领域中熟知的，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、有待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。
“有效剂量”是足以实现或至少部分地实现所希望的效果的治疗剂的量。“治疗有效剂量”是足以治愈或至少部分地阻止患有疾病的患者的疾病及其并发症、体征和症状的量。对此用途有效的量或剂量将取决于待治疗的疾病(适应症)、递送的构建体、治疗背景和目标、疾病的严重程度、先前疗法、患者的临床病史和对治疗剂的响应、施用途径、患者的体型(体重、体表)和/或病状(年龄和一般健康状况)以及患者自体免疫系统的一般状态。可以根据主治医师的判断调整适当的剂量，以获得最佳治疗效果。
治疗有效量的本发明的构建体优选地导致疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率或持续时间增加或预防由于疾病引起的损害或残疾。相对于未经治疗的患者，在表达肿瘤抗原的肿瘤治疗中，治疗有效量的本发明的构建体(其包含针对所述肿瘤抗原的结合结构域)优选地将肿瘤细胞生长抑制了至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。可以在预测在人肿瘤中的功效的动物模型中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。
在另外的实施例中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包含本发明的构建体、根据本发明的工艺产生的构建体、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞。在本发明的上下文中，术语“试剂盒”意指两种或更多种组分(其中一种对应于本发明的构建体、药物组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞)，这些组分一起包装在容器、接受器或其他中。因此，试剂盒可以被描述为足以实现特定目标的一组产品和/或器具，其可以作为单个单元销售。
设想本发明的试剂盒的另外的组分是与免疫检查点途径的蛋白质(如PD-1或CTLA-4)或与共刺激免疫检查点受体(如4-1BB)结合的药剂(优选地抗体或构建体)。这些药剂在本文上面更详细地描述。根据一个实施例，该试剂盒包含本发明的构建体和与PD-1结合的抗体或构建体。例如在PCT/US 2019/013205中详细描述了可用于该目的的抗PD-1结合蛋白。在某些实施例中，该试剂盒允许组分的同时和/或依次施用。
试剂盒可以包含具有任何适当形状、大小和材料(优选防水的，例如塑料或玻璃)的一个或多个接受器(如小瓶、安瓿、容器、注射器、瓶、袋)，该一个或多个接收器含有适于施用的剂量的本发明的构建体或药物组合物(参见上文)。试剂盒可以另外含有使用说明(例如以小册子或说明手册的形式)、用于施用本发明的构建体或药物组合物的装置(如注射器、泵、输注器等)、用于重构本发明的构建体的装置和/或用于稀释本发明的构建体的装置。
本发明还提供了用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明的试剂盒还可以含有包含干燥/冻干的构建体或药物组合物的第一接受器和包含水性配制品的第二接受器。在本发明的某些实施例中，提供了含有单室和多室预填充注射器的试剂盒。
在本文无论何时使用术语“构建体”，所述术语均是指所使用的本发明的多肽/多肽构建体或如指示的其对照。
如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”也包括复数指示物。因此，例如，对“一种试剂”的提及包括此类不同试剂中的一种或多种，并且对“所述方法”的提及包括提及本领域普通技术人员已知的可以修改或取代本文所述的方法的等效步骤和方法。
除非另外指示，否则在一系列元素前面的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个元素。本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等效物。此类等效物旨在涵盖在本发明中。
术语“和/或”在本文使用时包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
如本文所用，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的±20％内、优选在15％内、更优选在10％内、并且最优选在5％内。它还包括具体值，例如，“约50”包括值“50”。
贯穿本说明书及权利要求书，除非上下文另外要求，否则词语“包含/包括(comprise以及变型如comprises和comprising)”应当被理解成隐含包括所陈述的整体或步骤、或者整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤、或者整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”来取代，或者有时在本文中使用时用术语“具有”取代。
当在本文中使用时，“由……组成”时，排除了在权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”并不排除不实质性地影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
在本文的每个例子中，术语“包含/包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一个可以用其他两个术语中的任一个替代。
以上描述和以下实例提供了示例性的布置，但是本发明不限于本文描述的特定方法、技术、方案、材料、试剂、物质等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施例。本文使用的术语不旨在限制仅由权利要求书限定的本发明的范围。在独立权利要求中提供了本发明的各个方面。在从属权利要求中提供了本发明的一些可选特性。
本说明书全文中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入文中。本文没有任何内容应解释为承认本发明无权由于先前发明而早于这些披露内容。通过引用并入的材料在一定程度上与本说明书发生冲突或不一致时，本说明书将替代任何此类材料。
将从以下实例中获得对本发明及其优点的更好理解，这些实例仅用于说明目的。这些实例并不打算并不应该被解释为以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
图1：通过无应力测试情况下的SDS-PAGE分析的CD33
Figure BDA0004188881320000661
分子变体中的G4S相比于G4R接头
图2：通过无应力测试情况下的SDS-PAGE分析的PSMA
Figure BDA0004188881320000662
变体
图3：靶标2TDCC测定
图4：靶标1TDCC测定
图5：PSMA
Figure BDA0004188881320000663
分子相比于BiTE分子的经优化变体的直接比较
图6：BiTE分子Z5S中检测到的剪切位点和所引入的稳定化的示意性描绘实例：
实例1：材料与方法
BiTE分子的产生和表达
将开放阅读框的单个DNA片段按基因合成订购，并通过标准克隆方法亚克隆到哺乳动物表达载体中。该表达载体含有IgG衍生的信号肽，用于分泌表达到细胞培养上清液中。将序列验证的质粒克隆转染到CHO细胞中，7天后收获稳定细胞池的细胞培养上清液。将细胞培养上清液储存在-80℃下，直至进行蛋白质纯化。
BiTE纯化色谱分析
通过先后进行蛋白质A(思拓凡公司(Cytiva)，Mab Select SuRe柱)亲和色谱和尺寸排阻色谱(
Figure BDA0004188881320000671
16/600/>
Figure BDA0004188881320000672
200pg通用电气医疗集团(GE Healthcare))进行蛋白质纯化。根据OD280nm对信号(蓝色)峰进行汇集并通过SDS-PAGE对MW进行分析。蛋白质单体峰在10mM柠檬酸盐、75mM赖氨酸、4％海藻糖中形成，并将其等分以在-80℃下储存。
SDS-PAGE分析
通过在95℃下持续5min使样品变性并将样品应用于非还原(-DTT)或还原(+DTT)SDS-PAGE。随后将凝胶立即染成蓝色/使脱色成蓝色以可视化蛋白质条带。
体外FACS结合分析
将经纯化的
Figure BDA0004188881320000673
抗体构建体应用于流式细胞术，以确定与靶抗原转染的CHO细胞或人CD3阳性T细胞系(HPB-ALL)或健康志愿者的人PBMC的结合。使用PE抗人IgG(1:200)对BiTE分子进行染色。在4℃下持续30分钟以100/10/1/0.1nM/>
Figure BDA0004188881320000674
分子运行测定。该染色仅参考了由二级抗人Fc特异性PE缀合的多克隆Ab染色的细胞。
用未刺激的人PBMC进行的基于FACS的细胞毒性测定
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心从富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层，血库收集用于输血的血液的副产物)中制备人外周血单核细胞(PBMC)。血沉棕黄层由本地血库提供并且在采血后第二天制备PBMC。在Ficoll密度离心和用达尔伯克氏(Dulbecco’s)PBS(吉博科公司(Gibco))进行大量洗涤之后，经由与红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μMEDTA)一起孵育，从PBMC中去除剩余的红细胞。剩余的淋巴细胞主要包含B和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。将PBMC在含10％FCS(吉博科公司)的RPMI培养基(吉博科公司)中于37℃/5％ CO2下保持培养。
泛T细胞的分离
使用美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotec)人泛T细胞分离试剂盒(130-096-535)根据与试剂盒一起提供的方案从PBMC中分离人T细胞。然后使用LS柱(美天旎生物技术有限公司，#130-042-401)分离T细胞。将T细胞在培养箱中在RPMI完全培养基(即补充有10％ FBS(Bio West公司(Bio West)，#S1810)、1x非必需氨基酸(柏楉有限公司(Biochrom AG)，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(柏楉有限公司，#L1613)、1mM丙酮酸钠(柏楉有限公司，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(柏楉有限公司，#A2213)的RPMI1640(柏楉有限公司，#FG1215))中在37℃下培养直至需要时。
靶细胞标记
为了在流式细胞术测定中分析细胞裂解，将荧光膜染料DiOC18(DiO)(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，#V22886)用于标记靶转染的CHO细胞(作为靶细胞)并且将它们与效应细胞区分开。简而言之，将细胞收获，用PBS洗涤一次，并且在含有2％(v/v)FBS和膜染料DiO(5μL/10e6个细胞)的PBS中调整至10e6个细胞/mL。在37℃下孵育3min之后，将细胞在完全RPMI培养基中洗涤两次，并且将细胞数目调整至1.25x 10e5个细胞/mL。使用Nucleocounter NC-250(克莫麦特公司(Chemometec))以及含有吖啶橙和DAPI的溶液18染料(克莫麦特公司)确定细胞的活力。
基于流式细胞术的分析
将此测定设计用于在本发明的双特异性抗体构建体的连续稀释液存在下定量食蟹猴或人靶标转染的CHO细胞的裂解。将等体积的经DiO标记的靶细胞和效应细胞(即，没有CD14+细胞的PBMC)混合，得到10:1的E:T细胞比。将160μl该悬浮液转移到96孔板的每个孔中。添加40μL相应的靶标x CD3双特异性抗体构建体的连续稀释液和双特异性阴性对照(识别无关靶抗原的基于CD3的双特异性抗体构建体)或RPMI完全培养基(作为另外的阴性对照)。双特异性抗体介导的细胞毒性反应在7％ CO2加湿培养箱中进行48小时。然后将细胞转移到新的96孔板中，并且通过添加终浓度为1μg/mL的碘化丙啶(PI)监测靶细胞膜完整性的丧失。PI是通常被排除在活细胞之外的膜不可透过染料，然而死细胞则通过荧光发射将其吸收并变得可鉴定。
将样品通过在iQue Plus(Intellicyt公司，现在的赛多利斯公司(Sartorius))仪器上的流式细胞术测量，并且通过Forecyt软件(Intellicyt公司)分析。将靶细胞鉴定为DiO阳性细胞。PI阴性靶细胞被分类为活的靶细胞。细胞毒性的百分比根据下式计算：
Figure BDA0004188881320000691
n＝事件数
使用GraphPad Prism 7.04软件(图板软件公司，圣地亚哥)，将细胞毒性的百分比相对于相应的双特异性抗体构建体浓度绘图。使用四个参数逻辑回归模型来分析剂量反应曲线，用于评价具有固定坡面的S形剂量反应曲线，并计算EC50值。
样品的应力测试
通过在40℃下持续4周在配制品缓冲液中孵育样品来诱导热降解。通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将配制品中的样品调节到pH 7.2，然后在37℃下孵育4周，诱导生理pH降解(pH跳跃)。
溶液制备
变性缓冲液(6M盐酸胍，200mM tris，20mM甲硫氨酸，pH 8.3)通过以下制备：将20mL 1M(羟甲基)一甲胺盐酸盐(tris)，pH 8.3(密苏里州圣路易斯天惠华公司(Teknova,St.Louis,MO)，P/N T1083)添加到87.5mL 8M盐酸胍(伊利诺伊州罗克福德皮尔斯公司，P/N24115)中，然后添加299mg L-甲硫氨酸(J.T.Baker公司(J.T.Baker)，P/N 2085-05)。用1N盐酸(HCl)(德克萨斯州阿灵顿市Ricca公司(Ricca,Arlington,TX)，P/N R3700100-120A)或1N氢氧化钠(NaOH)(新泽西州凯尼尔沃思市默克集团(Merck,Kenilworth,NJ)，P/N1.09137.100)将溶液的pH调节至pH 8.3。用HPLC级水将体积调节至100mL。通过将7.7mg预称重的二硫苏糖醇(DTT)(伊利诺伊州罗克福德皮尔斯公司，P/N 20291)溶解于100μL变性缓冲液中来制备还原溶液(500mM DTT)。通过将15-65mg碘乙酸钠(NaIAA)(密苏里州圣路易斯西格玛公司(Sigma,St.Louis,MO)，P/N I-9148)溶解于一定体积的足以产生500mMNaIAA的变性缓冲液中来制备烷基化溶液(500mM NaIAA)。通过将299mg L-甲硫氨酸溶解于10mL 1M tris，pH 7.8中并添加100mL HPLC级水来制备消化缓冲液(50mM tris，20mM甲硫氨酸，pH 7.8)。用1N盐酸(HCl)(德克萨斯州阿灵顿市Ricca公司，P/N R3700100-120A)或1N氢氧化钠(NaOH)(新泽西州凯尼尔沃思市默克集团，P/N 1.09137.100)将溶液的pH调节至pH 7.8，并用HPLC级水将体积调节至100mL。通过将100μL消化缓冲液添加到100μg胰蛋白酶(瑞士巴塞尔罗氏公司(Roche,Basel,Switzerland)，P/N 03708969001)或100μg中性粒细胞弹性蛋白酶(密苏里州欧文斯维尔弹性蛋白产品公司(Elastin Products Company,Owensville,MO)，P/N SE563)中来制备酶溶液(1mg/mL胰蛋白酶，1mg/mL中性粒细胞弹性蛋白酶)。通过将76.4g盐酸胍(密苏里州圣路易斯西格玛公司，P/N 50933)和1.0g乙酸钠(西格玛公司，P/N 32319)溶解于95mL HPLC级水中来制备消化淬灭溶液(8M盐酸胍，250mM乙酸盐，pH 4.7)。然后添加716μL冰乙酸(密苏里州圣路易斯西格玛公司，P/N 320099)，并用HCl或NaOH将pH调节至pH 4.7。然后用HPLC级水将体积调节至100mL。
MWCO旋转过滤器辅助的连续消化
将200μL变性缓冲液添加至分子量为30kDa的截止旋转部件中，该截止旋转部件由位于离心管内用于收集滤液的膜部件组成。(马萨诸塞州比勒利卡密理博公司(Millipore,Billerica,MA)，P/N MRCF0R030或纽约华盛顿港颇尔公司(Pall,Port Washington,NY)，P/N OD030C34)。使用Eppendorf 5430离心机将该部件在14,000xg下旋转10min。将滤液丢弃。将配制品缓冲液中的100μg样品添加到过滤器元件中，并在14,000x g下旋转10min。将滤液丢弃。针对每个样品，将3μL还原溶液添加到37μL变性缓冲液中，并将40μL的该溶液添加到过滤器元件中。通过在37℃水浴中持续30min将样品变性并还原。针对每个样品，将7μL烷基化溶液添加到33μL变性缓冲液中，并将40μL的该溶液添加到过滤器元件中。通过在室温下黑暗中孵育20min将样品烷基化。针对每个样品，将4μL变性溶液添加到36μL变性缓冲液中，并将40μL的该溶液添加到过滤器元件中以淬灭烷基化。然后将样品在14,000x g下旋转15min，并将滤液丢弃。将200μL消化缓冲液添加到样品中，将过滤器元件在14,000x g下旋转15min，并将滤液丢弃；将此再重复两次，以去除变性剂、还原剂和烷基化剂。针对每个样品，将5μL胰蛋白酶溶液添加到35μL消化缓冲液中，并将40μL的该溶液添加到过滤器元件(1:20酶:底物比率)中。将样品在37℃水浴中孵育60min。将过滤器元件转移到新的收集管(收集管2)。将初始的收集管(收集管1)搁置一旁。将过滤器元件在14,000x g下离心10min。含有胰蛋白酶肽的滤液保留在收集管2中。将20μL消化缓冲液添加到过滤器元件中，将(收集管2中)的过滤器元件在14,000x g下离心10min，并将滤液保留在收集管2中；将此再重复一次。将过滤器元件转移回收集管1，并将收集管2搁置一旁。针对每个样品，将5μL中性粒细胞弹性蛋白酶溶液添加到35μL消化缓冲液中，并将40μL的该溶液添加到过滤器元件(现在在收集管1中，1:20酶:底物比率，基于起始材料)中。将样品在37℃水浴中孵育30min。将过滤器元件转移到收集管2。将收集管1丢弃。将过滤器元件在14,000x g下离心10min。含有从中性粒细胞弹性蛋白酶消化中所得的肽的滤液保留在收集管2中(连同来自前述步骤的胰蛋白酶肽)。将20μL消化缓冲液添加到过滤器元件中，将(收集管2中)的过滤器元件在14,000x g下离心10min，并将滤液保留在收集管2中；将此再重复一次。通过将160μL消化淬灭缓冲液添加到收集管2中对消化进行淬灭。
UPLC条件
对于所有样品而言，流动相A由在水中的0.1％甲酸组成，而流动相B由在乙腈中的0.1％甲酸组成。使用BEH C18 1.7μm，2.1x150 mm UPLC柱(马萨诸塞州米尔福德沃特世公司(Waters,Milford,MA)，P/N 186003556)将肽分离。使用赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)U-3000系统(马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))、沃特世公司Acquity H级系统(马萨诸塞州米尔福德)或安捷伦公司(Agilent)1290系统(加利福尼亚州圣克拉拉)利用表1中概述的梯度进行UPLC分离。基于起始材料，将约3-4μg样品上样到柱上。
MS条件
使用赛默飞世尔科技公司Q Exactive(马萨诸塞州沃尔瑟姆)、赛默飞世尔科技公司Q Exactive Plus(马萨诸塞州沃尔瑟姆)或赛默飞世尔科技公司Q Exactive BioPharma(马萨诸塞州沃尔瑟姆)分析由消化产生的肽。由于使用了多种仪器，所以数据采集参数根据仪器的不同而略有不同。仪器在200-2,000m/z的扫描范围内以数据依赖模式操作(前4-8个)。AGC目标对于MS1扫描设置为1E6，并且对于MSMS扫描设置为5E5。以35,000或140,000的分辨率采集MS1扫描，并且以17,500的分辨率采集MS2扫描。对于MSMS扫描而言，指定2-4m/z的分离窗口。从MSMS中排除了未分配电荷状态和电荷状态大于8的峰。动态排除设置为10s。已启用m/z391.28430的锁定质量。
数据分析
对于肽鉴定，用MassAnalyzer搜索MS数据(数据为数月内所收集，所以使用了多个版本的MassAnalyzer)。将羧甲基化指定为静态修饰。取决于实验，将裂解指定为非特异性的或氨基酸KRVITAL氨基酸的C末端。对于所有搜索，信噪比均设置为20，质量精度指定为15ppm，置信度设置为0.95。对于序列覆盖图，最小峰面积设置为基础峰的1％，相对峰面积阈值设置为17％，最小置信度设置为0.95，并且最大肽质量设置为15,000。对于定量，将MS数据用Skyline进行处理。Skyline工作簿是使用利用MassAnalyzer搜索结果鉴定的肽创建的。
表1.UHPLC梯度：MS数据仅在10-78min收集。在前10分钟，将流从MS分流，以便用于样品制备的试剂可以被洗涤到废物。MS数据采集后，对柱进行洗涤和平衡(78-123min)。在此期间，将流从MS分流。
Figure BDA0004188881320000721
Figure BDA0004188881320000731
实例2：结果
SDS-PAGE分析
在非还原和/或还原条件下，对产生的BiTE分子的纯化单体进行SDS-PAGE分析。除BiTE分子(W7V、W8I)以外，在两种条件下，所有BiTE分子在预期分子量下均呈现一条单一条带。对于包含G4R接头重复序列的BiTE分子W7V和W8I，可以观察到另外的较低分子量的条带，这表明无热应力测试情况下的低分子量(LMW)片段。
细胞毒活性
所有分析的BiTE分子显示出对靶抗原转染的CHO细胞的细胞毒活性。活性可与参考标准BiTE分子(靶标2，图3)或包含亲本的、亲和力较低的靶结合物的标准BiTE分子(R5C/P2K，靶标1，图4)相比。
热应力测试
在40℃下将BiTE分子应用于热应力，持续四周，随后对与如所述未处理的样品对照相比的％LMW增加进行分析。
抗CD3 scFv
利用G4Q接头重复序列，在BiTE分子中标准抗CD3 scFv被稳定的抗CD3 scFv取代(F8I相比于F1D，表1)使LMW降低了13.3％。在G4Q接头的背景下，当标准抗CD3 scFv和标准单链Fc结构域被相应的稳定结构域取代(M5J相比于Q8I，表1)时，LMW降低了40.9％。
接头
针对包含标准抗CD3 scFv、工程化抗CD3 scFv cys钳和标准scFc结构域的BiTE分子，包含G4Q接头重复序列而非G4S接头重复序列的BiTE分子显示LMW百分比降低了35.8％(11D相比于F8I，表1)。
在没有工程化的抗CD3 scFv cys钳的情况下，包含G4Q接头重复序列的BiTE分子的LMW比包含G4S接头的BiTE分子低32.3％(Z5S相比于Q6S，表1)。
包含不具有工程化的抗CD3 scFv cys钳但具有稳定的scFc结构域的标准抗CD3scFv的BiTE分子显示在G4Q接头重复序列相比于G4S接头重复序列的背景下LMW降低43.3％(J1X相比于X7D，表1)。
scFc结构域
对于包含G4Q接头重复序列、标准CD3结合物和工程化的抗CD3 scFv cys钳的BiTE分子，标准单链Fc结构域与稳定的单链Fc结构域相比，LMW降低3.2％(F8I相比于M5J，表1)。
与稳定的CD3结合物和工程化的抗CD3 scFv cys钳组合，经修饰的scFc使LMW百分比降低34.0％(F1D相比于Q8I)。
与不具有工程化的抗CD3 scFv cys钳的标准抗CD3 scFv组合的G4Q接头重复序列显示，对于包含稳定scFc的BiTE分子，LMW降低约37.5％(Q6S相比于X7D，表1)。类似地，包含标准G4S接头重复序列、不具有工程化的cys钳的标准抗CD3 scFv的BiTE分子中的稳定的scFc结构域显示出比标准scFc结构域低约26.2％的LMW(Z5S相比于J1X，表1)。
表1
根据稳定的抗CD3 scFv的差异
Figure BDA0004188881320000751
根据G4Q接头重复序列的差异
Figure BDA0004188881320000752
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根据经修饰的scFc的差异
Figure BDA0004188881320000753
根据工程化的CD3 cys钳的差异
Figure BDA0004188881320000754
抗CD3 scFv工程化的cys钳
在抗CD3 scFv中引入工程化的cys钳后，与无CD3 cys钳的BiTE分子对应物相比，包含标准抗CD3 scFv、标准G4S接头重复序列和标准scFc结构域的标准BiTE分子的LMW增加49.3％。
包含稳定的抗CD3 scFv、G4Q接头重复序列和标准单链Fc结构域的BiTE分子显示，与不具有工程化的cys钳的相同BiTE分子相比，具有工程化的cys钳的BiTE变体的LMW仅增加2.1％。
包含稳定的抗CD3 scFv和G4Q接头，但不包含经修饰的单链Fc结构域的BiTE分子显示，对于包含CD3工程化的cys钳的BiTE分子，LMW增加2.6％。
值得注意的是，对于具有工程化的CD3 cys钳的BiTE分子，LMW百分比是小幅的。然而，包含稳定结构域的BiTE分子显示与参考分子相比更低的LMW百分比，这独立于抗CD3scFv cys钳(分别地，不具有CD3 scFv cys钳情况下约15.5％ LMW相比于29％，或具有CD3scFv cys钳情况下15.9％相比于43.3％)。
组合
对于靶标1结合分子，BiTE分子S5Z显示出与其参考分子11S相比的最低LMW百分比(15.5％相比于29％，图5)。详细而言，总LMW降低46.6％是由于抗CD3 scFv接头、靶标scFv接头和scFc结构域的剪切减少导致。
对于靶标2结合BiTE分子，X7D显示与参考分子的22.1％ LMW相比总体上9.2％的LMW，因此，通过将G4S接头重复序列用G4Q替代以及将标准scFc结构域用稳定的scFc结构域替代，稳定化使LMW降低了58.2％。
表2
Figure BDA0004188881320000771
表3
Figure BDA0004188881320000772
结论
这些观察结果显示，单个结构域或接头(例如抗CD3 scFv、接头或scFc)本身的稳定化有助于热应力后LMW％的降低。此外，BiTE分子中G4Q接头、稳定的抗CD3 scFv和稳定的组合对总％LMW显示了加性效应(图5，表2)。
在所测试的包含标准抗CD3 scFv、标准接头和标准scFc结构域的BiTE分子中，工程化的CD3 cys钳作为单一修饰在标准BiTE分子中显示了升高的％LMW水平(43.3％相比于29.0％)。然而，在稳定的结构域的背景下，工程化的CD3 cys钳显示出与其无cys钳的对应物相比升高较少的LMW％水平(2.1％或2.6％)。值得注意的是，与标准对照分子11D以及没有抗CD3 scFv cys钳的标准BiTE分子(11S)相比，包含CD3 cys钳的稳定的BiTE分子在热应力后的总％LMW水平降低。
热应力后显示剪切的其他基序和缓解
在BiTE分子的抗靶标scFv中，我们在VL结构域的N末端处鉴定出剪切位点，其起始于氨基酸序列：DI。此处，我们引入了单一氨基酸变化以缓解该剪切位点(例如，D→E突变)。
类似地，在包含scFv亚基之一中的VL-接头-VH顺序的BiTE构建体中，由VH末端(VSS)构建的SSS基序和SG4X接头显示出升高的剪切，该升高的剪切通过消除接头序列(SG4X→G4X)中的一个丝氨酸以产生SS基序(即VSSGGGGX)来解决。
序列
序列表：
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Claims (29)

1.一种多肽或多肽构建体，其包含第一靶抗原结合结构域，其中所述第一靶抗原结合结构域包含通过肽接头连接的VH和VL可变区，其中该肽接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。
2.如权利要求1所述的多肽或多肽构建体，其中n是1、2、3、4、5或6。
3.如权利要求1或2所述的多肽或多肽构建体，其中X是Q。
4.如权利要求1至3中任一项所述的多肽或多肽构建体，其中该肽接头是S(G4X)n或(G4X)n，n是3，并且X是Q。
5.如权利要求1至4中任一项所述的多肽或多肽构建体，其包含与靶抗原结合的至少一个另外的结合结构域。
6.如权利要求5所述的多肽或多肽构建体，其中该至少一个另外的靶抗原结合结构域包含与该第一靶抗原结合结构域相同的组分。
7.如权利要求5或6所述的多肽或多肽构建体，其中每个靶抗原结合结构域与一个靶抗原结合。
8.如权利要求5至7中任一项所述的多肽或多肽构建体，其中所述多肽或多肽包含：
结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)。
9.如权利要求8所述的多肽或多肽构建体，其中所述多肽或多肽构建体包含：
结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-结合结构域3(VH/VL-肽接头-VH/VL)。
10.如权利要求8至9所述的多肽或多肽构建体，其中C末端结合结构域与CD3结合，并且其中所述剩余的一个或多个N末端结合结构域与细胞表面抗原结合。
11.如权利要求8至10中任一项所述的多肽或多肽构建体，其中连接这些结合结构域的接头包含S(G4X)n或(G4X)n或由其组成，其中X选自由以下组成的组：Q、T、N、C、G、A、V、I、L、和M，并且其中n是选自整数1至20的整数。
12.如权利要求11所述的多肽或多肽构建体，其中该接头是S(G4X)n，n是1并且X是Q。
13.如权利要求1至12中任一项所述的多肽或多肽构建体，其包含延长半衰期的结构域。
14.如权利要求13所述的多肽或多肽构建体，其中所述延长半衰期的结构域(HLE结构域)包含两个多肽单体或由其组成，每个单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域，其中所述两个多肽单体经由肽接头彼此融合，按氨基至羧基顺序包含：铰链-CH2-CH3-肽接头-铰链-CH2-CH3。
15.如权利要求8和10至14中任一项所述的多肽或多肽构建体，其中所述多肽或多肽构建体按氨基至羧基顺序包含：结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-HLE结构域。
16.如权利要求9和10至14中任一项所述的多肽或多肽构建体，其中所述多肽或多肽构建体按氨基至羧基顺序包含：结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域3(VH/VL-肽接头-VH/VL)-HLE结构域。
17.如权利要求15所述的多肽或多肽构建体，其中所述多肽或多肽构建体按氨基至羧基顺序包含：结合结构域1(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域2(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-HLE结构域-接头-结合结构域3(VH/VL-肽接头-VH/VL)-接头-结合结构域4(VH/VL-肽接头-VH/VL)，
其中结合结构域1与第一细胞表面抗原结合，结合结构域2和3与CD3结合，其中结合结构域4与第二细胞表面抗原结合。
18.如权利要求17所述的多肽或多肽构建体，其中这些结合结构域内的肽接头是(G4Q)3，并且该HLE结构域内的肽接头是(G4Q)6，连接所述结合结构域的接头是S(G4Q)，并且其中将该HLE结构域与这些结合结构域连接的接头是G4接头。
19.如权利要求14至16中任一项所述的多肽或多肽构建体，其中将该HLE结构域与这些结合结构域连接的接头是G4接头。
20.如权利要求10至19中任一项所述的多肽或多肽构建体，其中所述细胞表面抗原是肿瘤抗原。
21.如权利要求20所述的多肽或多肽构建体，其中该肿瘤抗原选自由以下组成的组：BCMA、CD123、CD19、CD20、CD22、CD33、CD70、CDH19、CDH3、CLL1、CS1、CLDN6、CLDN18.2、DLL3、EGFRvIII、FLT3、MAGEB2、MART1、MSLN、MUC17、PSMA、和STEAP1。
22.一种多核苷酸，其编码如权利要求1至21中任一项所述的多肽或多肽构建体。
23.一种载体，其包含如权利要求22所述的多核苷酸。
24.一种宿主细胞，其经如权利要求22所述的多核苷酸或如权利要求23所述的载体转化或转染。
25.一种用于产生如权利要求1至21中任一项所述的多肽或多肽构建体的工艺，所述工艺包括在允许表达如权利要求1至21中任一项所述的多肽或多肽构建体的条件下对如权利要求所述的宿主细胞进行培养，以及从培养物中回收所产生的多肽或多肽构建体。
26.一种药物组合物，其包含如权利要求1至21中任一项所述的多肽或多肽构建体，或如权利要求25所述的工艺产生的多肽或多肽构建体。
27.如权利要求20或21所述的多肽或多肽构建体、或如权利要求25所述的工艺产生的多肽或多肽构建体，用于在预防、治疗或缓解肿瘤性疾病中使用。
28.一种用于预防、治疗或缓解肿瘤性疾病的方法，该方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用如权利要求20至21中任一项所述的多肽或多肽构建体、或如权利要求25所述的工艺产生的多肽或多肽构建体。
29.一种试剂盒，其包含如权利要求1至21中任一项所述的多肽或多肽构建体、或如权利要求25所述的工艺产生的多肽或多肽构建体、如权利要求22所述的多核苷酸、如权利要求23所述的载体、和/或如权利要求24所述的宿主细胞。
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