JPH07151757A - 非競合結合検定方法 - Google Patents

非競合結合検定方法

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JPH07151757A
JPH07151757A JP6220186A JP22018694A JPH07151757A JP H07151757 A JPH07151757 A JP H07151757A JP 6220186 A JP6220186 A JP 6220186A JP 22018694 A JP22018694 A JP 22018694A JP H07151757 A JPH07151757 A JP H07151757A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 １つの容器中で分析物を測定できる結合検定
方法であって、感度が改善され、妨害物質の影響を受け
にくい便利な結合検定方法を提供する。 【構成】 分析物としてトリヨードチロニン（Ｔ３）を
用意する。これに標識抗Ｔ３を添加する。するとＴ３が
一部の標識抗Ｔ３に付着する。さらに過剰のＣＰＧ−Ｔ
３擬態物を添加する。未反応の標識抗Ｔ３がＣＰＧ−Ｔ
３擬態物に付着する。次いでＰＭＰ−抗標識を添加す
る。Ｔ３に付着した標識抗Ｔ３の標識がこのＰＭＰ−抗
標識に付着する。ＣＰＧとＰＭＰを分離して、ＣＰＧを
洗い流す。さしてＰＭＰを計数してＴ３の量を求める。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】結合検定を発達させるに際して、
科学者が、高水準の感度と特異性を有し、妨害物質を除
去でき、そして便利な検定方法を開発することが重要で
ある。ここでの議論は免疫化学型の検定を強調するかも
しれないが、その記載は、遺伝子プローブや他の種類の
結合検定にも適用できることも理解されよう。
【０００２】
【従来の技術】感度とは、最小の検出可能量、すなわ
ち、分析物がない場合に得られる信号に対する、検定に
より生じる信号の統計上有意な変化を生じる分析物の最
小量を意味する。多くの状況において、分析物（例え
ば、ホルモン、薬物、微生物、トキシン、汚染物または
遺伝子物質）は低濃度で効果を発揮するので、結合検定
の感度を増大させる（すなわち、より少量の分析物を検
出する）必要がある。さらに、高感度であれば小さいサ
イズの試料を使用することができ、「試料マトリック
ス」の妨害を減少させるのに役立つ。そして、感度が高
いほど、低濃度の分析物の測定をより精度の高いものに
することができる。
【０００３】感度について論じる際に、免疫化学者はし
ばしば競合検定と非競合検定とを区別している。競合検
定において、測定される信号は、分析物と結合しない特
異的なバインダー（binder）から発せられる信号であ
る。例えば、ある競合検定においては、標識抗体を、分
析物および固相に固定化した分析物誘導体を含有する試
料とともに定温放置する。分析物と結合しなかった標識
抗体はその固相と結合する。次いで固相に結合した標識
抗体から発せられる信号を測定する。別の種類の競合検
定においては、非標識抗体を、分析物および標識分析物
誘導体（または分析物擬態物）を含有する試料とともに
定温放置する。標識分析物誘導体は、分析物と結合しな
かった非標識抗体の結合部位と結合する。非標識抗体と
結合した標識分析物誘導体から発せられる信号を測定す
ることにより、分析物とは結合しなかった非標識抗体の
結合部位の濃度の推定値が得られる。このようにして、
両方の種類の競合検定において、分析物と結合しなかっ
た特異的なバインダーの部位の分画と関連する信号を測
定する。競合検定により発せられる信号は、分析物の濃
度が増加するにつれ減少する。少量の分析物は大きな信
号と対応するので、低濃度の分析物における小さな変化
が信号の大きな値の間の小さな差に対応してしまって、
正確な測定が困難になってしまう。
【０００４】第２の種類の結合検定は非競合検定であ
る。この検定においては、標識特異的バインダー（例え
ば、標識抗体）を試料とともに定温放置する。この標識
特異的バインダーは分析物の一部と結合する。非競合検
定のある変形（Ａ型）において、固相に固定化された非
標識特異的バインダーを同時にまたは連続して添加し、
分析物上の別のエピトープと結合させる。この検定を
「サンドイッチ」検定と称する。例えば、固定化された
分子を、分析物上の第２のエピトープに対する抗体とし
た場合、分析物は、標識抗体と固定化非標識抗体との三
成分複合体を形成する。次いで固相を洗浄する。測定す
る信号は、分析物を有する三成分複合体から発せられる
信号である。この場合、信号は、分析物の濃度が増加す
るにつれ増加する。
【０００５】Ｌ．Ｅ．Ｍ．マイルスおよびＣ．Ｎ．ヘイ
ルスにより別の種類の非競合免疫学的検定（Ｂ型）が発
明された（ネイチャー219 ：186 、1968）。この種の検
定においては、最初に標識抗体を分析物とともに定温放
置して免疫複合体を形成させ、次いで混合物を固相と接
触させる。この固相は過剰の分析物誘導体（または擬態
物）を有している。このため、接触により、未反応の標
識抗体が分析物誘導体に結合する。次いで固相を液相か
ら分離し、液相の一部を信号測定のために採集する。競
合型の検定との差異は、固相、すなわち、分析物と結合
しなかった標識バインダーと関連する信号を測定するも
のではないことである。代わりに測定するのは、分析物
と結合し、結果として固定化バインダーとは結合せず、
液相中に残存した標識バインダーと関連する信号であ
る。
【０００６】Ａ型の非競合検定は最高の感度を達成する
可能性がある。ジャクソンおよびエキンス（Ｔ．Ｍ．ジ
ャクソンおよびエキンス、Ｒ．Ｐ．、Jornal of Immuno
logical Methods 、87：12、1986）は、標識の特異的活
性が制限されない場合、Ａ型の感度は競合検定の感度よ
り高いことを数理的分析によって示した。実験データ
は、Ａ型の免疫学的検定は競合型の免疫学的検定よりも
感度が高いという結論を裏付けている。甲状腺刺激ホル
モンの検定のようないくつかの免疫学的検定は、検定キ
ュベット当たり数百万分子の感度を有する。反対に、ジ
ゴキシン（digoxin ）およびトリヨードチロニンの検定
のような最も感度が高い競合免疫学的検定は、検定キュ
ベット当たり数十億分子の感度を有する。Ａ型検定は最
も感度の高い種類であるが、その感度をさらに改良する
必要がある。
【０００７】競合型とＡ型の非競合型との間に潜在的な
感度の大きなずれ（分画的な非特異的結合の値に依存す
る何桁もの大きさ）が存在することが、Ａ型を広く用い
る主な理由である。前者（すなわち、競合検定）は、高
感度が必要ではない場合、または分析物がハプテンまた
は短いペプチドであるときのように分析物上に１つのエ
ピトープしか存在しないためにＡ型が可能ではない場合
のいずれかの場合に用いられる。
【０００８】最初にマイルスとヘイルスにより進展させ
られた理論的検討結果は、１つのエピトープを有する分
析物に適しているＢ型の非競合検定はまた、競合型より
も高い感度を有することを強く示唆している。これは、
Ａ型の感度を計算する式（ジャクソンおよびエキンスを
参照、1986）は、「分別非特異的結合（Fractional non
-specific binding ）」を同等な「分別非特異的保持
（Fractional non-specific retention ）」と置き換え
ることによって適用できるためである。後者の用語は単
に、液相中の標識バインダー−分析物複合体から分離で
きなかった未反応の標識バインダーの濃度を意味し、同
様に、非特異的結合とは、固相上の複合体から分離でき
なかった未反応の標識バインダーを意味する。
【０００９】したがって、数学的見地からは、非競合検
定はより感度が高いはずである。信号は、分析物の濃度
が増加するにつれ増加し、小さな数の間の小さな差は比
較的区別しやすいので低濃度の分析物も検出でき、分析
物が存在するために発せられる信号は、大きなバックグ
ラウンドというよりもむしろ小さなバックグラウンドか
ら区別される。
【００１０】したがって、理論的には、Ｂ型検定には競
合検定よりも実質的に高い感度を有する可能性があるこ
とが予想される。さらに、標識バインダーの非特異的保
持が非特異的結合と同じ大きさであり、同一の検定条件
（抗体親和性、定温放置時間、分離時間等が挙げられ
る）が与えられる場合には、Ａ型とＢ型の感度は同一で
あるはずである。この検定方法の使用については、以下
のような報告がある。シュアースおよびバンウィーメン
1972、米国特許第3,654,090 号；フレイタグ等1984、
Clin. Chem. 30：417 ；レフラー等 1984、Clin. Che
m. 30：1809；フレイタグ 1984、米国特許第4,434,236
号；フレイタグ等 1985、米国特許第4,551,426 号；
ベイアー等 1987、米国特許第4,670,383 号；ゲイナー
等 1988、米国特許第4,788,136 号。これらの文献に
は、非競合検定が高感度であることが記載されている
が、競合型の検定に対して非競合検定の感度は直接比較
されていない。分別非特異的保持が十分に低くない場合
には理論的予測は満たされないこと、または分離工程中
に標識特異的バインダー−分析物からなる複合体の一部
が分解反応により損失することが予測される。これらの
要因の全ては、感度を減少させてしまい、固相の濃度ま
たは固相による定温放置時間を増加させることにより非
特異的保持を低下させようと試みると不幸なことに、い
っそう分解が進行し、したがって、標識特異的バインダ
ー−分析物の複合体が損失してしまう。
【００１１】バイアー等は、分離工程を加えたＢ型の非
競合免疫学的検定の方式について記載している（バイア
ーの分析方法の図１を参照のこと）。分析物を含有する
試料を標識抗体とともに定温放置した後、分析物誘導体
が固定化されている固相を添加して未反応の標識抗体を
結合させる。固相を分離し、残りの液相のアリコートを
ピペットで採取し、第２の固相を含有する新しい反応キ
ュベットに入れた。第２の固相には、標識抗体または標
識抗体−分析物複合体の一部に対する抗体が固定化され
ている。第２の固相上に捕獲された複合体に関連する信
号を測定する。この追加の工程の意図は、試料マトリッ
クスの妨害要因を除くための洗浄工程を行なうことにあ
る。同一検定の競合変形に対する比較はバイアー等によ
り示されていないので、この追加の工程により感度が実
質的に改良されたか否かは明らかではない。競合固相検
定には１つの分離工程が含まれるので、バイアー等の特
許における２つの分離工程はさらに不便になってしま
う。このことが、この方法が商業化されていない、もし
くは学術的環境に広く用いられていない主な理由であろ
う。
【００１２】バイアーは、２つの固相を後に分離するこ
とができなかったので、その２つの固相を混合するのを
避けている。別々の固相を用いる場合でさえも、２つの
固相は免疫化学的結合パートナーを担持するので（ある
粒子上の抗標識は、他の粒子に結合した標識抗体を有す
る結合パートナーである）、２つの固相をともにかたま
らせると思われていた。免疫化学的結合パートナーに結
合した粒状固相を凝集させることは、粒子凝集検定でし
ばしば行なわれている（Ｋ．Ｅ．ヘッケミーおよびＥ．
Ｅ．マイケルソン、Laboratory Management 、６月、19
84、27−40頁参照のこと）。
【００１３】両方の固相が同一の反応管中に保持できる
という発見が、本発明の新しく非常に重要な特徴であ
る。このために、現存する器具を用いることができ、第
２の固相の分離を含むより複雑な機構を必要としない。
【００１４】妨害物質の除去 免疫学的検定において分析すべき試料はしばしば、妨害
物質を含む環境中に用意される。例えば、血清試料は、
関心のある分析物を含有するだけでなく、免疫学的検定
を妨害し得る多くの成分もまた含有している。免疫化学
検定技術には、妨害物質から分析物を容易に単離する工
程がある。例えば、分析物は、固相に結合している抗体
と反応できる。次いで固相を環境中の他の成分から分離
して分析できる。
【００１５】上述した分離工程を、様々な方法のいずれ
においても行なうことができる。例えば、検定者は、分
離方法として遠心分離濾過を用いる、固相としての非磁
気粒子、または磁界を適用することにより分離を行なえ
る、固相としての磁気粒子のいずれかを用いることがで
きる。他の分離の効果的な手段としては、様々なクロマ
トグラフィー、電気泳動、および広い表面（例えば、マ
イクロタイタ板、大きなビーズ、繊維等）の使用等が挙
げられる。分離工程は、手動、または自動器具もしくは
非自動器具により行なえる。しかしながら、いずれの場
合においても、固相を分離して洗浄し、液相を捨ててお
り、そして、固相に関連する信号が測定される信号であ
る。
【００１６】多くの物質は、洗浄工程にもかかわらず検
定を妨害する。例えば、交差反応物質（cross-reactio
n）は分析物と構造的な類似性を有し、また標識または
非標識の特異的バインダーと結合もする。交差反応物質
が標識特異的バインダーと結合する場合、検定結果は虚
偽の増加を示す。十分に高濃度の交差反応物質が非標識
特異的バインダーと結合してこれを飽和させる場合、誤
った低い結果が得られる。
【００１７】時折、分析物それ自身が非常に高濃度で存
在し、それによって、非標識特異的バインダーを飽和し
て、「高濃度フック効果（high dose hook effect ）」
を引き起こしてしまう。
【００１８】異好性（heterophilic）抗体およびリウマ
チ因子は抗体と結合し、標識抗体と非標識抗体との間の
架橋（bridge）を形成するかまたは、所望の結合活性を
阻害し得るので、虚偽の結果となってしまう。
【００１９】便宜性 分離工程は、手動で行なわれようとも、自動器具で行な
われようとも、検定において最も技術が要求される操作
のうちの１つである。関心のある分析物−バインダー複
合体が分解しないように、分離工程は迅速に行なわなけ
ればならない。未結合の標識バインダーと妨害物質がほ
ぼ完全に除去されるように、分離工程は能率的である必
要がある。さらに、全体的に高い検定精度を維持するよ
うに、分離工程には再現性が必要である。分離工程につ
いてのこれらの要求は、固相の分離を必要としない、様
々な「相同」検定、または「非分離」検定の発達をうな
がしている。この議論から、追加の分離工程を使用する
バイアーの技術はこの点で不利であることが明らかであ
る。バイアーの技術の追加の分離工程には、試験する各
々の試料について追加の反応容器を必要とするので、特
に複雑であり、問題となってしまう。さらに、液相を、
第２の固相を含有する第２の反応容器に移すことのでき
る自動器具は現在、市販されていない。この工程を手動
で行なうことは、非常に冗長であり、再現性をもって行
なうのが困難である。
【００２０】現在の免疫学的検定技術における洗練され
た水準に鑑みれば、検定を簡便と考えられるようにする
ためには、所定の器具に現在用いられる工程以上の工程
を追加すべきではない（すなわち、その器具を改造する
ことを必要とすべきではない）。さらに、検定は好まし
くは、１つの管中で行なえるべきである。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
した問題点を解決することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】本発明者は、感度を改良
するだけでなく、便利であり、妨害要因の影響を受けに
くい新しい非競合免疫学的検定技術を開発した。この技
術は、既存の器具にも適用でき、１つの試験管中で行な
える検定である。分析物を標識特異的バインダーと反応
させ、その後、混合物を、(1) 分析物誘導体に付着した
不溶性物質および(2) バインダーを担持する固相と反応
させる。次いで固相を分離し、固相に付着した標識を測
定する。
【００２３】本発明者は、感度が改善され、妨害物質の
影響を受けづらい便利な結合検定技術を提供するもので
ある。この技術の主な用途のうちの１つは免疫化学の分
野にあるので、技術についての以下の説明のほとんどは
免疫化学分野に関連している。しかしながら、この技術
は、遺伝子プローブ検定および受容体検定のような他の
結合検定にも同様に適用できるものである。この検定技
術は、１つ以上のエピトープを有する分析物を含む様々
な分析物に適している。分析物の例としては、タンパク
質、ペプチド、薬物、ホルモン、環境汚染物、核酸、脂
質、炭水化物およびこれらの様々な結合体等が挙げられ
る。この技術は、試料中の分析物の合計量と遊離分画
（free fraction ）（例えば、生物学的液体中の遊離ホ
ルモンおよび遊離薬物）の両方を求めるのに適してい
る。
【００２４】本発明によれば、分析物を含有していると
思われる試料を試薬１とともに定温放置する。この試薬
１は、分析物の少なくとも一部と結合する標識特異的バ
インダーを含んでいる。分析物と標識特異的バインダー
が互いに反応する定温放置期間後、さらに２つの試薬を
同時（試薬２および３は事前に混合されている）または
連続して（試薬２を最初に添加し、試薬３を後に添加す
る）添加する。
【００２５】結合検定には様々な種類の標識が用いられ
る（例えば、放射化学粒子、発光粒子、蛍光粒子、化学
発光粒子、酵素粒子、リポソーム粒子、および様々な金
属粒子ならびに非金属粒子）。好ましくは、標識は化学
発光標識（たとえば、アクリジニウムエステル）または
酵素標識である。標識を、共有結合により直接特異的バ
インダーに付着させることができる。あるいは、ビオチ
ン／アビジン、ＤＮＰ／抗ＤＮＰまたは他の結合対のよ
うな結合対を用いて間接的に標識を付着させることがで
きる。全ての標識がここに記載する検定への使用に同様
に適している。
【００２６】試薬２は、これまで未反応だった標識特異
的バインダーが試薬３と結合するのを遅らせるかまたは
結合を減少させる不溶性物質に付着した分析物または分
析物誘導体もしくは分析物擬態物からなる成分を含有し
ている。この試薬２がこの結合を減少させなかった場合
には、試薬３に付着したバインダーは、望みどおりの標
識バインダー−分析物複合体に結合するだけでなく、不
溶性物質とこの段階で結合している標識バインダーにも
結合し、したがって、非特異的信号を増大させてしま
う。ほとんどの場合、試薬２はその立体障害のために結
合を妨害する。この不溶性物質の例としては、制御され
た孔を有するガラス（controlled-pore glass ）から作
られた粒子、高分子粒子、ラテックス粒子、コロイド状
金属粒子または金属酸化物粒子、不混和液相、延長表面
（extended surface）、多孔性紙、多孔性ゲル、リポソ
ーム、エマルジョン、放置または遠心分離により容易に
は澄まない非常に小さな粒子の系、常磁性粒子、セルロ
ースビーズ、架橋デキストランまたは他の粒子等が挙げ
られる。延長表面とは、キュベットまたはマイクロタイ
タ板（micro-titre plate ）の表面のような比較的平ら
な表面、および１ｍｍより大きな直径を有するビーズの
ような比較的大きなビーズの表面を含むことを意味す
る。好ましい不溶性物質は、制御された孔を有するガラ
ス、高分子粒子、ラテックス粒子、架橋デキストランお
よび延長表面である。粒径は、直径で10ｎｍから数ミク
ロンまでにおよび、より小さな物質としては、デキスト
ランまたはタンパク質凝集塊のような大型分子である高
分子が挙げられる。あらゆるサイズの大型ビーズ、平ら
な表面、試験管壁、計量棒（dipstick）の表面、繊維、
膜、ロッドおよびディスク、または固定化バインダーを
担持できるあらゆる延長表面または粒状表面も用いるこ
とができる。立体障害以外の機構（例えば、多孔性）も
また試薬３への結合を妨害する傾向にある。
【００２７】試薬２は粒子または延長表面の形状であり
得るが、試薬２を、試料と検定の他の成分とを含有する
液相から分離する必要はないので、試薬２は結合検定に
おける通常の固相として機能しない。しかしながら、試
薬２は固相に実質的に付着すべきではなく、または固相
とともに分離されるべきではない。したがって、信号測
定の前に、試料と他の検定成分とを含有する液相から固
相を分離する場合、試薬２は液相とともに実質的に残存
し、液相とともに除去されるべきである。これらの理由
と試薬２を真の固相から区別するために、試薬２に使用
する物質を不溶性物質と称する。
【００２８】試薬２中の不溶性物質に付着した成分は、
分析物または分析物の誘導体で有り得る。標識特異的バ
インダーのこの成分に対する親和性は、完全な分析物に
対する親和性と同様（同じ桁以内）であろう。あるい
は、その成分は分析物の類似体であってもよく、標識特
異的バインダーに対するその親和性は非常に低くてもよ
い（２桁以上異なる）。この場合、標識特異的バインダ
ーの試薬２への結合は、結合活性（バインダーの２つ以
上の結合部位間の協同性．ピラン等、Clinical Chemist
ry 39 巻、879 −883 頁、1993を参照のこと）により促
進される。その成分は、合成分子（有機分子、合成ペプ
チド、またはオリゴヌクレオチドのような）または生物
学的由来分子（タンパク質、ペプチド、抗体、抗イディ
オタイプ抗体、受容体、抗原、核酸等のような）であっ
てもよい。
【００２９】試薬３は、標識特異的バインダー−分析物
複合体と結合する固定化バインダーを含有する固相であ
る。この固定化バインダーは、(1) 特異的バインダー、
(2)標識、または(3) 複合体に対する抗体であり得る。
あるいは、固定化バインダーは、二価または多価の標識
特異的バインダーを用いる場合、分析物または分析物擬
態物であり得る。さらに、分析物が二価または多価であ
る場合には、固定化バインダーは、抗分析物、特異的受
容体、または相補的核酸配列であり得る。言い換える
と、固定化バインダーは、標識特異的バインダー−分析
物複合体のどの部分にも結合できる。試薬２および３を
添加した後、標識特異的バインダー−分析物複合体を試
薬３に結合させるために、定温放置を継続する。最終的
に、固相（試薬３）と関連する標識から発せられる信号
を測定する。この信号測定の前に、固相を分離して洗浄
してもよいが、センサまたは偽性同種検定（pseudo-hom
ogeneous assays ）の場合には、分離は必要ない。
【００３０】固相物質の例としては、常磁性粒子、制御
した孔を有するガラスから作られた粒子、高分子粒子、
ラテックス、コロイド状金属または金属酸化物の粒子、
不混和性液相、延長表面、多孔性紙、多孔性ゲル、リポ
セルロースビーズ（lipos cellulose beads ）、架橋デ
キストランまたは他の粒子が挙げられる。粒径は、直径
で10ｎｍから数ミクロンまでにおよぶ。あらゆるサイズ
の大型ビーズ、平らな表面、試験管壁、計量棒の表面、
繊維、膜、ロッドおよびディスク、または固定化バイン
ダーを担持できるあらゆる延長表面または粒状表面。好
ましくは固相物質は常磁性粒子または延長表面のいずれ
かである。
【００３１】様々な技術が固相を液相から分離するのに
用いられる。そのような技術の例としては、遠心分離、
濾過、重力による清澄、磁気による引付け（magnetic a
ttraction ）、電気泳動、様々なカラムクロマトグラフ
ィー、毛細管力等が挙げられる。センサはセンサ表面の
近くに位置する信号を読み取れるので、液相を除去する
必要のないセンサ様式にも本発明を適用できる。少量の
液相信号もセンサにより読み取られる。自動研究室器具
に用いられるシステムのようなバッチシステム、および
連続フローシステムの両方にも、適用できる。計量棒、
免疫クロマトグラフィーおよび免疫濃縮（immunoconcen
tration ）装置のような「患者近辺での試験」に用いら
れる検定様式も本発明に適用できる。
【００３２】１つのエピトープを有する分析物並びに２
つ以上のエピトープを有する分析物についてこの新しい
方法を用いることができる。様々な構成を示す実施例を
後述する。さらに、遺伝子プローブおよび受容体検定の
ような、免疫検定以外の方法にもこの分析技術を用いる
ことができる。
【００３３】図２は、１つのエピトープを有する分析物
（トリヨードチロニン、Ｔ３）に適用した本発明の方法
を示している。分析物は１つしかエピトープを有さない
ので、第２の固相に付着したバインダーは抗分析物とは
なり得ないが、標識抗Ｔ３のある部分のバインダーには
なり得る。この場合、第２の固相に付着したバインダー
は抗標識である。この固相は、様々な分析物の検定に使
用できる万能試薬である（実施例１参照のこと）。
【００３４】図３は、少なくとも２つのエピトープを有
する分析物（甲状腺刺激ホルモンまたはＴＳＨ）に適用
した本発明を示している。この分析物について、抗ＴＳ
Ｈのような、分析物に直接結合する固相バインダーを使
用することが好ましい。しかしながら、抗標識または標
識特異的バインダーの別の部分に対するバインダーを有
することも好ましい。このことは、交差反応物、妨害物
質または非常に高い分析物の濃度の有害な影響を避ける
助けになるであろう。さもなければ、有害な影響が固定
化分析物に及ぼされてしまう（実施例４参照のこと）。
【００３５】図４は、遺伝子プローブ検定について同様
の反応機構を示している。核酸は高分子量の高分子であ
るので、図４に示すように、固相バインダーは通常、標
的分析物に対して相補的な配列（以後エピトープと称す
る）であり得る。しかしながら、多数のエピトープを有
する分析物の免疫学的検定の場合のように、ある場合に
おいては、抗標識を使用することが好ましいかもしれな
い。
【００３６】本発明においては、試料の容量を少なくす
ることにより試料の妨害物質を減少でき、第２のエピト
ープに対するバインダーを使用しないことにより妨害物
質をなくすことができる（すなわち、試料が、(1) 「フ
ック効果（hook effect ）」を生じ得る過剰の分析物、
または(2) 第２のエピトープに対するバインダーと交差
反応する分子を含有する場合、妨害の程度が増加してし
まう）。さらに、驚くべきことに、化学構造において分
析物に類似している物質（例えば、交差反応物）は、本
発明の検定方法の信号に、従来の競合方法と比較してわ
ずかな影響しか及ぼさないことが分かった（実施例１お
よび３を参照のこと）。
【００３７】この方法は、既存の自動免疫学的検定器具
に適用でき、その器具を改造する必要なく用いられる。
この方法は、手動でも、または非自動の器具を用いても
便利である。
【００３８】
【実施例】以下、図面に示す実施例に基づいて本発明を
詳細に説明する。
【００３９】実施例１．全トリヨードチロニン（Ｔ３）
検定 試薬：免疫化とそれに続く、コーラーおよびミルステイ
ンによりNature（ロンドン）256 巻、494 −497 頁（19
75）に記載された方法を用いたＳｐ２／０−Ａｇ１４骨
髄腫細胞と脾臓細胞との融合（fusion）とによって、マ
ウス中にモノクローナル抗Ｔ３および抗ＤＭＡＥ抗体を
産生させた。抗Ｔ３を産生する免疫原は、バークおよび
シェークスピアによりJ. Endocrinol. 65巻、133 頁
（1975）に記載されたように調製したウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ−Ｔ３）であった。抗ＤＭＡＥを産生する免
疫原は、ロー等によりJ. Biolumin. Chemilumin. ４
巻、88−98頁（1989）に記載されたようにタンパク質当
たり500 ：１のＤＭＡＥの入力比により調製したキーホ
ールリンペットヘモシアニンＫＬＨ−ＤＭＡＥであっ
た。ネズミを約0.1 ｍｇの免疫原で３回免疫化した。１
回目の接種を完全フロインドアジュバント中で行ない、
それに続く接種を不完全フロインドアジュバント中で行
なった。融合の４日前に、0.01ｇの抗原を静脈内に注射
してマウスを免疫化した。免疫化したマウスからの脾臓
細胞を、５：１の比率で骨髄腫細胞に融合した。融合か
ら７−21日後、肉眼的コロニーが観察されたとき、抗体
活性産生物について細胞培養上澄をスクリーニングし
た。抗Ｔ３抗体および抗ＤＭＡＥ抗体についてスクリー
ニングするのに用いたトレーサは、それぞれＩ−１２５
−Ｔ３およびＤＭＡＥであり、固相はＰＭＰ−ヤギ−抗
マウス−ＩｇＧであった。所望の抗体を分泌する雑種細
胞を、プリスタンを初回免疫したマウス（pristane-pri
med-mice）に腹腔内に注射した（ＣＡＦ）。これらのマ
ウスから腹水液を３−５週間後に採取した。アフィ−ゲ
ルプロテインＡマップスＩＩキット（Affi-gel Protein
AMAPS II kit；94901 カリフォルニア州、リッチモン
ドのバイオ−ラド ラボラトリーズ）を用いて、このキ
ットに添付されているプロトコルにしたがって、プロテ
インＡカラムクロマトグラフィーにより腹水液から抗体
を精製した。
【００４０】ロー等によりJ. Biolumin. Chemilumin.
４巻、88−98頁（1989）にＬ−チロキシンについて記載
されているように、Ｌ−Ｔ３およびＬ−３、５−ジヨー
ドチロニン（Ｔ２）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活
性化Ｎ−ヘミスクシネートメチルエステルにウシガンマ
グロブリン（ＢＧＧ）を結合させた。ＢＧＧ−Ｔ２をＣ
ＮＢｒ−活性化セファロース６Ｂ（ニュージャージー
州、ピッツキャタウェイ、ファーマシア）に結合させ
て、製造者の開示にしたがって抗Ｔ３のアフィニティー
（affinity）精製に用いた。
【００４１】ＢＧＧ−Ｔ２またはＢＧＧ−Ｔ３もしくは
抗ＤＭＡＥに結合した常磁性粒子（ＰＭＰ）を、グロマ
ン等のBioTechniques 、３巻、156 −160 頁（1985）に
記載したように調製した。ここに記載した方法と実質的
に同一の方法により、ＢＧＧ−Ｔ２を、制御した孔を有
するガラス（ＣＰＧ）粒子に結合させた。ＣＰＧそれ自
身（チバコーニングのイモフェーズ（Immophase ）製品
に使用したのと同一物質；直径が１ミクロン；表面のア
ミノシラン基を有する）をＨ．Ｈ．ウィートールにより
記載されたように調製した（Science 、166 ：615 ；Na
ture、223 ：959 、1969；Biochem and Biophys Acta
185 ：464 、1969を参照のこと）。
【００４２】プロテインＡ精製抗Ｔ３および抗ＤＭＡＥ
並びにアフィニティー（affinity）精製抗Ｔ３に、ロー
等によりJ. Biolumin. Chemilumin. ４巻、88−98頁
（1989）に記載されたようにＤＭＡＥで標識を付けた。
【００４３】検定：ＡＣＳ：１８０器具（チバ コーニ
ング ダイアグノスティクス社）を用いてＴ３の非競合
検定を行なった。試料プローブを用いて、0.01ｍｌの試
料または標準物、および0.05ｍｌの0.15Ｎ ＮａＯＨを
反応キュベット中に注入した。試薬プローブ１を用い
て、140 ｍＭのリン酸ナトリウム、20ｍＭのナトリウム
バービタル、４ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのエチレ
ンジアミン−テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、0.15ｇ／Ｌの８
−アニリノ−１−ナフタレン−スルホン酸（ＡＮＳ）、
１ｇ／Ｌの窒化ナトリウム、0.02ｇ／Ｌのウシガンマグ
ロブリン（ＢＧＧ）、および2.5 ｇ／Ｌのウシ血清グロ
ブリン（ＢＳＡ）を含有する、ｐＨ6.6 の緩衝液Ａ中で
0.1 ｍｌのアフィニティー（affinity）精製のＤＭＡＥ
−標識抗Ｔ３（２×106 相対照度単位（ＲＬＵ））を注
入した。37℃での2.5 分間の定温放置後、試薬プローブ
２を用いて、50ｍＭのリン酸ナトリウム、150 ｍＭの塩
化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、0.2 ｇ／Ｌの窒化ナ
トリウム、および１ｇ／ＬのＢＳＡを含有する、ｐＨ7.
4 の緩衝液Ｂ中で0.1 ｍｌのＣＰＧ−ＢＧＧ−Ｔ２を注
入した。さらに2.5 分間の定温放置後、試薬プローブ３
を用いて、0.5 ｍｌの緩衝液Ｂ中で0.05ｍｇのＰＭＰ−
抗ＤＭＡＥを注入した。さらに2.5 分間の定温放置後、
器具を用いてＰＭＰをキュベットの壁に誘引させ、１ｍ
ｌの脱イオン水で２回洗浄した。次いで器具に、0.3 ｍ
ｌの0.1 Ｎ ＨＮＯ3 中５％（容量／容量）のＨ
2 Ｏ2 、および0.3 ｍｌの0.1 Ｎ ＮａＯＨ中0.5 ％
（重量／容量）の陽イオン界面活性剤アーカッド（Arqu
ad）を添加し、発せられた光を光電子増倍管に集め、Ｒ
ＬＵで表した（反応の様式については図５を参照のこ
と）。
【００４４】同一条件下で同一の器具を用いてＴ３の競
合検定を行なった。試料プローブを用いて、0.01ｍｌの
試料または標準物、および0.05ｍｌの0.1 Ｎ ＮａＯＨ
を反応キュベットに注入した。試薬プローブ１を用い
て、非競合検定の場合と同様な0.1 ｍｌのＤＭＡＥ−標
識抗Ｔ３を注入した。2.5 分間の定温放置後、試薬プロ
ーブ２を用いて、0.1 ｍｌの緩衝液を加え、さらに2.5
分後、試薬プローブ３を用いて0.5 ｍｌの緩衝液Ｂ中の
0.005 ｍｇのＰＭＰ−ＢＧＧ−Ｔ２を注入した（反応の
様式については図５を参照のこと）。非競合検定につい
ての条件と同一の条件下で器具を用いて、ＰＭＰの分離
および洗浄、並びに光測定を行なった。両方の検定を３
回ずつ行なった。
【００４５】２種類の検定で得られた標準曲線を図６に
示す。Ｔ３の濃度がゼロでの信号から、最低の標準物
（0.25ｎｇ／ｍｌ）により生じた信号までの分画として
の変化は、非競合検定において、競合検定より約９倍大
きい。信号の精度が両方の検定で同一である場合、これ
らの結果により、感度が約９倍増加する、すなわち、最
小の検出可能な投与量が９分の１まで減少することが予
測される。信号の精度は実際に、0.15ｎｇ／ｍｌのＴ３
を含有する血清標準物の50回の繰返し試験により同一で
あることが分かった。競合検定により2.1 ％の信号変動
係数（ＣＶ）が得られ、非競合検定により1.9 ％の信号
変動係数が得られた。さらに、ほぼ同一の信号変動係数
が、全てのＴ３の水準で両方の検定に得られた。最低の
標準物とそれに続く複製の（ｎ＝10）連続希釈により、
競合検定においては0.0625ｎｇ／ｍｌ標準物が検出可能
であることが示された。なぜなら、これが、0.0625ｎｇ
／ｍｌ標準物がゼロ投与量の信号からの標準偏差の３倍
の範囲外にある最低の投与量であったからである。同一
の基準により、非競合検定では0.0078ｎｇ／ｍｌまで検
出可能であった。47人の被験者からの0.2 から3.4 ｎｇ
／ｍｌの範囲に亘る血清試料を２つの方法で試験した場
合、２つの方法はほぼ一致した。相関係数は0.995 であ
り、回帰線の傾斜は1.02であり、切片（intercept ）は
−0.04であった。
【００４６】驚くべきことに、３、５−Ｔ２の非競合検
定は競合検定より7.5 倍低く（0.02％対0.15％）、逆−
Ｔ３（reverse-T3）の交差反応性は競合検定より２倍低
かった（0.15％対0.07％）。
【００４７】ＤＭＡＥ−標識アフィニティー精製抗Ｔ３
をＤＭＡＥ−標識プロテインＡ精製抗体と置換すること
により、非競合検定においてゼロ投与量の信号が10倍増
加する。このことは、変性した、もしくは固定化配位子
と結合できない標識抗Ｔ３の存在により生じた。ＰＭＰ
−抗ＤＭＡＥの代わりに、ＰＭＰ−ＢＧＧ−Ｔ３を使用
することにより、この問題は克服できた（図７参照）。
アフィニティー精製トレーサとＰＭＰ−ＢＧＧ−Ｔ３と
の組合せにより、最低の「ＮＳＢ」が得られるので、最
高の感度が得られる可能性がある。トレーサがアフィニ
ティー精製されていない場合には競合検定においてはほ
とんど変化がなかった。
【００４８】実施例２．遊離Ｔ３検定 全ての試薬に緩衝液Ｂを用いたことを除いては、実施例
１に用いたものと同様な試薬とプロトコルを用いて、Ａ
ＣＳ：１８０に遊離Ｔ３検定を行なった。
【００４９】非競合検定の標準曲線により、約8.5 倍も
競合検定より感度が高いことが分かった。47の試料から
の結果により、両方の検定方法はほぼ一致することが分
かった（Ｒ＝0.95、傾斜＝0.88、切片＝−0.13）。
【００５０】実施例３．ジゴキシン検定 モノクローナル抗−ジゴキシン抗体をケミコン インタ
ーナショナル社（カリフォルニア州、テメキュラ）から
得た。バトラーおよびツエングによるMethodsin Enzymo
logy 、84巻、558 −577 頁（1982）に記載された過ヨ
ウ素酸塩方法により、ジギトキシンをＢＧＧに結合させ
た。実施例１に記載した方法を用いて、セファロース−
ＢＧＧ−ジギトキシン上の抗体をアフィニティー精製
し、ＣＰＧとＰＭＰ上にＢＧＧ−ジギトキシンを固定化
し、精製した抗体にＤＭＡＥを標識付けた。
【００５１】ジゴキシンの免疫学的検定を３種類行なっ
た。
【００５２】本発明の非競合検定のために、0.05ｍｌの
標準物と、１リットル当たり8.5 ｇの塩化ナトリウム、
１ｇの窒化ナトリウム、6.66ｇのトリス塩基、0.38ｇの
ＥＤＴＡ、５ｇのＢＳＡおよび５ｇのＢＧＧを含有する
ｐＨ7.8 の緩衝液Ｃ中にＤＭＡＥ−標識アフィニティー
精製抗−ジゴキシンを含む0.05ｍｌのトレーサ（２×10
6 ＲＬＵ）とを調製した。標準物とトレーサとを12×75
ｍｍのポリスチレン試験管中で混合し、37℃で10分間に
亘り定温放置した。次いで緩衝液Ｂ中のＣＰＧ−ＢＧＧ
−ジギトキシン１ｍｇを添加して混合し、混合物を37℃
で10分間に亘り定温放置した。緩衝液Ｂ中のＰＭＰ−ヤ
ギ−抗−マウス−ＩｇＧ（マサチューセッツ州、ボスト
ンのアドバンスト マグネティック社）0.05ｍｇを添加
し、10分間に亘り標識抗体−分析物複合体を捕獲させ
た。ピラン等によりClinical Chemistry 33巻、1517−
1520頁（1987）に記載されているように、試験管を磁気
分離器内に配置し、ＰＭＰを脱イオン水で２度洗浄し、
ルミノメータ（マジック ライト アナライザーＩＩ、
チバコーニング ダイアグノスティクス社）内でＰＭＰ
に関連する化学発光を測定した。
【００５３】競合検定のために、ＣＰＧ−ＢＧＧ−ジギ
トキシンを緩衝液のみと置き換え、ＰＭＰ−ヤギ−抗−
マウス−ＩｇＧをＰＭＰ−ＢＧＧ−ジギトキシンと置き
換えた。
【００５４】競合検定と本発明の非競合検定との標準曲
線を図８に示す。濃度がゼロでの信号からの分画として
の変化に基づいて、非競合検定は競合検定より約８倍も
感度が高いことが分かる。ジギトキシン溶液の連続の希
釈により、非競合検定は競合検定より10倍もジギトキシ
ンとの交差反応性が低いことが分かった（0.05％対0.5
％）。
【００５５】実質的にバイアー等により記載されたよう
に３種類目のジゴキシン検定を行なった。室温で１時間
に亘り0.025 ｍｌの標準物と0.05ｍｌの標識抗体とを定
温放置し、0.1 ｍｌ中の0.25ｍｇのＣＰＧ−ジギトキシ
ンを添加し、混合物を５分間に亘り定温放置した。臨床
遠心分離機内において１分当たり2000回転の回転速度で
10分間に亘り試験管を回転させ、0.1 ｍｌの透明な上澄
をピペットで吸引し、新しい試験管に移した。この２つ
目の試験管に0.5 ｍｌ中の0.05ｍｇのＰＭＰ−抗−ＤＭ
ＡＥを添加し、混合物を室温で30分間に亘り定温放置し
た。全ての試薬は緩衝液Ｂ中のものであった。それに続
く処理と光測定を初めのジゴキシン検定の場合と同様に
行なった。本発明の非競合検定に対して比較するため
に、遠心分離工程まで同一であった二重の検定（duplic
ate assay ）を同時に行なった。遠心分離を省いて、0.
05ｍｇのＰＭＰ−抗−ＤＭＡＥを添加し、さらに30分間
に亘り定温放置した。さらなる処理と読出しを他のジゴ
キシン検定と同様に行なった。２種類の非競合検定によ
り得られた標準曲線を図９に示す。バイアー等の方法に
より得られた曲線のほうが全てに亘り低い信号を与える
のが明らかである。この結果は、全体で0.175 ｍｌの定
温放置混合物から0.1 ｍｌを移したことにより少なくと
も一部は説明される。この操作は、沈殿物を浮遊させて
感度を悪くすることを避けるために行なった。この沈殿
物のために、ＣＰＧを２番目の試験管に移す必要性が生
じる。
【００５６】実施例４．甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）
検定 実施例１に記載した方法にしたがってマウス（Ｂａｌｂ
／ｃ）をヒトＴＳＨにより免疫化することによって、モ
ノクローナル抗−ＴＳＨ抗体（７Ａ１０および１１Ａ
８）を調製した。マレイミド活性化キーホールリンペッ
トヘモシアニン（ピアース ケミカル社）に結合した抗
−ＴＳＨ（７Ａ１０）のＦａｂ２断片でマウス（Ａ．Ｓ
Ｗ）を免疫化することにより抗イデオタイプ抗−抗−Ｔ
ＳＨ（７Ａ１０）を調製した。「Antibodies：a labora
tory manual 」Ｅ．Ｄ．ハーローおよびＤ．レーン編
集、コールド スプリング ハーバー出版、1988、630
−１頁に記載されているようにペプシンによる切断によ
って、Ｆａｂ２断片を調製した。Ｉ−１２５−ＴＳＨお
よびＰＭＰ−ヤギ−抗−マウス−ＩｇＧを用いて、抗−
ＴＳＨ抗体のスクリーニングを行なった。抗イデオタイ
プ産生細胞をスクリーニングするために、ＰＭＰ−抗−
ＴＳＨ（７Ａ１０）およびＤＭＡＥ−抗−ＴＳＨ（７Ａ
１０）を細胞培養上澄とともに定温放置し、ＰＭＰと標
識との間の架橋の形成によって、抗イデオタイプが存在
することを検出した。架橋の形成をＴＳＨにより阻害さ
せて、抗イデオタイプの特異性を確認した。抗−ＴＳＨ
（７Ａ１０）にＤＭＡＥで標識付け、抗−ＴＳＨ（１１
Ａ８）および抗イデオタイプ抗−抗−ＴＳＨ（７Ａ１
０）を実施例１に記載したようにそれぞれＰＭＰおよび
ＣＰＧ上に固定化させた。
【００５７】ＡＣＳ：１８０器具を用いてＴＳＨ検定を
行なった。試料プローブを用いて反応キュベットに0.1
ｍｌの標準物を添加した。試薬プローブ１を用いて緩衝
液Ｂ中で0.1 ｍｌのＤＭＡＥ−抗−ＴＳＨ（７Ａ１０）
（２×107 ＲＬＵ）を添加した。37℃で2.5 分間の定温
放置後、試薬プローブ２を用いて緩衝液Ｂ中で0.1 ｍｌ
であり0.2 ｍｇのＣＰＧ−抗イデオタイプ（抗−１１Ａ
１０）を添加した。37℃で2.5 分間の定温放置後、試薬
プローブ３を用いて緩衝液Ｂ中で0.25ｍｌであり0.05ｍ
ｇのＰＭＰ−抗−ＤＭＡＥまたはＰＭＰ−抗−ＴＳＨ
（１１Ａ８）を添加した。37℃で2.5 分間の定温放置
後、磁気分離を行ない脱イオン水で２回洗浄し、ＰＭＰ
に関連する化学発光を器具を用いて測定した。２種類の
検定の機構を図１０に示す。
【００５８】標準曲線を図１１に示す。トレーサはアフ
ィニティー精製しなかったので、捕獲抗体としてのＰＢ
Ｐ−抗−ＤＭＡＥの場合、投与量がゼロのときの信号は
比較的大きい。標識されているが非活性のトレーサは捕
獲されなかったので、ＰＭＰ−抗−ＴＳＨ（１１Ａ８）
による捕獲の場合には、投与量がゼロのときの信号が小
さかった。トレーサにアフィニティー精製を行なうこと
により、ＰＭＰ−抗ＤＭＡＥを用いた検定を著しく改良
でき、またＰＭＰ−抗−ＴＳＨを用いた検定も改良でき
ることが明確である。
【図面の簡単な説明】
【図１】バイアー等の検定技術を説明する概略図
【図２】本発明の一実施態様を示す、１つのエピトープ
を有する分析物の検定様式を説明する概略図
【図３】本発明の一実施態様を示す、少なくとも２つの
エピトープを有するサンドイッチ型分析物の検定様式を
説明する概略図
【図４】本発明の一実施態様を示す、遺伝子プローブ検
定を説明する概略図
【図５】自動免疫学的検定器具を用いた、本発明の一実
施態様を示す非競合Ｔ３検定、および競合Ｔ３検定を説
明する概略図
【図６】実施例に記載した、１つのエピトープを有する
分析物の検定の標準曲線を示すグラフ
【図７】実施例に記載した、１つのエピトープを有する
分析物の検定の標準曲線を示すグラフ
【図８】実施例に記載した、１つのエピトープを有する
分析物の検定の標準曲線を示すグラフ
【図９】バイアー等の技術と、本発明の一実施態様であ
る検定技術とによる標準曲線を比較したグラフ
【図１０】本発明の一実施態様である、２つ以上のエピ
トープを処理したタンパク質分析物の非競合検定を説明
する概略図
【図１１】本発明の一実施態様である、固定化抗−標識
または固定化抗−分析物のいずれかを用いたＴＳＨ検定
を説明する概略図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ローリー アン リヴシン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02067 シャロン サミット アヴェニュ ー 19 (72)発明者 ウィリアム ジェイ リオーダン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02116 ボストン ボイルストン ストリ ート 62

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １つの容器中で分析物を測定する結合検
    定方法であって、 ａ． 分析物を含有する溶液を、該分析物上にある第１
    の結合部位に結合する標識特異的バインダーと混合し
    て、分析物−標識特異的バインダー複合体を形成させ、 ｂ． １． 前記分析物に結合しなかった前記標識特異
    的バインダーと結合する分析物誘導体または分析物擬態
    物が付着している不溶性物質を含有する試薬と、 ２． 前記分析物−標識特異的バインダー複合体の一部
    に結合する第２のバインダーを含有する試薬であって、
    前記第２のバインダーが固相に結合しており、前記不溶
    性物質が前記分析物に結合しなかった標識特異的バイン
    ダーに結合することにより、未反応の標識特異的バイン
    ダーが前記第２のバインダーに結合するのを阻害する試
    薬と、を含む１つ以上の物質に工程ａにより得られた溶
    液を接触させ、 ｃ． 前記固相に関連する前記標識を測定する、各工程
    からなることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 免疫学的検定、遺伝子プローブアッセ
    イ、タンパク質結合検定、受容体検定、遊離ホルモン検
    定、または遊離薬物検定であることを特徴とする請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記分析物が１つのエピトープを含有す
    ることを特徴とする請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記分析物が２つ以上のエピトープを含
    有することを特徴とする請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記不溶性物質が、制御された孔を有す
    るガラス、高分子粒子、ラテックス粒子、架橋デキスト
    ランおよび延長表面からなる群より選択されることを特
    徴とする請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記固相が常磁性粒子または延長表面で
    あることを特徴とする請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記固相および該固相に付着した前記分
    析物−標識特異的バインダー複合体を、工程ｂにより得
    られた反応混合物から分離し、前記分析物−標識特異的
    バインダーの標識の量を測定する前に洗浄する工程を含
    むことを特徴とする請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記固相を分離する技術として、磁気分
    離または遠心分離を用いることを特徴とする請求項７記
    載の方法。
  9. 【請求項９】 前記標識特異的バインダーの標識がアク
    リジニウムエステルまたは酵素であることを特徴とする
    請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 １つの容器中で分析物を測定する免疫
    化学測定方法であって、 ａ． 分析物を含有する溶液を、該分析物上にある第１
    の結合部位に結合する標識特異的バインダーと混合し
    て、分析物−標識特異的バインダー複合体を形成させ、 ｂ． １． 前記分析物に結合しなかった前記標識特異
    的バインダーと結合する分析物誘導体または分析物擬態
    物が付着している制御された孔を有するガラスを含有す
    る試薬と、 ２． 前記分析物−標識特異的バインダー複合体の一部
    に結合する第２のバインダーを含有する試薬であって、
    前記第２のバインダーが磁気粒子に結合しており、前記
    分析物に結合しなかった結合標識特異的バインダーが第
    ２のバインダーに結合するのを前記制御した孔を有する
    ガラスが阻害する試薬と、を含む１つ以上の物質に工程
    ａにより得られた溶液を接触させ、 ｃ． 前記磁気粒子に関連するアクリジニウムエステル
    標識を測定する、各工程からなることを特徴とする方
    法。
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