JPS61132870A - 免疫学的分析方法 - Google Patents
免疫学的分析方法Info
- Publication number
- JPS61132870A JPS61132870A JP25520884A JP25520884A JPS61132870A JP S61132870 A JPS61132870 A JP S61132870A JP 25520884 A JP25520884 A JP 25520884A JP 25520884 A JP25520884 A JP 25520884A JP S61132870 A JPS61132870 A JP S61132870A
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- antigen
- immune complexes
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- antibody
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は免疫学的分析方法に関するものである。
（従来技術）
血液、体液等に含まれるグロブリン、酵素等の蛋白質、
ホルモン、細菌、ウィルス等はその分子構造が類似して
いたり、ごく微量であるために、通常の分析方法では同
定、定量が困難である。そこで、これら物質の分析には
、一般に抗原抗体反応を利用した免疫学的な分析方法が
用いられている。
ホルモン、細菌、ウィルス等はその分子構造が類似して
いたり、ごく微量であるために、通常の分析方法では同
定、定量が困難である。そこで、これら物質の分析には
、一般に抗原抗体反応を利用した免疫学的な分析方法が
用いられている。
このような免疫学的分析方法には、例えば標識物質を用
いるものとして、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ｆ
ｌＡ（エンザイムイムノアッセイ）Ｆ【Ａ（フルオロイ
ムノアッセイ）等がある。また、これらの標識物質を用
いる分析方法は、測定系において、例えば標識物質で標
識した抗体（抗原）とサンプル中の抗原（抗体）とが抗
原抗体反応を起こした免疫複合体（３ｏｕｎｄ）と、抗
原抗体反応に関与せず、自由（Ｆｒｅｅ）な状態で残余
する標識抗体（抗原）とを分離する操作、いわゆるＢ−
Ｆ分離を必要とするヘテロジニアス法と、必要としない
ホモジニアス法とに分類される。
いるものとして、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ｆ
ｌＡ（エンザイムイムノアッセイ）Ｆ【Ａ（フルオロイ
ムノアッセイ）等がある。また、これらの標識物質を用
いる分析方法は、測定系において、例えば標識物質で標
識した抗体（抗原）とサンプル中の抗原（抗体）とが抗
原抗体反応を起こした免疫複合体（３ｏｕｎｄ）と、抗
原抗体反応に関与せず、自由（Ｆｒｅｅ）な状態で残余
する標識抗体（抗原）とを分離する操作、いわゆるＢ−
Ｆ分離を必要とするヘテロジニアス法と、必要としない
ホモジニアス法とに分類される。
上記のへテロジニアス法による分析方法としては、特開
昭５３−１０４９５号公報において、カラムクロマトグ
ラフィーを利用してＢ−Ｆ分離を行なうようにしたもの
が提案されている。これは、例えば溶液中の遊離物質（
Ｆｒｅｅ）を選択的に吸着し、免疫複合体（３ｏｕｎｄ
）を吸着しないイオン交換樹脂や、分子ふるい効果を有
するゲルクロマトグラフィー用の充填剤を吸着剤として
用いてＢ−Ｆ分離を行なうというものである。
昭５３−１０４９５号公報において、カラムクロマトグ
ラフィーを利用してＢ−Ｆ分離を行なうようにしたもの
が提案されている。これは、例えば溶液中の遊離物質（
Ｆｒｅｅ）を選択的に吸着し、免疫複合体（３ｏｕｎｄ
）を吸着しないイオン交換樹脂や、分子ふるい効果を有
するゲルクロマトグラフィー用の充填剤を吸着剤として
用いてＢ−Ｆ分離を行なうというものである。
しかし、このようにＢ−Ｆ分離をカラムクロマトグラフ
ィーを用いて行なうものにおいて、多項目の分析を行な
うとすると、項目毎にカラムを作成しなければならない
と共に、反応液を項目毎に異なるカラムに吸着させる操
作が必要となる。したがって、費用がかかると共に、分
析操作が煩雑になり、また、各カラムにおいて免疫複合
体の大きさや形状にばらつきがあったり、免疫複合体と
遊離物質との大きざが近接しているとＢ−Ｆ分離が困罵
となり、精度が悪くなる。このため、例えば免疫グロブ
リン等の試薬として用いる抗体と同じ分子や、化学的、
物理的に類似した分子の測定には使用できず、分析項目
が極めて制限される。
ィーを用いて行なうものにおいて、多項目の分析を行な
うとすると、項目毎にカラムを作成しなければならない
と共に、反応液を項目毎に異なるカラムに吸着させる操
作が必要となる。したがって、費用がかかると共に、分
析操作が煩雑になり、また、各カラムにおいて免疫複合
体の大きさや形状にばらつきがあったり、免疫複合体と
遊離物質との大きざが近接しているとＢ−Ｆ分離が困罵
となり、精度が悪くなる。このため、例えば免疫グロブ
リン等の試薬として用いる抗体と同じ分子や、化学的、
物理的に類似した分子の測定には使用できず、分析項目
が極めて制限される。
（発明の目的）
本発明の目的は、上述した不具合を解決し、多項目の分
析を短時間で容易に、しかも高精度にできる免疫学的分
析方法を提供しようとするものである。
析を短時間で容易に、しかも高精度にできる免疫学的分
析方法を提供しようとするものである。
（発明の概要）
本発明の免疫学的分析方法は、サンプルと、複数の抗原
または抗体を所定の物質で標識した複数の標識抗原また
は抗体と、複数の粒径を有し、粒径毎に興なる抗原また
は抗体を固相化した複数の担体とを反応させた後、その
反応液を流しながら前記担体を順次検出し、この検出し
た担体の粒径情報に基いて前記サンプル中の所定の複数
の物質を各別に分析することを特徴とするものである。
または抗体を所定の物質で標識した複数の標識抗原また
は抗体と、複数の粒径を有し、粒径毎に興なる抗原また
は抗体を固相化した複数の担体とを反応させた後、その
反応液を流しながら前記担体を順次検出し、この検出し
た担体の粒径情報に基いて前記サンプル中の所定の複数
の物質を各別に分析することを特徴とするものである。
（実施例）
第１図は本発明の分析方法における反応模式図の一例を
示すものである。本例において、符号１゜２および３は
それぞれ担体に用いるポリスチレン製のラテックスで、
粒径は例えばラテックス１が０．５μ、ラテックス２が
１．０μ、ラテックス３が１．５μというように、８径
で均一なものを用いる。
示すものである。本例において、符号１゜２および３は
それぞれ担体に用いるポリスチレン製のラテックスで、
粒径は例えばラテックス１が０．５μ、ラテックス２が
１．０μ、ラテックス３が１．５μというように、８径
で均一なものを用いる。
符号４．５および６は８径のラテックス１，２および３
にそれぞれ物理的吸着により固相化した固相抗体である
。また、符号７．８および９はサンプルである血清等に
含まれている抗原で、符号１０゜１１および１２はそれ
ぞれの抗原７．８および９に特異的に結合する抗体をＦ
ＩＴＣ等の螢光物質で標識した標識抗体である。
にそれぞれ物理的吸着により固相化した固相抗体である
。また、符号７．８および９はサンプルである血清等に
含まれている抗原で、符号１０゜１１および１２はそれ
ぞれの抗原７．８および９に特異的に結合する抗体をＦ
ＩＴＣ等の螢光物質で標識した標識抗体である。
以下、ヒト免疫グロブリンクラスの特異性分析を例にと
って説明する。
って説明する。
粒径０．５μのラテックス１には抗ヒトＩｇＧ抗体４を
、粒径１．０μのラテツク゛ス２には抗ヒトＩｆｌｌＡ
抗体５を、粒径１．５μのラテックス３には抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体６をそれぞれ固相化する。なお、これらの固相抗
体には、ラテックス同志の非特異吸着をなくす意味と、
抗原との特異性を増強する意味で、モノクロナル抗体の
使用が望ましい。反応は、反応用緩衝液２００μβにこ
れらの抗体結合ラテックス溶液５０μぶと、ヒトＩ（ｌ
Ｇ７、ＩｇＡ８、Ｉ（ｌ Ｍ９等の抗原が含まれたサン
プル１０μ℃と、それぞれＦｔＴＣで標識した抗ヒトＩ
ｇＧ抗体１０、抗ヒトＩｇＡ抗体１１、抗ヒトＩｇＧ抗
体１２の混合溶液５０μ℃とを添加して行なわせる。こ
こで、標識抗体１Ｇ、 １１．１２は非特異吸着を少な
く、また反応速度を高める目的でＦａｂフラグメントを
用いることが望ましい。また、これらの試薬類は全て同
時に添加しても、また抗原を同相抗体と反応させて後、
標識抗体と反応させるように逐次添加しても良い。
、粒径１．０μのラテツク゛ス２には抗ヒトＩｆｌｌＡ
抗体５を、粒径１．５μのラテックス３には抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体６をそれぞれ固相化する。なお、これらの固相抗
体には、ラテックス同志の非特異吸着をなくす意味と、
抗原との特異性を増強する意味で、モノクロナル抗体の
使用が望ましい。反応は、反応用緩衝液２００μβにこ
れらの抗体結合ラテックス溶液５０μぶと、ヒトＩ（ｌ
Ｇ７、ＩｇＡ８、Ｉ（ｌ Ｍ９等の抗原が含まれたサン
プル１０μ℃と、それぞれＦｔＴＣで標識した抗ヒトＩ
ｇＧ抗体１０、抗ヒトＩｇＡ抗体１１、抗ヒトＩｇＧ抗
体１２の混合溶液５０μ℃とを添加して行なわせる。こ
こで、標識抗体１Ｇ、 １１．１２は非特異吸着を少な
く、また反応速度を高める目的でＦａｂフラグメントを
用いることが望ましい。また、これらの試薬類は全て同
時に添加しても、また抗原を同相抗体と反応させて後、
標識抗体と反応させるように逐次添加しても良い。
ここで、例えば３７℃、１０分間反応させると、各固相
抗体ラテックス−抗原−標識抗体の免疫複合体（Ｂｏｕ
ｎｄ） １３．１４．１５と残余の標識抗体（Ｆｒｅｅ
）１Ｇとが生成される。本例では、これを第２図に示す
フローサイトメータに流して測定する。
抗体ラテックス−抗原−標識抗体の免疫複合体（Ｂｏｕ
ｎｄ） １３．１４．１５と残余の標識抗体（Ｆｒｅｅ
）１Ｇとが生成される。本例では、これを第２図に示す
フローサイトメータに流して測定する。
フローサイトメータは既に知られているように、細胞の
分析専用機であり、７０−セル２１中のニードル２２に
反応液２３を流し、レーザ光２４をその流れに照射して
細胞から発する散乱光や螢光を測定する。通常、前方散
乱光はレーザ入射光とほぼ水平に位置するディテクタ２
５で検知され、主に細胞サイズの測定に用いられる。螢
光は、レーザ光２４の入射角に対して垂直方向に位８す
るディテクタ２６で検知され、細胞表面の螢光物質等の
測定に用いられる。レーザ光２４は単一波長であるため
、使用できる螢光色素に制限があるが、本例の分析方法
において用いる螢光色素ＦＩＴＣは波長４８９ｎｍ近く
の光を吸収して波長５１５ｎａの螢光を発するので、こ
の場合は波長４８８ｔ＋ａ＋のＡｒレーザを用いれば良
い。
分析専用機であり、７０−セル２１中のニードル２２に
反応液２３を流し、レーザ光２４をその流れに照射して
細胞から発する散乱光や螢光を測定する。通常、前方散
乱光はレーザ入射光とほぼ水平に位置するディテクタ２
５で検知され、主に細胞サイズの測定に用いられる。螢
光は、レーザ光２４の入射角に対して垂直方向に位８す
るディテクタ２６で検知され、細胞表面の螢光物質等の
測定に用いられる。レーザ光２４は単一波長であるため
、使用できる螢光色素に制限があるが、本例の分析方法
において用いる螢光色素ＦＩＴＣは波長４８９ｎｍ近く
の光を吸収して波長５１５ｎａの螢光を発するので、こ
の場合は波長４８８ｔ＋ａ＋のＡｒレーザを用いれば良
い。
このようにして、反応後の第１図に示す免疫複合体１３
．１４．１５と残余の標識抗体１６とが混ざり合った反
応液２３をニードル２２から７０−セル２１中に導入し
、ニードル２２中を流れる各免疫複合体と残余の標識抗
体等の各成分のレーザ光２４による散乱光および螢光を
ディテクタ２５および２６でそれぞれ検知すれば、ディ
テクタ２５によって各免疫複合体の大きざが測定され、
しかもその大きさは各ラテックスの径が１μ前後であれ
ば、せいぜい数ｎ―の固相抗体−抗原−標識抗体結合部
は誤差範囲となるから、殆んどラテックスの粒径に依存
する。また、同時にディテクタ２６により、各ラテック
ス上に乗った螢光量／１ラテックスが測定され、これら
２つのパラメータによって第３図に示すサイトグラムが
得られる。なお、第３図において縦軸は螢光量を、横軸
は粒子径を表わす。
．１４．１５と残余の標識抗体１６とが混ざり合った反
応液２３をニードル２２から７０−セル２１中に導入し
、ニードル２２中を流れる各免疫複合体と残余の標識抗
体等の各成分のレーザ光２４による散乱光および螢光を
ディテクタ２５および２６でそれぞれ検知すれば、ディ
テクタ２５によって各免疫複合体の大きざが測定され、
しかもその大きさは各ラテックスの径が１μ前後であれ
ば、せいぜい数ｎ―の固相抗体−抗原−標識抗体結合部
は誤差範囲となるから、殆んどラテックスの粒径に依存
する。また、同時にディテクタ２６により、各ラテック
ス上に乗った螢光量／１ラテックスが測定され、これら
２つのパラメータによって第３図に示すサイトグラムが
得られる。なお、第３図において縦軸は螢光量を、横軸
は粒子径を表わす。
ここで、抗原抗体反応に関与しなかった残余の標識抗体
は微径であるから１標識抗体あたりの螢光量の位置３１
に集中する。また、径が１番小さいラテックスにより結
合した第１図の免疫複合体１３は位１１３２に、２番目
に小ざいラテックスにより結合した第１図の免疫複合体
１４は、抗原濃度が高かったのでラテックス１１あたり
の螢光量としてもかなり高い位置３３に示される。また
、一番ラテックス径が大きかった第１図の免疫複合体１
５は、抗原濃度が薄かったので位置３４に示されること
になる。
は微径であるから１標識抗体あたりの螢光量の位置３１
に集中する。また、径が１番小さいラテックスにより結
合した第１図の免疫複合体１３は位１１３２に、２番目
に小ざいラテックスにより結合した第１図の免疫複合体
１４は、抗原濃度が高かったのでラテックス１１あたり
の螢光量としてもかなり高い位置３３に示される。また
、一番ラテックス径が大きかった第１図の免疫複合体１
５は、抗原濃度が薄かったので位置３４に示されること
になる。
このようにして螢光量測定値が得られれば、予めＩｏＧ
、ＩＯＡ、［ｇＭ等各抗原の既知濃度系列から同様にし
て求めた螢光強度と抗原濃度との国保を表わす検量線に
基いてサンプル中の各抗原濃度を求めることができる。
、ＩＯＡ、［ｇＭ等各抗原の既知濃度系列から同様にし
て求めた螢光強度と抗原濃度との国保を表わす検量線に
基いてサンプル中の各抗原濃度を求めることができる。
このように、フローサイトメータと、各抗原に応じて異
なる粒径のラテックスに抗体を固相化したラテックスイ
ムノアッセイとを用いれば、免疫複合体の大きさを、抗
原別に識別することが可能となり、これによりＢ−Ｆ分
離なしに同時に多項目の抗原濃度を測定することができ
る。これは、高速で多検体測定につながるばかりでなく
、抗原、抗体の大きざに比ベラテックス粒子の大きさが
かなり大きいところから、免疫複合体の大きさや形状の
バラツキがかなり小さくなり、したがって測定精度も高
くなる。
なる粒径のラテックスに抗体を固相化したラテックスイ
ムノアッセイとを用いれば、免疫複合体の大きさを、抗
原別に識別することが可能となり、これによりＢ−Ｆ分
離なしに同時に多項目の抗原濃度を測定することができ
る。これは、高速で多検体測定につながるばかりでなく
、抗原、抗体の大きざに比ベラテックス粒子の大きさが
かなり大きいところから、免疫複合体の大きさや形状の
バラツキがかなり小さくなり、したがって測定精度も高
くなる。
なお、本発明は上述した例にのみ限定されるものではな
く、幾多の変更または変形が可能である。
く、幾多の変更または変形が可能である。
例えば、担体はラテックスに限らず、分子量の均一な人
工細胞等、測定対象に応じて任意の形状や大きさのもの
を用いることができる。また、フローサイトメータにソ
ーティング機能を付加して各免疫複合体、残余の標識抗
体をそれぞれ分離することもできる。このようにすれば
、各免疫複合体毎に抗原の分析を行なうことができるか
ら、螢光物質以外の各種の標識物質を用いることができ
ると共に、残余の標識抗体を分離して取出すことができ
るから、これを再使用することができる。更に、フロー
サイトメータに反応装置やオートサンプラ等を付加する
ことによって自動測定も容易に行なうことができる。こ
の場合、フローサイトメータにおける測定速度は約５．
００粒子／ Ｓｅｃであるから、１つのサンプルについ
て１ｘｉｏｓ粒子を測定したとしても、３分前後で高速
に分析することができる。また、本発明は競合法による
分析にも有効に適用することができる。
工細胞等、測定対象に応じて任意の形状や大きさのもの
を用いることができる。また、フローサイトメータにソ
ーティング機能を付加して各免疫複合体、残余の標識抗
体をそれぞれ分離することもできる。このようにすれば
、各免疫複合体毎に抗原の分析を行なうことができるか
ら、螢光物質以外の各種の標識物質を用いることができ
ると共に、残余の標識抗体を分離して取出すことができ
るから、これを再使用することができる。更に、フロー
サイトメータに反応装置やオートサンプラ等を付加する
ことによって自動測定も容易に行なうことができる。こ
の場合、フローサイトメータにおける測定速度は約５．
００粒子／ Ｓｅｃであるから、１つのサンプルについ
て１ｘｉｏｓ粒子を測定したとしても、３分前後で高速
に分析することができる。また、本発明は競合法による
分析にも有効に適用することができる。
（発明の効果）
以上述べたように本発明によれば、サンプル中の数種類
の抗原について各別に分析できるから、数種類のカラム
を作らなくて良り、゛分析時間、手・間が大幅に短縮で
きる。また、ラテックス等の粒子径で多項目を分離して
測定するものであるから、類似の抗原に対しても精度良
く分析することができる。更・に、上述した実施例では
Ｂ−Ｆ分離を必要とせず、反応液をそのままフローサイ
トメータに流すことにより、多項目の分析を行なうこと
ができるから、高速度、多検体測定を目的とした自動化
が可能である。
の抗原について各別に分析できるから、数種類のカラム
を作らなくて良り、゛分析時間、手・間が大幅に短縮で
きる。また、ラテックス等の粒子径で多項目を分離して
測定するものであるから、類似の抗原に対しても精度良
く分析することができる。更・に、上述した実施例では
Ｂ−Ｆ分離を必要とせず、反応液をそのままフローサイ
トメータに流すことにより、多項目の分析を行なうこと
ができるから、高速度、多検体測定を目的とした自動化
が可能である。
第１図は本発明における一例の反応模式図、第２図はフ
ローサイトメータを説明するための図、 Ｎ３図は測定データのサイトグラムを示す図である。 １、 ２． ３・・・ラテックス ４、 ５． ６・・・固相抗体 ７、 ８． ９・・・抗原 １０．１１．１２・・・
標識抗体１３、１４．１５・・・免疫複合体 １θ・・・残余の標識抗体 ２１・・・フローセル２２
・・・ニードル ２３・・・反応液２４・・・レ
ーザ光 ２５．２６・・・ディテクタ第 １図
ローサイトメータを説明するための図、 Ｎ３図は測定データのサイトグラムを示す図である。 １、 ２． ３・・・ラテックス ４、 ５． ６・・・固相抗体 ７、 ８． ９・・・抗原 １０．１１．１２・・・
標識抗体１３、１４．１５・・・免疫複合体 １θ・・・残余の標識抗体 ２１・・・フローセル２２
・・・ニードル ２３・・・反応液２４・・・レ
ーザ光 ２５．２６・・・ディテクタ第 １図
Claims (1)
- １、サンプルと、複数の抗原または抗体を所定の物質で
標識した複数の標識抗原または抗体と、複数の粒径を有
し、粒径毎に異なる抗原または抗体を固相化した複数の
担体とを反応させた後、その反応液を流しながら前記担
体を順次検出し、この検出した担体の粒径情報に基いて
前記サンプル中の所定の複数の物質を各別に分析するこ
とを特徴とする免疫学的分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25520884A JPS61132870A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25520884A JPS61132870A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8131602A Division JP2709296B2 (ja) | 1996-05-27 | 1996-05-27 | 免疫学的分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61132870A true JPS61132870A (ja) | 1986-06-20 |
| JPH0588423B2 JPH0588423B2 (ja) | 1993-12-22 |
Family
ID=17275519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25520884A Granted JPS61132870A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61132870A (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5215815A (en) * | 1975-07-23 | 1977-02-05 | Coulter Electronics | Measurement of presence of antigen or antibody within sample |
| JPS5616872A (en) * | 1979-07-13 | 1981-02-18 | Ortho Diagnostics | Automatized identification and counting method of and apparatus for subclass of specified blood cell |
| JPS5821166A (ja) * | 1981-07-30 | 1983-02-07 | Fujitsu Ltd | 被測定物質分離方式 |
| JPS5826268A (ja) * | 1981-07-22 | 1983-02-16 | インタ−ナシヨナル・リモ−ト・イメ−ジング・システムズ | 懸濁液中の粒子と液体との間の反応物質の分布の分析法 |
-
1984
- 1984-12-03 JP JP25520884A patent/JPS61132870A/ja active Granted
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5215815A (en) * | 1975-07-23 | 1977-02-05 | Coulter Electronics | Measurement of presence of antigen or antibody within sample |
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| JPS5821166A (ja) * | 1981-07-30 | 1983-02-07 | Fujitsu Ltd | 被測定物質分離方式 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0588423B2 (ja) | 1993-12-22 |
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