JPH05504625A - 流量免疫センサ方法と装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 流量免疫センサ方法と装置 基づく方法と、その方法を導（ことを可能にする流量免疫センナ装置に関する。

背景技術 今日、健康と安全のために、環境　または、それら自身が危険であり、あるいは 危険であろうる材料と関連する試料における一部分の存在を迅速に検出する、こ とを可能にすることが必要である。、：れらの一部分は薬品内２食料品内、ある いは９人体の流体の試料内に存在しつる。さらにこれらの一部分は空気中または 水中に存在しつる。かかる一部分はここでは検査対象物（ｔａｒｇｅｔ）または 検査対象物の一部分（ｔａｒｇｅｔ　ｏｘ＋１ｅｔｙ　）として参照される。

検査対象物はたとえば食料品の中に有毒材料として存在するもの、または。

空気中または給水内に有毒媒体として存在するものであり、健康に対しである危 険を及ぼす可能性がある。さらに検査対象物はたとえば爆発性および不法な薬品 によってしみ出される蒸気であり１人間の福祉にとっである危険の存在を示す化 学品でありうる。またさらに検査対象物（九特定の構成物または動物の体内の流 体の内部に見出される物質代謝物（ｃｏｅｔａｂｏｌｉ　ｔｅ）でありうる。こ れらの後者の検波が利用でき、あるいは提案されている。食料または水の内部に おける有毒物はバッチ基準処理（ｈａｔｃｈ　ｂａｓｉｓ　）に関連した化学的 な検査によって検出される。さらに、空気または水の内部の有毒物は連続的なプ ロセスによって検出できるが、確定（肋するためには（ｔｏ　ｄａｔｅ　）　、 　これらのプロセスはその目的を遂行するために相当多くの検査対象物の試料を 必要とする。さらにそれらの検査は相互間を識別せず、また（も多（の検査対象 物に対して盲目である。多くのバッチ検査は体内流体の物質代謝物または構成物 の検出および同定のために存在する。これらの検査の多くのものが実質的に瞬間 的な答えを提供せず、また（を迅速な「あなたが待機している間の答え（ｗｈｉ ｌｅ−ｙｏｕ−ｗｉｔ　ａｎｓｗｅｒｓ）　Ｊを提供しないここでは、検査に提 供されているまたは導入されている試料について２分または３分以内の答えを提 供する検査として、実時間検査が規定される。環境から試料を除去し、複数のハ ンドリングおよび転送動作に対してそれを対象化するに要する検査は、読みを展 開する時間または培養時間（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｅｅ　）とともに、実 時間検査とは考えない。単なる図解の例示として、流れている空気または水の流 れから試料を除去し、検査によって指示される条件が環境内の条件を示すように １分以内で答えを提供するものは、実時間検査と考えられる。

今町非常に関心のある２つの分野が薬品の検出および爆発性材料の検出である。

これら２つの形式の材料を検出することに関する化学的な問題は顕著に異なるが 、物理的な問題はしばしば同じである。両者はともに実時間検査を要求する。同 様にまた。試料ごとの（ｓａｍｐｌｅ−ｂｙ−λ哩１ｅ）状況における一部分の 存在を検出する実時間方法の必要性が存在し、試料は迅速に特徴づけら札適切な 行動がとられる。このことは犯罪状況における簡単な品質検査であり、薬品とし ての試料、血液としての試料、または、精液としての試料を同定する。

テロリズムの行動として、爆弾が海外航空機内または建造物内に配設される。爆 発性装置は通常小さく隠されており、包囲され空間に制限されている。そのよう な行動に対する防御としては、隠蔽場所内の爆発性材料を検出することを要求す る。同様に、不法な薬品（トラッカが小さく隠されて、包囲されて、そして、空 間に制限されて２国内、建造物内、または他の保管場所に密かに導き入れられる 。多くのドラッグおよび爆発物の蒸気圧力は、非常に少量でも空気をサンプリン グすることによって検出することができるものである。特定の検査対象物の検査 対象物蒸気のそのような非常に少量の検出は、識別し検出する装置、検査方法お よび材料を要求する。

グリフイス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）　、その他に与えられた米国特許第４．　８１ ８．　８７０号は「スニファ（ｓｎｉｆｆｅｒ　）　Ｊ装置を用いた空気サンプ リングプローブを記述する。これらの装置はドラッグおよび爆発物から蒸気を検 出することを試みている。グリフイスの発明における検出装置は質量分析器であ る。米国特許第４，８６８．４８９号は電子捕捉検出装置を用いて爆発物を検出 する手段を開示する。

米国特許第４．８４９，６２８号、第４．７７６．４０９号および第４，８８４ ．８３９号は、イオン源またはフォトイオン検出器を用いる大気サンプリング装 置を記述する。米国特許第４，３６０，７７６号において、バウマン（ＢａＬ［ ＩＩａｎ）は検査対象媒体物（ｔａｒｇｅｔ　ａｇｅｎｔ）を検出するため、電 子スピン共鳴技法における抗体の使用を記述する。

モノクロナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体技術は驚（はど近代化学および医学 分析技術に変化してきている。モノクロナル抗体技術が非常に特定的な大量に利 用できる抗体に適用されているから、抗体を被覆したサポートを包含しているコ ラムが抗原を純粋化するために一般的に使用できる。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡＳ　（Ｅ！ｎｚｙｍｅし１ｎｋｅｄ　ＩａｎｕｎｏＳｏｒｈａｎ ｔ　Ａｓ５ａｙｓ）などの抗体基準検出システムおよび放射性免疫分析検査が開 発されており、良好な抗体の特定性および感度をもたらしている。しかしながら 、感度はよいがこれらの技法は時間がかかり２通常、複数のマニュブレータ、お よび／または、添加試薬を必要とする。

抗体は、それらの本来の特性としての感度および選択性に起因してバイオセンサ における検出素子として使用する自然の候補である。

抗体と一体化されているバイオセンサは免疫センサとして分類されている。

これまで多くの免疫センナが報告された（Ｉｖｅｓ、その他２．へ２２ユ１」」 より１ｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　ｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年、３月１０ 日；　Ａｎ　ｄ　ｒ　ａ　ｄ　ｅ、その包米国特許第４，３６８，０４７号（１ ９８３）；Ｐｍｐｓｏｎ、Ｒ，Ｂ、およびＦ、Ｓ、Ｌｉｇｌｅｒ）、ＮＲＬメモ ランダム報告書（６１８２，１９８８）に開示のものは抗体と抗原との連合体に 依存しており、大きな分子を検出するための直接結合またはサンドイッチ分析物 として、または、小さい分子を検出する競合分析物（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　 ａｓｓａｙｓ）として、構成されている。

ＥＬＩＳＡの広範囲の使用および親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフィ 固溶体インターフェースにおける抗原・抗体結合の動力学の理論的な考察を刺激 してる比率は、動かないようにされている構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　）の 密度（ｄｅｎｓｉｔｙ）、抗体親和性、基材の幾何学的形状（ｇｅＣｌｍｅｔｒ ｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ）、および。

自由な構成要素の密度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　）の関数であるように決 定される。上記引用した研究においては、抗原が表面で跳ね返され抗体が溶液内 で自由となる多変数システムのために、上記引用したＳｔｅｎｂｅｒｇ、その他 番九表面反応が拡散比率に比較して速い場合に限り、マクロスコープ的な粒子の 表面における抗体と抗原との連合比率が拡散的な質量の転送（ｄｉｆｆｕｓｉｏ ｎａｌ　ｍｓｓ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）によって制限されることを示している。拡 散が制限されている領域において、その比率は球体の直径に反比例する。

上記において引用したＩｖｅｓ、その他（１９８９）ｔｔそれが等価交換反応で あるという仮定において、過剰なラベルづけされていなし楢１によるラベルづけ された抗原の置換を簡単に討議している。抗原が一価（ｍｏｎｖａｌｅｎｔ）で 低分子重量であるとき＋　Ｉｖｅｓ、その他は交換に１５〜２０分を要すること を結論づけている。

抗原・抗体相互作用のために１分離比率は通常、結合体の強度を決定するように 考慮されている。不活性化抗原からのＩｇＧとＦａｂ’抗体の分離のために、１ ０−’　〜１０−’ｓ　ｅ　ｃ−の範囲の比率定数が得られている（Ｌ　ｉ　ｕ 、その他ＩＥＥＥ　Ｔｒａｎｓ、ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｎ　、、Ｖｏ ｌ、　ＢＭＥ−３３，Ｎｏ、２．１９８６年、２月；上記引用したＮｙｇｒｅｎ 、１９８ｅｒｔｈｅｎ、そのａ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１１５ ．７１（１９８８））。免疫分析のこの代表的な時間間隔のために、結合体はそ れゆえ不可逆であると考えられている。

上記引用したＮｙｇｒｅｎの研究（１９８７）において、数時間の間にわたって 、不動化された（ｉｍｏｘ＋ｂｉｌｉｚｅｄ）抗原に跳ね返される抗体について 見られる単なる分離は過剰な抗原の存在においてであり總過剰な自由抗原の付加 に依存する抗体親和性コラムからの跳ね返された抗原の置換もまた知られている 。

Ａｉｚａｗａ、その他は、Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ、’　８７，７８３　（１９ ８８）、自由な抗原をマイクロモル程度の量を用いて不動化された抗原からの過 酸化水素化（ｐｅｒｏｘｉ　ｄａｓｅ）ラベルづけされたＩｇＧ抗体の「注目す べき」置換を報告している。Ａｉｚａｗａ、その他の報告は不完全である。その 理由（＝時間だけでなく自由抗原に対する抗体の比率が報告されなかったからで ある。

疫分析である。このヒツト・アンド・ラン式免疫分析の問題は、連続的な流量シ ステムでないことである。抗原がコラムに導入されたとき、そこに５分間残るこ とが許可される。したがって、５分周期において、試料の１つのコラム容積のみ が検査できる。またこの期間の間、流量比率よりも拡散が抗原・抗体の遭遇の数 を決定する。さらに加えて、抗原がコラムに不動にさｔｌ、ＩｇＧのＦａｂ’分 解物がマークされたフルオレセント（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　）がそれから跳 ね返される。このＦａｂ’分解物は等個結合状態であるように要求されその結果 として、それが個別の不動化された抗原に跳ね返され解放されそして、再び跳ね 返される。抗原を含む試料が導入されたとき、解放されたＦａｂ’分解物が５分 周期にわたってそれに結合し、溶液フルオレセント複合物（ｃｏｍｐｌｅｘ）が フルオレセント検出器の下流に流れる。

抗体が不法な薬品および爆発物の検出に適用されている。米国特許第４，３５３ ．８８６号において、Ｌｕｋｅｎｓ、その他は麻酔性（睡眠性）蒸気に関するフ ィールド検査を記述している。その検査はテストプレートに装着した抗体を使用 し、蒸気を検出する。この検査はバッチ形式のシステムであり、異なるプレート の露出と展開を必要とする。このシステムは環境を連続的に監視することができ ない。

種々の技法が薬品を単独またはグループのいずれかで検出することを開発してい る。米国特許第４．２３５，８６４号において、Ｋａｕｌ、その他は、（に発見 された複数の薬品を検出し同定する方法を記述している。エクゴニン（ｅｃｇｏ ｎｉｎｅ）の放射ラベルづけされた共役物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）を用いて慣 用的な放射免疫分析方法でコカインを検出する。種々の不法な薬品用の抗体の準 備をする方法がよく知られており、あるものは商業的なソースから利用可能であ る。

抗体を用いる現存する技法は連続的に環境を監視するための能力を有せず。

または、実時間における応答を提供しない。現存するシステムは直接結合、競合 的結合または等価交換反応に依存する半バッチ処理である。

付加的には２本発明の目的は、検査対象物を検出するため、実時間で環境を監視 する方法である。

本発明の他の目的は、少量の検査対象介在物を良好な感度で検出する方法である 。

さらに本発明の他の目的は、実時間で検査対象物を検出することが可能な可搬式 免疫センサである。

本発明のさらなる目的は、連続流量モードにおいて実時間で動作する免疫センサ である。

本発明の他の目的は、実時間で高いおよび低いハブチン（ｈａｐｔｅｎ）両者の 分子重量の検査対象物を検出することが可能な免疫センサである。

本発明のこれらおよび付加的な目的は検査対象物の一部分を検出する下記の方法 によって達成されるのであり、その方法は、　（ａ）検査対象物に抗体特定物を 提供する段階、　（ｂ）抗体の結合サイトをラベルづけされた形体の検査対象物 とともに飽和させる段階、　（Ｃ）飽和された抗体を通過させた検査対象物を含 む媒体を流す段階、　（ｄ）それにより、検査対象物をラベルづけされた抗原に 置換する段階、および、　（ｅ）置換された抗原をラベル用検出器を用いて検出 する段階を具備する。

また本発明は流量免疫センサによって達成され　この免疫センサは、免疫センサ を通して試料を移動させるため免疫センザ通して流れている液体ストリーム、液 体ストリームに試料を導入する受容手段、免疫センサを通る液体ストリームを移 動させる流量制御手段、試料受容手段に接続された交換器であってその中におい て試料が検査対象物のラベルづけされた抗原と接触させ、そして、任意の検査対 象物の存在がラベルづけされた抗原を置換させることを許可させるもの、解放さ れるラベルづけされた任意の抗原を検出するため交換器に接続された検出装置お よび、検出装置から到来する排気物を処分しまたは収集する検出装置に接続され た処分手段を具釘る。

交換器はサポート媒体を包含するチャンバを具備する。抗体はサポート媒体に不 動にされる。その抗体は検査対象物の特定性と感度を認識している。ラベルづけ された抗原は不動化された抗体によって跳ね返される。ここでは当該技術におい て使用される任意のラベルが使用できるが、ラジオロジカル（ｒａｄｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ）またはフルオレセント・ラベルが好適である。ラベルづけされた抗原 は検査対象物の存在において置換されつる。

検出装置はラベルの各形式ごとに異なる。ラベルが放射性ラベルであるとき、検 出器は少なくとも放射性検出器を包含し、検出された放射線の量を検出し。

表示する。フルオレセント・ラベルが使用されるとき、検出装置比少なくともフ ルオレセントに対してフルオロフｔし・ラベルづけされた抗原を励起させる光源 ９発生されたフルオレセント光の量を検出し表示する読み出し手段を乱含する装 置はまた。液体ストリームを形成しその方法と装置を通して試料を輸送する液体 を保持する容器を包含する。最後４１：、免疫センサはその装置を流れる流体を 処理しまたはリサイクルさせる手段を包含する。

図面の簡単な記述 本発明のより完全な理解が下記の好適実施例の記述および添付図面に関連づけて 得られるのであり、これらの図面において、異なる図面における類似の符号は同 じ構造または要素を示す。各々の図面における表記は図解的なものであり。

実際の寸法または詳細な比率を示しているものではない。

図１は本発明の実施例を形成する装置の平面図である。

図２は本発明の実施例の交換器の詳細な図面である。

図３は自由な抗原によってラベルづけされた抗体の置換を図解するチャートであ る。

図４は信号発生に依存する抗体密度の効果を示すグラフである。

図５はモデル抗原の検出の感度を図解するストリップチャート記録の再生である 。

発明を実施する形態 抗体は、そわらの本来の特性なので、バイオセンサにおける検出素子として使用 するための自然な候補である。抗体に使用されているバイオセンサは免疫センサ として分類される。

本発明の方法と免疫センサは、現存する方法と免疫センサと協働することよりも 、異なるメカニズムを介して動作するものと信じられている。用語「免疫センサ 」はここでは、それが装置またはデバイスに組み込まれるとき２本発明の一部と して参照されるように、使用される。

抗体を活動させないようにする抗原結合体（二最小の数時間内に本質的に不可逆 であるように考えられている（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ、その他　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１１３．ｐ、３　（１９８８））。したがって、そのこと（ 九（抗体のモルに対して）低レベルの抗原が液体の連続的な流れの中で検出され る可能性があることが見出されることに驚かされていた。

本発明の方法において（九　ラベルづけられた抗原の置換が数秒間の不均衡な条 件のもとで発生する。反応のメカニズムが静的なシステムにおける抗原／抗体複 合物の活動をさせないよう口それらの記述に続けられないということを仮想化す る。検出方法（＝同様なまたは等価な抗原サイトを育する予め跳ね返された（ｐ ｒｅ−ｂｏｕｎｄ）ラベルづけされた複合物の置換に基づいており、ただ単にコ ラムに対する抗原の結合に基づくものでない。置換反応は、対象物の分子が抗体 ／ラベルづけれた抗原複合物の近傍において等個物が発生することを可能にする 充分な時間を許容させないので、従来技術の簡単な等個結合を反映していない。

本発明の方法と免疫センサは、抗体と抗原との連合に代えて、抗体結合サイトか ら抗原を分離させることに関連している。

先に引用した１ｖｅｓ、その他は等価交換反応の仮定において、ラベルづけされ ていない抗原によってラベルづけされた抗原の置換を簡単に討議している。

抗原が１価で低分子重量である限り、Ｉｖｅｓその他は交換が１５〜２０分以内 で完了に到達することを結論している。ここで記述するシステムにおいては、置 換は数秒で起こる。

本発明の方法と免疫センサまたは流れ免疫センサとして参照されるゴールは、特 定的な化学物または微生物学的な試料（ＦｃＪＲ′）の存在に関する環境を連続 的に監視することにより検査対象物の存在をほとんど瞬間的に指示することを提 供することにある。その方法と免疫センサは複数の化学品または試料を同時に監 視するのに使用できる。

本発明は疑いのある材料の流れが連続するということが期待されている状況に限 定されない。本発明の概念は、　「流れ（Ｂｔｒｅｍ　ストリーム）」として流 れている中から試料を取り出して事象とは分離してそれを分析することに代えて 。

実時間で活性度（または活動Ｉｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を監視することを可能に することにある。もちろん２本発明の方法とデバイス（九液体流量ストリームの 中に試料を注入することによる試料ごとの基準に基づく、１つの特定的な試料ま たは複数の離散的を試料を分析または検査するのにも使用できる。換言すれば、 単一または複数の試料がこの発明の免疫センサにおいてこの発明の方法によって 処理されてドリームを流させることを含み、交換領域は検査対象物のための活動 させないようにしである特定的な抗体に跳ね返されたラベルづけされた抗原を含 む。抗原および抗体はそれらが流れている液体には反応しないようになっている 。交換領域を介して通路に続けて、液体が、必要ならば、ラベルづけされた抗原 のラベルを検出することが可能な検出装置を通過する。

この方法を動作させるため、試料が液体の流れの中に注入され交換領域を通過す る。あるいは試料は、液体の容積内に分散させられ　この液体の容積が試料とし て流れている流れの中に導入される。さらに他の実施例においては、試料が液体 の容積の中に分散させられこの液体の容積が液体が流れているストリームとして 使用される。もし、試料が検査対象物を含む場合、その検査対象物は、それが検 出される検出装置を介して液体の中を流れるラベルづけされた抗原を置換する。

試料を有するまたは試料を有しない液体は検出装置から適切に処理される処分領 域または再生領域に流れる。

本発明において使用される液体（おにバッファ、および、水性希釈試料（ａｑｕ ｅｏｕｓ　ｓａｍｐｌｅ　ｄｉｌｕｅｎｔｓ）である。好適なバッファはたとえ ば、フォスフェート・バッファ処理サリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ ｅｄ　５ａｌｉｎｅ）、はう素バッファ処理すリン（ｂｏｔａｔｅ−ｂｕｆｆｅ ｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）、　ＴＲＩ　Ｓサリン、Ａｌ５ｅｉＶｅｒのバッファ、 および、Ｒｉｎｇｅｒのバッファなどである。微生物学的に使用するバッファは Ｄｏｎａｌｄ　Ｇｕｏｆｆｒｅｙによって監修さｆｇ　ＣＡ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ のＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｈｏｅｃｈｓｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって（１９ ８３年に）刊行された書籍ｒＢｕｆｆｅｒｓＪに一般的に記述されている。液体 が検査対象物および処理過程に使用される試薬のための溶媒である限り、そして 。

液体が検査対象物と、または本発明の方法の試薬と、または免疫センサ装置の構 成要素と、化学的に反応しない限り２本発明に対して、明確な液体は臨界的では ない。

本発明の方法における液体流れの流量比率は、１分間光たり０．１〜２．０ミリ リツトルの間にあるべきであるが、好適には、１分間光たり０．３〜０．　８ミ リリツトルの間である。最適な流量比率は交換器に検査対象物がある時間が最も 短い時間においてラベルづけされた抗原の測定可能な量の置換を発生させるに充 分であるようなものである。

本発明において使用するために適用可能な抗体の拡張範囲は商業的に有効であり 、または２文献として利用可能な調合（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の方法の記述 からなされる。Ｌｉｎ５ｃｏｔｔのディレトクリイ（Ｌｉｎ５ｃｏｔｔ’　ｓ　 Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ”、４０　Ｇｌｅｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｍｉｌｌ　Ｖａｌｌｅｙ 、ＣＡ９４９４１）は、商業的に利用可能な抗体の完全な単一のリストを提供す る。その文献に記載された任意の抗体は広範囲の検査対象物を同定のため本発明 の方法および免疫センサに使用される。または、適合される。

その方法は流体の特定の構成要素を検出するための使用できる。流体としてはた とえば、チロキシン（ｔｙｒｏｘｉｎｅ）、高密度リポプロティン（ｌｉｐｏｐ ｒｏｔｅｉｎ）、低密度リボプロティン、コレステロール、アルブミン（ａｌｂ ｕｍｉｎ）、　α−１アンチトリプシン（ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）、β−２ミ クログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、セルロブラスミン（ｃｅｒｕ ｌｏｐｌａｓｍｉｎ）、　ＣＩ阻害物質（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、　Ｃ１ｑおよ び他の補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）成分、Ｃ−反応性蛋白質、α−２−肝臓の （ｈｅｐａｔｉｃ）蛋白質、クリオフィブリノゲン（ｃｒｙｏｆｉｂｒｉｎｏｇ ｅｎ）、フェリチン（ｆｅｒｒｉｔｉｎ）、ミニリン（ＩＩｌｙｅｌｉｎ）ベー シック蛋白、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、インシュリン、ヒ ユーマン・クリオニツク・ゴナドトロピン（ｂｕｍａｎ　ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　 ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）、発情物質（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）、プロゲステロン （ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）またはバクテリア脳膜炎（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ ）などの病原菌から発散させた抗原、Ｈ，インフルエンザ、Ｎ、メニンブタイブ （ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、　Ｓ、　＝ニーモニア（ｐｎｅｕｍｏｎｉａ） 、ポルディテラ・ベルタスシス（Ｂｏｒｄｉｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ） 、ボレリア・ブルグドルフエリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉＸ リメの病原菌（Ｌｙｍｅ’　ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ））、ブドウ状球菌（ｓｔａｐ ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）などがある 。

本発明の方法と免疫センサの重要な機能は、決定が実時間で行われることにある 。このこ＆Ｇｔ　流体および、セオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）、ジ ゴキシン（ｄｉｇｏｘｉｎ）、　Ｌ−ドーパ（ｄｏｐａ）、インシュリン、コカ インとその物質代謝物、カナビス（ｃａｎｎａｂｉｓ）物質代謝物、ヘロインま たはモルヒネ物質代謝物などの治療薬および乱用（誤用）している薬品の試料の 瞬間的な評価を可能にする。これらの治療薬および乱用されている薬は適切な抗 体およびラベルづけされた抗原を包含している交換器を介して流れるストリーム の中に試料を注入または溶解させることにより試料ごと監視できる。

最も大事なことは、包囲している空気または水などの環境が、痕跡（ｔｒａｃｅ ｓ）、または、危険な材料の蒸気および不法なドラッグの蒸気ＴＮＴ、ＲＤＸ、 ＲＥＴＮ、または他の爆発物などの種々の爆発物、または、微生物学的または化 学的な戦争媒体、トキシン（ｔｏｘｉｎｓ）、ニトロベンゼン、イソジオシアネ ート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｓ）、および、他の水および大気汚染物の ために連続的に監視され得ることである。

本発明の方法と免疫センサは、醗酵処理または物質の酵素変換の監視にも使用で きる。

本発明の方法の主要な利益は、流れる流体以外の試薬が、もし「ヒツト」として 参照されるポジティブな結果が検出されない限り、使い果たされないことにある 。この方法を自動化する装置の適切な設計によると、　「ヒツト」が存在するま でバッファが繰り返して使用できる。「ヒツト」に続けて交換領域が置換される 。または再生される。

交換領域を再生するため、過剰なラベルづけされた抗原を含む流体が交換領域に 導入される。ラベルづけされた抗原がラベルづけされていない検査対象物を交換 し、抗体結合サイトを飽和させる。再生が等価交換反応であるから、バッファ内 のラベルづけされた抗原の集中はできるだけ高（なるべきであり、交換領域内の ラベルづけされた抗原の停留時間は完全な交換を促進させるべ（できるだけ長く なるべきである。

この方法ど免疫センサは抗原−抗体結合体の不可逆性に依存する。ラベルづけさ れた抗原複合体ｉｔ　水溶解性が維持されている限り１種々の化学組成を存し得 る。ラベルづけされた分子の抗原サイトは検出されるべぎ抗原と同一である性質 を有しない。抗体結合体を禁止しないが結合親和性を減少させるラベルづけされ た抗原についての修正（あ置換反応を実際に強調させうるし、その結果として、 システムの感度を向上させる。

「鮒」時間なしで迅速に検出され得る任意のラベルが使用できる。ラベル（も放 射性ラベル、フルオロフナレス（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）、りＤ’７フｔレ ス（ｃｈｒｏｍｐｈｏｒｅｓ）、電子能動性（ｅｌｅｃｔｒｏａｃｔｉｖｅ）グ ループおよび電子スピングループを包含するが、これらに限定されない。好適な もの（Ｌ放射性ラベルおよびフルオレセント・ラベルである。放射性廃棄材料の 処分の困難性により、フルオレセント・ラベルが最も好適である。

フルオレセント・ラベルづけされた抗原複合体の２つの特徴は感度を最小にする ために臨界的である。まず、フルオレセント抗原複合体はコラムマトリクスにま たは流量経路内の任意の組成に直接固着差させなければならない。第２に。

最も高い感度のために、フルオレセント・ラベルづけされた分子ごとにただ１つ の抗原サイトが好適である。複数の抗原サイトを包含する複合体が用いられるが 、感度はさほど良好でない。

流量免疫センサの原理的な部分１ｔ（１）対象とする抗原の特定的な微生物学的 認識のための活動が停止された抗体を包含するコラムおよびサポート媒体。

（２）ラベルづけされた抗原複合体および、　（３）流量監視システムまたは検 出器である。もちろん、完全に動作可能な免疫センサ装置を構成させるには接続 管、ポンプおよび弁などの補助的な装置を必要とするが、ひとたび本発明の原理 が理解されれば、補助的な装置などの接続手段は通常の方法で行われる。特定的 な構成要素は２本発明の方法の試薬を関心の対象としないまたは汚染しない材料 で製造されなければならない。必要とされているので、そして、そのようなデバ イスについての知られている従来の方法において、コンピュータハードウェアお よびソフトウェアがそのシステムを自動化するのに付加できる。

図１はそのシステムの異なる構成を示すために使用される図解図である。流体は 容器１１に収容されている。流体は容器１１から流れて管２２を通ってそして適 切な制御弁２１を通って適切なポンプ１９に流れ込む。ポンプ１９はそのシステ ムを汚染させることなしにそのシステムを介して定常的な流量比率で比較的少量 の液体を移動させることが可能な形式のものである。

試料受容手段１３もまた管１５を介して弁２１に接続されている。受容手段は免 疫センサの適用に依存して複数の形態をとり得る。１つの実施例において。

１３は流体容器であり得り、その容器の中で試料が溶解されそのシステムとして の装置内に、または、より少量の液体において、スポイト（ｓｙｒｉｎｇｅ）ま たは注入ループによって容器１１から到来する液体の流れに加算される試料とし ての装置内に供給される。他の代替実施例において（お試料受容手段（を液体「 ストロ−（ｓｉｐｐｅｒ）　Ｊまたはミツドウェスト研究所（Ｍｉｄｗｅｓｔ　 Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）によって製造された５ｐｉｎｃｏｎなど の）空気サンプリング装置の形態であり得り。

この装置は環境を連続的に監視し、環境の試料を管２２を流れる液体ストリーム の中に持ち込む。

ポンプ１９から流体が弁２３を介して管２５ａ、ｂ、および／または、Ｃに流れ る。弁２３は転換（ｄｉｖｅｒｔｅｒ）弁であり得り、コラム３５とコラム３１ またはダンプ４５の間の流量を切り換える。またＧｉ他の代替実施例においては 、スプリッタ弁であり得り、この弁は液体流量を３５と３１との間に分割する。

コラム３１は絶対的に必要ではないが、誤った正の信号に対する制御の観点から 好適な実施例である。ドレイン４５は管２５ｃおよび４３を介して弁２３に接続 され、コラム３５および３１から流れる流量を転換する。または、システムをド レインする手段として存在する。免疫センサの好適な形態において、弁２３は交 換クラム３５と制御コラム３１との間の試料を分離する。交換フラム３５および 制御コラム３１はある特定的な形状としては必要とされないが、管、コラムまた は任意の形状の容器であり得り、この容器がサポート媒体３３を包含し、液体ス トリームのための通路を提供し、サポートとこのサポートに活動が停止されてい る抗体とを接触させる。

それが試料とラベルづけされた抗原との間の良好な接触時間を許可し、この免疫 センサまたは方法におけるラベル、検査対象物または他の材料と相互に作用をし ない限り、これらのコラム３５および３１の容積の形状は臨界的ではない。

好適には、ガラス、テフロンまたはステンレススチールなどの化学的に不活性で 硬い材料で製造されたコラムを使用することが好適である。コラム内に保持され ている液体の容量は臨界的ではないが、交換可能な微小コラムを使用するには。

好適な構造としては容積が０．　１〜０．５ｍｌであることが好適である。流量 免疫センサは形に可搬式に製造できる。はぼ２００μｍベッド（ｂｅｄ）容積の コラムが多くの適用に対して充分である。

サポート媒体３３は分析される材料に対して中性的である材料で製造されなけれ ばならず、このサポート媒体は誤ったポジティブな信号または誤ったネガティブ な信号を生成しない。好適な材料は、Ｓｉｇｍａから提供されている５ｅｐｈａ ｒｏｓｅ　（商標）ビーズなどのボリサク力ロイデ（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉ 　ｄｅ）ビーズで駆動される。とりわけ他の適切な材料はシリコン、ガラスピー ズ、中空のファイバまたはアクチベイト、ポリマーである。サポート媒体は交換 コラム３５および制御コラム３１の両者内に存在する。さらなる代替実施例にお いて（九中空のファイバまたは毛細管の束が管とサポート媒体として同時に提供 されつる。サポートとして作用する管の表面面積と流体を通過させる通路として 作用する束におけるまたはその周囲における通路である。

抗体８７はサポート媒体３３に対して跳ね返り、ラベルづけされた抗原３９とと もに飽和される。交換コラム３５は対象物用の抗体および抗原を包含する。

制御コラム３１は試料としてではない検査対象物用の抗体および抗原を包含する 。一方、交換コラム３５および制御コラム３１の両者において、ラベル９サポー ト、および、コラム材料は同じである。

図１および図２に図解したように、その動作において、検査対象物抗原が交換コ ラム３５に入り込み、抗体３７からラベルづけされた抗原３９を置換する。

置換されたラベルづけされた抗原３９はコラム３５から流出し、管４０を通って その存在が検出される検出器４１に至る。廃棄物４５は管４３に伝導されつ処分 され適切に、リサイクルされる。同時に、制御試料は制御コラム３１を通り。

不応答抗体に接触し、それから管４０ａを通って流れて第２の検出器４１ａに到 り、この検出器はなんの信号も期待されない。流れている制御用液体は処分され 得り、また濡　４３および４５を通ってコラム３５を通って流れる液体に対する ものと同様にリサイクルされる。

検出器４１とそのシスタ（ｓｉｓｔｅｒ）　４１　ａはフルオリメータ（ｆｌｕ ｏｒｉｍｔｅｒ）、スペクトロフォトメータ、放射線検出器、または電極であり うるが、好適には、流量セル、および、流量制御、データ処理および信号発生用 のマイクロコンピュータが設けられたフルオリメータが望ましい。

コラム内で反応物の置換の実行は下記の段階を包含する：固体サポート媒体３３ に活動が制限された抗体がまず過剰な抗原に照射される。この過剰な抗原はラベ ルづけされており、その結果としてラベルづけされた分子が抗体の利用可能な結 合サイトを占める。抗体で被覆されたサポートおよびラベルづけされた抗原が２ ００μｌのコラムに装荷され基準ラインが安定になるまでバッファで洗浄される 。このシステムに用いる代表的な流量比率は０．　３〜０．　８ｍｌ　（ミリリ ットル）７分である。（ラベルづけされていない）抗原を含む検査用試料がコラ ム全体を通過し７　ラベルづけされた抗原が活動が制限されている抗体の結合サ イトから解放され試料内の抗原の濃度に比例した信号が発生されろ。その信号は 流量セルを設けた検出器を介してラベルづけされた複合体流量ダウンストリーム として検出される。

コラムは刀１さく、安価に、そして、交換可能に設計されており、過剰なラベル づけされた抗原によってコラムを廃棄し、または再生することを可能にする。

この回復収容能力は溶解されている抗原の「標準」を導入することによりそのシ ステムの周期的な検査を可能にし、ポジティブな信号が発生されることを確実に する。無関係な抗体を含みラベルづけされた分子に対応しているコラムは誤った ポジティブな信号を制御するための使用できる（図４のコラム３１）。試料の流 れは、それが交換コラムを通過するとき１分離され（図１．弁２３）この制御コ ラムを通過する。抗体から抗原の特定されない解放をもたらしつる任意の因子（ すなわち、気有機溶剤）は制御コラムおよび交換コラムから信号をトリガし得る 。

そのデバイスの現在の改定版はスペクトロビジョン（Ｓｐｅｃｔｒｏｖｉｓｉｏ ｎ）から得られるブリーフケースサイズのフルオリメータと一体化されているが 、そのデバイスのその部分はさらに小型に製造できる。小型のレーザもフルオリ メータに一体化でき、感度を向上させる。オプションとして２マイクロコンピユ ータを付加して弁およびポンプを制御し、データを処理し、出力データを発生で きる。

抗原の存在のための連続的なストリームを監視することに加えて、交換コラムは 大量の離散的な試料の自動分析に関連づけて使用できる。たとえば、自動化され た試料シブパー（ｓｉｐｐｅｒｓ）が存在し、９６−ウェル・マイクロタイタ（ ｍｉ　ｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートまたはアレー管から流体を抽出させることが でき、それらを流体の流れに導入できる。上記した免疫センサに関連させて使用 するとき、大量の離散的な試料は非常に迅速にスクリーニングできる。

本発明のこの免疫センサ（九小さな分子を検出する競合する免疫センサを魅力的 に交代させる複数の特徴を有している。第１偽　ピコモル程度の抗原が最小０． ８ミリリットル／分程度の連続的な流量比率で検出できる。流れを停止させるべ ぎ絶対的な要求は存在しないから、抗原置換反応が起こる。第２に、現れない信 号が測定される多くの競合する免疫センサに対して、置換反応は信号を発生する 。小さく２減少する信号を検出するよりもこの装置の信号を検出することか容易 である。第３に、このセンサ自体が比較的小型に製造でき、そして、大量の試料 を連続的に監視しまたはスクリーニングすることに都合がよい。付加する試薬、 露出させる（照射させる）ための混合工程、また（二分析作業期間に行うべき操 作が存在しない。最後に、さらにこの方法と免疫センサとは、小さなならび定的 な適用を図解するように得られるのであり、その技法は本発明を遂行するために 使用される。これらの特定的な実施例はこの適用において記述した本発明の範囲 を制限することを意図しない。

実施例１ ジニトロフェノール（ＤＮＰ）の検出 標準的な手続きを用いて抗体がトレシル・クロライド・活性化されたセフエロセ ４　Ｂ　（ｔｒｅｓｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　５ｅｐｈａ ｒｏｓｅ　４Ｂ）（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｈ　ｅｍ　１ｃａｌ　Ｃｏ、Ｌｏｕｉｓ 、ＭＯ，）に結合された。サポートに跳ね返された蛋白質の量がＣｏｏｍａｓｓ ｉｅブルー分析を用いて決定され続けて、固体サポートにおける蛋白質の密度を 決定するためＡｈｍａｄおよびＳａｌｅｅｍｕｄｄｉｎによってアウトライン付 けられた変形態様が行われた（Ａｎａｌ、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、１４８，５３３〜５４１ページ、（１９８５））、不動化された抗体 の利用可能な抗結合体サイトが、放射ラベルづけされたまたはフルオリセイン処 理された（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅｄ）　Ｄ　Ｎ　Ｐ共役体と、少なくと も一晩ロッキングブラットフｔ−ムで５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商Ｉを用いて培養 させることにより２反応させられ九これらの実施例において２その接合体Ｇｔ　 （名称をｒＮｏｖｅｌＳｕｌｆｏｎａｔｅｄ　Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ　Ｃａｒｒ ｉｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｏｒ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓ ｃｅｎｔ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｏｆ　ＬｉｇａｎｄＳＪ　とするＢｒｅｄｅｈｏ ｒｓｔ、Ｌｉｇｌｅｒ。

ＫｕｓｔｅｒｂｅｃｋおよびＶｏｇｅｌによる特許出願に関連して記述されてい る）テトラ・硫酸化（ｔｅｔｒａ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅｄ）インシュリン　Ａ− チエ一二ノに結合されているＤＮＰからなっていた。ＤＮＰ結合体は、３対ｌの 抗体に対するＤＮＰのモル比率で付加された。使用に先立って直後ロアリコート （整数で割ることができる）・スラリー（ａｎ　ａｌｉｑｕｏｔ　ｏｆ　５ｌｕ ｒｒｙ）が除去され　３０秒間マイクロ遠心分離機で回転させらし」二澄み液が 除去されそして、５ｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）が０．　１％　ｖ／ｖ　Ｔｒｉｔ ｏｎ　Ｘ−１００（１０ｍＭフォスフェート、０．１５Ｍサリン、これは分析を 通じて使用されるシステムバッファである）を有するフォスフェート・バッファ 処理化サリン内で再び浮遊させられた。

貯蔵するため、０．１％　ｖ／ｖのアジ化ナトリューム（ｓｏｄｉｕｎ　ａｚｉ ｄｅ）が媒体に付加されて、バクテリアの成長を禁止させた。

ベット容積５００μｍ　（マイクロリットル）を有するコラムを用いて放射性免 疫分析が行われた。ベット容積２００μｍの準備された５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（ 商標）を有するコラムを用いてフルオロ免疫分析力（行われた。コラムは７ｍｍ の内径を有し、コラムの外部はガラスフリットである。バッファの流れ（お　コ ラムの下流に、そして、適用可能な場合には、フルオロメータの下流に接続され た螺動（ｐｅｒｊｓｔａｌｔｉｃ）ポンプを用いて確立された。コラム放出路（ ｅｆｆｌｕｅｎｔ）の離散的なアリコートが集められたとき、これらはシンチレ ーションカウンタまたは２００ミリリツトルのキューベテ（ｃｕｖｅｔｅｅ）を 装着したＳＬＭ　８０００　フルオロメータで分析された。連続的に監視するた め、放出路は、８ミリリツトルの流量セルおよび９００ｖに設定された高電圧Ｐ ＭＴを設けた５ｐｅｃｔｒｏｖｉｓｉｏｎフルオロメータに指向させられた。Ｓ ＬＭ　８０００および３ｐｅｃｔｒｏｖｉｓｉｏｎフルオロメータの両者は放射 性光線用に５１５ｎｍのバンドパスフィルタが設けられた。

最も正確に置換を定量化するため、ラベルづけされたジニトロフェノール（ｄｉ ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ　：　ＤＮＴ）がヨウ化（ｉｏｄｉｎａｔｅｄ）ＤＮＰ 結合体を用いた自由抗原によってコラムから移送されうること示す初期研究を示 す。図３に示すデータは低レベルの自由抗原によってラベルづけされた抗原の置 換を示す。第１および第２に付加した抗原が減少した後に表示されたラベルづけ された抗原の量はしかしながら依然として測定可能である。

検出感度を向上させるために、装置を動作させる。ならびに、ラベルづけされた 抗原を生成する条件が試験された。試験されたシステム変数は固体サポートの上 の抗体の密度および流量比率を含んだ。増加した信号はより高い抗体密度を有し ていることが判ったし、その結果として、活動が停止された抗原の密度が高いこ とも判った（図４）。このことはたぶん、抗体／ラベルづけされた抗原複合体に 遭遇している自由な抗原のもっともな増加を反映している。この特別な抗原／抗 体組合せの最適な流量比率はほぼＯ，ａミリリットル／分であった（表−１）。

０．　５ミリリットル／分においては、コラムの流体下流内にはラベルづけされ た抗原は検出されなかった。流量比率を減少させると、増加したフルオレセント 抗原が検出されたが、流量比率が０．１ミリリットル／分に接近したとき２　ラ ベルづけされた抗原は大きな容積にわたって分散し、フルオレセンス（ｆｌｕｏ ｒｅｓｃｅｎｅｅ）ピークが広がり、信号対ノイズ分解能が正確でなくなった。

表−１ 流量比率の効果 流量比率　抗原　信号　ピーク （ｍ１／分）　（ｎｇ／ｍｌ）　フルオレセンス単位　（ｈ／ｗ＋／ｌ　ｍａｘ 　）０．１８　２５０　１２０　１．２ ０．３１　２５０　９１　１．８６ ０．５３　２５０　４５　５．０ システムを充分利用させるため、ラベルづけされた抗原の置換が特定化された検 査対象物抗原の存在にのみ起こることが本質的である。反応の特定性を確定する ため、インシュリン、グリシン、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、サクロース（ｓｕｃ ｒｏｓｅ）。

０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，および、ボビン・セラム・アルブミン（ ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｎ＋ｅｎ）を包含するコンポパウンドが交 換器に導入された。ラベルづけされた抗原は全（これらでは置換されなかった。

代表的な実験においては、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標）に結合されたアンチＤ ＮＰがまず放射ラベルづけされたＤＮＰ結合体と混合された。洗浄の後、５００ 　）ｔ　１のベットコラムが準備さねウ　リシンに結合されたＤＮＰ　（ＤＮＰ リジン）がバッファストリームに導入されアリコートが放射能の決定のための放 出路から集められた。試料の寸法は全体で４ｎｇから１２ｎｇのコラムに装荷さ れたＤＮＰリジンの範囲にあった（表−２）。４ｎｇのＤＮＰリシンにおいて、 信号は２ｘのバックグランド以下であり、これはこの分析の下限であるように決 定された。

表−２ 放射ラベルづけされたＤＮＰ結合体を用いたＤＮＰの検出ＤＮＰリシン　ＤＮＰ リシン　ｂｋｄ　置換信号　信号／Ｂｋｄ（ｎ　Ｎ４）　（ｎ　ｇ　）　（ＣＰ 　Ｍ＞　（ＣＰ　Ｍ）１７３　１２　４１５　２．３９１　５．８１１５　８　 ２５５　１．１５５　４．５４　１１５　１８５　１．６ ４００μｌの分留（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　）が集められその活動度がシンチレー ションカウンタによって決定され總ピーク活動度が報告された。

放射ラベルづけされた信号分子を用いた対象物抗原の検出と同様に、フッ化物（ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ　）でラベルづけされた信号分子がまたこの分析装置を 用いることができる。５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商ｌに結合されたアンチＤＮＰ抗 体のコラムが準備された。放射ラベルに代えて、信号分子としてフルオレセイン ・ＤＮＰ結合体が用いられた。再び量を変化させたＤＮＰリシンが（０，３ミリ リットル／分で）装置に導入されならびに、ＤＮＰが存在しないリシンが特定性 制御として導入されそれらの結果を表−３に示す。これらの試験において反復し て行われた最小の検出可能な試料の寸法は２００μｍにおいて２０ｎｇ　ＤＮＰ リシンであった。

表−３ フルオレセインＤＮＰ結合体を用いたＤＮＰの検出試料　任意フルオレセイン単 位　信号：ノイズ比率２００ｎｇ　リシン　検出されず　１ （制御） ２０”ｎｇ　ＤＮＰ・リシン　１４　４，６４０ｎｇ　ＤＮＰ・リシン　３８　 １２．７８０ｎｇ　ＤＮＪ”リシン　５６　１８．７最後に、フルオレセイン／ ＤＮＰ／抗原／抗体ペア（抗体親和力は１ｏ−７である）を用いて流量構成にお ける装置の感度水準は、０．３５ミリリットル／分の最適流量比率を用いて決定 された。図５は代表的な試験を示す。抗原はできるだけ低い、０．２ミリリツト ルにおける５ｎｇ　（１４ｘｌ　Ｏ”モル）の濃度で検出され得る。抗原のより 高い濃度が予め動作したものからラベルづけされた抗原の排出が現れる点にいた るまで大きな釣り合った応答を発生し總しかしながら、注目すべきことは、予め ２５，５０，１００および２５０ｎｇの抗原を付加した後、２５０ｎｇの試料が 付加されたとき、顕著なポジティブな信号が依然として発生されたことである。

実施例２ トリニトロトルエン（ＴＮＴ）の検出 ＴＮＴ用のマウス・モノクロナルＩｇＧ抗体特定物が５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商 釦に活動が停止された。利用可能な抗原結合物サイトがフルオレセイン・ＴＮＴ 共役物とともに充満された。このサポートは２００μｍのベッド容積コラムを製 造するのに使用され７’−、ｐＨ７，６，０，１％　ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ− １００を有する）ｔスフエート・バッファ処理されたセリン（ＰＢＳ、１０ｍＭ フｔスフエート）のバッファ流量が確立された。放出路が５ｐｅｃｔｒｏｎ可搬 式フルオリメータに指向され　このフルオリメータの出力がストリップチャート 記録装置に記録され總安定な基準ライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）が得られた視　８ μｇ／ミリリットルで２００μｍのリシン試料が装置のヘッドに操作され　この 装置の特定性が検査されたが、信号は得られなかっ九次に、　ＰＢＳ−Ｔｒ　ｉ 　ｔ　。

ｎ内に２００ｎＨのＴＮＴを含む新鮮に準備された溶液の２００μｍの試料がコ ラムに導入された。２倍の基準ラインよりも大きな信号が一貫して発生された。

その結果を表−４に要約する。

この例示は本発明のアプローチが水性試料内のＴＮＴを特定的に検出できること を実証している。

表−４ ＴＮＴの検出 試料　任意フルオレセイン単位　信号：ノイズ比率２００ｎｇ　リシン　検出さ れず　１ （制御） 動作１ ９６ｎｇ　ＴＮＴ　３６　２．４ ２００ｎｇ　ＴＮＴ　８５．５　３．８フルオレセインを用いた連続流量におけ る対象物の検出。流量比率は０．　３２ミリリットル／分であり、ベッド容積は ２００μｌであった。

実施例３ コカインを検出するため、アンチ・コカイン抗体（Ｂｉｏ　Ｄｅｓｉｇｎ）およ びフルオレセイン・ベンゾールエクゴ＝ン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅｄ　 ｂｅｚｏｙｌｅｃｇｏｎｉｎｅ）を用いた上記のように、２００μｍのベッド容 積のコラムが確立された。５ｐｅｃｔｒｏｖｉｓｉｏｎおよび８μｍの流量セル を用いた連続的な流量条件下で２分析が行われた。種々のコカイン濃度および試 料の容積がコラムに適用された。表−４に要約したそれらの結果Ｇｔ４０ｎｇ未 滴のコカインの検査対象の服用量が免疫センサによって、信号対ノイズ比率が５ ：１以上で、流量の得れに試料の導入後に２０秒以内で、検出できる。

表−５ ３４０ｎｇ　リシン　検出されず　１ （制御） ３６ｎｇ　コカイン　７０８　５．９ ７２ｎｇ　’：１カイン　１．８７０　２０以上１４４ｍｇ　コカイン　２．４ ９６　２０以上コラムベッド容積は抗体被覆された２００μｍの５ｅｐｈａｒｏ ｓｅ　（商標）であり、バッファ流量比率は０．７２ミリリットル／分であっ九 本発明の免疫センサにおいて、フルオロフォレスまたはプロテオリシス（ｐｒｏ ｔｅｏｌｙｓｉｓ　）の付加による抗体の修正は必要ではない。そのような修正 は、抗体活性度の損失を導（可能性があり、抗体親和性に影響を与える可能性が ある。また、ラベルづけされた一部分がそれが反復した解放されるときに洗浄さ れるとき、そこでヒツト・アンド・ラン装置が依存する（Ｇｉｅｓｅその他同書 ）弱い抗体／抗原相互作用は連続的なストリームの装置においては発生されない 。

明瞭なように９本発明の種々の修正および変形形態が上述した技法に照らして可 能である。したがって、添付した特許請求の範囲において２本発明が特定的に記 述した以外のものも実用化されることが理解されつる。

浄書（内容に変更なし） 管　８　号 Ａ＝８０ｕｇ／ｍｌ　（４４，Ｍ　ｏｒ　１．６７ａＱ　ｊ’荷　）ｙｓｉｎｅ Ｂ：２５ｎ９””　（７２ｎＭ　ｏｒ　５　ｎｇ　Ｊｆ；ｒ、Ｑ　ＩＤＮＰ−１ ｙｓ （＝　５０　ｎｑ／ｍ１ ＤＮＰ−１ｙｓ　（１４０ｎＭｏｒｌｏｎｇ　ｇ荷）”Ｏｎ９７ｍ’　（２９０ ｎＭ　ｏｒ　２０　ｎｇ　装荷１”　ＤＮＰ−１ｙｓ Ｅ、２０°”””　（５８０ｎＭ　ｏ、４０ｎｑ　’ＡＲＩＤＮＰ−１ソ５ Ｆ＝４００ｎｑ””（１，Ｉ５ｐＭ　ｏｒ　８０ｎｇ　萌）ＤＮＰ−ｌｙｓ ＦＩ６．５ 開示の要約 検査対象物の一部分を検出する方法は、　（ａ）検査対象物に対して抗体特定物 を提供する段階、　（ｂ）抗体の結合体をラベルづけされた形態の検査対象物と ともに飽和させる段階、　（Ｃ）対象物を通過させた抗体を含む液体を流す段階 。

（ｄ）検査対象物をラベルづけされた抗原に置換することを許可する段階ｒ　（ ｅ）置換された抗原を検出する段階を具備する。

本発明は流量免疫センサによって達成され流れている液体が免疫センサを通して 試料を動かし、受容手段がその液体に試料を導入し、流量制御手段が免疫センサ を通る液体の移動を制御し、交換器が試料を検査対象物のラベルづけされた抗原 に接触させて任意の検査対象物の存在をラベルづけされた抗原に置換し。

検出装置が解放される任意のラベルづけされた抗原を検出し、そして、処分手段 が検出装置力）ら到来する廃棄物を処分または収集する。

手続補正書 平成４年１１月５日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 我々は請求する： １．検査対象物の一部分を検出する方法であって，該方法が，（ａ）検査対象物 に抗体特定物を提供する段階，（ｂ）検査対象物のラベルづけされた類似のもの （ａｎａｌｏｇ）に抗体の結合サイトを露出させてラベルづけされた抗原／抗体 複合物を形成する段階，（ｃ）ラベルづけされたものの先の抗原／抗体複合体に 検査対象物を含む液体媒体を流す段階， （ｄ）検査対象物をラベルづけされた類似物に置換させる段階，および，（ｅ） 置換されたラベルづけされた類似物を検出する段階を具備する検査対象物の一部 分を検出する方法。 ２．検査対象物が，チロキシン，高密度リポプロテイン，低密度リポプロテイン ，コレステロール，アルブミン，α−１アンチ・トリプシン，β−２ミクログロ ブリン，セルロプラスミン，Ｃ１阻害物質，Ｃ１ｑ，Ｃ−反応性蛋白質，α−２ −へパテック蛋白質，クリオフィプリノゲン，フェリチン，ミエリン・ベーシッ ク蛋白質，トランスフェリン，インシュリン，ヒューマン・クリオニック・ゴナ ドトロピン，発情物質，プロゲステロン，バクテリア脳膜炎を具備する病原菌か ら発散させた抗原，Ｈ．インフルエンザ，Ｎ．メニングチデス（ｍｅｎｉｎｇｔ ｉｄｅｓ），Ｓ．ニューモニア，Ｂｏｒｄｉｔｅｌｌａペルタスシス，Ｂｏｒｒ ｅｌｉａブルグドルフエリ，ブドウ状球菌，連鎖球菌，セオフィリン，ジゴキシ ン，Ｌ−ドーパ，インシュリン，コカインとその物質代謝物，カナビス物質代謝 物，ヘロイン，モルヒネ物質代謝物，ＴＮＴ，ＲＤＸ，ＲＥＴＮまたは他の爆発 物，微生物学的戦争媒体，化学的戦争媒体，トキシン，ニトロベンゼン，イソシ オシアネート，水および大気汚染物，酸酵処理の元素，および，酵素変換サブス トレートからなるグループから選択される請求項１記載の方法。 ３．ラベルづけされた抗原／抗体複合体が水溶液であり，分子あたり１つの抗原 を有する請求項１記載の方法。 ４．ラベルづけされた複合体のラベルが，放射化ラベル，フルオロフォレス，ク ロマフォレス，電子能動グループおよび電子スピンラベルからなるグループから 選択される請求項３記載の方法。 ５．ラベルづけされた複合体のラベルが，放射化ラベルおよびフルオロフォレス からなるグループから選択される請求項４記載の方法。 ６．液体媒体が水，バッファ，および，水性希釈試料からなるグループから選択 される請求項１記載の方法。 ７．液体媒体が水，バッファ，および，水性希釈試料からなるグループから選択 される請求項３記載の方法。 ８．液体媒体が水，バッファ，および，水性希釈試料からなるグループから選択 される請求項４記載の方法。 ９．液体媒体が水，バッファ，および，水性希釈試料からなるグループから選択 される請求項５記載の方法。 １０．バッファが，フォスフェート・バッファ処理サリン，ほう素バッファ処理 サリン，ＴＲＩＳサリン，Ａｌｓｅｉｖｅｒの溶液，および，Ｒｉｎｇｅｒの溶 液からなるグループから選択される請求項９記載の方法。 １１．液体媒体はほぼ０．１〜２．０ミリリットル／分の比率で流れる請求項１ 記載の方法。 １２．液体媒体はほぼ０．１〜２．０ミリリットル／分の比率で流れる請求項３ 記載の方法。 １３．液体媒体はほぼ０．１〜２．０ミリリットル／分の比率で流れる請求項６ 記載の方法。 １４．液体媒体はほぼ０．１〜２．０ミリリットル／分の比率で流れる請求項９ 記載の方法。 １５．液体媒体はほぼ０．３〜０．８ミリリットル／分の比率で流れる請求項１ ４記載の方法。 １６．流量免疫センサであって，該センサが，試料を収集する試料収集手段， 試料収集手段に接続された交換器であって下記のものを具備するもの，チエンバ ， チエンバ内のサポート媒体， 媒体に不動化された抗体であって，該抗体が検査対象物の特定性と感度を認識す るもの， 抗体と抗原・抗体複合物を形成し，検査対象物によって容易に置換されるラベル づけされた抗原 収集装置への接続点からの最大流量経路距離の点において交換器に接続された検 出装置， 液体を収容する容器， 収集手段，収集装置，および，検出装置を介してそれぞれ液体を連続的に流す流 量手段， 検出装置に接続され，検出装置から到来する廃棄物を処分または収集する処分手 段 を具備する流量免疫センサ。 １７．液体が水，バッファ，および，水性希釈試料からなるグループから選択さ れる請求項１７記載のセンサ。 １８．バッファが，フォスフェート・バッファ処理サリン，ほう素バッファ処理 サリン，ＴＲＩＳサリン，Ａｌｓｅｉｖｅｒの溶液，および，Ｒｉｎｇｅｒの溶 液からなるグループから選択される請求項１７記載のセンサ。 １９．ラベルづけされた抗原のラベルが，放射化ラベル，フルオロフォレス，ク ロマフォレス，電子能動グループおよび電子スピンラベルからなるグループから 選択される請求項１６記載のセンサ。 ２０．ラベルづけされた抗原のラベルが，放射化ラベル，フルオロフォレス，ク ロマフォレス，電子能動グループおよび電子スピンラベルからなるグループから 選択される請求項１７記載のセンサ。 ２１．ラベルづけされた抗原のラベルが，放射化ラベル，フルオロフォレス，ク ロマフォレス，電子能動グループおよび電子スピンラベルからなるグループから 選択される請求項１８記載のセンサ。 ２２．ラベルづけされた抗原のラベルが，放射化ラベルおよびフルオロフォレス からなるグループから選択される請求項１９記載の方法。 ２３．ラベルづけされた抗原のラベルが，放射化ラベルおよびフルオロフォレス からなるグループから選択される請求項２１記載のセンサ。 ２４．検出器が放射能を測定する手段および検出された放射能の量を表示する手 段を具備する請求項１６記載のセンサ。 ２５．検出器が放射能を測定する手段および検出された放射能の量を表示する手 段を具備する請求項２２記載のセンサ。 ２６．検出装置が少なくとも， フルオロフィロを励起させて光を発生させる放射源，および，発生された光の量 を検出し，読み出された光の量の指示を表示する読み出す手段 を包含する請求項１６記載のセンサ。 ２７．検出装置が少なくとも， フルオロフィロを励起させて光を発生させる放射源，および，発生された光の量 を検出し，読み出された光の量の指示を表示する読み出す手段 を包含する請求項２３記載のセンサ。 ２８．検査対象物用交換器，および，この検査対象物用交換器き並列に設けられ た制御用交換器を有する請求項１６記載のセンサ。 ２９．検査対象物用交換器，および，この検査対象物用交換器き並列に設けられ た制御用交換器を有する請求項１７記載のセンサ。 ３０．検査対象物用交換器，および，この検査対象物用交換器き並列に設けられ た制御用交換器を有する請求項２３記載のセンサ。 ８１．検査対象物用交換器，および，この検査対象物用交換器き並列に設けられ た制御用交換器を有する請求項２５記載のセンサ。 ３２．検査対象物用交換器，および，この検査対象物用交換器き並列に設けられ た制御用交換器を有する請求項２７記載のセンサ。 ３３．各交換器がほぼ０．１〜０．５ミリリットルの容積を有する請求項１６記 載のセンサ。 ８４．各交換器がほぼ０．１〜０．５ミリリットルの容積を有する請求項２８記 載のセンサ。 ３５．各交換器がほぼ０．１〜０．５ミリリットルの容積を有する請求項３２記 載のセンサ。 ３６．サポート媒体が，アクチベート・ポリサクカロイデ・ビーズ，シリカ・ビ ーズ，グラス・ビーズ，中空ファイバ，および，アクチベート・ポリマーからな るグループから選択される請求項１６記載のセンサ。 ３７．サポート媒体が，アクチベート・ポリサクカロイデ・ビーズ，シリカ・ビ ーズ，グラス・ビーズ，中空ファイバ，および，アクチベート・ポリマーからな るグループから選択される請求項１９記載のセンサ。 ３８．サポート媒体が，アクチベート・ポリサクカロイデ・ビーズ，シリカ・ビ ーズ，グラス・ビーズ，中空ファイバ，および，アクチベート・ポリマーからな るグループから選択される請求項２６記載のセンサ。 ３９．サポート媒体が，アクチベート・ポリサクカロイデ・ビーズ，シリカ・ビ ーズ，グラス・ビーズ，中空ファイバ，および，アクチベート・ポリマーからな るグループから選択される請求項３３記載のセンサ。