CN102614948B - 一种微流控芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测、环境监测、临床检测技术领域，尤其涉及一种微流控芯片及其制备方法。为了解决现有技术中生物检测过程中样本用量大，操作步骤复杂的缺陷，本发明提供一种微流控芯片及其制备方法。所述微流控芯片包括基底层、功能层和微流控管道层；所述功能层固定在所述基底层上，其包括至少两条平行的功能条带，所述功能条带为能与特定物质起反应的材料形成的条状带；所述微流控管道层设置有至少两条管道，所述管道与所述的至少一条功能条带相连通，每个管道的两端设置有与大气相通的通孔。本发明提供的微流控芯片能够同时检测多个样本中的多种不同的物质，本发明提供的检测方法操作简单，试剂用量少，节省时间，高效准确。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测、环境监测、临床检测技术领域，尤其涉及一种微流控芯片及其制备方法。
背景技术
现有技术中用于生物检测的方法很多，例如免疫印迹法和酶联免疫法(ELISA法)等免疫分析方法。但这些免疫分析方法需要比较长的分析时间，液体处理过程也比较麻烦，通量比较小(每次只能检测一个项目)，而且需要比较多的生物活性试剂，而微流控分析芯片则可以有效地克服这些缺点。
微流控免疫分析方法是近些年新发展起来的一项技术，该方法以分析化学为主，结合生物化学、物理化学、免疫学等相关学科的成果，在微小结构中操控流体，被称为微型实验室。应用到免疫分析中，对临床疾病诊断具有重要实用价值。例如，在分析样本量非常少的样品时，微流控技术表现出极强的优势，通常需要样品量为几毫升的实验在采用微流控技术后，仅需要几微升的样品量，大大节省了样本和试剂的消耗量，具有广泛的应用前景和重要的应用价值。
发明内容
为了解决现有技术中生物检测过程中样本用量大，操作步骤复杂的缺陷，本发明提供一种能够同时对多种不同的样品进行检测的微流控芯片及其制备方法，本发明提供的微流控芯片能够同时检测多个样本中的多种不同的物质，本发明提供的检测方法操作简单，试剂用量少，节省时间，高效准确。
为了解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：
本发明提供一种微流控芯片，所述微流控芯片自下而上依次包括基底层、功能层和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层的上表面，所述功能层由至少两条平行的功能条带组成，所述功能条带为能与特定物质起反应的材料形成的条状带；所述微流控管道层覆盖在所述功能条带上，所述微流控管道层的下表面设置有至少两条管道，所述管道与所述的至少一条功能条带相连通，每个管道的两端设置有与大气相通的通孔。所述通孔也称为进样孔，与大气相通的一端的开口位于微流控管道层的上表面；为了便于将待测样品加入到管道内，所述进样孔分散设置，相邻的进样孔之间有一定的间隔。上述的特定物质指待测样品。
上述微流控管道层的每个管道与全部功能条带相垂直并在交叉点相连通。
上述微流控芯片的基底层的材料应利于吸附固定所述能与特定物质起反应的材料。例如抗体或抗原，并且不会影响所吸附的抗体和抗原的特异性反应。所述微流控管道层和基底层的材料可选用聚二甲基硅氧烷，玻璃薄片、陶瓷、高分子材料等常用的固相载体。所述高分子材料选自聚苯乙烯、聚碳酸酯等。
上述微流控芯片的基底层为聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜。
上述微流控芯片的基底层和微流控管道层的材料均为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
上述微流控芯片的基底层的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜，微流控管道层的材料为陶瓷。
上述微流控芯片的基底层和微流控管道层的材料可以相同，也可以不同。还可以对基底层材料进行活化处理，使其以共价键交联生物分子，从而提高包被效率和包被物的稳定性。微流控管道层的管道用封闭剂进行表面处理，降低管道的内表面对生物分子的吸附性，进而使得样本中的待检物质可以更 少量的被管道吸附，从而提高检测灵敏度。
上述基底层厚度为0.5-2mm，微流控管道层的底部分布长方体管道，长方体管道宽0.01-2mm，高0.01-2mm，长10-50mm，管道之间间隔1-2mm，管道两端为进样孔，进样孔直径1-2mm，垂直距离(或称高度)1-4mm；上述管道的横截面也可以是半圆形，直径为0.01-2mm，优选的，半圆形的直径为0.5-0.7mm。微流控管道层的长、宽、高与长方体管道的尽寸和进样孔的高度相适应，通常，微流控管道层的长15-60mm、宽0.1-20mm、高1-4mm。
上述微流控管道层通过机械加工，精密机加工，模塑工艺，刻蚀，纳米压印和/或复模法制备。
上述能与特定物质起反应的材料选自生物材料、人工合成的高分子材料、受体或药物分子的结合靶物质。所述生物材料包括抗体、抗原、DNA、RNA、肽链、蛋白质或其组合。
进一步的，上述功能条带选自包被抗体条带、包被抗原条带、或其组合。
上述基底层和微流控管道层紧密贴合在一起。上述基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起。还可以通过粘结剂，如环氧树脂将微流控管道层和基底层粘结在一起。
上述功能条带选自促甲状腺激素(TSH)包被抗体条带、催乳素(PRL)包被抗体条带、促黄体生成激素(LH)包被抗体条带、生长激素(GH)包被抗体条带、卵泡刺激素(FSH)包被抗体条带、皮质醇(Cor)包被抗体条带或其组合；TSH包被抗体浓度为10-100μg/ml；PRL包被抗体浓度为10-100μg/ml；LH包被抗体浓度为10-100μg/ml；GH包被抗体浓度为10-100μg/ml；FSH包被抗体浓度为10-100μg/ml；Cor包被抗体浓度为10-100μg/ml。
进一步的，上述TSH包被抗体浓度为50μg/ml；PRL包被抗体浓度为40μg/ml；LH包被抗体浓度为25μg/ml；GH包被抗体浓度为50μg/ml；FSH包被抗体浓度为27μg/ml；Cor包被抗体浓度为72μg/ml。
在本发明的另一个实施方式中，上述功能条带为肿瘤标志物AFP包被抗 体条带；AFP包被抗体浓度为10-100μg/ml。
本发明还提供一种标记物混合液，包括标记物、稀释剂，所述标记物为标记的生物材料，该标记物能够与待测样品起反应并与待测样品结合在一起；所述待测样品能够与本发明提供的微流控芯片的功能条带中的材料起反应并结合在一起。所述生物材料选自抗体、抗原、肽、DNA、RNA、蛋白质或其组合。
上述标记物为标记抗体，标记抗原，或其组合。
进一步的，上述标记物混合液包括：
(1)TSH、PRL、LH、GH、FSH的标记抗体，所述标记抗体的浓度均为1-10μg/ml；
(2)Cor的标记抗原，浓度为1-10μg/ml；
(3)稳定剂。优选的，采用的稀释剂和稳定剂均为未稀释的新生牛血清。
本发明还提供上述的微流控芯片的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：
(1)将能与特定物质起反应的材料包被或吸附在基底层上，形成功能条带；
(2)将微流控管道层贴合在步骤(1)所得基底层的上表面；所述微流控管道层的管道与所述功能条带相垂直并在交叉点相连通；
(3)用封闭剂封闭步骤(2)中的管道，之后洗涤管道；
(4)干燥，即得所述微流控芯片。
进一步的，上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
(1)、将微流控管道层覆盖于基底层上，向微流控管道层的管道内分别通入包被抗体或抗原，使之固定在基底层相应区域，形成功能条带；
(2)、移除步骤(1)中微流控管道层；
(3)、取清洁的微流控管道层，对步骤(1)所得的基底层的带有功能条带的表面和微流控管道层的下表面进行离子氧化处理，使微流控管道层和基底层贴合在一起；所述微流控管道层的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉 点相连通；
(4)、向步骤(3)中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清，封闭60-200分钟后，在管道内通入PBS冲洗3-4次；
(5)干燥，即得所述微流控芯片。
本发明还提供上述的微流控芯片的使用方法，所述使用方法包括下述步骤：
(1)将待测样品与上述的相应标记物混合液相混合；
(2)将步骤(1)所得的混合液通入微流控管道层的管道内，培育30分钟至2小时；
(3)向各管道内通入PBS冲洗3-4次后，移除管道层，在反应区域内加入相应试剂；
(4)根据试剂性质，检测反应区域的显色、发光或反射性；
(5)根据步骤(4)的结果确定样品中的目标抗体。
用于标记的物质可以是酶、同位素、有机荧光染料或荧光量子点。用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。
常用的封闭剂有0.05％-10％的BSA、10％-100％的新生牛血清、1％明胶、5％脱脂奶粉。本发明采用的封闭剂和稳定剂优选100％新生牛血清(指未稀释的新生牛血清)，由新出生10天内的小牛采血制成，蛋白含量为3.5％-5％(w/v，g/100ml)。本发明可以采用现有制备包被抗体和标记抗原/抗体的方法。
上述微流控芯片主要用于高效筛选，环境监测，生物分析，临床检测，食品安全检测，动物检测等用途。
在某些药物分子的研发和筛选中，可以将一系列受体或药物分子的结合靶物质固定在上述微流控芯片上，然后同时将筛选的多种物质同时通过该微流控芯片，从而确定哪些分子能与哪种受体或靶物质相结合，从而实现高效筛选；同样原理也可以用于监测环境中存在哪些污染物质或确定引起污染的 物质的特征；微流控芯片也可以用于生物分子的相互作用分析，从而揭示生物分子之间的相互关系；在临床检测及监测方面也有重要的应用，可用于肿瘤标志物、激素、病毒、抗生素、毒品等的联合检测。在食品安全检测方面，可以用于检测食品内是否含有禁用的物质，如三聚氰氨、瘦肉精；可以测定食品中的农药残留、抗生素残留、毒素(如黄曲霉素)等。
与现有技术相比，本发明提供的微流控芯片能够同时对多种不同的样品进行检测，具有体积小、比表面积大、反应时间短、分析速度快、试剂和样品用量少、多样品多指标同时检测等优点，本发明提供的检测技术操作简单，高效准确。
利用本发明提供的微流控芯片进行生物检测，准确率高，抗干扰性强，检测灵敏度和特异性灵敏度均较高，而且制备工艺简单，检测操作方便且易掌握，生产成本低，检测费用少，不仅适合专业检测机构使用，也适合例行体检、采/供血、疫情检测、医疗临床检测等方面的使用。
附图说明
图1为本发明提供的微流控芯片的立体结构示意图，其中，微流控管道层由透明材料制成；
图2为本发明提供的微流控芯片的检测方法示意图；
图3为本发明提供的微流控芯片的微流控管道层俯视图；
图4为本发明提供的微流控芯片检测样品结果的发光成像图；
图5为本发明提供的微流控芯片的微流控管道层的立体图；
图6为本发明提供的微流控芯片的微流控管道层的结构示意图；
图7为本发明提供的微流控芯片的基底层的结构示意图；
图8为本发明提供的微流控芯片的微流控管道层的结构示意图；
图9为图8所示微流控管道层的A-A剖面结构示意图；
图10为本发明提供的微流控芯片检测AFP结果的发光成像图；
图11为本发明提供的微流控芯片检测Cor结果的校准曲线图；
图12为本发明提供的微流控芯片检测AFP结果的标准曲线图。
具体实施方式
如图1所示，本发明提供的微流控芯片包括基底层1和微流控管道层2，两层紧密贴合，基底层1的厚度为0.5-2mm，微流控管道层2的底部分布七个平行的长方体管道4，管道两端为进样孔5，进样孔5与大气连通。
如图2所示，本发明提供的微流控芯片(检测装置)的检测示意图，在微流控管道层依次通入TSH、PRL、LH、GH、FSH、Cor的包被抗体，使之固定在基底层1相应区域，弃去管道，在与包被抗体成直角的方向上，平行覆盖上两块微流控管道层2，在管道4内通入不同的抗原抗体，进行检测。
如图3所示，本发明提供的检测装置的微流控管道层2，底部分布五个平行的长方体管道4，长方体管道4宽0.5mm，高0.7mm，长40mm，管道4之间间隔2mm，管道两端为进样孔5，进样孔5直径为2mm，相邻进样孔5的垂直距离(间隔)3mm，进样孔5与大气连通。
本发明所用的材料和设备均为现有材料和设备，例如：促甲状腺激素(TSH)、催乳素(PRL)、促黄体生成激素(LH)、生长激素(GH)、卵泡刺激素(FSH)、皮质醇(Cor)的包被抗体，抗原，HRP标记抗体，HRP标记抗原均为北京润德康泰生物科技有限公司生产，具体内容如表1所示，
表1原料名称，货号和生产厂家
本发明所用的检测装置为现有常用的仪器，如化学发光成像系统ChemiScope Mini，上海勤翔科学仪器有限公司生产。
本发明实施例中所用的包被抗体的方法如下：
包被抗体采用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释成指定的浓度，在3-4℃条件下包被10-30小时，或在37℃条件下包被2-5小时，包被的浓度依据固相载体和包被物的性质调整。
本发明实施例中所用的标记物为辣根过氧化物酶(HRP)，用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde，CHO-(CH2)3-CHO)。
本发明使用的标记抗体或抗原的标记步骤如下：
(1)取4mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1％(w/v)的2，4-二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液0.1mL，室温(20±5℃)下轻微搅拌2-3h。
(2)加入0.08mol/L NaIO41mL，室温下避光轻搅30-60min，溶液呈黄绿色。
(3)加入0.2mol/L乙二醇1mL，室温(20±5℃)下轻搅2-3h，终止氧化反应。
(4)加入5mg抗体(IgG)，装入透析袋，置于浓度为0.05mol/L，pH9.1的碳酸盐缓冲液(无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g，溶于1000mL蒸馏水) 1000mL中，3-4℃透析10-30小时，更换3次缓冲液。
(5)取出透析袋中液体，加入浓度为6mg/mL的NaHB40.2mL，在2-8℃的条件下透析2-3小时。
(6)步骤(5)所得的液体经过凝胶过滤柱分离去除游离的抗体或抗原分子和酶分子，得到抗体或抗原的酶结合物。
(7)向步骤(6)所得产物内等体积加入甘油，用新生牛血清将酶结合物稀释至2-30μg/ml，即得抗体或抗原的酶结合物，低温保存备用。
将至少2种通过上述步骤所得的酶标记的抗体或抗原使用新生牛血清，并只用新生牛血清作为稀释剂和稳定剂。将标记的抗体或抗原稀释到指定的浓度，即得到本发明所述的标记物混合液。
实施例1
如图1、图3所示，本发明提供一种可用于检测的微流控芯片，所述微流控芯片自下而上依次包括基底层1、功能层和微流控管道层2；所述功能层固定于所述基底层1的上表面，所述功能层由六条平行的功能条带3组成，所述功能条带为能与特定物质起反应的材料形成的条状带，所述功能条带为包被抗体；所述微流控管道层2覆盖在所述功能条带3上，所述微流控管道层2的下表面设置有七条管道4，所述管道4与所述的功能条带3相连通。
基底层1是厚度为2mm的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜，微流控管道层2的底部分布七个平行的长方体管道4，长方体管道4宽0.5mm，高0.7mm，长40mm，管道4之间间隔2mm，管道4两端为进样孔5，进样孔5直径2mm，相邻管道的同一端的进样孔的垂直距离(间隔)3mm，进样孔5与大气连通。
(1)包被抗体
如图2所示，在微流控管道层依次通入促甲状腺激素(TSH)、催乳素(PRL)、促黄体生成激素(LH)、生长激素(GH)、卵泡刺激素(FSH)、皮质醇(Cor)的包被抗体，包被抗体采用0.02mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释成指定的浓度，在2-8℃条件下包被15小时，使之固定在基底层相应区域， TSH包被抗体浓度为50μg/ml；PRL包被抗体浓度为40μg/ml；LH包被抗体浓度为25μg/ml；GH包被抗体浓度为50μg/ml；FSH包被抗体浓度为27μg/ml；Cor包被抗体浓度为72μg/ml。
(2)封闭：
弃去管道，在与包被抗体成直角的方向上，平行覆盖上两块微流控管道层，管道内通入未稀释的新生牛血清，封闭60分钟后，在管道内通入PBS冲洗三次。
上述未稀释的新生牛血清的蛋白含量为3.5％-5％(w/v，g/100ml)。
(3)加入抗原及检测抗体/抗原：
在步骤(2)所述的左侧微流控管道层的管道1-6内依次通入TSH、PRL、LH、GH、FSH和Cor的高值样本与酶结合物混合液(又称标记物混合液)，所述酶结合物混合液包括TSH、PRL、LH、GH、FSH的标记抗体(所述标记抗体的浓度均为5μg/ml)和Cor的标记抗原(浓度为5μg/ml)，前述标记抗体和标记抗原的稀释剂和稳定剂为100％新生牛血清(即未稀释的新生牛血清)。
上述高值样本指高浓度的抗原，主要是临床上高于正常参考范围的样本。通常，TSH抗原的浓度≥20mIU/L，PRL抗原的浓度≥400IU/L，LH抗原的浓度≥50IU/L，GH抗原的浓度≥20mIU/L，FSH抗原的浓度≥50IU/L，Cor抗原的浓度≥40μg/L。例如：前述抗原的浓度可与下述通入右侧管道a内的酶结合物混合液中的相应的抗原浓度相同。
在右侧微流控管道层的管道a-e内通入稀释成不同浓度的TSH、PRL、LH、GH、FSH的混合抗原与酶结合物混合液，根据检测结果制作校准曲线，比照该校准曲线，以获得左侧样本的定量结果。
在右侧管道a内通入酶结合物混合液中TSH的浓度是200mIU/L，PRL的浓度是2000mIU/L，LH的浓度是100IU/L，GH的浓度是200mIU/L，FSH的浓度是200IU/L，Cor的浓度是300μg/L。
在右侧管道b内通入酶结合物混合液中TSH的浓度是100mIU/L，PRL的浓度是1000mIU/L，LH的浓度是50IU/L，GH的浓度是100mIU/L，FSH的浓度是100IU/L，Cor的浓度是100μg/L。
在右侧管道c内通入酶结合物混合液中TSH的浓度是50mIU/L，PRL的浓度是500mIU/L，LH的浓度是10IU/L，GH的浓度是50mIU/L，FSH的浓度是50IU/L，Cor的浓度是25μg/L。
在右侧管道d内通入酶结合物混合液中TSH的浓度是25mIU/L，PRL的浓度是100mIU/L，LH的浓度是5IU/L，GH的浓度是10mIU/L，FSH的浓度是20IU/L，Cor的浓度是5μg/L。
在右侧管道e内通入酶结合物混合液中TSH的浓度是5mIU/L，PRL的浓度是20mIU/L，LH的浓度是0.5IU/L，GH的浓度是5mIU/L，FSH的浓度是10IU/L，Cor的浓度是2μg/L。
在右侧管道f内通入酶结合物混合液中TSH的浓度是0mIU/L，PRL的浓度是0mIU/L，LH的浓度是0IU/L，GH的浓度是0mIU/L，FSH的浓度是0IU/L，Cor的浓度是0μg/L。
(4)显色：
在各管道内通入PBS冲洗三次后，弃去管道层，在反应区域内加入化学发光液，使用化学发光成像系统ChemiScope Mini成像，所得图像如图4所示。
上述酶结合物混合液中的抗原和抗体以辣根过氧化物酶标记，化学发光液为鲁米诺(1.25mmol/L鲁米诺，0.136mmol/L对碘苯酚，10mmol/L Tris HCl(pH8.6)，0.2％乙醇，0.3mmol/L NaCl，5mmol/L环己二胺四乙酸(CDTA)及4mmol/L的H2O2与4mmol/L的NaBO3的混合液)。
(5)结果：
参考图4，检测方法的特异性如图4左侧结果所示，各检测样品在对应的抗体包被区域出现明显的信号，由于Cor是小分子，检测中使用的是竞争法，所以在非高值样本区域出现信号，在高值样本区则未发现信号。上述结果说 明，利用本发明提供的微流控芯片进行检测，所得检测结果的特异性较好。
检测方法线性如图4右侧结果所示，利用ImageJ图像处理软件分析处理得到：TSH、PRL、LH、GH、FSH的R2依次为0.9973；0.9960；0.9913；0.9901；0.9882。如图11所示，Cor的R2为0.9936。前述数据说明本发明提供的微流控芯片具有比较好的检测线性。
本实施例提供的微流控芯片的检测结果的灵敏度和线性范围参见表2。表2实施例1提供的微流控芯片的检测结果的灵敏度和线性范围数据
| 检测项目 | 灵敏度 | 线性范围 |
| TSH | 0.1mIU/L | 0.1mIU/L-200mIU/L |
| GH | 1.0mIU/L | 1.0mIU/L-200mIU/L |
| CORTISOL | 0.5μg/L | 0.5μg/L-300μg/L |
| PRL | 5IU/L | 5IU/L-2000IU/L |
| FSH | 0.5IU/L | 0.5IU/L-200IU/L |
| LH | 0.5IU/L | 0.5IU/L-100IU/L |
实施例2
如图1至图8所示，本发明提供一种可用于检测的微流控芯片，所述微流控芯片自下而上依次包括基底层1、功能层和微流控管道层2；所述功能层固定于所述基底层1的上表面，所述功能层由六条平行的功能条带3组成，所述功能条带为能与特定物质起反应的材料形成的条状带；所述微流控管道层2覆盖在所述功能条带3上，所述微流控管道层2的下表面设置有七条管道4。所述管道4与所述的功能条带3相连通。
基底层1是厚度为2mm的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜，微流控管道层2的底部分布七个平行的长方体管道4，长方体管道4宽0.5mm，高0.7mm，长40mm，管道4之间间隔2mm，管道4两端为进样孔5，进样孔5直径2mm，为了便于将待测样品加入到管道中，相邻管道的同一侧的进样孔的垂直距离(间隔)为3mm，进样孔5与大气连通。
所述功能条带3为6条包被抗体条带，具体为促甲状腺激素(TSH)、催乳素(PRL)、促黄体生成激素(LH)、生长激素(GH)、卵泡刺激素(FSH)、 皮质醇(Cor)的包被抗体条带；TSH包被抗体浓度为50μg/ml；PRL包被抗体浓度为40μg/ml；LH包被抗体浓度为25μg/ml；GH包被抗体浓度为50μg/ml；FSH包被抗体浓度为27μg/ml；Cor包被抗体浓度为72μg/ml。
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
(1)、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体的原料为表1中所列的包被抗体，使用时，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到上述指定的浓度，之后，向微流控管道层的管道内分别通入抗体溶液，在4℃条件下包被过夜(包被10-12小时)，使之固定在基底层相应区域，形成功能条带；
(2)、移除步骤(1)中微流控管道层；
(3)、取清洁的微流控管道层，基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
(4)、向步骤(3)中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清(蛋白含量为5％(w/v))，封闭60分钟后，在管道内通入PBS冲洗3次；
(5)低温干燥，即得所述微流控芯片。
本实施例提供的微流控芯片，在2-8℃密封保存，其中的包被抗体(固相抗体)活性可保持12个月。
实施例3
如图3至图8所示，本发明提供一种微流控芯片，包括基底层1、功能层、和微流控管道层2；所述功能层固定于所述基底层1的上表面，所述功能层包括六条平行的功能条带3；所述微流控管道层2设置有五条管道4(如图3所示)，所述管道4与所述的功能条带3相连通，每个管道4的两端设置有与大气相通的通孔5。
上述基底层的材料选用聚二甲基硅氧烷薄膜。
上述基底层厚度为0.5mm，微流控管道层的底部分布长方体管道，长方 体管道宽0.01mm，高0.01mm，长10mm，管道之间间隔1mm，管道两端为进样孔，进样孔直径1mm，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔1mm，进样孔的高度1mm。微流控管道层的长15mm、宽0.1mm、高1mm。
所述功能条带3为包被抗体条带，包括促甲状腺激素(TSH)、催乳素(PRL)、促黄体生成激素(LH)、生长激素(GH)、卵泡刺激素(FSH)、皮质醇(Cor)的包被抗体条带；前述包被抗体的浓度均为10μg/ml。
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
(1)、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体采用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到指定的浓度，向微流控管道层的管道内分别通入抗体，在4℃条件下包被10小时，使之固定在基底层相应区域；
(2)、移除步骤(1)中微流控管道层；
(3)、取清洁的微流控管道层，基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层上的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
(4)、向步骤(3)中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清(蛋白含量为3.5％(w/v))，封闭60分钟后，在管道内通入PBS冲洗3次；
(5)干燥，即得所述微流控芯片。
本实施例提供的微流控芯片，在2-8℃密封保存，其中的包被抗体(固相抗体)活性可保持12个月。该微流控芯片可同时检测1-5个人的血清中TSH抗原、PRL抗原、LH抗原、GH抗原、FSH抗原、Cor抗原的浓度。
实施例4
如图1至图8所示，本发明提供一种微流控芯片，包括基底层1、功能层、和微流控管道层2；所述功能层固定于所述基底层1的上表面，所述功能层包括六条平行的功能条带3(如图1所示)；所述微流控管道层2设置有管道4，所述管道4与所述的功能条带3相连通，每个管道4的两端设置有与大气相 通的通孔5。
上述基底层的材料选用聚二甲基硅氧烷薄膜。上述基底层厚度为1mm，微流控管道层的底部分布长方体管道，长方体管道宽2mm，高2mm，长50mm，管道之间间隔2mm，管道两端为进样孔，进样孔直径2mm，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔4mm。微流控管道层的长60mm、宽20mm、高4mm。
所述功能条带3为包被抗体条带，包括促甲状腺激素(TSH)、催乳素(PRL)、促黄体生成激素(LH)、生长激素(GH)、卵泡刺激素(FSH)、皮质醇(Cor)的包被抗体条带；前述包被抗体的浓度均为100μg/ml。
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
(1)、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体采用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到指定的浓度，向微流控管道层的管道内分别通入抗体，在4℃条件下包被30小时，使之固定在基底层相应区域；
(2)、移除步骤(1)中微流控管道层；
(3)、取清洁的微流控管道层，基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层上的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
(4)、向步骤(3)中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清(蛋白含量为5％(w/v))，封闭200分钟后，在管道内通入PBS冲洗4次；
(5)干燥，即得所述微流控芯片。
本实施例提供的微流控芯片，在2-8℃密封保存，其中的包被抗体(固相抗体)活性可保持12个月。
实施例5
如图3至图8所示，本发明提供一种微流控芯片，包括基底层1、功能层、和微流控管道层2；所述功能层固定于所述基底层1上，所述功能层包括六条平行的功能条带3(如图1所示)；所述微流控管道层2设置有五条管道4(如 图3所示)，所述管道4与所述的功能条带3相连通，每个管道4的两端设置有与大气相通的通孔5。
上述基底层的材料选用聚二甲基硅氧烷薄膜。基底层厚度为2mm。微流控管道层的长30mm、宽15mm、高2.5mm，其底部分布长方体管道，长方体管道宽1mm，高1mm，长30mm，管道之间间隔1.5mm，管道两端为进样孔，进样孔直径1.5mm，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔2.5mm。进样孔的高度2.5mm。
所述功能条带3为包被抗体条带，包括促甲状腺激素(TSH)、催乳素(PRL)、促黄体生成激素(LH)、生长激素(GH)、卵泡刺激素(FSH)、皮质醇(Cor)的包被抗体条带；前述包被抗体的浓度均为50μg/ml。
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
(1)、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体采用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到指定的浓度，向微流控管道层的管道内分别通入抗体，在37℃条件下包被5小时，使之固定在基底层相应区域；
(2)、移除步骤(1)中微流控管道层；
(3)、取清洁的微流控管道层，基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层上的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
(4)、向步骤(3)中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清(蛋白含量为4％(w/v))，封闭100分钟，之后在管道内通入PBS冲洗3次；
(5)干燥，即得所述微流控芯片。
本实施例提供的微流控芯片，在2-8℃密封保存，其中的包被抗体(固相抗体)活性可保持12个月。
实施例6
如图5至图8所示，本发明提供一种微流控芯片，包括基底层1、功能层、 和微流控管道层2；所述功能层固定于所述基底层1的上表面，所述功能层包括六条平行的功能条带3；所述微流控管道层2设置有两条管道4(如图5和图6所示)，所述管道4与所述的功能条带3相连通，每个管道4的两端设置有与大气相通的通孔5。
上述基底层的材料选用聚二甲基硅氧烷薄膜。
上述基底层厚度为1mm，微流控管道层的底部分布截面为半圆形的管道，半圆形管道的半径为0.5mm，长20mm，管道之间间隔1mm，管道两端为进样孔，进样孔直径0.5mm，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔1mm。
所述功能条带3为包被抗体条带，包括促甲状腺激素(TSH)、催乳素(PRL)、促黄体生成激素(LH)、生长激素(GH)、卵泡刺激素(FSH)、皮质醇(Cor)的包被抗体条带；TSH包被抗体浓度为60μg/ml；PRL包被抗体浓度为30μg/ml；LH包被抗体浓度为20μg/ml；GH包被抗体浓度为55μg/ml；FSH包被抗体浓度为20μg/ml；Cor包被抗体浓度为80μg/ml。
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
(1)、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体采用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到指定的浓度，向微流控管道层的管道内分别通入抗体，在37℃条件下包被3小时，使之固定在基底层相应区域；
(2)、移除步骤(1)中微流控管道层；
(3)、取清洁的微流控管道层，基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层上的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
(4)、向步骤(3)中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清(蛋白含量为5％(w/v))，封闭150分钟后，在管道内通入PBS冲洗4次；
(5)干燥，即得所述微流控芯片。
本实施例提供的微流控芯片，在2-8℃密封保存，其中的包被抗体(固相 抗体)活性可保持12个月。
实施例7
如图5至图8所示，本发明提供一种微流控芯片，包括基底层1、功能层、和微流控管道层2；所述功能层固定于所述基底层1的上表面，所述功能层包括两条平行的功能条带3；所述微流控管道层2设置有两条管道4(如图5和图6所示)，所述管道4与所述功能条带3相连通，每个管道4的两端设置有与大气相通的通孔5。
上述基底层的材料选用聚二甲基硅氧烷薄膜，微流控管道层的材料为陶瓷。
上述基底层厚度为2mm，微流控管道层的底部分布长方体管道，长方体管道宽0.5mm，高0.7mm，长40mm，管道之间间隔1mm，管道两端为进样孔，进样孔直径0.5mm，高度2mm，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔2mm。
所述功能条带3为促甲状腺激素(TSH)、催乳素(PRL)的包被抗体条带。
上述微流控芯片的制备方法与实施例2所述的制备方法相同。
本实施例提供的微流控芯片，在2-8℃密封保存，其中的包被抗体(固相抗体)活性可保持12个月。
实施例8
如图5至图8所示，本发明提供一种可用于检测的微流控芯片，所述微流控芯片自下而上依次包括基底层1、功能层、和微流控管道层2；所述功能层固定于所述基底层1的上表面，所述功能层由七条平行的功能条带3组成；所述微流控管道层2覆盖在所述功能条带3上，所述微流控管道层2的下表面设置有七条管道4(如图1所示)。所述管道4与所述的功能条带3相连通。
基底层1是厚度为2mm的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜，微流控管道层2的底部分布七个平行的长方体管道4，长方体管道4宽0.5mm，高0.7mm，长40mm，管道4之间间隔2mm，管道4两端为进样孔5，进样孔5直径2mm， 高度3mm，为了便于将待测样品加入到管道中，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔为3mm，进样孔5与大气连通。
所述功能条带3为七条AFP包被抗体条带，AFP包被抗体浓度为50μg/ml。
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
(1)、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体的原料为表1中所列的包被抗体，使用时，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到上述指定的浓度，之后，向微流控管道层的管道内分别通入抗体溶液，在37℃条件下包被5小时，使之固定在基底层相应区域，形成功能条带；
(2)、移除步骤(1)中微流控管道层；
(3)、取清洁的微流控管道层，步骤(1)所得的基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
(4)、向步骤(3)中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清(蛋白含量为5％(w/v))，封闭60分钟后，在管道内通入PBS冲洗3次；
(5)低温干燥，即得所述微流控芯片。
本实施例提供的微流控芯片的线性检测如下：
(1)用5％(w/v)BSA稀释检测抗体；
(2)用1％(w/v)BSA稀释AFP抗原；
(3)将步骤(1)和(2)所得产物混合，得到AFP抗原与酶结合物混合液，该酶结合物混合液中检测抗体的浓度为5μg/ml；
微流控管道层的管道分别标记为A、B、C、D、E、F、G，向微流控管道A-G内通入稀释成不同浓度的AFP抗原与酶结合物混合液：
在管道A内通入酶结合物混合液中AFP的浓度是400ng/ml，
在管道B内通入酶结合物混合液中AFP的浓度是200ng/ml，
在管道C内通入酶结合物混合液中AFP的浓度是100ng/ml，
在管道D内通入酶结合物混合液中AFP的浓度是50ng/ml，
在管道E内通入酶结合物混合液中AFP的浓度是25ng/ml，
在管道F内通入酶结合物混合液中AFP的浓度是6.25ng/ml，
在管道G内通入酶结合物混合液中AFP的浓度是0ng/ml。
(4)显色：
在各管道内通入PBS冲洗三次后，弃去管道层，在反应区域内加入化学发光液，使用化学发光成像系统ChemiScope Mini成像，所得图像如图10所示。
上述酶结合物混合液中的抗原和抗体以辣根过氧化物酶标记，化学发光液为鲁米诺。
(5)结果：
本实施例提供的微流控芯片的检测灵敏度为6.25ng/ml。
利用ImageJ图像处理软件分析处理图10的图像，得到图12所示的标准曲线。可根据该标准曲线，测定样品中AFP的浓度(含量)。
图12中，AFP的R2为0.9904。说明本发明提供的微流控芯片具有比较好的检测线性。
本实施例提供的微流控芯片，在2-8℃密封保存，其中的包被抗体(固相抗体)活性可保持12个月。
实施例9
按照实施例8所述方法制备微流控芯片，其中，AFP包被抗体浓度为10μg/ml。
本实施例提供的微流控芯片，在2-8℃密封保存，其中的包被抗体(固相抗体)活性可保持12个月。
实施例10
按照实施例8所述方法制备微流控芯片，其中，AFP包被抗体浓度为100 μg/ml。
本实施例提供的微流控芯片，在2-8℃密封保存，其中的包被抗体(固相抗体)活性可保持12个月。
实施例11
本发明提供一种标记物混合液，所述标记物为标记的抗体和标记的抗原的混合物；所述标记的抗体与待测样品反应，所述待测样品能够与功能条带中的抗体起特异性反应。所述标记抗原能与功能条带中的抗体起特异性反应。
上述标记混合液(酶结合物混合液)具体包括TSH、PRL、LH、GH、FSH的标记抗体(所述标记抗体的浓度均为5μg/ml)和Cor的标记抗原(浓度为5μg/ml)，前述标记抗体和标记抗原的稀释剂和稳定剂为未稀释新生牛血清。
本实施例中所用的标记物为辣根过氧化物酶(HRP)。
标记抗体或抗原的标记步骤如下：
(1)取4mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1％(w/v)的2，4-二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液0.1mL，室温(20±5℃)下轻微搅拌作用2h。
(2)加入0.08mol/L NaIO41mL，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
(3)加入0.2mol/L乙二醇1mL，室温(20±5℃)下轻搅作用2h，终止氧化反应。
(4)加入5mg抗体(IgG)，装入透析袋，置于浓度为0.05mol/L，pH9.1的碳酸盐缓冲液(无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g，溶于1000mL蒸馏水)1000mL中，4℃透析10小时，更换3次缓冲液。
(5)取出透析袋中液体，加入浓度为6mg/mL的NaHB40.2mL，在2℃的条件下透析2小时。
(6)步骤(5)所得的液体经过凝胶过滤柱分离去除游离的抗体或抗原分子和酶分子，得到抗体或抗原的酶结合物。
(7)向步骤(6)所得产物内加入等体积甘油，用新生牛血清将酶结合物稀释至2μg/ml，即得抗体或抗原的酶结合物，低温保存备用。
利用上述方法标记TSH、PRL、LH、GH、FSH抗体和Cor抗原，将通过上述步骤所得的酶标记的抗体和抗原使用新生牛血清，稀释至指定的浓度(即配制成工作液)，即得到本发明所述的标记物混合液。
辣根过氧化物酶标抗体或抗原的显色试剂为现有已知的显色试剂，例如3，3‘二氨基联苯胺(3，3’diaminobenzidine，DAB)，邻苯二胺(O-phenylene diamine，OPD)。
实施例12
本发明提供一种标记物混合液，所述混合液包括TSH(2μg/ml)、PRL(2μg/ml)、LH(2μg/ml)、GH(2μg/ml)、FSH(2μg/ml)的标记抗体，Cor的标记抗原(2μg/ml)，新生牛血清为稀释剂和稳定剂。
标记抗体或抗原的标记步骤如下：
(1)取4mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1％(w/v)的2，4-二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液0.1mL，室温(20±5℃)下轻微搅拌作用2h。
(2)加入0.08mol/L NaIO41mL，室温下避光轻搅60min，溶液呈黄绿色。
(3)加入0.2mol/L乙二醇1mL，室温(20±5℃)下轻搅作用2h，终止氧化反应。
(4)加入5mg抗体(IgG)，装入透析袋，置于浓度为0.05mol/L，pH9.1的碳酸盐缓冲液(无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g，溶于1000mL蒸馏水)1000mL中，3℃透析30小时，更换3次缓冲液。
(5)取出透析袋中液体，加入浓度为6mg/mL的NaHB40.2mL，在8℃的条件下透析2小时。
(6)步骤(5)所得的液体经过凝胶过滤柱分离去除游离的抗体或抗原分子和酶分子，得到抗体或抗原的酶结合物。
(7)向步骤(6)所得产物内加入等体积甘油，用新生牛血清将酶结合物稀释至30μg/ml，得到的抗体或抗原的酶结合物，低温保存备用。
利用上述方法标记TSH、PRL、LH、GH、FSH抗体和Cor抗原，将通过上述步骤所得的酶标记的抗体和抗原使用新生牛血清，稀释至指定的浓度，即得到本发明所述的标记物混合液。
实施例13
本发明提供一种标记物混合液，所述混合液包括TSH(10μg/ml)、PRL(10μg/ml)、LH(10μg/ml)、GH(10μg/ml)、FSH(10μg/ml)的标记抗体，Cor的标记抗原(10μg/ml)，新生牛血清为稀释剂和稳定剂。
标记抗体或抗原的标记步骤如下：
(1)取4mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1％(w/v)的2，4-二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液0.1mL，室温(20±5℃)下轻微搅拌作用2h。
(2)加入0.08mol/L NaIO4 1mL，室温下避光轻搅45min，溶液呈黄绿色。
(3)加入0.2mol/L乙二醇1mL，室温(20±5℃)下轻搅作用2h，终止氧化反应。
(4)加入5mg抗体(IgG)，装入透析袋，置于浓度为0.05mol/L，pH9.1的碳酸盐缓冲液(无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g，溶于1000mL蒸馏水)1000mL中，3-4℃透析20小时，更换3次缓冲液。
(5)取出透析袋中液体，加入浓度为6mg/mL的NaHB4 0.2mL，在4℃的条件下透析2小时。
(6)步骤(5)所得的液体经过凝胶过滤柱分离去除游离的抗体或抗原分子和酶分子，得到抗体或抗原的酶结合物。
(7)向步骤(6)所得产物内等体积加入甘油，用新生牛血清将酶结合物稀释至20μg/ml，即得抗体或抗原的酶结合物，低温保存备用。
利用上述方法标记TSH、PRL、LH、GH、FSH抗体和Cor抗原，将通过上述步骤所得的酶标记的抗体和抗原使用新生牛血清，稀释至指定的浓度，即得到本发明所述的标记物混合液。
实施例14
本发明提供一种标记物混合液，所述混合液包括TSH(1μg/ml)、PRL (1μg/ml)、LH(1μg/ml)、GH(1μg/ml)、FSH(1μg/ml)的标记抗体，Cor的标记抗原(1μg/ml)，新生牛血清为稀释剂和稳定剂。
标记抗体或抗原的标记步骤如下：
(1)取4mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1％(w/v)的2，4-二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液0.1mL，室温(20±5℃)下轻微搅拌作用3h。
(2)加入0.08mol/L NaIO41mL，室温下避光轻搅30-60min，溶液呈黄绿色。
(3)加入0.2mol/L乙二醇1mL，室温(20±5℃)下轻搅作用3h，终止氧化反应。
(4)加入5mg抗体(IgG)，装入透析袋，置于浓度为0.05mol/L，pH9.1的碳酸盐缓冲液(无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g，溶于1000mL蒸馏水)1000mL中，3-4℃透析15小时，更换3次缓冲液。
(5)取出透析袋中液体，加入浓度为6mg/mL的NaHB40.2mL，在2-8℃的条件下透析3小时。
(6)步骤(5)所得的液体经过凝胶过滤柱分离去除游离的抗体或抗原分子和酶分子，得到抗体或抗原的酶结合物。
(7)向步骤(6)所得产物内加入等体积甘油，用新生牛血清将酶结合物稀释至15μg/ml，低温保存备用。
利用上述方法标记TSH、PRL、LH、GH、FSH抗体和Cor抗原，将通过上述步骤所得的酶标记的抗体和抗原使用新生牛血清，稀释至指定的浓度，即得到本发明所述的标记物混合液。
实施例15
本发明提供一种标记物混合液，所述混合液包括AFP标记抗体(标记抗体浓度为1μg/ml)，未稀释的新生牛血清为稀释剂和稳定剂。
该标记物混合液用于检测AFP抗原。
实施例16
本发明提供一种标记物混合液，所述混合液包括AFP标记抗体(标记抗体浓度为10μg/ml)，未稀释的新生牛血清为稀释剂和稳定剂。
该标记物混合液用于检测AFP抗原。
实施例17
利用本发明提供的微流控芯片检测人的血清是否含有TSH抗原、PRL抗原、LH抗原、GH抗原、FSH抗原、Cor抗原。本发明提供的微流控芯片包括7条管道，且每条管道都与TSH包被抗体条带、PRL包被抗体条带、LH包被抗体条带、GH包被抗体条带、FSH包被抗体条带、Cor包被抗体条带相连通，所以，该微流控芯片可同时检测1-7个人的血清中TSH抗原、PRL抗原、LH抗原、GH抗原、FSH抗原、Cor抗原的浓度。
检测方法包括下述步骤：
(1)分别取样，分别将待测样品与本发明实施例1中所述的标记物混合液相混合；
(2)将步骤(1)所得的混合液分别通入微流控管道层的管道内，培育30分钟至2小时；
(3)向各管道内通入PBS冲洗3-4次后，移除管道层，在反应区域内加入鲁米诺；
(4)检测反应区域的发光亮度；
(5)根据步骤(4)的结果确定样品中的目标抗体或抗原。
通过上述实施例可以看出，本发明提供的微流控芯片的体积小，样品用量少，易于操作，检测速度快，可用于检测抗原等目标物质，适用于生物检测等领域。本发明提供的微流控芯片的制备方法工艺简单，易于操作。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡是根据本发明内容所做的均等变化与修饰，均涵盖在本发明的专利范围内。
Claims (2)
1.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片自下而上依次包括基底层、功能层和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层的上表面，所述功能层由至少两条平行的功能条带组成，所述功能条带为能与特定物质起反应的材料形成的条状带；所述微流控管道层覆盖在所述功能条带上，所述微流控管道层的下表面设置有至少两条管道，所述管道与所述的至少一条功能条带相连通，每个管道的两端设置有与大气相通的通孔；
其中：第1项技术方案：
所述微流控芯片自下而上依次包括基底层、功能层和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层的上表面，所述功能层由六条平行的功能条带组成，所述功能条带为能与特定物质起反应的材料形成的条状带，所述功能条带为包被抗体；所述微流控管道层覆盖在所述功能条带上，所述微流控管道层的下表面设置有七条管道，所述管道与所述的功能条带相连通；
基底层是厚度为2mm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜，微流控管道层的底部分布七个平行的长方体管道（4），长方体管道（4）宽0.5mm，高0.7mm，长40mm，管道（4）之间间隔2mm，管道（4）两端为进样孔（5），进样孔（5）直径2mm，相邻管道的同一端的进样孔的垂直距离3mm，进样孔（5）与大气连通；
（1）包被抗体
在微流控管道层依次通入促甲状腺激素（TSH）、催乳素（PRL）、促黄体生成激素（LH）、生长激素（GH）、卵泡刺激素（FSH）、皮质醇（Cor）的包被抗体，包被抗体采用0.02mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释成指定的浓度，在2-8℃条件下包被15小时，使之固定在基底层相应区域，TSH包被抗体浓度为50μg/ml；PRL包被抗体浓度为40μg/ml；LH包被抗体浓度为25μg/ml；GH包被抗体浓度为50μg/ml；FSH包被抗体浓度为27μg/ml；Cor包被抗体浓度为72μg/ml；
（2）封闭：
弃去管道，在与包被抗体成直角的方向上，平行覆盖上两块微流控管道层，管道内通入未稀释的新生牛血清，封闭60分钟后，在管道内通入PBS冲洗三次；
上述未稀释的新生牛血清的蛋白含量为3.5%-5%（w/v，g/100ml）；
或者，第2项技术方案：
所述微流控芯片自下而上依次包括基底层、功能层和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层的上表面，所述功能层由六条平行的功能条带组成，所述功能条带为能与特定物质起反应的材料形成的条状带；所述微流控管道层覆盖在所述功能条带上，所述微流控管道层的下表面设置有七条管道；所述管道与所述的功能条带相连通；
基底层是厚度为2mm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜，微流控管道层的底部分布七个平行的长方体管道，长方体管道宽0.5mm，高0.7mm，长40mm，管道之间间隔2mm，管道两端为进样孔，进样孔直径2mm，为了便于将待测样品加入到管道中，相邻管道的同一侧的进样孔的垂直距离为3mm，进样孔与大气连通；
所述功能条带为6条包被抗体条带，具体为促甲状腺激素（TSH）、催乳素（PRL）、促黄体生成激素（LH）、生长激素（GH）、卵泡刺激素（FSH）、皮质醇（Cor）的包被抗体条带；TSH包被抗体浓度为50μg/ml；PRL包被抗体浓度为40μg/ml；LH包被抗体浓度为25μg/ml；GH包被抗体浓度为50μg/ml；FSH包被抗体浓度为27μg/ml；Cor包被抗体浓度为72μg/ml；
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
（1）、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体为包被抗体，使用时，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到上述指定的浓度，之后，向微流控管道层的管道内分别通入抗体溶液，在4℃条件下包被过夜，包被10-12小时，使之固定在基底层相应区域，形成功能条带；
（2）、移除步骤（1）中微流控管道层；
（3）、取清洁的微流控管道层，基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
（4）、向步骤（3）中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清，新生牛血清的蛋白含量为5%（w/v），封闭60分钟后，在管道内通入PBS冲洗3次；
（5）低温干燥，即得所述微流控芯片；
或者，第3项技术方案：
所述微流控芯片包括基底层、功能层、和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层的上表面，所述功能层包括六条平行的功能条带；所述微流控管道层设置有五条管道（4），所述管道（4）与所述的功能条带相连通，每个管道（4）的两端设置有与大气相通的通孔；
上述基底层的材料选用聚二甲基硅氧烷薄膜；
上述基底层厚度为0.5mm，微流控管道层的底部分布长方体管道，长方体管道宽0.01mm，高0.01mm，长10mm，管道之间间隔1mm，管道两端为进样孔，进样孔直径1mm，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔1mm，进样孔的高度1mm；微流控管道层的长15mm、宽0.1mm、高1mm；
所述功能条带为包被抗体条带，包括促甲状腺激素（TSH）、催乳素（PRL）、促黄体生成激素（LH）、生长激素（GH）、卵泡刺激素（FSH）、皮质醇（Cor）的包被抗体条带；前述包被抗体的浓度均为10μg/ml；
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
（1）、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体采用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到指定的浓度，向微流控管道层的管道内分别通入抗体，在4℃条件下包被10小时，使之固定在基底层相应区域；
（2）、移除步骤（1）中微流控管道层；
（3）、取清洁的微流控管道层，基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层上的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
（4）、向步骤（3）中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清，新生牛血清的蛋白含量为3.5%（w/v），封闭60分钟后，在管道内通入PBS冲洗3次；
（5）干燥，即得所述微流控芯片；
或者，第4项技术方案：
所述微流控芯片包括基底层、功能层、和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层的上表面，所述功能层包括六条平行的功能条带；所述微流控管道层设置有管道（4），所述管道（4）与所述的功能条带相连通，每个管道的两端设置有与大气相通的通孔；
上述基底层的材料选用聚二甲基硅氧烷薄膜；上述基底层厚度为1mm，微流控管道层的底部分布长方体管道，长方体管道宽2mm，高2mm，长50mm，管道之间间隔2mm，管道两端为进样孔，进样孔直径2mm，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔4mm；微流控管道层的长60mm、宽20mm、高4mm；
所述功能条带3为包被抗体条带，包括促甲状腺激素（TSH）、催乳素（PRL）、促黄体生成激素（LH）、生长激素（GH）、卵泡刺激素（FSH）、皮质醇（Cor）的包被抗体条带；前述包被抗体的浓度均为100μg/ml；
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
（1）、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体采用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到指定的浓度，向微流控管道层的管道内分别通入抗体，在4℃条件下包被30小时，使之固定在基底层相应区域；
（2）、移除步骤（1）中微流控管道层；
（3）、取清洁的微流控管道层，基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层上的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
（4）、向步骤（3）中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清，新生牛血清的蛋白含量为5%（w/v），封闭200分钟后，在管道内通入PBS冲洗4次；
（5）干燥，即得所述微流控芯片；
或者，第5项技术方案：
所述微流控芯片包括基底层、功能层、和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层上，所述功能层包括六条平行的功能条带；所述微流控管道层设置有五条管道，所述管道与所述的功能条带相连通，每个管道的两端设置有与大气相通的通孔；
上述基底层的材料选用聚二甲基硅氧烷薄膜；基底层厚度为2mm；微流控管道层的长30mm、宽15mm、高2.5mm，其底部分布长方体管道，长方体管道宽1mm，高1mm，长30mm，管道之间间隔1.5mm，管道两端为进样孔，进样孔直径1.5mm，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔2.5mm；进样孔的高度2.5mm；
所述功能条带3为包被抗体条带，包括促甲状腺激素（TSH）、催乳素（PRL）、促黄体生成激素（LH）、生长激素（GH）、卵泡刺激素（FSH）、皮质醇（Cor）的包被抗体条带；前述包被抗体的浓度均为50μg/ml；
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
（1）、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体采用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到指定的浓度，向微流控管道层的管道内分别通入抗体，在37℃条件下包被5小时，使之固定在基底层相应区域；
（2）、移除步骤（1）中微流控管道层；
（3）、取清洁的微流控管道层，基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层上的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
（4）、向步骤（3）中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清，新生牛血清的蛋白含量为4%（w/v），封闭100分钟，之后在管道内通入PBS冲洗3次；
（5）干燥，即得所述微流控芯片；
或者，第6项技术方案：
所述微流控芯片包括基底层、功能层、和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层的上表面，所述功能层包括六条平行的功能条带；所述微流控管道层设置有两条管道，所述管道与所述的功能条带相连通，每个管道的两端设置有与大气相通的通孔；
上述基底层的材料选用聚二甲基硅氧烷薄膜；
上述基底层厚度为1mm，微流控管道层的底部分布截面为半圆形的管道，半圆形管道的半径为0.5mm，长20mm，管道之间间隔1mm，管道两端为进样孔，进样孔直径0.5mm，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔1mm；
所述功能条带为包被抗体条带，包括促甲状腺激素（TSH）、催乳素（PRL）、促黄体生成激素（LH）、生长激素（GH）、卵泡刺激素（FSH）、皮质醇（Cor）的包被抗体条带；TSH包被抗体浓度为60μg/ml；PRL包被抗体浓度为30μg/ml；LH包被抗体浓度为20μg/ml；GH包被抗体浓度为55μg/ml；FSH包被抗体浓度为20μg/ml；Cor包被抗体浓度为80μg/ml；
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
（1）、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体采用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到指定的浓度，向微流控管道层的管道内分别通入抗体，在37℃条件下包被3小时，使之固定在基底层相应区域；
（2）、移除步骤（1）中微流控管道层；
（3）、取清洁的微流控管道层，基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层上的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
（4）、向步骤（3）中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清，新生牛血清的蛋白含量为5%（w/v），封闭150分钟后，在管道内通入PBS冲洗4次；
（5）干燥，即得所述微流控芯片；
或者，第7项技术方案：
所述微流控芯片包括基底层、功能层、和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层的上表面，所述功能层包括两条平行的功能条带；所述微流控管道层设置有两条管道，所述管道与所述功能条带相连通，每个管道的两端设置有与大气相通的通孔；
上述基底层的材料选用聚二甲基硅氧烷薄膜，微流控管道层的材料为陶瓷；
上述基底层厚度为2mm，微流控管道层的底部分布长方体管道，长方体管道宽0.5mm，高0.7mm，长40mm，管道之间间隔1mm，管道两端为进样孔，进样孔直径0.5mm，高度2mm，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔2mm；
所述功能条带为促甲状腺激素（TSH）、催乳素（PRL）的包被抗体条带；
上述微流控芯片的制备方法与上述第2项技术方案所述的制备方法相同；
或者，第8项技术方案：
所述微流控芯片自下而上依次包括基底层、功能层、和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层的上表面，所述功能层由七条平行的功能条带组成；所述微流控管道层覆盖在所述功能条带上，所述微流控管道层的下表面设置有七条管道；所述管道与所述的功能条带相连通；
基底层是厚度为2mm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜，微流控管道层的底部分布七个平行的长方体管道，长方体管道宽0.5mm，高0.7mm，长40mm，管道之间间隔2mm，管道两端为进样孔，进样孔直径2mm，高度3mm，为了便于将待测样品加入到管道中，相邻管道的同一侧的进样孔的间隔为3mm，进样孔5与大气连通；
所述功能条带为七条AFP包被抗体条带，AFP包被抗体浓度为50μg/ml；
上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤：
（1）、包被抗体
将微流控管道层覆盖于基底层上，上述抗体为包被抗体，使用时，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释到上述指定的浓度，之后，向微流控管道层的管道内分别通入抗体溶液，在37℃条件下包被5小时，使之固定在基底层相应区域，形成功能条带；
（2）、移除步骤（1）中微流控管道层；
（3）、取清洁的微流控管道层，步骤（1）所得的基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起；所述微流控管道层的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；
（4）、向步骤（3）中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清，新生牛血清的蛋白含量为5%（w/v），封闭60分钟后，在管道内通入PBS冲洗3次；
（5）低温干燥，即得所述微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片的应用，其特征在于，所述微流控芯片用于高效筛选，环境监测，生物分析，临床检测，食品安全检测，动物检测。
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