CN103182334B - 一种电化学微流控传感芯片的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种电化学微流控传感芯片的制备方法及其应用，将改进后的玻璃溶液直接涂到商业化标准印刷电极上。然后将预先设计好管道的PDMS芯片和涂有玻璃的印刷电极一起进行真空等离子体处理，将PDMS直接键合到商业化标准印刷电极上，从而构建了一种新型的微流控电化学传感器平台。该传感器能够在生物液样对各种样品分析物超灵敏检测，以检测人血清中前列腺癌标志物PSA为例，采用库伦安培法对PSA检测，结果表明检测灵敏度达0.84pg/mL,比标准化临床检测要求的0.1ng/mL提高了两个数量级，具有超高的检测灵敏度和准确性,高于其他电化学检测器件，同时易操作，能将样品的处理，分离等集成到一个微型电化学微流控传感器芯片上。
Description
技术领域
本发明涉及一种微流控传感芯片，具体地说，涉及一种电化学微流控传感芯片的制备方法及其应用。
背景技术
微流控系统是对微小体积液体（10-9–10-18L)在几十到几百微米管道内操控的过程,该技术在生物医学，环境监控，食品安全具有非常广泛的应用前景。微流控器件具备下列优点，体积小，减少试剂消耗，多样品平行检测，增加可靠性，灵敏性等优点。电化学系统可以很容易的整合到微流控芯片上，与传统的分析平台相比如质谱，光学检测等，电化学微流控具有更灵巧的样品处理，优越的灵敏度和多用途性，无需借助庞大的光学检测设备。
然而，目前电化学微流控传感芯片制备是将金属丝作为电极加工到微流控芯片中，如James F.Rusling（Electrochemistry Communications11(2009)819–822）报道的微流控电化学检测器件，是用采用0.5mm直径的金丝，经用王水处理后，再进一步表面修饰后加工到微流控芯片上，该器件制备工艺复杂，耗时，成本高，需要在超净间内完成，一般实验室条件难以达到，而且其电化学检测重复性差。本发明采用的是标准化的印刷电极，将PDMS（聚二甲基硅氧烷）芯片直接在印刷电极上加工制备，获得电化学微流控器件，该方法简单，快速，成本低廉，可在普通实验室下完成，而且检测重复性很高,。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种简单，快速，低成本，高灵敏度，具有普适性的新型电化学微流控传感芯片的制备方法，并将该器件应用于医学检测。
根据本发明的一个方面，提供一种电化学微流控传感芯片的制备方法，所述方法包括如下步骤：
第一步，采用绘图软件设计微流控管道绘制掩模板，利用标准的软光刻技术加工微流控PDMS芯片；
第二步，配制玻璃溶液，具体方法：
将3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS),正硅酸乙酯(TEOS),乙醇（Et OH），水(H2OpH=2-8)按体积比5：1：1：1至1：5：10：20混合，超声，然后放置在20-90℃烘箱进行熟化2-24h，即得到玻璃溶液。该改进后玻璃溶液相比现有的玻璃溶液制备，方法简单，成本低廉，易于在印刷电极表面快速形成一层超薄玻璃，并且能够牢固的结合到印刷电极表面。
第三步，印刷电极表面玻璃涂层处理，在印刷电极涂上一层第二步配制的玻璃溶液，室温下静止干燥，待表面形成一层玻璃。
第四步，将第一步的PDMS芯片和第三步的涂有玻璃的印刷电极印刷电极一起进行O2等离子体处理，然后取出来将PDMS芯片与印刷电极键合，即完成该电化学微流控传感芯片制备。
优选地，第一步中，所述的微流控管道绘制掩模板，其尺寸大小为进出样管道宽度为100-500μm,中间检测区域宽度为5-10mm，总长度为14-20mm，管道的高度为50-400μm。所述的微流控管道的进口、出口均具有设计弧度，管道中间为椭圆形，保证液体流畅通过，均匀的经过工作电极表面。
优选地，第二步中超声处理时间为5-30min。
优选地，第三步中所述的印刷电极，该电极采用是标准化的印刷电极。
优选地，第三步中所述的印刷电极玻璃涂层化处理，其具体加工工艺是，将熟化好的玻璃均匀的涂在印刷电极周围，注意避免将玻璃溶液涂到印刷电极表面上，涂好之后放置室温下干燥，形成一层超薄玻璃。
优选地，第四步中等离子体处理时间为30-120s。
根据本发明的另一个方面，提供一种上述得到的电化学微流控传感芯片的应用，即将该电化学微流控传感芯片应用于人血清中前列腺癌标志物PSA，胃癌标志物（CA199），肺癌肿瘤标志物（CEA），乳腺癌肿瘤标志物（CA153），DNA，RNA，miRNA，核酸适体等生物样品的检测。
优选地，所述电化学微流控传感芯片应用于人血清中前列腺癌标志物PSA的检测，具体包括如下步骤：
第一步，在外加磁场作用下将0.1–0.5mg/m带有PSA捕获抗体的磁珠固定到电化学微流控传感芯片电极工作区域；
第二步，通过注射泵以2-50μL/min注射0-10ng/mL不同浓度PSA抗原到电化学微流控传感芯片中，在37℃培养箱孵育20-60min，PBS洗涤，封闭；
第三步，将HRP标记的PSA检测抗体以2-20μL/min速度注射到该电化学微流控传感芯片中，同样37℃孵育20-60min，然后采用磷酸盐缓冲液PBS洗涤；
第四步，再注入20-100μL含有氢醌和双氧水的PBS溶液；
第五步，最后采用库伦安培法在-1.0-5mV的恒电位下检测，每组平行八次测定。
优选地，所述第一步中，首先将带有biotin的PSA捕获抗体修饰到带有streptavidin的磁珠上，通过外加磁场的作用将50μL0.2mg/mL修饰好的磁珠固定到微流控芯片中的工作电极区域内，进而PSA抗原捕获。
更优选地，所述的磁珠大小为1μm，其表面是链酶亲和素修饰，与生物素标记的PSA捕获抗体作用，得到PSA捕获抗体修饰的磁珠。
更优选地，所述的通过外加磁场作用将磁珠固定到微流控芯片中的工作电极区域内，是指将5mm大小的磁铁固定到工作电极正下方，通过注射泵以50μL/min的速度将0.2mg/mL磁珠注入到微流控芯片内，并在外加的磁场作用下，将捕获抗体修饰的磁珠固定到工作电极上。
优选地，所述第二步中，采用注射泵将100μL含有0-10ng/mL不同浓度PSA抗原的血清以10μL/min速度注射到芯片中，进行富集，再在37℃培养箱孵育30min,之后用100μL pH7.4PBS溶液以50μL/min速度充分洗涤，再用50μL的封闭液进行封闭，去除非特异性吸附。
优选地，所述的封闭液，是0.05%Tween-20,和2%的BSA的PBS溶液，所用体积是50uL，其目的是去除抗的非特异性结合。
优选地，所述第三步中，在第二步操作后，以10μL/min流速注射100μL PSA检测抗体，将50μL辣根过氧化酶HRP标记的PSA检测抗体以10μL/min速度注入，同样再在37℃培养箱孵育30min和PBA洗涤。
优选地，所述第四步中，以50μL/min速度注入50μL含有浓度为0.1-10mM氢醌和0.05-5mM双氧水的pH=7.4的PBS溶液。
本发明上述芯片可以应用于医学诊断，环境监控，食品安全等的检测领域，比如检测胃癌标志物（CA199）肺癌肿瘤标志物（CEA），前列腺癌标志物（PSA），乳腺癌肿瘤标志物（CA153）等肿瘤标志物。
本发明提供了一种简单，快速，低成本，通用性的微流控电化学传感器的制备方法。本发明通过对玻璃溶液制备工艺的改进，将改进后的玻璃溶液直接涂到标准化印刷电极上。然后有预先设计好管道的PDMS，和涂有玻璃的印刷电极一起进行真空等离子体处理，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)直接键合到商品化印刷电极上，从而构建了一种新型的微流控电化学传感器平台。该传感器能够在生物液样如PBS溶液，血清中等对各种样品分析物超灵敏检测，本发明以检测人血清中前列腺癌标志物PSA为例，采用库伦安培法对PSA检测，结果表明检测灵敏度达0.84pg/mL,比标准化临床检测要求的0.1ng/mL提高了两个数量级，具有超高的检测灵敏度和准确性。高于其他电化学检测器件，同时该器件易操作，能够将样品的处理，分离等功能整合到一起。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1，重量轻，可便携，多功用；2，标准化；3，检测重复性强，超高灵敏度和精确度；4，易操作，无需专业人员和复杂的仪器设备；5，允许高密度检测体系整合到一个微型器件中；6，与小型的电化学工作站结合可在野外和家庭诊断；7，该器件易制备，可实现标准化，大规模生产。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例一采用Freehand绘图软件设计微流控管道绘制掩模板；
图2为本发明实施例一电化学微流控器传感器器件结构示意图；
图3为本发明实施例一电化学微流控器传感器器件加工制备示意图；
图4为本发明实施例一在微流控电化学器件中，不同扫速下的循环伏安图a以及不同扫速下的阳极电流和阴极电流的标准曲线b；
图5为本发明实施例库伦安培法检测在血清中检测不同浓度PSA抗原图a以及在血清中检测不同浓度PSA抗原的标准曲线b。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。以下实施例中没有详细说明的操作，可以参照发明内容，发明内容也没有说明的可以参照常规操作。
如图2所示，为本发明实施例一电化学微流控器传感器器件结构示意图；1为印刷电极连接头，2为标准三电极即工作电极，参比电极，对电极；3为印刷电极，4为PDMS芯片，5为微流控器件液体出口管道，6为微流控液体进口管道。
实施例1：
(a)采用Freehand绘图软件设计微流控管道绘制掩模板，该管道设计根据流体力学设计如图1所示，进口，出口均具有设计一定弧度，并无直角，管道中间为椭圆形，保证液体流畅通过，均匀的经过工作电极表面，该技术不同于其他微流控芯片通常采用长方形管道设计。
(b)利用软光刻标准微加工技术制备PDMS芯片。
(c)玻璃溶液配制，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS),正硅酸乙酯(TEOS),乙醇（EtOH），水(H2O pH=2–8)按1：1：1：1体积比混合，超声5–30min，在20-90℃下熟化2–24h。，比如超声可以为5min，15min，30min，熟化温度可以为20℃，50℃，90℃，熟化时间可以为2h，15h，24h等等。
(d)在标准化印刷电极表面上均匀涂一层玻璃溶液，室温下静置干燥。
(e)将PDMS芯片和涂有玻璃的印刷电极O2等离子体处理30-120s，之后键合（如图3）。
(f)在外加磁场作用下将50μL0.1–0.5mg/m带有PSA捕获抗体的磁珠固定到芯片电极工作区域。
(g)通过注射泵以10μL/min注射100μL0.001ng/mL,PSA抗原到芯片中，在37℃培养箱孵育30min。PBS洗涤，封闭。
(h)将50μL HRP标记的PSA检测抗体以2-20μL/min速度注射到该芯片中。同样在37℃孵育30min，PBS洗涤。
(i)再以20–80μL/min速度注入20-90μL含有氢醌（0.1-10mM）和双氧水（0.05–0.5mM）的pH=7.4PBS溶液。
(j)最后采用库伦安培法在-1.0–4mV的恒电位下检测，每组平行八次测定。
实施例2：
(a)采用Freehand绘图软件设计微流控管道绘制掩模板，具体设计见附图1。
(b)利用软光刻标准微加工技术制备PDMS芯片。
(c)玻璃溶液配制，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS),正硅酸乙酯(TEOS),乙醇（EtOH），水(H2O pH=2-8)按5：1：1：1至1：5：10：20体积比混合，超声5-15min，在20-90℃下熟化2–24h。
(d)在标准化印刷电极表面上均匀涂一层玻璃溶液，室温下静置干燥。
(e)将PDMS芯片和涂有玻璃的印刷电极O2等离子体处理60s，然后键合。
(f)在外加磁场作用下将50μL0.05-0.5mg/m带有CEA捕获抗体的磁珠固定到芯片电极工作区域。
(g)通过注射泵以10μL/min注射100μL0.1ng/mL,CEA抗原到芯片中，在37℃培养箱孵育20-60min。PBS洗涤，封闭。
(h)将50μL HRP标记的CEA检测抗体以5-20μL/min速度注射到该芯片中。同样37℃孵育20-60min，PBS洗涤。
(i)再以50μL/min速度注入20-100μL含有氢醌（0.5-4mM）和双氧水（0.005-0.1mM）的pH=7.4PBS溶液。
(j)最后采用库伦安培法在-1.0-4.0mV的恒电位下检测，每组平行八次测定。
实施例3：
(a)采用Freehand绘图软件设计微流控管道绘制掩模板，具体设计见附图1。
(b)利用软光刻标准微加工技术制备PDMS芯片。
(c)玻璃溶液配制，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS),正硅酸乙酯(TEOS),乙醇（EtOH），水(H2O pH=2-8)按体积比1：5：10：20混合，超声5–20min，在20-90℃下熟化2–24h。
(d)在标准化印刷电极表面上均匀涂一层玻璃溶液，室温下静置干燥。
(e)将PDMS芯片和涂有玻璃的印刷电极O2等离子体处理90s，之后键合。
(f)在外加磁场作用下将50μL0.05–0.5mg/m带有CA199捕获抗体的磁珠固定到芯片电极工作区域。
(g)通过注射泵以2–50μL/min注射100μL10ng/mL,CA199抗原到芯片中,在37℃培养箱孵育20-60min。PBS洗涤，封闭。
(h)将50μL HRP标记的CA199检测抗体以2-20μL/min速度注射到该芯片中。同样37℃孵育30min，PBS洗涤。
(i)再以50μL/min速度注入20-100μL含有氢醌（0.5-10mM）和双氧水（0.05-5mM）的pH=7.4PBS溶液。
(j)最后采用库伦安培法在-1.0-5mV的恒电位下检测，每组平行八次测定。
如图4所示，其中曲线a为在微流控电化学器件中不同扫速10,25,50,80,100,150,200,250,300,350mV s-1下的循环伏安图；b为不同扫速下的阳极电流和阴极电流的标准曲线
如图5所示，其中a为库伦安培法检测在血清中检测不同浓度0,0.001,0.01,0.1,1and10ng mL-1的PSA抗原；b为在血清中检测不同浓度PSA抗原的标准曲线。
本发明介绍了一种简单，快速加工制备微流控电化学传感器的工艺，并将该芯片应用于检测胃癌标志物（CA199）肺癌肿瘤标志物（CEA），前列腺癌标志物（PSA），乳腺癌肿瘤标志物（CA153）等肿瘤标志物。本发明是将带有设计不同管道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)直接耦合到标准化印刷电极上，从而构建了一种新型的微流控电化学传感器平台，并将该器件应用于人血清中前列腺癌标志物PSA的检测，结果表明检测灵敏度达0.84pg/mL,比商业化临床检测要求的0.1ng/mL提高了两个数量级，具有超高的检测灵敏度和准确性。本发明工艺简单新颖，材料简单，设备数量少，能耗低，加工环境要求不高，一般实验室即可完成，便于推广，并且很容易将样品制备，分离，检测多功能集成在一个芯片上，可以实现芯片检测微型化，同时该器件在人类健康，食品安全，环境检测等领域。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (12)
1.一种电化学微流控传感芯片的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
第一步，采用绘图软件设计微流控管道绘制掩模板，利用标准的软光刻技术加工微流控PDMS芯片；
第二步，配制玻璃溶液：
将3-氨基丙基三乙氧基硅烷,正硅酸乙酯,乙醇，pH＝2–8的水按体积比5：1：1：1至1：5：10：20混合，超声，然后放置在20℃-90℃烘箱进行熟化2-24h，即得到玻璃溶液；
第三步，印刷电极表面玻璃图涂层处理，在印刷电极涂上一层第二步配制的玻璃溶液，室温下静止干燥，待表面形成一层玻璃；该电极采用是标准化的印刷电极；
第四步，将第一步的PDMS芯片和第三步的涂有玻璃的印刷电极一起进行O2等离子体处理，然后取出来将PDMS芯片与印刷电极键合，即完成该电化学微流控传感芯片制备。
2.根据权利要求1所述的电化学微流控传感芯片的制备方法，其特征在于，第二步中超声处理时间为5-30min。
3.根据权利要求1所述的电化学微流控传感芯片的制备方法，其特征在于，第三步中所述的印刷电极玻璃涂层化处理，其具体加工工艺是，将熟化好的玻璃均匀的涂在印刷电极周围，避免将玻璃溶液涂到印刷电极表面上，涂好之后放置室温下干燥，形成一层超薄玻璃。
4.根据权利要求1所述的电化学微流控传感芯片的制备方法，其特征在于，第四步中等离子体处理时间为30-120s。
5.根据权利要求1-4任一项所述的电化学微流控传感芯片的制备方法，其特征在于，第一步中，所述的微流控管道绘制掩模板，其尺寸大小为进出样管道宽度为100-500μm,中间检测区域宽度为5-10mm，总长度为14-20mm，管道的高度为50-400μm；所述的微流控管道的进口、出口均具有设计弧度，管道中间为椭圆形，保证液体流畅通过，均匀的经过工作电极表面。
6.一种权利要求1所得到的电化学微流控传感芯片的应用，其特征在于，将该电化学微流控传感芯片应用于人血清中前列腺癌标志物PSA，胃癌标志物CA199，肺癌肿瘤标志物CEA，乳腺癌肿瘤标志物CA153，DNA，RNA，miRNA，核酸适体生物样品的检测。
7.根据权利要求6所述的电化学微流控传感芯片的应用，其特征在于，所述电化学微流控传感芯片应用于人血清中前列腺癌标志物PSA的检测，具体包括如下步骤：
第一步，在外加磁场作用下将0.1–0.5mg/m带有PSA捕获抗体的磁珠固定到电化学微流控传感芯片电极工作区域；
第二步，通过注射泵以2-50μL/min注射0-10ng/mL不同浓度PSA抗原到电化学微流控传感芯片中，在37℃培养箱孵育20-60min，PBS洗涤，封闭；
第三步，将HRP标记的PSA检测抗体以2-20μL/min速度注射到该电化学微流控传感芯片中，同样37℃孵育20-60min，然后采用磷酸盐缓冲液PBS洗涤；
第四步，再注入20-100μL含有氢醌和双氧水的PBS溶液；
第五步，最后采用库伦安培法在-1.0-5mV的恒电位下检测，每组平行八次测定。
8.根据权利要求7所述的电化学微流控传感芯片的应用，其特征在于，所述第一步中，首先将带有生物素的PSA捕获抗体修饰到带有链霉亲和素的磁珠上，通过外加磁场的作用将50μL 0.2mg/mL修饰好的磁珠固定到微流控芯片中的工作电极区域内，进而PSA抗原捕获。
9.根据权利要求8所述的电化学微流控传感芯片的应用，其特征在于，所述第二步中，采用注射泵将100μL含有0-10ng/mL不同浓度PSA抗原的血清以10μL/min速度注射到芯片中，进行富集，再在37℃培养箱孵育30min,之后用100μL pH7.4PBS溶液以50μL/min速度充分洗涤，再用50μL的封闭液进行封闭，去除非特异性吸附。
10.根据权利要求9所述的电化学微流控传感芯片的应用，其特征在于，所述的封闭液，是0.05％Tween-20和2％的BSA的PBS溶液，所用体积是50uL，其目的是去除抗体的非特异性结合。
11.根据权利要求6-9任一项所述的电化学微流控传感芯片的应用，其特征在于，所述第三步中，在第二步操作后，以10μL/min流速注射100μL PSA检测抗体，将50μL辣根过氧化酶HRP标记的PSA检测抗体以10μL/min速度注入，同样再在37℃培养箱孵育30min和PBA洗涤。
12.根据权利要求6-9任一项所述的电化学微流控传感芯片的应用，其特征在于，所述第四步中，以50μL/min速度注入50μL含有浓度为0.1-10mM氢醌和0.05-5mM双氧水的pH＝7.4的PBS溶液。
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