CN104407036B - 用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备及其应用。在印刷电极上直接构建微流控电化学传感器件，包含两层PDMS芯片，上层的微通道以满足各种样品的充分混匀，下层微通道区域则是反应区和检测区；将温控元件整合到上述器件上；对电极表面进行功能化修饰，针对乙肝病毒核酸设计相应的引物，将电化学报告分子修饰到引物上，将标记好的引物与待检测核酸混匀，注入到微流控芯片内，控制合适温度，对待测核酸样品进行等温扩增反应。被标记的引物在扩增的同时通过碱基配对作用结合到电极表面。对电化学报告分子检测，实现对病毒的检测。本发明微型化，成本低，便携，可实现快速、高灵敏检测，方便用于野外和家庭诊断。

Description

用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备及其应用

技术领域

本发明涉及一种微流控器件，具体地说，涉及一种用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法及其在医学检测方面的应用。

背景技术

微流控器件是把化学和生物等领域中所涉及的样品转移、分离和纯化处理等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术平台，由于低消耗、高通量和微型化的优势，该技术在临床、诊断、药物、毒理等研究方面具有很大的应用潜力。

电化学检测技术具有高灵敏度，高特异性，成本低，便携，微型化等特点，而且电化学检测易的整合到微流控器件上，与传统的分析平台相比，如质谱、光学检测等相比，具有很大优势。电化学微流控器件这些优越的性能将使其在生物医学体外诊断上展示了巨大应用价值。

目前传统的微流控电化学POCT(即使诊断)器件是采用复杂的磁控溅射技术、甩胶光刻技术、离子束刻蚀技术、湿法刻蚀技术等，在玻璃基质上完成微型电极制备，通常为单层PDMS芯片长方形管道设计；在三电极体系中，若工作电极、参比电极、对电极采用的材质不同，其电极制备工艺将更加复杂。整个加工制备过程都需要在净化间内完成，成本高，另外由于制备过程涉及环节多，且每个环节参数设置很多，对技术操作人员要求非常高，因此很难保证不同批次产品的重复性。同时，采用这种方式难以实现大批量规模化生产。

发明内容

本发明的目的是，针对现有技术中的缺陷，提供一种简单，快速，低成本，高灵敏度，具有普适性的，温度可控的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备，并将该电化学微流控器件应用于医学检测，如HBV、HIV、肺结核病毒等，以及野外和家庭诊断。

本发明是通过以下技术方案实现的。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法，包括如下步骤：

第一步，设计所需要的微流控管道图形，制绘掩模板，根据掩模板制备两层带有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷芯片，再将两层聚二甲基硅氧烷芯片与印刷电极键合；

第二步，对电化学微流控器件中的印刷电极表面进行功能化修饰，通过共价键法，将核酸捕获探针固定到印刷电极表面；

第三步，将用于注入待检测反应物的进样通道连通至聚二甲基硅氧烷芯片位置，将用于进行反应物检测的电化学传感元件结合到印刷电极的工作区域，进而得到电化学微流控器件。

优选地，在第一步和第二步之间还包括如下步骤：在电化学微流控器件上结合微型温控装置。

优选地，所述第一步中，两层带有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷芯片分别为上层聚二甲基硅氧烷芯片和下层聚二甲基硅氧烷芯片，其中，上层聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道为蛇形通道，下层聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道为椭圆形通道。

优选地，所述第二步中，对印刷电极的功能化修饰，是以聚苯胺为反应物，进行电聚合，在印刷电极表面引入用于键和的氨基-NH2，再通过戊二醛将合成的捕获探针共价修饰到印刷电极上。

优选地，所述第三步中，进样通道为三条。

优选地，所述微型温控装置包括温控加热元件和微型温度传感芯片，其中，所述温控加热元件通过微加工技术将镍、铬溅射到玻璃基底上，然后将温控加热元件与电化学微流控器件结合，最后在电化学微流控器件的印刷电极上插入微型温度传感芯片。

根据本发明的另一个方面，提供了一种按照上述用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中乙肝病毒、人类免疫缺陷病毒、肺结核病毒中的应用。

优选地，所述的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中乙肝病毒的应用，包括如下步骤：

步骤1，通过戊二醛将乙肝病毒捕获探针固定到电化学微流控器件印刷电极的工作区域；设计针对乙肝病毒的引物，然后将电化学报告分子标记到该引物上；

步骤2，以5～10μL/min的速度分别向进样通道注射18μL LAMP反应液、1μL链置换DNA聚合酶、1μL标记好的引物、1μL乙肝病毒模板、若干μL无核酸酶H₂O，总反应物体积25μL；

步骤3，总反应物在65℃条件下保温60min，进行等温扩增；然后在80℃、10min的条件下灭活链置换DNA聚合酶；被标记的引物在等温扩增的同时通过碱基配对作用结合到印刷电极表面；

步骤4，采用磷酸盐缓冲液洗涤电化学微流控器件下层聚二甲基硅氧烷芯片的椭圆形管道区域，以洗去灭活的链置换DNA聚合酶；

步骤5，再注入25μL含有氢醌和双氧水的磷酸盐缓冲液的混合溶液，采用库伦安倍法在-0.3～4mV的恒电位下通过电化学传感元件对电化学报告分子进行检测，进而检测乙肝病毒。

优选地，每组平行测定八次。

优选地，所述的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中人类免疫缺陷病毒的应用，包括如下步骤：

步骤一，通过戊二醛将人类免疫缺陷病毒捕获探针固定到电化学微流控器件印刷电极的工作区域；设计针对人类免疫缺陷病毒的引物，然后将电化学报告分子标记到该引物上；

步骤二，通过注射泵以5～10μL/min的速度分别注射18μLLAMP(核酸环介导等温扩增)反应液、1μL链置换DNA聚合酶、1μL引物、1μL人类免疫缺陷病毒模板、若干无核酸酶H₂O，总反应物体积25μL；

步骤三，总反应物在65℃条件下保温60min，进行等温扩增；然后在80℃、10min的条件下灭活链置换DNA聚合酶；被标记的引物在等温扩增的同时通过碱基配对作用结合到印刷电极表面；

步骤四，采用磷酸盐缓冲液洗涤电化学微流控器件下层聚二甲基硅氧烷芯片的椭圆形管道区域，以洗去灭活的链置换DNA聚合酶；

步骤五，再注入25μL含有氢醌和双氧水的磷酸盐缓冲液的混合溶液，采用库伦安倍法在-0.3～4mV的恒电位下通过电化学传感元件对电化学报告分子进行检测，进而检测人类免疫缺陷病毒。

优选地，每组平行测定八次。

优选地，所述的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中肺结核病毒的应用，包括如下步骤：

步骤I，通过戊二醛将肺结核病毒捕获探针固定到电化学微流控器件印刷电极的工作区域；设计针对肺结核病毒的引物，然后将电化学报告分子标记到该引物上；

步骤II，通过注射泵以5～10μL/min的速度分别注射18μLAMP反应液、1μL链置换DNA聚合酶、1μL引物、1μL肺结核病毒模板、若干无核酸酶H2O，总反应物体积25μL；

步骤III，总反应物在65℃条件下保温60min，进行等温扩增；然后在80℃、10min的条件下灭活链置换DNA聚合酶；被标记的引物在等温扩增的同时通过碱基配对作用结合到印刷电极表面；

步骤IV，采用磷酸盐缓冲液洗涤电化学微流控器件下层聚二甲基硅氧烷芯片的椭圆形管道区域，以洗去灭活的链置换DNA聚合酶；

步骤V，再注入25μL含有氢醌和双氧水的磷酸盐缓冲液的混合溶液，采用库伦安倍法在-0.3～4mV的恒电位下通过电化学传感元件对电化学报告分子进行检测，进而检测肺结核病毒。

优选地，每组平行测定八次。

上述电化学报告分子即能够产生电化学响应的物质，如二茂铁、三联吡啶钌等。

本发明提供了一种简单，快速，低成本，便携式，通用性的电化学微流控器件的制备方法。本发明的独特之处之一在于，设计了两层PDMS芯片，上层用于混合样品，下层用于核酸等温扩增和检测，有效减少了样品使用量，节约了成本。然后将两层PDMS芯片与标准化印刷电极直接键合，从而构建一种新型的电化学微流控器件。最后，将微型温控装置以及微型温度传感器与上述器件整合，即得最终产品。该器件能够对生物液样，如血清，尿液等各种样品分析物进行超灵敏检测，以检测人血清中乙肝病毒HBV的LAMP为例，采用库伦安倍法对HBV检测，具有超高的检测灵敏度和准确性，高于其他电化学检测器件，而且该器件易操作，能够将样品的混合，反应，检测等功能整合到一起。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、重量轻，可便携，多功用；

2、价格低廉；

3、超高灵敏度和精确度；

4、易操作，无需专业人员和复杂的仪器设备；

5、可在野外和家庭诊断；

6、该器件制备工艺简单，可实现标准化，大规模生产；

7、本发明一方面可以很方便的控制核酸扩增所需温度，另一方面，针对现有的核酸等温扩增技术一般是通过肉眼观察颜色变化来判断扩增结果，并不十分精确的问题，提出将核酸等温扩增技术与电化学检测相结合，极大地提高了检测结果的准确性和可靠性。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明采用计算机辅助设计CAD程序设计微流控管道绘制掩模板，其中，(a)为下层掩模板，(b)为上层掩模板；

图2为本发明电化学微流控器件结构示意图；

图3为本发明电化学微流控器件加工制备示意图；

图4(a)和图4(b)分别为本发明采用库伦安培法检测在血清中检测不同浓度HBV抗原谱图以及在血清中检测不同浓度HBV抗原的标准曲线图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供了一种用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法，包括如下步骤：

第一步，设计所需要的微流控管道图形，制绘掩模板，根据掩模板制备两层带有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片，再将两层聚二甲基硅氧烷芯片与印刷电极键合，进而得到电化学微流控器件；

第二步，对电化学微流控器件中的印刷电极表面进行功能化修饰，通过共价键法，将核酸捕获探针固定到印刷电极表面；

第三步，将用于注入待检测反应物的进样通道连通至聚二甲基硅氧烷芯片位置，将用于进行反应物检测的电化学传感元件结合到印刷电极的工作区域，进而得到电化学微流控器件。

进一步地，在第一步和第二步之间还包括如下步骤：在电化学微流控器件上结合微型温控装置。

进一步地，所述第一步中，两层带有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷芯片分别为上层聚二甲基硅氧烷芯片和下层聚二甲基硅氧烷芯片，其中，上层聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道为蛇形通道，下层聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道为椭圆形通道。

进一步地，所述第二步中，对印刷电极的功能化修饰，是以聚苯胺为反应物，进行电聚合，在印刷电极表面引入用于键和的氨基-NH2，再通过戊二醛将合成的捕获探针共价修饰到印刷电极上。

进一步地，所述第三步中，进样通道为三条。

进一步地，所述微型温控装置包括温控加热元件和微型温度传感芯片，其中，所述温控加热元件通过微加工技术将镍、铬溅射到玻璃基底上，然后将温控加热元件与电化学微流控器件结合，最后在电化学微流控器件的印刷电极上插入微型温度传感芯片。

本实施例的工作过程为：

设计针对待检测核酸的引物，然后将电化学报告分子标记到该引物上，再将标记好的引物、待检测核酸以及其他试剂(LAMP反应液、链置换DNA聚合酶和无核酸酶水混合溶液)通过三个孔道分别注入到电化学微流控器件内，控制合适温度，对待测核酸样品进行等温扩增；被标记的引物在等温扩增的同时通过碱基配对作用结合到印刷电极表面；通过电化学传感元件对电化学报告分子进行检测，从而实现对核酸的检测。

针对待检测核酸的引物同时用于核酸等温扩增。

电化学报告分子即能够产生电化学响应的物质，如二茂铁、三联吡啶钌等。

下面结合附图对本实施例作进一步描述。

如图2所示，为本实施例提供的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件结构示意图，其中：1为第一进样口；2为第二进样口；3为第三进样口；4为上层微流控PDMSX芯片和下层微流控PDMS芯片对准接口；5为上层微流控PDMS芯片；6为下层微流控PDMS芯片；7为印刷电极；8为微型温度传感芯片；9为微型温控元件；10为USB接口(连接计算机系统)；11为样品出口。

本实施例具体为：

用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法，具体步骤如下：

第一步，采用计算机辅助CAD软件设计蛇形和椭圆形微流控管道，绘制掩模板，利用标准的软光刻技术加工微流控PDMS芯片，先将上层蛇形管道的PDMS芯片与下层椭圆形管道的PDMS芯片键合，然后与经过表现处理的印刷电极键合，以制备电化学微流控器件；

第二步，印刷电极(工作电极)的功能化修饰，是将聚苯胺电聚合到电极上，再通过戊二醛将合成的捕获探针共价修饰到电极上；

第三步，将用于注入待检测反应物的进样通道连通至聚二甲基硅氧烷芯片位置，将用于进行反应物检测的电化学传感元件结合到印刷电极的工作区域，进而得到电化学微流控器件。

所述第一步和第二步之间还可以包括如下步骤：采用微加工精密制造技术，将微型温控装置有效与电化学微流控器件相结合。

第一步中，所述的微流控管道绘制掩模板，其上层PDMS芯片管道宽度25-100μm，总长度为5-30mm，高度为25-200μm。下层PDMS芯片进出口管道宽度为50-400μm,中间反应及检测区域宽度为5-10mm，总长度为10-20mm，管道的高度为25-400μm。上层管道出口必须与下层管道入口对齐。

使用计算机辅助设计CAD程序设计出所需要的芯片图形，制备掩模板，采用微加工技术制备两层带有不同结构微通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片，再将两层芯片以及印刷电极键合，以制备电化学微流控器件。

两层PDMS芯片的设计，上层PDMS芯片的蛇形微流控管道可使样品充分混匀、孵化,是使从不同孔道同时进入器件的样品充分混匀，然后进入下一层PDMS芯片中进行等温扩增及电化学检测。此设计可以很好地节约试剂和样品的用量，从而降低了检测成本，而且，比起目前等温扩增法方法使用肉眼观察结果，我们通过电化学检测更为灵敏。

所述将微型温控装置有效与电化学微流控器件相结合，是在印刷电极底部涂一层PDMS溶液，然后与制备好的温控加热元件粘合，置于60℃烘箱中1～2小时。取出后将微型温度传感芯片插入靠近反应区域的印刷电极预留空隙中。

通过微加工精密制造技术，将微型温控装置有效结合到电化学微流控器件上，通过温控加热及温度传感装置，可以有效控制温度，保证扩增在合适温度下进行。

通过微加工技术将镍、铬溅射到玻璃基底上，作为温控加热元器件。然后将该温控加热元件与上述电化学微流控器件结合，最后插入微型温度传感芯片。

温度的控制可满足不同核酸，不同等温扩增方法所需要的不同温度。

第二步中，在工作电极上采用循环伏安法，将聚苯胺电聚合到电极上，即在电极上修饰上可供共价结合的氨基-NH2。

对电化学微流控器件中的工作电极表面进行功能化修饰，即通过共价键法，将核酸捕获探针固定到电极表面。

工作电极的功能化修饰，是以聚苯胺为反应物，进行电聚合，在电极表面引入可供键和的氨基(-NH2)，再通过戊二醛将合成的捕获探针共价修饰到电极上。

本实施例运用了电化学检测的高灵敏性对核酸等温扩增结果进行准确检测。

设计针对待检测核酸的引物。然后将电化学报告分子标记到该引物上，再将标记好的引物、待检测核酸以及其他试剂通过三个孔道注入到器件内，控制合适温度，对待测核酸样品进行扩增。被标记的引物在等温扩增的同时通过碱基配对作用结合到电极表面。通过电化学传感元件对电化学报告分子检测，从而实现对核酸的检测，如乙肝病毒、HIV、肺结核病毒等。

本实施例提供的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法，在印刷电极上直接构建了一种微流控电化学传感器件，包含两层聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片，上层里面含有微通道以满足各种样品的充分混匀，下层PDMS芯片的椭圆形区域则是反应区和检测区。通过微加工工艺将温控元件整合到上述器件上。对电极表面进行功能化修饰。再针对病毒核酸设计相应的引物，同时将电化学报告分子修饰到引物上，再将标记好的引物与待检测核酸混匀，注入到微流控芯片内，控制合适温度，对待测核酸样品进行等温扩增反应。被标记的引物在扩增的同时通过碱基配对作用结合到电极表面。通过电化学传感器对电化学报告分子检测，从而实现对乙肝病毒的检测。本实施例具有微型化，成本低，便携，可实现快速、高灵敏检测的特点，方便用于野外和家庭诊断。

实施例2

本实施例提供了一种按照实施例1提供的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中乙肝病毒、人类免疫缺陷病毒、肺结核病毒中的应用。

进一步地，所述的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中乙肝病毒(HBV)的应用，包括如下步骤：

步骤1，在印刷电极修饰上氨基-NH2之后，通过戊二醛将乙肝病毒捕获探针固定到电化学微流控器件印刷电极工作区域；

步骤2，通过注射泵以5～10μL/min的速度分别注射18μL LAMP反应液、1μL链置换DNA聚合酶、1μL引物、1μL乙肝病毒模板、若干无核酸酶H2O，总反应物体积25μL；

步骤3，总反应物在65℃左右保温60min，并在80℃、10min的条件下灭活链置换DNA聚合酶；

步骤4，采用磷酸盐缓冲液洗涤；

步骤5，再注入25μL含有氢醌和双氧水的磷酸盐缓冲液的混合溶液，采用库伦安倍法在-0.3～4mV的恒电位下检测乙肝病毒，每组平行测定八次。

具体为：

(a)采用计算机辅助CAD程序设计微流控管道绘制掩模板，该管道设计根据流体力学设计如图1(a)和图1(b)所示，两层PDMS芯片，上层蛇形管道的PDMS与下层椭圆形管道的PDMS，蛇形管道保证样品充分混匀，椭圆形管道保证液体流畅通过，均匀的经过工作电极表面。

(b)利用软光刻标准微加工技术制备PDMS芯片。

(c)将PDMS芯片和印刷电极键合(如图3)。

(d)将微型温控元件和微型温度传感器整合到印刷电极上去。

(e)采用循环伏安法对工作电极(印刷电极)表面进行功能化修饰。将玻碳电极用金相砂纸打磨；再用0.5μm粒度的α-Al2O3在绒布上抛光；依次在无水乙醇、丙酮和蒸馏水中分别超声清洗3min；再在0.1mol/L NaOH中，于1.2V电位下活化5min。准确称取0.0042g聚苯胺，溶于10mL0.1mol/L H₂SO₄溶液中配制成聚苯胺修饰液，备用；然后将预处理好的裸玻碳电极置于聚苯胺修饰液中，在氮气饱和氛围下，于-0.6～1.0V范围内，以100mV/s扫速循环伏安扫描50次左右即可。然后在戊二醛作用下，将HBV抗原捕获探针固定上去。

(f)设计针对乙肝病毒核酸扩增的引物，将电化学报告分子Fc修饰上去；

(g)通过注射泵以5～10μL/min注入18μLLAMP反应液，1μL链置换DNA聚合酶，1μL引物，1μLHBV模板，若干无核酸酶H2O，总反应体积25μL；

(h)注射结束后，控制合适温度，进行核酸等温扩增，被标记的引物在核酸等温扩增的同时通过碱基配对作用结合到电极表面。

(i)电化学传感器对电化学报告分子产生感应，转化为电信号输出到计算机，从而实现对核酸的检测。

(j)最后采用库伦安培法在-0.3～4mV的恒电位下检测乙肝病毒，每组平行八次测定。

进一步地，所述的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中人类免疫缺陷病毒(HIV)的应用，包括如下步骤：

步骤一，在印刷电极修饰上氨基-NH2之后，通过戊二醛将人类免疫缺陷病毒捕获探针固定到电化学微流控器件印刷电极工作区域；

步骤二，通过注射泵以5～10μL/min的速度分别注射18μLLAMP反应液、1μL链置换DNA聚合酶、1μL引物、1μL人类免疫缺陷病毒模板、若干无核酸酶H2O，总反应物体积25μL；

步骤三，总反应物在65℃左右保温60min，并在80℃、10min的条件下灭活链置换DNA聚合酶；

步骤四，采用磷酸盐缓冲液洗涤；

步骤五，再注入25μL含有氢醌和双氧水的磷酸盐缓冲液的混合溶液，采用库伦安倍法在-0.3～4mV的恒电位下检测人类免疫缺陷病毒，每组平行测定八次。

具体为：

(a)采用计算机辅助CAD程序设计微流控管道绘制掩模板，该管道设计根据流体力学设计如图1(a)和(b)所示，两层PDMS芯片，上层蛇形管道的PDMS与下层椭圆形管道的PDMS，蛇形管道保证样品充分混匀，椭圆形管道保证液体流畅通过，均匀的经过工作电极表面，该技术不同于现有的微流控芯片通常采用的单层PDMS长方形管道设计。

(b)利用软光刻标准微加工技术制备PDMS芯片。

(c)将PDMS芯片和印刷电极键合(如图3)。

(d)将微型温控装置和微型温度传感器整合上去。

(e)采用循环伏安法对工作电极表面进行功能化修饰。将玻碳电极用金相砂纸打磨；再用0.5μm粒度的α-Al2O3在绒布上抛光；依次在无水乙醇、丙酮和蒸馏水中分别超声清洗3min；再在0.1mol/L NaOH中，于1.2V电位下活化5min。准确称取0.0042g聚苯胺，溶于10mL0.1mol/L H2SO4溶液中配制成聚苯胺修饰液，备用；然后将预处理好的裸玻碳电极置于聚苯胺修饰液中，在氮气饱和氛围下，于-0.6～1.0V范围内，以100mV/s扫速循环伏安扫描50次左右即可。然后在戊二醛作用下，将HIV抗原捕获探针固定上去。

(f)设计针对HIV病毒核酸扩增的引物，将电化学报告分子Fc修饰上去；

(g)通过注射泵以5～10μL/min注入18μLLAMP反应液，1μL链置换DNA聚合酶，1μL引物，1μLHIV模板，若干无核酸酶H2O，总反应体积25μL；

(h)注射结束后，控制合适温度，进行核酸等温扩增，被标记的引物在核酸等温扩增的同时通过碱基配对作用结合到电极表面；

(i)电化学传感器对电化学报告分子产生感应，转化为电信号输出到计算机，从而实现对核酸的检测；

(j)最后采用库伦安培法在-0.3～4mV的恒电位下检测HIV病毒，每组平行八次测定。

进一步地，所述的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中肺结核病毒的应用，包括如下步骤：

步骤I，在印刷电极修饰上氨基-NH2之后，通过戊二醛将肺结核病毒捕获探针固定到电化学微流控器件印刷电极工作区域；

步骤II，通过注射泵以5～10μL/min的速度分别注射18μLLAMP反应液、1μL链置换DNA聚合酶、1μL引物、1μL肺结核病毒模板、若干无核酸酶H2O，总反应物体积25μL；

步骤III，总反应物在65℃左右保温60min，并在80℃、10min的条件下灭活链置换DNA聚合酶；

步骤IV，采用磷酸盐缓冲液洗涤；

步骤V，再注入25μL含有氢醌和双氧水的磷酸盐缓冲液的混合溶液，采用库伦安倍法在-0.3～4mV的恒电位下检测肺结核病毒，每组平行测定八次。

具体为：

(a)采用计算机辅助CAD程序设计微流控管道绘制掩模板，该管道设计根据流体力学设计如图1(a)和(b)所示，两层PDMS芯片，上层蛇形管道的PDMS与下层椭圆形管道的PDMS，蛇形管道保证样品充分混匀，椭圆形管道保证液体流畅通过，均匀的经过工作电极表面，该技术不同于现有的微流控芯片通常采用的单层PDMS长方形管道设计。

(b)利用软光刻标准微加工技术制备PDMS芯片。

(c)将PDMS芯片和印刷电极键合(如图3)。

(d)将微型温控装置和微型温度传感器整合上去。

(e)采用循环伏安法对工作电极表面进行功能化修饰。将玻碳电极用金相砂纸打磨；再用0.5μm粒度的α-Al2O3在绒布上抛光；依次在无水乙醇、丙酮和蒸馏水中分别超声清洗3min；再在0.1mol/L NaOH中，于1.2V电位下活化5min。准确称取0.0042g聚苯胺，溶于10mL0.1mol/L H2SO4溶液中配制成聚苯胺修饰液，备用；然后将预处理好的裸玻碳电极置于聚苯胺修饰液中，在氮气饱和氛围下，于-0.6～1.0V范围内，以100mV/s扫速循环伏安扫描50次左右即可。然后在戊二醛作用下，将肺结核病毒抗原捕获探针固定上去；

(f)设计针对肺结核病毒核酸扩增的引物，将电化学报告分子Fc(二茂铁)修饰上去；

(g)通过注射泵以5～10μL/min注入18μLLAMP反应液，1μL链置换DNA聚合酶，1μL引物，1μL肺结核病毒扩增模板，若干无核酸酶H2O，总反应体积25μL；

(h)注射结束后，控制合适温度，进行核酸等温扩增，被标记的引物在核酸等温扩增的同时通过碱基配对作用结合到电极表面；

(i)电化学传感器对电化学报告分子产生感应，转化为电信号输出到计算机，从而实现对核酸的检测；

(j)最后采用库伦安培法在-0.3～4mV的恒电位下检测，每组平行八次测定。

上述两个实施礼介绍了一种简单，快速加工制备用于核酸等温扩增的电化学微流控器件，并将该电化学微流控器件应用于检测HBV，HIV，肺结核病毒等。其中，实施例1是将带有不同设计管道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)直接耦合到标准化印刷电极上，从而构建了一种新型的电化学微流控器件，并将该器件应用于人血清中病毒的检测，检测灵敏度比商业化临床检测要求的0.1ng/mL提高了两个数量级，具有超高的检测灵敏度和准确性。本发明工艺简单新颖，材料简单，设备数量少，能耗低，加工条件要求不高，一般实验室或者厂房即可完成，便于推广，可以实现芯片检测微型化，同时该器件在人类健康，食品安全，环境检测等领域具有广阔的应用前景。

实施例1针对现有技术中存在的问题，在低成本的印刷电极上，采用微加工技术直接构建而成，大大简化了制备过程，显著地降低了成本，可进行大批量生产。印刷电极具有设计灵活、种类多样、价格低廉、制备简单、重复率高等优点，而且对生产环境要求不是很苛刻，在一般的厂房和实验室条件下均可完成。实施例1提供的电化学微流控器件的制备方法，不仅保证了产品的低成本和可重复性，而且容易实现产品标准化，极大拓宽了应用领域，其市场前景相当可观。

实施例1的独特之处是制备了两层结构不同的PDMS芯片，并整合了微型温控装置以及温度传感器，可以通过温控加热装置有效控制核酸等温扩增反应的最佳温度，保证扩增反应顺利进行。核酸等温扩增与电化学检测有效结合在一起，实现样品的处理与检测功能的高效化。

利用实施例1提供的制备方法制备得到的电化学微流控器件，不仅节约空间和试剂，其优点还表现在：(1)加热和冷却系统体积小，热容量小，可达到较高的加热和冷却速率；(2)由于尺寸的缩小使得比表面积增大，增大了热传导效率；(3)易于集成化。通过薄膜沉积和微加工技术在芯片底部将控温单元的各部件集成为薄膜电阻，紧贴于微流控电化学芯片，进行热传递，将核酸等温扩增系统与电化学检测系统集于一体，实现整个实验室微型化、自动化、提高分析速度。

实施例1在生物医学、环境监控、食品安全等领域具有非常广泛的应用前景。和常规实验相比，微流控器件具有许多独特的优势：样品和试剂量少，分析时间短，效率高，结果精确和灵敏度高，微型化和便携化。微流控器件将多种单元技术在微小平台上的灵活组合和大规模集成是其基本特征，也是其最大优势。因此可以利用微流控器件制作功能齐全的便携仪器，用于各类现场分析。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (6)

1.一种用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，设计所需要的微流控管道图形，制绘掩模板，根据掩模板制备两层带有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷芯片，再将两层聚二甲基硅氧烷芯片与印刷电极键合；所述第一步中，两层带有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷芯片分别为上层聚二甲基硅氧烷芯片和下层聚二甲基硅氧烷芯片，其中，上层聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道为蛇形通道，下层聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道为椭圆形通道；

第二步，对电化学微流控器件中的印刷电极表面进行功能化修饰，通过共价键法，将核酸捕获探针固定到印刷电极表面；所述第二步中，对印刷电极的功能化修饰，是以聚苯胺为反应物，进行电聚合，在印刷电极表面引入用于键和的氨基-NH2，再通过戊二醛将合成的捕获探针共价修饰到印刷电极上；

第三步，将用于注入待检测反应物的进样通道连通至聚二甲基硅氧烷芯片位置，将用于进行反应物检测的电化学传感元件结合到印刷电极的工作区域，进而得到电化学微流控器件；

在第一步和第二步之间还包括如下步骤：在电化学微流控器件上结合微型温控装置；所述微型温控装置包括温控加热元件和微型温度传感芯片，其中，所述温控加热元件通过微加工技术将镍、铬溅射到玻璃基底上，然后将温控加热元件与电化学微流控器件结合，最后在电化学微流控器件的印刷电极上插入微型温度传感芯片。

2.根据权利要求1所述的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法，其特征在于，所述第三步中，进样通道为三条。

3.一种按照权利要求1至2中任一项所述的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中乙肝病毒、人类免疫缺陷病毒、肺结核病毒中的应用。

4.根据权利要求3所述的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中乙肝病毒的应用，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，通过戊二醛将乙肝病毒捕获探针固定到电化学微流控器件印刷电极的工作区域；设计针对乙肝病毒的引物，然后将电化学报告分子标记到该引物上；

步骤2，以5～10μL/min的速度分别向进样通道注射18μL LAMP反应液、1μL链置换DNA聚合酶、1μL标记好的引物、1μL乙肝病毒模板、若干μL无核酸酶H₂O，总反应物体积25μL；

步骤3，总反应物在65℃条件下保温60min，进行等温扩增；然后在80℃、10min的条件下灭活链置换DNA聚合酶；被标记的引物在等温扩增的同时通过碱基配对作用结合到印刷电极表面；

步骤4，采用磷酸盐缓冲液洗涤电化学微流控器件下层聚二甲基硅氧烷芯片的椭圆形管道区域，以洗去灭活的链置换DNA聚合酶；

步骤5，再注入25μL含有氢醌和双氧水的磷酸盐缓冲液的混合溶液，采用库伦安倍法在-0.3～4mV的恒电位下通过电化学传感元件对电化学报告分子进行检测，进而检测乙肝病毒。

5.根据权利要求4所述的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中人类免疫缺陷病毒的应用，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，通过戊二醛将人类免疫缺陷病毒捕获探针固定到电化学微流控器件印刷电极的工作区域；设计针对人类免疫缺陷病毒的引物，然后将电化学报告分子标记到该引物上；

步骤二，通过注射泵以5～10μL/min的速度分别注射18μLLAMP反应液、1μL链置换DNA聚合酶、1μL引物、1μL人类免疫缺陷病毒模板、若干无核酸酶H₂O，总反应物体积25μL；

步骤三，总反应物在65℃条件下保温60min，进行等温扩增；然后在80℃、10min的条件下灭活链置换DNA聚合酶；被标记的引物在等温扩增的同时通过碱基配对作用结合到印刷电极表面；

步骤四，采用磷酸盐缓冲液洗涤电化学微流控器件下层聚二甲基硅氧烷芯片的椭圆形管道区域，以洗去灭活的链置换DNA聚合酶；

步骤五，再注入25μL含有氢醌和双氧水的磷酸盐缓冲液的混合溶液，采用库伦安倍法在-0.3～4mV的恒电位下通过电化学传感元件对电化学报告分子进行检测，进而检测人类免疫缺陷病毒。

6.根据权利要求4所述的用于核酸等温扩增的电化学微流控器件的制备方法制备得到的电化学微流控器件在检测人血清中肺结核病毒的应用，其特征在于，包括如下步骤：

步骤I，通过戊二醛将肺结核病毒捕获探针固定到电化学微流控器件印刷电极的工作区域；设计针对肺结核病毒的引物，然后将电化学报告分子标记到该引物上；

步骤II，通过注射泵以5～10μL/min的速度分别注射18μLAMP反应液、1μL链置换DNA聚合酶、1μL引物、1μL肺结核病毒模板、若干无核酸酶H2O，总反应物体积25μL；

步骤III，总反应物在65℃条件下保温60min，进行等温扩增；然后在80℃、10min的条件下灭活链置换DNA聚合酶；被标记的引物在等温扩增的同时通过碱基配对作用结合到印刷电极表面；

步骤IV，采用磷酸盐缓冲液洗涤电化学微流控器件下层聚二甲基硅氧烷芯片的椭圆形管道区域，以洗去灭活的链置换DNA聚合酶；

步骤V，再注入25μL含有氢醌和双氧水的磷酸盐缓冲液的混合溶液，采用库伦安倍法在-0.3～4mV的恒电位下通过电化学传感元件对电化学报告分子进行检测，进而检测肺结核病毒。