CN103627806A

CN103627806A - 一种基于磁场可控微流控芯片开发ssr标记的方法

Info

Publication number: CN103627806A
Application number: CN201310641796.4A
Authority: CN
Inventors: 李立家; 张志凌; 何世斌; 余旭; 王翔伍
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2013-12-03
Publication date: 2014-03-12

Abstract

本发明公开了一种基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法。本发明方法包括如下步骤：将基因组DNA酶切成200-800bp的片段，加接头进行PCR扩增，扩增产物微卫星探针杂交；制备微流控芯片；使用阀门和Matlab软件控制溶液从微流控芯片中进入和流出，将杂交混合物、与微卫星探针结合的磁珠、洗脱液分别注入微流控芯片中，杂交混合物与磁珠结合，通过外磁场的作用，将杂交混合物与磁珠固定在微流控芯片中，洗脱液将杂质洗脱出来，通过加热使DNA变性，将含有SSR片段的DNA分离出来。本发明节省了大量的试剂和材料，缩短了分离的时间，提高了分离的灵敏度，重复性好，可以快速、高效的进行SSR标记的筛选。

Description

一种基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，涉及一种基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法。

背景技术

随着分子生物学的快速发展，分子遗传标记技术已广泛应用于分子遗传图谱的构建，遗传多样性分析，医学诊断等方面，包括扩增片段长度多态性标记（Amplified restriction fragmentpolymorphisms，AFLPs），简单重复序列标记（simple sequence repeats，SSRs），单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphisms，SNPs）等。在这些分子标记中，SSR标记又称为微卫星标记（microsatellites），是由1-6个核苷酸经过多次重复组成的串联重复序列，重复序列两端有保守序列，可以根据两端的保守序列设计引物，即SSR引物，进行PCR扩增，不同基因型的材料重复序列长度不同，可以作为多态性分析。由于SSR广泛的分布在基因组中，多态性丰富，重复性好，数据易于统计，共显性遗传等优点，越来越广泛应用。然而，不像AFLPs，SNPs等分子标记，SSR分子标记具有物种特异性，需要对每一个物种单独开发。

目前广泛使用的是磁珠富集法开发SSR标记（Mol Ecol2002,11,1），在传统的磁珠富集法中，先提取基因组DNA，酶切成200-800bp的片段，加接头进行PCR扩增，然后将含有SSR的片段和生物素化的微卫星探针杂交，再与链霉亲和素修饰的磁珠结合。形成DNA-探针-磁珠复合物。在外磁场的作用下，通过多次洗涤将非特异性的DNA去除，DNA与探针-磁珠复合物进行分离，得到含有SSR序列的特异性片段。传统的磁珠富集法在eppendorf管中进行，要消耗大量的试剂和磁珠，磁珠一般价格较贵，而且需要复杂繁琐的人工洗涤、吹打过程。长时间的洗涤会引起大量的材料丢失，得到的含有SSR序列的片段少，导致筛选失败；而不充分的洗涤会引起出现大量的非特异性DNA，会得到很多假阳性的序列，这个分离过程对筛选SSR标记非常重要，而且需要熟练的操作人员。

微流控芯片技术，是近年来发展的一个新的研究领域，通过把生物、医学、化学等样本的反应、分离、检测等过程集成到微米级大小的芯片上，需要少量的样本和试剂，而且可以快速分离得到高纯度的分子物质，自动完成整个过程。最近，微流控芯片技术已经应用在生物和医学检测很多方面，包括荧光原位杂交定位序列在细胞核的分布情况，染色质免疫共沉淀检测染色质的表观修饰情况以及配体的筛选等（Microsystems and Nanotechnology:Springer,2012,853-895）。因此如果能将微流控芯片技术应用于传统筛选SSR标记的FIASCO方法中，将避免上述的缺点，减少试剂的用量和操作时间，不需要熟练的操作人员，并且由于在芯片中可以充分洗涤又不会有样本损失，可以实现SSR标记的快速筛选。然而如何在微流控芯片进行精确地磁场控制，使得在高流速情况下快速捕获磁珠和高流速下清洗过程，是进行特异性SSR标记快速筛选的首要条件。通过现有技术检索，中国专利授权号201010196067.9公开的“一种微磁场控制的微流控芯片及其制作方法”，该方法制作的微流控芯片可以在微米范围内进行磁场控制，在高流速下能够捕获磁性物质，因此结合磁场可控微流控芯片，开发一种快速筛选SSR标记的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，该方法操作简单、方便易行。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，包括如下步骤：提取基因组DNA，将基因组DNA酶切成200-800bp的片段；往酶切片段两端加接头进行PCR扩增，将PCR扩增产物和微卫星探针杂交；制备可以与微卫星探针结合的磁珠；制备磁场可控的微流控芯片；使用阀门和Matlab软件控制溶液从微流控芯片中进入和流出，将磁珠、杂交混合物、洗脱液分别注入微流控芯片中，杂交混合物与磁珠结合，通过外磁场的作用，将杂交混合物与磁珠固定在微流控芯片中，洗脱液将杂质洗脱出来，通过加热使DNA变性，将含有SSR片段的DNA分离出来。

所述的磁场可控的微流控芯片，包括三层：第一层是气阀控制层，用来控制溶液的流入和流出；第二层是流体层，控制流体流动；第三层是在ITO玻璃上PDMS（聚二甲基硅氧烷）封装的镍微结构，用来调控微通道内微区磁场分布。该微流控芯片的设计和制作方法参照专利号为ZL201010196067.9，名称为“一种微磁场控制的微流控芯片及其制作方法”中国专利，并在其上略有改动；其制作方法优选包含如下步骤：

（1）制作气阀控制层：利用光刻技术，制作气阀控制层光刻胶模型，接着倒上预聚的PDMS，排除气泡，固化后，切下PDMS，打孔。

（2）制作流体层：制作流体层通道光刻胶模型的方法与制作气阀层方法一致，然后甩上一层PDMS，固化。

（3）将流体层和气阀控制层对准键合，键合牢固后，揭下来双层芯片，打孔。

（4）制作PDMS封装的镍微结构：在ITO导电玻璃上进行光刻和电镀，制作出光刻胶模型，在ITO导电玻璃上制作出镍微结构；然后用一层PDMS将镍微结构封装在里面。

（5）将流体层通道和含有PDMS封装的镍微结构对准，键合，形成永久键合的微流控芯片。

（6）组装成完整的微流控芯片，包括将半导体加热片放在在ITO玻璃下面，两个永磁铁放置在半导体加热片下方，位于流体通道两侧，温控探头放置在ITO玻璃和半导体加热片之间。

所述的基因组DNA为真核生物的基因组DNA。

优选的，所述的酶切为使用MseI进行酶切，对应的接头为MseI A：5’-TACTCAGGACTCAT-3’和MseI B：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’；通过T4DNA连接酶将接头加到酶切片段两端；对应的PCR扩增的引物为MseI-N：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’；所述的PCR扩增的条件优选为：1）94℃4min；2）94℃30s，53℃30s，72℃1min，20个循环；3）72℃10min。

优选的，所述的微卫星探针为5’端有biotin-T10修饰的SSR；对应的可以与微卫星探针结合的磁珠为链霉亲和素修饰的磁珠。

所述的杂交的条件优选为：95℃下变性5min，然后在65℃下杂交1h。

所述的洗脱液包括TEN1000（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl，pH7.5）、0.2×SSC+0.1%SDS和TE（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，PH=8.0）。

所述的加热优选为加热至95℃。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明节省了大量的试剂和材料，缩短了分离的时间，提高了分离的灵敏度，重复性好，可以快速、高效的进行SSR标记的筛选。

附图说明

图1是微流控芯片制作的流程图；其中，1是气阀控制层，2是流体层，3是气阀控制层和流体层对齐键合，4是ITO玻璃，5是在ITO玻璃上制作镍点图案，6是PDMS封装镍图案，7是上层芯片（包括气阀控制层和流体层）和下层镍图案对准键合，组成完整的芯片。

图2是镍微结构图；a是镍微结构阵列，b是捕获到磁珠形成的磁珠阵列。

图3是进样口与出样口示意图；a是磁珠进样时的进样口与出样口，b是后续特定SSR片段捕获以及清洗等步骤的进样口与出样口。

图4是测序结果，波浪线代表引物序列，横线代表SSR序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

（1）制备益母草基因组DNA，使用MseI酶将基因组DNA酶切成200-800bp的片段，在T4DNA连接酶的作用下将酶切片段两端分别加上接头（MseI A：5’-TACTCAGGACTCAT-3’，MseI B：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’）。

（2）将MseI-N：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’作为引物、接头的酶切片段为模板进行PCR扩增，扩增条件为：1）94℃4min；2）94℃30s，53℃30s，72℃1min，20个循环；3）72℃10min。

（3）将扩增的PCR产物和探针biotin-T₁₀-(AG)₁₃进行杂交。杂交体系为：6×SSC+0.1%SDS3μL，PCR产物1.5μL，探针biotin-T₁₀-(AG)₁₃0.5μL（探针浓度为100mmol/L）；杂交反应条件为95℃下变性5min，然后在65℃下杂交1h。

（4）制备链霉亲和素修饰的磁珠，500nm羧基磁珠，修饰链霉亲和素后的粒径大约为700nm。

（5）制备磁场可控的微流控芯片，该芯片包括三层：第一层是气阀控制层，用来控制溶液的流入和流出；第二层是流体层，控制流体流动；第三层是在ITO玻璃上PDMS封装的镍微结构，用来调控微通道内微区磁场分布。

其制作流程图如图1所示，其设计和制作方法参照专利号为ZL201010196067.9，名称为“一种微磁场控制的微流控芯片及其制作方法”中国专利，具体包括如下步骤：

1）制作气阀控制层：利用光刻技术，制作气阀控制层光刻胶模型（高度40微米），接着倒上预聚的PDMS（单体:催化剂=10:1，质量比），排除气泡，75℃烘4小时，固化后，切下PDMS，打孔。

2）制作流体层：制作流体层通道（高度40微米）光刻胶模型的方法与制作气阀控制层方法一致，然后用甩胶机甩上一层PDMS，在烘箱中烘1小时固化。

3）将流体层和气阀控制层对准键合，置于烘箱中，烘烤30min，揭下来双层芯片，打孔。

4）制作PDMS封装的镍微结构：在ITO导电玻璃上进行光刻和电镀，制作出光刻胶模型，接着以光刻胶模型为模板进行电镀（即ITO上被光刻胶覆盖的区域不会被镀上镍微结构，而未被光刻胶遮住有图案的地方被镀上镍微结构，因此可以制作出各种镍微结构），在ITO导电玻璃上制作出镍微结构；然后用一层很薄（微米级）的PDMS将镍微结构封装在里面。其中镍微结构由40微米的矩形组成，13行×81列，高度约为10微米的阵列，如图2a所示。

5）将流体层通道和含有PDMS封装的镍微结构对准，键合，形成永久键合的微流控芯片。

6）组装成完整的微流控芯片，包括将半导体加热片放在在ITO玻璃下面，两个永磁铁放置在半导体加热片下方，位于流体通道两侧，温控探头（PT100）放置在ITO玻璃和半导体加热片之间。

（6）在微流控芯片中分离含有SSR的片段的DNA，整个过程见表1。杂交混合物、磁珠、洗脱液分别注入微流控芯片中，这个过程由Matlab软件操作完成（其中，磁珠进样时，进样口和出口如图3a所示；而当后续特定SSR片段捕获以及清洗等步骤，将进样口和出口调换，如图3b所示。）。首先将约0.1mg的链霉亲和素修饰的磁珠注入微流控芯片中，注入的流速为20μL/min，用时5min，通过一对永磁铁组成的“NS”对作为外磁场，在微流控芯片中原位捕获到修饰了链霉亲和素修饰的磁珠，形成磁珠阵列（如图2b所示），用来捕获杂交混合物；然后用将TEN₁₀₀₀（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl，pH7.5）洗链霉亲和素修饰的磁珠，用量为40μL，流速为20μL/min，用时2min；将DNA-探针复合物，也就是杂交混合物注入微流控芯片中，流速为5μL/min，用时1min；DNA-探针复合物注入后，与链霉亲和素修饰的磁珠进行偶联，反应时间为2min30s；接着用TEN₁₀₀₀进行非严谨性洗脱，将一些非特异性片段洗脱下来，用量40μL，流速为20μL/min，用时2min；用0.2×SSC+0.1%SDS进行严谨性洗脱，用量40μL，流速为20μL/min，用时2min；再用TE（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，PH=8.0）洗脱，用量10μL，流速为20μL/min，用时30s；最后注入TE溶液，外部半导体加热至95℃，TE用量25μL，流速为5μL/min，用时5min，这时流速较为缓慢，目的是为了将TE溶液都加热至95℃，DNA变性充分，将含有SSR的片段的单链DNA分离出来。整个分离过程仅用了20min，比传统磁珠富集法节省了3/4的时间，磁珠仅用了0.1mg，节省了9/10的用量。

（7）将分离出来的DNA片段进行测序，其中一个片段的测序结果如图4所示（波浪线代表引物序列，横线代表SSR序列），表明通过本发明获得了含有SSR的DNA片段，可以在SSR两端设计引物作为SSR标记。

表1为本发明与现有技术的比较

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 一种基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头MseI A

<400> 1

tactcaggac tcat 14

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头MseI B

<400> 2

gacgatgagt cctgag 16

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物MseI-N

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

gatgagtcct gagtaan 17

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 微卫星探针

<400> 4

tttttttttt agagagagag agagagagag agagag 36

Claims

1. 一种基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，其特征在于包括如下步骤：提取基因组DNA，将基因组DNA酶切成200-800 bp的片段；往酶切片段两端加接头进行PCR扩增，将PCR扩增产物和微卫星探针杂交；制备可以与微卫星探针结合的磁珠；制备磁场可控的微流控芯片；将磁珠、杂交混合物、洗脱液分别注入微流控芯片中，将含有SSR片段的DNA分离出来。

2.根据权利要求1所述的基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，其特征在于：所述的磁场可控的微流控芯片，包括三层：第一层是气阀控制层，用来控制溶液的流入和流出；第二层是流体层，控制流体流动；第三层是在ITO玻璃上PDMS封装的镍微结构，用来调控微通道内微区磁场分布。

3.根据权利要求2所述的基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法其特征在于：所述的磁场可控的微流控芯片的制作方法包含如下步骤：

（1）制作气阀控制层：利用光刻技术，制作气阀控制层光刻胶模型，接着倒上预聚的PDMS，排除气泡，固化后，切下PDMS，打孔；

（2）制作流体层：制作流体层通道光刻胶模型的方法与制作气阀层方法一致，然后甩上一层PDMS，固化；

（3）将流体层和气阀控制层对准键合，键合牢固后，揭下来双层芯片，打孔；

（4）制作PDMS封装的镍微结构：在ITO导电玻璃上进行光刻和电镀，制作出光刻胶模型，在ITO导电玻璃上制作出镍微结构；然后用一层PDMS将镍微结构封装在里面；

（5）将流体层通道和含有PDMS封装的镍微结构对准，键合，形成永久键合的微流控芯片；

4.根据权利要求1所述的基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，其特征在于：所述的基因组DNA为真核生物的基因组DNA。

5.根据权利要求1所述的基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，其特征在于：所述的酶切为使用MseI进行酶切。

6.根据权利要求5所述的基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，其特征在于：所述的接头为MseI A：5’-TACTCAGGACTCAT-3’和MseI B：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’；通过T4 DNA连接酶将接头加到酶切片段两端；对应的PCR扩增的引物为MseI-N：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’。

7.根据权利要求1所述的基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，其特征在于：所述的微卫星探针为5’端有biotin-T₁₀修饰的SSR；对应的可以与微卫星探针结合的磁珠为链霉亲和素修饰的磁珠。

8.根据权利要求1所述的基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，其特征在于：所述的杂交的条件为：95 ℃下变性5 min，然后在65 ℃下杂交1 h。

9.根据权利要求1所述的基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，其特征在于：所述的洗脱液包括TEN₁₀₀₀、0.2×SSC+0.1% SDS和TE。

10.根据权利要求1所述的基于磁场可控微流控芯片开发SSR标记的方法，其特征在于：所述的加热为加热至95 ℃。