CN103614478B - 可用于多重检测的单链长探针的制法 - Google Patents

可用于多重检测的单链长探针的制法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可用于多重检测的单链长探针的制法，包括：1）、针对待检测的每种靶标设计下游鉴别探针；2）、针对与待检测靶标无关的核酸序列，即填充物长序列的模板设计一对扩增引物，扩增引物对的上游特异性引物的5′端与步骤1）所得的下游鉴别探针的3′端相连组成上游引物，扩增引物对的下游特异性引物5′端与Tag1的3′端相连组成下游引物；3）、步骤2）中所有的下游引物均相同；4）、合成上游引物并在其5′端进行磷酸化标记；5）、以所述与待检测靶标无关的核酸序列为模板进行不对称PCR扩增，获得磷酸化标记单链以及部分双链；6）、切胶回收不对称PCR扩增产物中带磷酸化标记的单链DNA。

Description

可用于多重检测的单链长探针的制法
技术领域
本发明涉及核酸分子检测以及寡核苷酸制备领域，尤其涉及一种可用于多重连接扩展技术的长探针的制备方法。
背景技术
目前基因检测的方法很多，常见的方法主要是以PCR为基础的检测方法。PCR技术是利用一对特异性引物与相关试剂扩增DNA的一种特异性方法，具有检测快速、操作简单、灵敏度高、结果准确可靠受到研究者的青睐。由于通常情况下，动植物体受到多种病原体同时侵染，而普通PCR方法单管只能分析一种靶基因，对如众多的靶基因需要逐一分析，其工作量大，成本高。多重PCR检测技术具有在一次反应中可以检测多种靶标，降低检测时间与成本。但多重PCR对引物的设计要求特别高，多对引物之间的发夹结构、错配以及退火温度的差异都可能导致低效率的扩增，甚至没有扩增，同时多重PCR检测的靶标一般不超过5种。并且需要对反应条件进行优化，特别需要对引物浓度比进行优化，过程复杂，消耗时间长（Liet al,2009.,Boonham et al,2003）。这些因素极大的制约多重PCR的应用。因此，对于靶基因的检测急需一种高通量的检测方法。
Busti等（2002）设计6对特异性的连接酶检测反应（ligase detection reaction,LDR）探针，每一对探针由鉴别寡核酸与通用探针组成，并且荧光标记所有待检测靶标的通用探针，从而达到检测的目的，该方法具有检测特异性。Szemes等（2005）将锚定探针（padlock probes,PLPs）技术和通用芯片技术结合用于检测属、种和亚种水平的植物病原生物鉴定，锚定探针的连接产物在通用荧光标记引物的作用下进行荧光标记，通过芯片杂交的达到鉴别不同种类的病原体，该方法具有良好的特异性和灵敏性。Wang等（2011）曾设计11组LDR探针，其中上游LDR探针由上游鉴别探针和上游通用靶标组成，下游LDR探针由下游鉴别探针、Zipcode序列以及下游通用靶标序列组成。通过设计这11组LDR探针与事先点制好的Zip通用芯片杂交，成功的检测10种马铃薯病毒和18S rRNA阳性对照样品。上述方法由于多重性好、灵敏度高、特异性强等优势广受研究者的青睐，但由于芯片杂交过程中容易出现假阳性，其操作过程需要优化不同的参数、需要荧光标记探针或检测产物以及合成长的探针，这些措施势必增加检测的成本。因此需要建立一种多重性好、特异性强、灵敏度相对高、操作简单快捷、成本低的检测方法。
2002年，荷兰科学家Dr.Schouten JP发明了多重连接依赖探针扩增技术（MultiplexLigation dependent Primers Amplification,MLPA）。其方法原理是针对感兴趣的检测靶标的基因位点设计长度不同的探针对，其探针对的一端与待检测的靶标完全互补，与各自的靶标基因区域复性后仅留一缺口，这样当探针对与待检测的靶标在连接酶的作用下相形成连接产物。所有待检测的靶标的连接产物均含有一对通用序列、一段填充序列以及鉴别探针序列。连接产物在通用引物作用下起到扩增放大的作用，不同的待检测靶标由于设计的填充物长序列的长度不同，经过PCR扩增后琼脂糖电泳分离即可了解混有靶标存在情况。
MLPA方法中设计到长、短探针，短探针由生物公司直接合成，长探针是利用M13单链噬菌体的特性，将设计两端带有限制性酶切位点的长探针序列插入到M13单链噬菌体中，然后培养放大、提起质粒、酶切回收获得相应的长探针。该方法客服了目前寡核苷酸合成长度达到100bp以上成本高、错误率高等困难。此外，该方法所针对的靶基因区域可短至40-50bp，特别适用高度降解样品的检测，至今MLPA技术已应用于很多领域。但该方法至少有以下3大缺陷：1）目前能够达到培养M13噬菌体要求的实验室不多，只能求助收费相对高昂的商业化公司生产，成本极高；2）制着长探针的周期比较长，M13载体的价格十分昂贵，操作容易M13病毒极易产生污染，而且M13载体被荷兰MRC-Holland公司垄断不再出售；3）为了设计合适的探针，必须避免所有的长探针序列中具有相应的酶切位点，这为探针的设计增添相应的难度，限制了探针的选择的。因此，单链长探针的制备法急待改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可用于多重检测的新型单链长探针的制法，该方法能具有简捷可靠、易于操作、制备周期短以及价格便宜等优势。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种可用于多重检测的单链长探针的制法，包括以下步骤：
1）、针对待检测的每种靶标的各个株系的核酸序列的保守区设计相应的探针，即设计每种靶标的下游鉴别探针；
2）、针对与待检测靶标无关的核酸序列，即填充物长序列的模板设计一对扩增引物，扩增引物对的上游特异性引物的5′端与步骤1）所得的下游鉴别探针的3′端相连组成上游引物，扩增引物对的下游特异性引物5′端与Tag1的3′端相连组成下游引物；
备注说明：针对每种靶标设计一对扩增引物，分别各自进行扩增；
3）、步骤2）中所有的下游引物均相同，节约了合成的成本；
4）、合成上游引物并在其5′端进行磷酸化标记；
备注说明：上游引物是指：下游鉴别探针+上游特异性引物这2段序列；下游引物是指：下游特异性引物和Tag1这两段序列；
5）、以所述与待检测靶标无关的核酸序列为模板，以磷酸化标记上游引物和未进行任何标记的下游引物进行不对称PCR扩增，获得磷酸化标记单链以及部分双链；
6）、切胶回收不对称PCR扩增产物中带磷酸化标记的单链DNA，即单链长探针。
作为本发明的可用于多重检测的单链长探针的制备方法的改进：
所述上、下游引物均由两段核苷酸序列组成；
上游引物中的一段核苷酸序列是根据待检测的靶标序列设计的下游鉴别探针，另一段核苷酸序列是根据填充物长序列模板设计的特异性上游引物；
下游引物中的一段核苷酸序列是根据填充物长序列模板设计的下游特异性引物，另一段核苷酸序列是根据与待检测靶标以及填充物长序列模板均无关所设计的Tag1序列。
作为本发明的可用于多重检测的单链长探针的制备方法的进一步改进：步骤1）所述的下游鉴别探针与填充物长序列的模板没有任何的同源性且不形成稳定空间结构的寡聚核苷酸。
作为本发明的可用于多重检测的单链长探针的制备方法的进一步改进：步骤2）所述的Tag1序列与下游鉴别探针、待检测靶标、填充物长序列的模板没有任何的同源性且不形成稳定空间结构的寡聚核苷酸；
作为本发明的可用于多重检测的单链长探针的制备方法的进一步改进：步骤4）中对所述的上游引物进行磷酸化是为了不对称PCR后获得5′端含有磷酸化修饰的单链长探针。
作为本发明的可用于多重检测的单链长探针的制备方法的进一步改进：步骤5）所述的单链比双链在琼脂糖胶上牵引速度快，从而达到准确区分的目的。
备注说明：同样长度的DNA单链比双链跑的快，因为单链的空间阻力相对小些；因此链比双链在琼脂糖胶上牵引速度快。
具体而言，本发明采用不对称PCR方法制备可用于多重检测的新型单链长探针（longdownstream probe,LDP），然后通过切胶回收获取5′含有磷酸化位点的单链长探针。
所述可用于多重检测的新型单链长探针的制备方法包含以下步骤：
1）利用NCBI下载每种待检测靶标的各个株系的全长序列，设计（例如使用Primer5.0软件）靶基因相应的全长序列的上下游引物，通过RT-PCR获取相应的全长靶标序列。并利用相关软件对每种靶标的多个株系的核酸序列进行相应的比对，并获取相应的保守区；再分别在每种靶标的保守区设计长度为20～25bp寡核苷酸鉴别探针，即下游鉴别探针，该下游鉴别探针的序列为与靶序列互补；
2）、设计通用序列Tag1与填充物，Tag1和填充物序列均是根据待检测的靶标的设计，每种待检测的靶标对应唯一长度的填充物，且与靶序列均无同源性同时也不形成稳定的空间结构（如发夹结构和二聚体）；
备注说明：Tag1是用于任何待检测靶标，完全一样；填充物都是来源于同一模板，只不过用于待检测靶标时长度会不一样。
所述Tag1为：5′>CAGACGGTTGGACGGAC<3′，
所述填充物模板序列为：5′>ATGGGGAGGGGAAGGGTTCAGTTGAAGAGGATCGAAAACAAAATCAACAGGCAGGTCACTTTCTCAAAGAGAAGGTCTGGTTTGCTGAAGAAAGCCCATGAGATCTCTGTGCTTTGTGATGCTGAGGTGGCTCTGATTGTTTTCTCTACCAAAGGGAAGGTCTTTGAGTATTCTACTGATTCTTGTATGGAAAGGATTCTTGAAAGGTATGAGAGATATTCATATGCAGAGAGGCAACTTATTGCACATGATCTCGAACAAAATGGAAGCTGGACTCTGGAGCATGCGAAGCTCAAGGCTAGGATGGAGATTTTACAAAGAAATCAAAAGTATTTCATGGGAGAAGATCTCGACTCCTTGAGTCTTAAAGAGCTTCAAAATTTGGAGCAGCAGCTTGATTCTGCTCTCAAACACATCAGGTCGAGAAAGAACCAAGTTATGCACGAATCCATTTCGGATCTTCAGAAAAAGGATAAGGCATTGCAGGAGCAAAACAACGTGCTTGCCAAGCAGGTGAAGGAGAAAGAAAAGGAATTACTTGCCGAACAGGCACAATGGGATATTCAGCATAATCAAACACTTGACACATCCTCTATCCTTCCACAAACGTTGCTGCCCTTGGACACTATTGGGACTGCGTCCTACCAAGCAATTAGAAGCAGCGAAAGAGAAGATGAGGCAAGACCATCTCGACATCGAGCCAATGCAGTACTCCTGCCCCCTTGGATGCTTAGCCATCTTGATTAATAG<3′；
3）、针对填充物模板设计上下游特异性引物，所选择的填充物模板与设计相应的特异性引物与待检测的靶标基因序列没有任何同源性；将填充物上游特异性引物的5′端与下游鉴别探针的3′端连接，并将组成的上游引物的5′端进行磷酸化修饰；将填充物特异性下游引物5′>GGCAGGAGTACTGCATTGGCT<3′的5′端与Tag1的5′>CAGACGGTTGGACGGAC<3′的3′端相连组成下游引物，所组成的所有下游引物序列均相同；
备注说明：
每一个靶标的下游长探针都是由一对特异性上下游引物扩增得到的，其中上游引物包含：下游鉴别探针（针对检测靶标设计的）和上游填充物特异性引物；下游引物包含下游填充物特异性引物和Tag1；每一对待检测的靶标的下游引物都一样，只有上游引物不一样，这样PCR扩增获得长度就不一样，获得片段就是下游长探针。
上述具有特定序列的和“填充物特异性下游引物”是通用于任何的待检测靶标，而“填充物上游特异性引物”需要根据待检测靶标进行分别设定。即，每一个靶标设计的填充物上游特异性序列都不一样（含下游鉴别探针和上游特异性引物两个部分），下游引物（含tag1和填充物下游特异性引物两个部分）都一样，这样活得长度不一样。
4）利用上下游引物进行不对称PCR扩增填充物长序列模板，利用琼脂糖电泳、切胶回收5′端含有磷酸化位点的单链长探针。
所述的检测上下游引物由两端核苷酸序列组成，上游引物一段是根据待检测的核苷酸序列设计，一段是根据填充物模板设计的上游特异性引物；下游引物一段是根据与填充物模板以及待检测靶标均无关的Tag1序列，一段是根据填充物设计特异性下游引物。
本发明所述长探针的制备方法与Dr.Schouten JP制备MLPA长探针方法相比，具有以下优点：
1）、Dr.Schouten JP利用M13病毒感染、连接、转化、培养、菌液PCR、双酶切筛选阳性克隆等步骤获取MLPA长探针，其操作过程复杂耗时且技术应用门槛高，使得该项技术很难在普通实验室中进行。而发明仅仅利用简单的不对称PCR扩增就能获得单链长探针，操作步骤少而且简单；
2）、本发明针对于制备的长探针仅需要设计上游引物与下游引物（上、下游引物均含特异性和非特异序列），只需要考虑引物与填充物模板的配对情况、针对待检测靶标设计的鉴别探针以及针对待检测靶标与填充物模板均无关的Tag1序列，即可进行不对称PCR扩增，从而获取5′端含有磷酸化位点的单链长探针；
3）、本发明所述单链长探针的制备方法，无需考虑设计探针序列中是否含有EcoRV和BsmI位点，使得长探针的设计具有更多的选择性。长探针填充物的序列来源广泛，可以实验室常见的质粒模板、实验室正在研究的基因序列，只要这些序列与待检测的靶标没有明显的同源性，对于制备长探针需要考虑鉴别探针序列的Tm、GC含量与序列特异性、填充物长度以及Tag1与待检测靶标和填充物模板没有任何同源性，这些条件相对来说比较容易实现；
4）、采用不对称PCR方法制备单链长探针所采用的填充物序列具有一致性，均来自同一个模板，可以通过人工设计或筛选的方法保证填充序列的特异性，避免在检测前导致错配、二聚体等现象，为后续试验避免非特异性连接扩增，从而提高检测的准确性、特异性以及可重复性。
5）、所有的下游引物的序列均相同，对于制备的长探针只需要合成一条下游引物，不需要针对每种靶标设计不同的引物。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是可用于多重检测的新型单链长探针的制法的原理图；
图2是可用于多重检测的新型单链长探针的制法用于检测7种单个靶标的检测结果；
泳道：1、3、5、7、9、11、13为阴性对照，模板均为水，泳道2、4、6、8、10、12、14的模板分别是：16kDaTRV、2bCMV、P0BWYV、18S rRNA基因、HcProPVY、P25PVX、P0PLRV。
图3是用于多重检测的新型单链长探针的制法用于检测7种靶标随机混合的检测结果；
泳道：1、2、3为阴性对照，模板分别为水，VPg；W19K；
泳道3-16的模板分别是：16kDaTRV；P0PLRV；16kDaTRV+2bCMV；P25PVX+P0PLRV；16kDaTRV+2bCMV+P0BWYV;HcProPVY+P25PVX+P0PLRV;16kDaTRV+2bCMV+P0BWYV+18S rRNA;18SrRNA+HcProPVY+P25PVX+P0PLRV;16kDaTRV+2bCMV+P0BWYV+18S rRNA+HcProPVY;P0BWYV+18S rRNA+HcProPVY+P25PVX+P0PLRV;16kDaTRV+2bCMV+P0BWYV+18S rRNA+HcProPVY+P25PVX;2bCMV+P0BWYV+18S rRNA+HcProPVY+P25PVX+P0PLRV;16kDaTRV+2bCMV+P0BWYV+18SrRNA+HcProPVY+P25PVX+P0PLRV。
具体实施方式
下面结合图1和图2以及具体实施例进一步详细说明本发明所述可可用于多重检测的新型单链长探针的制法方法，具体利用山核桃AP1基因为模板制备单链长探针的填充物，制备7种单链长探针。具体包括以下步骤：
1）选择待检测无关的山核桃Apetala 1基因（AP1），并根据AP1和待检测的靶标核酸序列设计引物；
2）人工合成引物，其中上游引物（upstream primer，UP）由特异性上游引物（specificalupstream primer，SUP）和特异下游鉴别探针（specifical downstream identifiable probe，SDIP）组成，下游引物（downstream primer，DP）由特异性下游游引物（specifical downstream primer，SDP）和Tag1组成。所述的UP为：SUP+SDIP，其5′端进行磷酸化修饰，所述的DP为：SDP+Tag1组成；
3）UP:DP=10:1进行不对称PCR扩增获取单链下游长探针（Single strand long probe，SSLP）
4）电泳割胶回收SSLP。
具体如下：
实施例1、可用于多重检测的新型单链长探针的制备方法，待检测靶标为以下7种：烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)16kDa（16kDaTRV）基因、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)2b基因（2bCMV）、甜菜西方黄化病毒(Beet western yellows virus，BWYV）P0基因（P0BWYV）、18S rRNA基因（是内参，阳性对照）、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)HcPro(Helper component-proteinase)基因（HcProPVY）、马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX）P25基因（P25PVX）、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus，PLRV)P0基因（P0PLRV）。
依次进行以下步骤：
1）、利用NCBI下载上述每种待检测靶标的各个株系的全长序列，设计靶基因相应的全长序列的上下游引物，通过RT-PCR获取相应的全长靶标序列。并利用相关软件对每种靶标的多个株系的核酸序列进行相应的比对，并获取相应的保守区；再分别在每种靶标的保守区设计长度为20～25bp寡核苷酸鉴别探针，即下游鉴别探针，该下游鉴别探针的序列为与靶序列互补的寡核苷酸；
具体如表1所述：
表1、
待检测靶标 下游鉴别探针
16kDaTRV AATCGAGAAATCTGGAAACA
2bCMV TTCGGAACTAATAGAGATG
P0BWYV AACCGACCGCTAACAGCTACAG
18S rRNA基因 TCAACCATAAACGATGCCG
HcProPVY AATGGAACAAGGAAACTCT
P25PVX TTCTACTTGGAAACATCATT
P0PLRV CATCAGCATTTGGTTCGGTCT
2）、设计通用序列Tag1与填充物模板AP1基因：
所述Tag1为：5′>CAGACGGTTGGACGGAC<3′，
填充物为：
5′>ATGGGGAGGGGAAGGGTTCAGTTGAAGAGGATCGAAAACAAAATCAACAGGCAGGTCACTTTCTCAAAGAGAAGGTCTGGTTTGCTGAAGAAAGCCCATGAGATCTCTGTGCTTTGTGATGCTGAGGTGGCTCTGATTGTTTTCTCTACCAAAGGGAAGGTCTTTGAGTATTCTACTGATTCTTGTATGGAAAGGATTCTTGAAAGGTATGAGAGATATTCATATGCAGAGA GGCAACTTATTGCACATGATCTCGAACAAAATGGAAGCTGGACTCTGGAGCATGCGAAGCTCAAGGCTAGGATGGAGATTTTACAAAGAAATCAAAAGTATTTCATGGGAGAAGATCTCGACTCCTTGAGTCTTAAAGAGCTTCAAAATTTGGAGCAGCAGCTTGATTCTGCTCTCA AACACATCAGGTCGAGAAAGAACCAAGTTATGCACGAATCCATTTCGGATCTTCAGAAAAAGGATAAGGCATTGCAGGAGCAAAACAACGTGCTTGCCAAGCAGGTGAAGGAGAAAGAAAAGGAATTACTTGCCGAACAGGCACAATGGGATATTCAGCATAATCAAACACTTGACACATCCTCTATCCTTCCACAAACGTTGCTGCCCTTGGACACTATTGGGACTGCGTCCTACCAAGCAATTAGAAGCAGCGAAAGAGAAGATGAGGCAAGACCATCTCGACATCGAGCC AATGCAGTACTCCTGCCCCCTTGGATGCTTAGCCATCTTGATTAATAG<3′
其中16kDaTRV填充物为594～719碱基，共126个碱基；2bCMV填充物为487～719碱基，共233个碱基；P0BWYV填充物为401～719碱基，共319个碱基；18S rRNA填充物为323～719碱基，共397个碱基；HcProPVY填充物为221～719碱基，共499个碱基；P25PVX填充物为114～719碱基，共606个碱基；P0PLRV填充物为4～719碱基，共716个碱基。填充物长序列与通用引物没有任何同源性。
备注说明：上述带单下划线的为SUP1-SUP7，上述带双下划线的为下游特异性引物。
3）、针对填充物模板设计填充物上下游特异性引物，具体如表2所示。
表2、
待检测靶标
16kDaTRV 上游特异性引物（SUP1）TATCCTTCCACAAACGTTG
2bCMV 上游特异性引物（SUP2）GAGCAAAACAACGTGCTTGC
P0BWYV 上游特异性引物（SUP3）TGCTCTCAAACACATCAGGT
18S rRNA基因 上游特异性引物（SUP4）ATCAAAAGTATTTCATGGGAG
HcProPVY 上游特异性引物（SUP5）CATATGCAGAGAGGCAACTTA
P25PVX 上游特异性引物（SUP6）TTGTGATGCTGAGGTGGCT
P0PLRV 上游特异性引物（SUP7）GGGAGGGGAAGGGTTCAGTTCAGT
下游特异性引物均为：5′>GGCAGGAGTACTGCATTGGCT<3′
按照如下规则获得上游引物和下游引物：
将填充物上游特异性引物的5′端与下游鉴别探针的3′端连接，并将组成的上游引物的5′端进行磷酸化修饰；
将填充物特异性下游引物5′>GGCAGGAGTACTGCATTGGCT<3′的5′端与Tag1的5′>CAGACGGTTGGACGGAC<3′的3′端相连组成下游引物，所组成的所有下游引物序列均相同；
所得的上游引物和下游引物具体如下表3所示：
表3、
待检测靶标 上游引物
16kDaTRV UP1AATCGAGAAATCTGGAAACA TATCCTTCCACAAACGTTG
2bCMV UP2TTCGGAACTAATAGAGATG GAGCAAAACAACGTGCTTGC
P0BWYV UP3AACCGACCGCTAACAGCTACAG TGCTCTCAAACACATCAGGT
18S rRNA基因 UP4TCAACCATAAACGATGCCG ATCAAAAGTATTTCATGGGAG
HcProPVY UP5AATGGAACAAGGAAACTCT CATATGCAGAGAGGCAACTTA
P25PVX UP6TTCTACTTGGAAACATCATT TTGTGATGCTGAGGTGGCT
P0PLRV UP7CATCAGCATTTGGTTCGGTCT GGGAGGGGAAGGGTTCAGTTCAGT
下游引物均为：5′>CAGACGGTTGGACGGAC GGCAGGAGTACTGCATTGGCT<3′
加粗部分为下游鉴别探针，未加粗部分是填充物特异性引物，划线部分为Tag1。
4）、利用上下游引物进行不对称PCR扩增填充物长序列模板，利用琼脂糖电泳、切胶回收5′端含有磷酸化位点的单链长探针：
以下，以16kDaTRV基因为例进行说明：
①、不对称PCR扩增得到SSLP1序列
以AP1为模板，用引物UP1:DP1=10:1的浓度比进行不对称PCR扩增。
1)PCR反应体系
2)不对称PCR反应程序
②、切胶回收纯化PCR获得含有5′端磷酸化位点的SSLP1序列
由于DNA在电泳时单链和双链分离的速度不一样，为了便于更好的分离和回收SSLP1序列，采用4%高浓度的琼脂糖电泳胶进行分离，其中电泳跑在前面的条带为单链长探针SSLP1（为本发明所需的单链长探针SSLP1），切胶回收后采用切胶回收试剂盒进行纯化，并NanoDropND-100测定SSLP1浓度，并保存在-20℃以备用，即得到用于多重检测的新型单链长探针。
备注说明：
根据上述步骤①中的上游引物UP1为相应的UP2～UP7，其余等同于上述步骤①和步骤②，从而相应的获得SSLP2～SSLP7。
实施例2、将上述实施例1得到的SSLP用于多重检测
1.人工合成16kDaTRV上游探针1（upstream probe，USP1），其核酸序列为：5′-TGCTTATGTTATGCGATGCC GTAAACGCTTTGAAGCAAGA-3′，其中划线的部分为：Tag2序列，不划线的部分为上游特异性鉴别探针1（specifical upstream identifiable probe1，SUIP1）
2.将USP1和SSLP1探针对检测16kDaTRV靶基因进行连接酶检测反应（ligase detectionreaction，LDR）以及后续的PCR反应
1）LDR反应体系
2）LDR反应条件：
3）LDR-PCR反应体系
其中上游通用引物与Tag2互补，下游通用引物与Tag1序列相同。
即，上游通用引物为：GGCATCGCATAACATAAGCA；下游通用引物为：GTCCGTCCAACCGTCTG
备注说明：连接产物是上述2）LDR反应得到的连接产物。
4）LDR-PCR反应条件
3.结果检测
琼脂糖电泳检测相应的PCR扩增产物。其结果见图2。
备注说明：
相应替换上述1）中的LDR上游探、LDR下游探针，且相应替换上述3）中的上游通用引物，其余等同于上述1）～4）。
即，同样的方法合成2bCMV、P0BWYV、18S rRNA基因、HcProPVY、P25PVX、P0PLRV6种基因的USP2、USP3、USP4、USP5、USP6、USP7，并与相应靶标基因进行LDR反应，扩增获取相应的PCR产物，琼脂糖电泳检测相应的PCR扩增产物。其结果见图2。
实施例3、将上述实施例1得到SSLP用于多重检测
1.将人工合成16kDaTRV、2bCMV、P0BWYV、18S rRNA基因、HcProPVY、P25PVX、P0PLRV7种上游探针1-7（upstream probe1-7，USP1-7）混合，其混合浓度为0.01μM，并将实施例1获得的SSLP1-7混合，其混合浓度为0.01μM；
2.将USP1-7和SSLP1-7混合探针对检测混合靶基因进行连接酶检测反应（ligasedetection reaction，LDR）以及后续的PCR反应
1）LDR反应体系
2）LDR反应条件：
3）LDR-PCR反应体系
其中上游通用引物与Tag2互补，下游通用引物与Tag1序列相同。
即，上游通用引物为：GGCATCGCATAACATAAGCA；下游通用引物为：GTCCGTCCAACCGTCTG
4）LDR-PCR反应条件
3.结果检测
琼脂糖电泳检测相应的PCR扩增产物。其结果见图3。
本发明所制备的单链长探针可应用于多个领域，具有无可比拟的优势，众所周知合成100nt以上的寡聚核苷酸序列价格贵，错误率高，这导致其应用受到极大的限制，此外，这种制备探针的方法保持了所制备长链长探针序列的同一性和特异性，人为的避免了其后续检测的非特异扩增结果，使得检测的准确性和可靠性大大加强。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 浙江农林大学
 
<120> 可用于多重检测的单链长探针的制法
 
<160> 8
 
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223> 16kDaTRV上游特异性引物
 
<400> 1
tatccttcca caaacgttg            19
 
 
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223> 2bCMV上游特异性引物
 
<400> 2
gagcaaaaca acgtgcttgc          20
 
 
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223> P0BWYV上游特异性引物
 
<400> 3
tgctctcaaa cacatcaggt          20
 
 
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223> 18S rRNA基因上游特异性引物
 
<400> 4
atcaaaagta tttcatggga g      21
 
 
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223> HcProPVY上游特异性引物
 
<400> 5
catatgcaga gaggcaactt a                21
 
 
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223> P25PVX上游特异性引物
 
<400> 6
ttgtgatgct gaggtggct             19
 
 
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223> P0PLRV上游特异性引物
 
<400> 7
gggaggggaa gggttcagtt cagt           24
 
 
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223> 下游特异性引物
 
<400> 8
ggcaggagta ctgcattggc t          21
 

Claims (9)

1.可用于多重检测的单链长探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、针对待检测的每种靶标的各个株系的核酸序列的保守区设计相应的探针，即设计每种靶标的下游鉴别探针；
2)、针对与待检测靶标无关的核酸序列，即填充物长序列的模板设计一对扩增引物，扩增引物对的上游特异性引物的5′端与步骤1)所得的下游鉴别探针的3′端相连组成上游引物，扩增引物对的下游特异性引物5′端与Tag1的3′端相连组成下游引物；
所述上、下游引物均由两段核苷酸序列组成；
上游引物中的一段核苷酸序列是根据待检测的靶标序列设计的下游鉴别探针，另一段核苷酸序列是根据填充物长序列模板设计的上游特异性引物；
下游引物中的一段核苷酸序列是根据填充物长序列模板设计的下游特异性引物，另一段核苷酸序列是根据与待检测靶标以及填充物长序列模板均无关所设计的Tag1序列；
3)、步骤2)中所有的下游引物均相同；
4)、合成上游引物并在其5′端进行磷酸化标记；
5)、以所述与待检测靶标无关的核酸序列为模板，以磷酸化标记上游引物和未进行任何标记的下游引物进行不对称PCR扩增，获得磷酸化标记单链以及部分双链；
6)、切胶回收不对称PCR扩增产物中带磷酸化标记的单链DNA，即单链长探针。
2.根据权利要求1所述的可用于多重检测的单链长探针的制备方法，其特征在于：步骤1)所述的下游鉴别探针与填充物长序列的模板没有任何的同源性且不形成稳定空间结构的寡聚核苷酸。
3.根据权利要求2所述的可用于多重检测的单链长探针的制备方法，其特征在于：步骤2)所述的Tag1序列与下游鉴别探针、待检测靶标、填充物长序列的模板没有任何的同源性且不形成稳定空间结构的寡聚核苷酸。
4.根据权利要求3所述的可用于多重检测的单链长探针的制备方法，其特征在于：步骤4)中对所述的上游引物进行磷酸化是为了不对称PCR后获得5′端含有磷酸化修饰的单链长探针。
5.根据权利要求4所述的可用于多重检测的单链长探针的制备方法，其特征在于：步骤5)所述的单链比双链在琼脂糖胶上牵引速度快，从而达到准确区分的目的。
6.根据权利要求1～5任一所述的可用于多重检测的单链长探针的制备方法，其特征在于：
待检测靶标与相对应的下游鉴别探针如下表所示：
待检测靶标 下游鉴别探针 16kDaTRV AATCGAGAAATCTGGAAACA 2bCMV TTCGGAACTAATAGAGATG POBWYV AACCGACCGCTAACAGCTACAG 18S rRNA基因 TCAACCATAAACGATGCCG HcProPVY AATGGAACAAGGAAACTCT P25PVX TTCTACTTGGAAACATCATT POPLRV CATCAGCATTTGGTTCGGTCT
7.根据权利要求6所述的可用于多重检测的单链长探针的制备方法，其特征在于：
所述Tag1序列为：5′-CAGACGGTTGGACGGAC-3′。
8.根据权利要求7所述的可用于多重检测的单链长探针的制备方法，其特征在于：
上游特异性引物如下表所示：
待检测靶标 16kDaTRV 上游特异性引物TATCCTTCCACAAACGTTG 2bCMV 上游特异性引物GAGCAAAACAACGTGCTTGC POBWYV 上游特异性引物TGCTCTCAAACACATCAGGT 18S rRNA基因 上游特异性引物ATCAAAAGTATTTCATGGGAG HcProPVY 上游特异性引物CATATGCAGAGAGGCAACTTA P25PVX 上游特异性引物TTGTGATGCTGAGGTGGCT POPLRV 上游特异性引物GGGAGGGGAAGGGTTCAGTTCAGT
下游特异性引物均为：5′-GGCAGGAGTACTGCATTGGCT-3′。
9.根据权利要求8所述的可用于多重检测的单链长探针的制备方法，其特征在于：
上游引物如下表所示：
下游引物均为：5′-CAGACGGTTGGACGGACGGCAGGAGTACTGCATTGGCT-3′。
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