CN101591711A - 肽核酸探针生物芯片及其表面等离子体共振的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肽核酸探针生物芯片及其表面等离子体共振的检测方法，本发明检测系统的生物芯片固相载体上连接的是肽核酸(PNA)检测探针，肽核酸(PNA)探针所附着的具有表面等离子体共振(SPR)响应特性的金属薄膜是金膜。该技术的研制成功将真正实现芯片技术的高通量、特异性、敏感性以及快速等特点。既可对病原微生物进行快速而准确的检测和鉴定，同时该技术也可以应用到在野战条件下由基层检验人员实施战场病原体分布的调查、战伤感染的早期诊断、生物战剂的早期发现等方面，将会产生较好的经济效益和社会效益。

Description

肽核酸探针生物芯片及其表面等离子体共振的检测方法

技术领域

本发明涉及生物芯片领域及基于其的检测方法，尤其是涉及肽核酸探针生物芯片及其表面等离子体共振的检测方法。

背景技术

随着分子生物学在医学领域的广泛应用，芯片技术必将成为未来临床疾病诊断中不可缺少的一个新内容。芯片技术是伴随人类基因组计划而产生的，是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展，其突出特点在于高速度、高通量、高并行性及多样化、微型化、自动化等，已经成为当今生物医学技术研究的热点，在基因诊断、药物开发和毒性分析、病原检测等多个领域显示出巨大的发展潜力和应用价值。

目前，尽管芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但是仍然存在着许多的问题，而且价格昂贵，从而严重地制约了芯片技术的广泛应用和进一步发展。如在标记方法上，荧光法是目前使用最多的方法，但它的灵敏度不高、需要避光，杂交完成后要快速检测以免荧光淬灭，另外结果检测需用价格极其昂贵的激光扫描仪等特殊设备；同位素标记法由于需要同位素和放射自显影，有使用不便，操作复杂，耗时较长、有污染的缺点。尤其是在基因芯片的检测中，由用荧光标记会影响PCR扩增效率，同位素标记常用的如³²P和³³P半衰期又太短，均不易推广使用，而且PCR扩增既需要设计引物，又要PCR仪，需要对各检测对象的靶序列建立不同的扩增体系、扩增方法和扩增条件，这显然大大增加了工作量和工作难度。总之，芯片技术在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面仍然存在着许多难以解决的问题。特别是技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较狭窄等问题限制了该技术在生物检测中的应用。

肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)是借助计算机辅助设计的一种DNA模拟物，与DNA一样也是由ATCG四种碱基的单体聚合而成，只是两者的骨架结构不同：DNA是由磷酸二酯键连接而成的磷酸戊糖骨架；而PNA是由酰胺键连接的重复的N-2-氨乙基苷氨酸单位构成的。PNA不易被蛋白酶、核酸酶等降解，也不与血清中蛋白结合，但可以通过ATCG四种碱基的互补配对原则和DNA杂交结合。由于PNA的假肽骨架是电中性的，PNA与DNA或RNA间的杂交不存在静电斥力，因而具有更强的亲和性，其结合的稳定性和特异性都大大提高。

虽然目前还未有以PNA作为探针用于基因或蛋白芯片检测方面的报道，但我们的分析认为，与传统的DNA探针相比，PNA做为核酸杂交探针在理论上可能更具有优势。因为传统DNA探针只能与单链的DNA杂交结合，我们知道PCR产物都是双链的，因此在杂交前必须通过变性过程使双链的PCR产物解体为单链的DNA片段，而且在杂交过程中必须保持低温以防止产物DNA复性而影响杂交效率，产生假阴性结果。但PNA作为探针其不仅仅可以与单链的DNA杂交高效杂交，甚至还可以直接与双链DNA以链侵袭模式结合形成稳定的DNA-PNA-DNA的三链复合物，因此大大增加了对DNA的检测能力，且可降低标本处理的复杂性，简化前期标本的准备时间和操作过程，从而为临床快速基因检测提供了可能。

基于上述理论，我们开创性地以PNA为探针，对PNA与DNA、蛋白质的结合活性，及对其做为芯片检测的探针特性和杂交特性等系统地进行了研究，并与现行的芯片检测探针进行比较；在此基础上，并首次将PNA芯片引入表面等离子体共振传感器，对其做为检测探针的芯片的特异性、敏感性，及实际检测应用的方法与特性进行了详细的研究。

表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)传感器是近年迅速发展起来的新型光学传感器装置，其突出特点是可以实时(real time)、在线(on line)地检测生物分子之间的相互作用，而且不需要标记及纯化，是当前国际传感器领域的研究热点之一。其基本原理是当入射光以一定的角度经一组光学器件——通常为一高折射率的棱镜上顺序放置一层低折射率的耦合层(多为金属薄膜)耦合激发后，在金属膜界面上发生表面等离子体共振，即入射光与界表面的自由电子会发生相互作用，其中部分入射光波被电荷密度波吸收，则入射光线不能发生全反射，从而导致反射光的强度大大减弱，反射角也发生明显的偏差，而且这种反射光的强度和角度的变化与界面上吸附的生物物质分子数量的多少成一定的比例关系。

作为探针固定的硫醇化合物表面单分子层自组装层(Self-assembledMonolayer，SAM)技术自20世纪80年代初报道以来，由于其满足了作为模型界面的几个主要要求，包括和基底的牢固结合，可控制的分子取向有序排列，可控制的外表面性质及可控制的厚度等方面，因此很快地得到了各方的关注。总的来说，SAM是基于巯基化合物与基底材料(如金、银、铂等)的强烈化学结合而形成的。如在金膜表面，巯基被氧化而生成硫金化合键。其化学反应式如下：2Au+2RSH→2Au-SR+H₂。Au-S之间的化学键合力很强，其键能高达184kJ/mol，很少有其他基团可以与其竞争，这就保证了结合的选择性。同时，SAM的排列紧密有序，对酸、碱、离子渗透等有较强的抵抗力。应用此方法固定探针可以使探针结合牢固，且排列有序、分布均匀。我们基于巯基与金属表面的这种强烈化学结合的特性，在本发明中将巯基修饰的PNA探针与SPR设备的金属薄膜结合，制成PNA探针阵列的芯片，从而完成对各种靶基因、蛋白的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供肽核酸(PNA)作为探针的生物芯片及其相应的SPR检测方法。通过本发明，可以绕过对样品进行扩增，简化样本处理步骤，提高检测的灵敏度和特异性；且以光学信号作为检测信号，既稳定，又易于检测，使结果检测、分析的设备和技术大为简化。从而可以充分利用生物芯片技术的高通量、高敏感、高特异的特性，克服目前检测芯片存在的主要缺点。并且为了进一步提高芯片检测的效率。我们还在传统SPR传感器的基础上，研究开发了一种更简单的、易实施的、价廉的纳米金属膜的镀制方法，自行设计编制了相应的的信息处理和操作控制软件，设计装配了小型的流动样本注入系统，及适用于芯片预杂交、杂交及漂洗的温控测试池，从而使该传感器更具有了适用于芯片检测的高自动化及智能化。由于本发明研究提供的这种生物芯片及其快速检测的方法具有杂交、检测设备简单，技术稳定易于掌握，灵敏度高，重复性好，应用范围广等的特性，其必将成为可广泛应用于普通实验室，甚至野外环境的新一代生物芯片。

本发明的目的是这样实现的：本发明检测系统的生物芯片固相载体上连接的是肽核酸(PNA)检测探针，肽核酸(PNA)探针所附着的具有表面等离子体共振(SPR)响应特性的金属薄膜是金膜，采用化学还原法制备纳米金胶体液，在芯片片基表面直接铺制二维的纳米金膜层，应用探针的固化-自组装单分子层技术在纳米金膜表面点制探针阵列；基于肽核酸探针生物芯片的表面等离子体共振的检测方法，其检测步骤如下：

(1)在芯片片基表面铺制具有等离子体共振(SPR)感应性的纳米金膜(厚度为10nm～150nm)，在纳米金膜表面点制肽核酸(PNA)探针阵列制备芯片；

(2)处理标本，并与生物芯片上的探针进行杂交反应；

(3)利用等离子体共振(SPR)设备对各探针杂交区进行偏振光检测，利用等离子体共振(SPR)原理分析阵列探针杂交反应，获取结果。

在芯片片基表面铺制具有等离子体共振(SPR)感应性的纳米金膜和在纳米金膜表面点制肽核酸(PNA)探针阵列方法的步骤包括：

(1)按Frens法(柠檬酸三钠还原法)制备纳米金溶液；

(2)以N-β-(氨乙基)-γ氨丙基三价氧基硅烷(APTMS)为核心铺制性质均一的SPR纳米金膜；

(3)所铺纳米金膜氮气干燥后密封备用；

(4)清洁处理制备好的钠米金膜；

(5)以表面自组装单分子层技术点制肽核酸(PNA)探针阵列，生成探针的自组装阵列；

(6)清洗芯片，去除未组装的探针，干燥后封闭备用。标本的处理方法及生物芯片上的探针进行杂交反应步骤包括：

(1)提取细菌、细胞及组织的DNA或RNA；由PCR或RT-PCR反应生成的核酸物质，如DNA、cDNA；

(2)提取细菌、细胞及组织的蛋白质，以及分泌液体中的蛋白质；

(3)将处理好的标本注入微流动反应池中进行杂交反应；

(4)清洗去除未杂交结合的标本。

等离子体共振(SPR)检测步骤包括：

(1)对芯片杂交反应区进行等离子体共振(SPR)扫描；

(2)对扫描结果分析，获得芯片检测结果。

本发明所使用的术语“生物芯片”是由生物大分子或组织附着于玻璃、陶瓷、金属片或尼龙膜、硝酸纤维素膜等基片物质上构建而成的阵列。生物芯片的实例包括基因(核酸)芯片、细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片或组织芯片等。

本发明所述的核酸包括DNA、RNA、cDNA或PNA。

本发明所使用的术语“肽核酸”是核酸的一种DNA模拟物，与DNA一样也是由ATCG四种碱基的单体聚合而成，只是两者的骨架结构不同：DNA是由磷酸二酯键连接而成的磷酸戊糖骨架；而PNA是由酰胺键连接的重复的N-2-氨乙基苷氨酸单位构成的。

本发明所述的蛋白包括各种抗体、抗原、核酸功能相关酶等。

本发明所使用的术语“纳米金属膜”是指由直径在10nm-150nm之间的纳米金颗粒形成的厚度为10nm-150nm金膜层。本发明使用的优选的纳米金属膜层为厚度为50nm的纳米金膜。

本技术发明的优点与效果如下：

(1)本发明采用PNA做为杂交探针，较之普通DNA或PNA探针具有更高的灵敏度和特异性；

(2)本发明采用PNA做为杂交探针，不但避免了PCR反应，而且降低了样品的处理要求，简化了操作步骤，缩短了检测时间；

(3)本发明采用PNA做为杂交探针，并应用SPR技术进行信号检测，不需要昂贵的检测仪器，降低了芯片的使用成本及实验条件。

总之，该技术的研制成功将真正实现芯片技术的高通量、特异性、敏感性以及快速等特点。既可对病原微生物进行快速而准确的检测和鉴定，也可以进行某一或多个特定基因、或与其相关的表达产物的研究，还可以进行基因和蛋白质与疾病关系的研究、疾病相关基因的验证以及新药物的开发与筛选，疾病的分子诊断，治疗过程的追踪和预后等方面，为临床疾病的预防和治疗提供重要的指导作用；同时该技术也可以应用到在野战条件下由基层检验人员实施战场病原体分布的调查、战伤感染的早期诊断、生物战剂的早期发现等方面，将会产生较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为本发明设计PNA探针基本结构模式图

图2为本发明SPR传感器基本结构模式图

图3为本发明SPR芯片系统模式图

图4为本发明芯片点样模式

具体实施方式

具体实施方式

在玻璃载玻片上铺制50nm厚度的具有SPR感应性的纳米金膜方法，步骤如下：

(1)、按Frens法(柠檬酸三钠还原法)制备金溶胶：取0.01％氯金酸水溶液100ml加热煮沸，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液0.75ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积；

(2)、金膜铺制：

A、玻片11酸洗清洁干净后，放入N-β-(氨乙基)-γ氨丙基三价氧基硅烷(APTMS)/甲苯溶液中回流12小时后洗净，取出，氮气吹干，置于清洁干燥处备用；

B、处理好的玻片11置纳米金溶液中浸泡12小时后，浸入0.01mol/L，的PDDA水溶液中10-20min，取出用超纯水清洗。烘干后移入羟胺/氯金酸溶液中，浸泡0.5小时，玻片11表面既形成光亮的金膜12。

表面自组装单分子层技术在金膜表面点制PNA探针阵列方法，步骤如下：

(1)、制备好的钠米金金膜12在piranha液(30％H₂O₂∶浓H₂SO₄＝1∶3)中浸泡清洗，然后用双蒸水反复清洗，氮气吹干；

(2)、滴加500nM浓度的SH-PNAs/PBS缓冲液与纳米金膜12上自组装反应，100％湿度反应24小时，生成探针的自组装阵列13；

(3)、分别吸干缓冲液，6-巯基己醇封闭，双蒸水清洗，氮气吹干。

通过Chelex-100一步法快速处理标本，提取细菌DNA，步骤如下：

(1)、用无菌接种环收集纯培养菌落一环，置于1.5ml灭菌Eppendorf管中；

(2)、加入5％Chelex悬浊液50μl，混匀，加入20mg/ml蛋白酶K，56℃水浴消化2h以上，再经沸水浴7.5min，随后立即置入冰浴3min，12000r/min离心5min，取上清液作DNA样本。

细胞裂解液裂解细胞，粗提细胞核蛋白质，步骤是：

(1)、将组织剪成小块，按每20mg组织加入200～300μl均浆液加入均浆液，4℃低温均浆；

(2)、静置10min后加入90μl 10％NP-40，剧烈震荡30s，4℃800g离心15min，弃去上清；

(3)、沉淀再溶于裂解液5ml中，4℃震摇孵育30min，4℃13000g离心15min，取上清为胞核蛋白提取液；

DNA标本与基因芯片上的PNA探针进行杂交反应，步骤是：

(1)、将制备好的芯片1组装到所制作的SPR传感器棱镜3表面，流动反应池中注入20mM磷酸钠缓冲液(PH7.0)20μl，预热(45℃)30分钟，并读取此时反射光4反射角度初始数值；

(2)、将处理好的标本上清液注入20μl流动反应池中，45℃循环流动杂交3小时，并读取各探针13点样点反射光4反射角度数值；

(3)、流动反应池14中充入20μl 20mM磷酸钠缓冲液(PH7.0)，37℃清洗芯片1小时，重复3次。

蛋白质标本与蛋白芯片上的PNA探针进行杂交反应，步骤是：

(1)、将制备好的芯片1组装到所制作的SPR传感器棱镜3表面，流动反应池14中注入10mM TE缓冲液20μl，预热(37℃)30分钟，读取此时反射光4反射角度初始数值；

(2)、将处理好的蛋白质标本上清液注入20μl流动反应池中，37℃杂交2小时，并读取各探针点样点反射光反射角度数值；

(3)、流动反应池14中充入20μl 10mM TE缓冲液，37℃清洗芯片1小时，重复3次。

实施例1利用PNA探针实施DNA芯片检测步骤为：

淋球菌由大坪医院检验科细菌室提供，鉴定标准按《全国临床检验操作规程》；

Chelex-100购自BioRad公司，制备5％Chelex缓冲液，含1％NP-40，1％Tween-20，0.03％SDS；

淋球菌PNA探针13：HS-(CH₂)₆-5’-TCGC TT C T CGG T CGCT-3’；美国Applied Biosystems公司合成；

TCEP HCL：Tis(2-carboxyethyl)-Phosphine Hydrochloride，美国Pierce，0.287mg TCEP溶于1000ul水中制备1mmol/L TCEP；

(1)、用无菌接种环收集纯培养淋球菌菌落一环，置于1.5ml灭菌Eppendorf管中；

(2)、加入5％Chelex悬浊液50μl，混匀，加入蛋白酶K(20mg/ml)2μl，56℃水浴消化6h，再经沸水浴7.5min，随后立即置入冰浴3min，12000r/min离心5min，取上清液作DNA样本；

(3)、制备好的钠米金金膜在piranha(30％H₂O₂∶浓H₂SO₄＝1∶3)液中浸泡清洗，然后用双蒸水反复清洗，氮气吹干；

(4)、25μM的SH-PNA中加等体积1mmol/L TCEP，37℃还原30分钟，加入PBS缓冲液(1.44g NaH₂PO₄、8g NaCL、0.2g KCL、0.24g KH₂PO₄，加入800mL去离子水溶解后，用HCL调pH为6.5，定溶至1L，高压灭菌)，SH-PNA终浓度500nM；

(5)、滴加500nM浓度的SH-PNA/PBS缓冲液与纳米金膜上自组装反应，100％湿度反应24小时，生成探针的自组装阵列；

(6)、将制备好的芯片组装到所制作的SPR传感器棱镜表面，流动反应池中注入20mM磷酸钠缓冲液(PH7.0)20μl(10μl/min)，预热30minx45℃，并读取此时反射光反射角度初始数值；

(7)、将处理好的标本上清液注入20μl流动反应池中(5μl/min)，45℃循环杂交3小时，并读取各探针点样点反射光反射角度数值；

(8)、流动反应池中充入20μl 20mM磷酸钠缓冲液(PH7.0)(10μl/min)，37℃清洗芯片1小时，重复3次。

实施例2利用PNA探针实施蛋白芯片检测，步骤为：

根据NF-κB的核酸结合位点(GGGACTTTCC)设计PNA探针，HS-(CH₂)₆-5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’；

蛋白芯片杂交缓冲液：20mM HEPES，1mM DTT，0.1mM EDTA，50mM KCl，5％甘油，200μg/ml牛血清白蛋白；

(1)、将肝组织剪成小块，加入均浆液A(mmol/L：Hepes10、Na₃VO4 1、MgCl₂1.5、KCl 10、NaF 50、EDTA0.1、EGTA 0.1、phenylmethylsulfonyl fluoride0.5、dithiothreitol 1和0.02％ protease inhibitors cocktail，pH7.9)10ml，4℃低温均浆；

(2)、静置10min后加入90μl 10％NP-40，剧烈震荡30s，4℃ 800g离心15min，弃去上清；

(3)、沉淀再溶于裂解液B(mmol/L：Hepes 20、NaCl 420、MgCl₂ 1.5、EDTA1、EGTA 1、dithiothreitol 1、phenylmethylsulfonyl fluoride 0.5、glycerol 20％和0.02％ protease inhibitors cocktail，pH 7.9)5ml中，4℃震摇孵育30min，4℃ 13000g离心15min，取上清为胞核蛋白提取液；

(4)、制备好的钠米金金膜在piranha(30％H₂O₂∶浓H₂SO₄＝1∶3)液中浸泡清洗，然后用双蒸水反复清洗，氮气吹干；

(5)、25μM的SH-PNA中加等体积1mmol/L TCEP，37℃还原30分钟，加入PBS缓冲液(1.44g NaH₂PO₄、8g NaCL、0.2g KCL、0.24g KH₂PO₄，加入800mL去离子水溶解后，用HCL调pH为6.5，定溶至1L，高压灭菌)，SH-PNA终浓度500nM；

(6)、滴加500nM浓度的SH-PNA/PBS缓冲液与纳米金膜上自组装反应，100％湿度反应24小时，生成探针的自组装阵列；

(7)、将制备好的芯片组装到所制作的SPR传感器棱镜表面，流动反应池中注入蛋白芯片杂交缓冲液20μl(10μl/min)，0℃静置30分钟，并读取此时反射光反射角度初始数值；

(8)、将处理好的标本上清液30μl注入20μl流动反应池中(5μl/min)，25℃循环杂交3小时，并读取各探针点样点反射光反射角度数值；

(9)、流动反应池中充入20μl蛋白芯片杂交缓冲液(10μl/min)，0℃清洗芯片1小时，重复3次。

杂交检测和结果分析

实验检测采用折射光角度调制方式，角度调制范围从40度到70度角；角分辨率精度高于0.001度；检测最小浓度小于1×10^-11M。根据设计芯片探针的检测靶DNA/蛋白质，利用标准品浓度梯度分别测量相应角度响应改变值绘制靶DNA/蛋白质浓度/角度反应曲线。实验结束后根据实验结果角度变化值与曲线相应位置对比检测靶DNA/蛋白质的存在与否以及浓度。

Claims (9)

1、肽核酸探针生物芯片，其特征在于：检测系统的生物芯片固相载体上连接的是肽核酸(PNA)检测探针。

2、根据权利要求1所述的肽核酸探针生物芯片，其特征在于：肽核酸(PNA)探针所附着的具有表面等离子体共振(SPR)响应特性的金属薄膜是金膜。

3、根据权利要求1所述的肽核酸探针生物芯片，其特征在于：肽核酸(PNA)探针所附着的具有具有表面等离子体共振(SPR)响应特性的金属薄膜是厚度为10nm～150nm的纳米金膜。

4、根据权利要求1所述的肽核酸探针生物芯片，其特征在于：采用化学还原法制备纳米金胶体液，在芯片片基表面直接铺制二维的纳米金膜层。

5、根据权利要求1所述的肽核酸探针生物芯片，其特征在于：应用探针的固化-自组装单分子层技术在纳米金膜表面点制探针阵列。

6、基于肽核酸探针生物芯片的表面等离子体共振的检测方法，其检测步骤如下：

(1)在芯片片基表面铺制具有等离子体共振(SPR)感应性的纳米金膜(厚度为10nm～150nm)，在纳米金膜表面点制肽核酸(PNA)探针阵列制备芯片；

(2)处理标本，并与生物芯片上的探针进行杂交反应；

(3)利用等离子体共振(SPR)设备对各探针杂交区进行偏振光检测，利用等离子体共振(SPR)原理分析阵列探针杂交反应，获取结果。

7、根据权利要求6所述的基于肽核酸探针生物芯片的表面等离子体共振的检测方法，在芯片片基表面铺制具有等离子体共振(SPR)感应性的纳米金膜和在纳米金膜表面点制肽核酸(PNA)探针阵列方法的步骤包括：

(1)按Frens法(柠檬酸三钠还原法)制备纳米金溶液；

(2)以N-β-(氨乙基)-γ氨丙基三价氧基硅烷(APTMS)为核心铺制性质均一的SPR纳米金膜；

(3)所铺纳米金膜氮气干燥后密封备用；

(4)清洁处理制备好的钠米金膜；

(5)以表面自组装单分子层技术点制肽核酸(PNA)探针阵列，生成探针的自组装阵列；

(6)清洗芯片，去除未组装的探针，干燥后封闭备用。

8、根据权利要求6所述的基于肽核酸探针生物芯片的表面等离子体共振的检测方法，标本的处理方法及生物芯片上的探针进行杂交反应步骤包括：

(1)提取细菌、细胞及组织的DNA或RNA；由PCR或RT-PCR反应生成的核酸物质，如DNA、cDNA；

(2)提取细菌、细胞及组织的蛋白质，以及分泌液体中的蛋白质；

(3)将处理好的标本注入微流动反应池中进行杂交反应；

(4)清洗去除未杂交结合的标本。

9、根据权利要求6所述的基于肽核酸探针生物芯片的表面等离子体共振的检测方法，等离子体共振(SPR)检测步骤包括：

(1)对芯片杂交反应区进行等离子体共振(SPR)扫描；

(2)对扫描结果分析，获得芯片检测结果。

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