WO2014075482A1 - 一种表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、应用 - Google Patents

一种表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、应用 Download PDF

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surface plasmon
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汪鹏飞
蓝敏焕
张洪艳
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中国科学院理化技术研究所
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Definitions

  • the invention belongs to the field of surface plasmon sensor chip preparation, and in particular relates to a surface plasmon resonance sensor chip which can be used for lipopolysaccharide detection, a preparation method thereof and an application thereof.
  • Lipopolysaccharide is a polymer composed of a lipid and a polysaccharide linked by a covalent bond. It is a major component of the outer membrane of Gram-negative bacteria and is a potent bacterial toxin known as endotoxin. When gram-negative bacteria such as Escherichia coli and Salmonella enterica are multiplied or lysed, lipopolysaccharide is released. Gram-negative bacteria in the human body release a large amount of lipopolysaccharide in the cell wall, which causes inflammation and inflammation of the human body, and further develops into a serious disease that seriously threatens human health - sepsis.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • the content of LPS must be detected in purified water and water for injection to ensure water quality.
  • researchers have therefore been working to invent a highly selective, ultrasensitive method for the detection of lipopolysaccharides in aqueous solutions.
  • the gel method is the most commonly used method for detecting lipopolysaccharide in clinical practice. It can detect lipopolysaccharide qualitatively, semi-quantitatively and highly sensitively, but this method must use a paleontological ( ⁇ ) blood, so Long-term and large-scale use must be subject to certain restrictions.
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • a total internal reflection evanescent wave is generated, which has a wave penetration distance of about 300 nm, which can induce surface electrons generated by free electrons on the metal surface.
  • the surface plasmons are equal to the frequency of the evanescent wave, the two will resonate, and the incident light is absorbed, causing the reflected light energy to drop sharply, so that the resonance peak appears at the reflection spectrum (ie, the lowest value of the reflection intensity).
  • any slight change in the refractive index and conformation of the surface medium will cause the angle of incidence to migrate, which is captured by the detector and converted into the corresponding spectrum. Since the surface plasma wave is very sensitive to the small change of the refractive index and conformation of the medium, if the sample to be tested is brought into contact with the metal film where surface plasmon resonance occurs, and the interaction occurs, the dielectric constant, refractive index and conformation of the film will occur. The change, and thus the resonance condition, causes the shift of the formant.
  • the resonance principle of the SPR sensor determines that this sensor has obvious advantages compared with traditional biological detection methods or chemical detection methods, such as Real time, dynamic, and especially ultra-sensitive detection.
  • SPR sensors have been widely used in many fields such as environmental sanitation, food safety, and disease diagnosis. It is mainly used to detect interactions between biomolecules and other substances and kinetic molecules.
  • SPR sensors for detecting lipopolysaccharide have not appeared, and SPR technology has not been used to detect the content of lipopolysaccharide in aqueous solution, especially the content of lipopolysaccharide in water for injection, in real time, quickly, simply, quantitatively and ultrasensitively.
  • a first technical problem to be solved by the present invention is to provide a surface plasmon resonance sensor chip.
  • a second technical problem to be solved by the present invention is to provide a method of preparing a surface plasmon resonance sensor chip.
  • the surface plasmon resonance spectroscopy technique generated on the surface of the gold film on the glass substrate is used to quickly, easily, quantitatively and ultrasensitively detect the content of lipopolysaccharide in the aqueous solution.
  • a third technical problem to be solved by the present invention is to provide an application of a surface plasmon resonance sensor chip.
  • the invention provides a surface plasmon resonance sensor chip, which comprises a glass substrate layer, a gold film layer and a probe molecule layer; a gold film layer is disposed on the glass substrate layer, and a probe molecule layer is disposed on the gold film layer;
  • the probe molecule layer is a layer of one or more probe molecules having the following structure:
  • X, Y, W are O, S, NR 5 or Si-R 6 R respectively Zi ? , Ri, R2, R, , , R6, R7 ' R8, R9 ' Rl0, Rll, Rl2, Rl3, Rl4,
  • R 15 is a hydrogen atom; a thiol group of 1 to 18 carbons, a hydroxyl group, a decyl group, a carboxyl group, an amide, an acid anhydride, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, an ester group, an ether group, an amino group, a cyano group, a quaternary ammonium salt, Sulfonate, phosphate or polyethylene glycol; m, n, 0 is 0 to 10000, and is not 0 at the same time.
  • “1 to 18 carbon sulfhydryl groups, hydroxy groups, mercapto groups, carboxyl groups, amides, acid anhydrides, alkenyl groups, alkynyl groups, aryl groups, ester groups, ether groups” means sulfhydryl groups, hydroxyl groups, sulfhydryl groups, carboxyl groups, amide groups.
  • the carbon of the acid anhydride, alkenyl group, alkynyl group, aryl group, ester group or ether group is 1 to 18 carbons.
  • the thickness of the gold film layer is 10 to 60 nm ; the thickness of the probe molecule layer is 1 to 100 nm ; and the coverage of the probe molecule layer on the gold film layer is 5% to 100%.
  • the coverage of the probe molecule on the gold film layer can be semi-quantitatively determined by AFM; after the probe molecule covers the gold film layer, it will self-assemble to form a granular structure; the surface of the probe molecule is modified with a sulfhydryl group and a gold film. contact.
  • the invention also provides a preparation method of a surface plasmon resonance sensor chip, comprising the following steps:
  • the glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecular solution having a concentration of 0.01 to 1000 mg/mL, and left for 5 minutes to 24 hours;
  • the probe molecule solution is a solution having one or more of the following structures:
  • Ar 2 is one of the following structures:
  • X, Y, W are O, S, NR 5 or Si-R 6 R 7 respectively ;
  • Ri , R 2 , R 3 , R4 , R5 , R 6 , R 7 , R 8 , Rg, R 10 , Ru, R 12 , R 13 , R 14 , R 15 are each a hydrogen atom; 1 ⁇ 18 Carbon sulfhydryl, hydroxy, decyl, carboxy, amide, anhydride, alkenyl, alkynyl, aryl, ester, ether, amino, cyano, quaternary ammonium, sulfonate, phosphate or polyethylene glycol
  • the base; m, n, 0 is 0 ⁇ 10000, and is not 0 at the same time.
  • the gold film has a thickness of 10 to 60 nm.
  • the coverage of the probe molecule on the gold film is 5% to 100%.
  • the waters that can be selected are: secondary distilled water, tertiary distilled water, four distilled water, ultrapure water, and the like.
  • the rinsing solution After rinsing once or several times with water, the rinsing solution is analyzed with a high-performance liquid phase, and the signal of the probe molecule is not detected, and it can be considered that it has been rinsed clean.
  • the purpose of the rinsing is to remove the probe molecules adsorbed on the surface of the gold film by physical absorption.
  • the concentration of the probe molecules and the soaking time will ultimately affect the coverage of the probe molecules on the gold film, which in turn affects the sensitivity of the chip.
  • the resulting sensor chip is stored in secondary distilled water for later use.
  • the above reaction may be carried out at room temperature.
  • Step 1) The coating is performed by vacuum evaporation or magnetron sputtering.
  • the vacuum degree is 1 X 10 - 4 Pa
  • the thickness of the gold film of 10 to 60 nm can be precisely controlled by adjusting the frequency variation of the film thickness meter (10 to 60 Hz) and the evaporation rate of 0. lA/s.
  • the solvent of the probe molecule solution is physiological saline, HEPES buffer, phosphate buffer; or methanol, ethanol, acetonitrile, dichloromethane, trichloromethane, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, hydrazine, hydrazine - one or a mixture of two or more kinds of organic solvents such as dimethylformamide, hydrazine, hydrazine-dimethylacetamide; or a mixture of one or more of the foregoing organic solvents and water in any ratio Mixed mixture.
  • the invention further provides a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip, comprising the following steps: (1) plating gold on the surface of a glass substrate;
  • the glass substrate obtained in the step (1) is immersed in a solution of 0.01 to 1000 mmol/L of the compound S1, allowed to stand for 1 to 24 hours, rinsed repeatedly with water, and used; probe molecules, NHS, EDC, solvent According to the mass ratio of 1: 0.1 ⁇ 100: 0.1-100: 1-1000, a mixed solution is obtained; the glass substrate is immersed in the mixed solution, allowed to stand for 5 minutes to 24 hours, the glass substrate is taken out, and ethanol is used. The water is repeatedly washed; wherein, the structure of the compound S1 is:
  • R 16 are each a hydrogen atom; a thiol group of 1 to 18 carbons, a hydroxyl group, a decyl group, a carboxyl group, an amide group, an acid anhydride group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, an ester group, an ether group, an amino group, a cyano group Or a polyethylene glycol group;
  • the structure of the probe molecule is defined as defined in the above paragraph.
  • NHS is N-hydroxysuccinimide
  • EDC is 1-ethyl-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide.
  • the gold film has a thickness of 10 to 60 nm.
  • the coverage of the probe molecule on the gold film is 5% to 100%.
  • the waters that can be selected are: secondary distilled water, tertiary distilled water, four distilled water, ultrapure water, and the like.
  • the signal of S1 is not detected, and it can be considered that it has been rinsed clean. Improper rinsing can affect the coverage of the probe molecules on the gold film.
  • the soaked glass substrate was first rinsed with ethanol and then rinsed with water.
  • the S1 compounds are either commercially available or synthesized by existing literature.
  • the above reaction may be carried out at room temperature.
  • Step (1) The coating is by vacuum evaporation or magnetron sputtering.
  • the degree of vacuum is 1 X 10 - 4 Pa
  • the thickness of the gold film of 10 to 60 nm can be precisely controlled by adjusting the frequency variation (10 to 60 Hz) of the film thickness meter and the evaporation rate of 0. lA/s.
  • the compound S1 is dissolved in physiological saline, HEPES buffer, phosphate buffer; or methanol, ethanol, acetonitrile, dichloromethane, trichloromethane, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, hydrazine, hydrazine- One or a mixture of two or more kinds of organic solvents such as dimethylformamide, hydrazine, hydrazine-dimethylacetamide; or a mixture of one or more of the foregoing organic solvents and water in any ratio In the mixture, a solution of the compound S1 is formed.
  • the solvent is physiological saline, HEPES buffer, phosphate buffer; or methanol,
  • organic solvents such as ethanol, acetonitrile, methylene chloride, chloroform, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, hydrazine, hydrazine-dimethylformamide, hydrazine, hydrazine-dimethylacetamide
  • the above mixed solvent or a mixture of one or a mixture of two or more of the foregoing organic solvents and water mixed in an arbitrary ratio.
  • the invention also provides the use of a surface plasmon resonance sensor chip for detecting lipopolysaccharide in an aqueous solution.
  • the application is to install the sensor chip into an angle modulation type or a wavelength modulation type surface plasmon resonance sensing device, and pass different concentrations of the lipopolysaccharide aqueous solution in the flow cell to detect the surface plasmon resonance peak
  • the offset is used to detect lipopolysaccharide.
  • the amount of shift of the surface plasmon resonance peak is linear with the concentration of the introduced lipopolysaccharide in a corresponding range, and can be used for quantitative detection of lipopolysaccharide.
  • the present invention firstly proposes the use of surface plasmon resonance sensing technology to detect LPS in aqueous solution. Compared with the conventional detection method, the sensitivity is high and the selectivity is good. The linear range of detection of lipopolysaccharide concentration in aqueous solution is lO -lO ⁇ M;
  • the modification of the probe molecule on the surface of the gold film used in the present invention has a clear structure, the molecule is easy to synthesize, and the structure is controllable;
  • the process of preparing the SPR chip of the invention has the advantages of simple operation steps and low cost, so that the prepared chip has good reproducibility and meets the requirements of batch preparation in industrial production, so that it is easy to be practically popularized and applied.
  • FIG. 1 is a schematic structural view of a sensor chip of the present invention.
  • AFM atomic force microscope
  • Fig. 3 is a diagram showing the selectivity test of the sensor chip of the present invention for lipopolysaccharide in an aqueous solution by a wavelength type surface plasmon resonance sensing device.
  • the ordinate is a relative light intensity value at a wavelength shift of 12 nm of the resonance wavelength
  • the abscissa is a lipopolysaccharide concentration
  • Fig. 5 is a graph showing changes in the concentration of the sensor chip and lipopolysaccharide of Example 6.
  • Fig. 6 is a graph showing changes in the concentration of the sensor chip and lipopolysaccharide of Example 15.
  • Fig. 7 is a view showing the molecular structure of several probe molecules and compound S1 involved in the examples.
  • a surface plasmon resonance sensor chip comprises a glass substrate layer, a gold film layer and a probe molecule layer; a gold film layer is disposed on the glass substrate layer, and a probe molecule layer is disposed on the gold film layer; the gold film layer a thickness of 10 ⁇ 60nm; the probe molecule layer thickness is l ⁇ 100nm; probe the molecular structure layer is a layer of one of the following structures or two or more probe molecules:
  • X, Y, W are O, S, NR 5 or Si-R 6 R 7 respectively ;
  • R 10 , Ru, R 12 , R 13 , R 14 , R 15 are each a hydrogen atom; 1 to 18 carbons of ruthenium Base, hydroxy, thiol, carboxy, amide, anhydride, alkenyl, alkynyl, aryl, ester, ether, amino, cyano, quaternary ammonium, sulfonate, phosphate or polyethylene glycol; m , n, 0 is 0 ⁇ 10000, and is not 0 at the same time.
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • Figure 2 is an atomic force microscope (AFM) image of a gold film plated on a glass substrate.
  • AFM atomic force microscope
  • the white particles in Figure 2 (C) are probe molecules with a coverage of approximately 20%.
  • the surface plasmon resonance sensor chip prepared in Example 2 is incorporated into an angle modulation type or wavelength modulation type surface plasmon resonance sensing device, and different concentrations of the lipopolysaccharide aqueous solution are introduced into the flow cell to cause a reflection angle.
  • the change by detecting the change in the angle, is linear with the concentration of the introduced lipopolysaccharide, and the results are shown in Fig. 3.
  • the offset of the surface plasmon resonance peak is linear with the concentration of the introduced lipopolysaccharide in the range of 10-14 ⁇ 10 - 1Q M.
  • the sensor chip is incorporated into a wavelength-type surface plasmon resonance sensing device, and a 10-1 Q M lipopolysaccharide aqueous solution is introduced into the flow cell, causing a large change in resonance wavelength and relative light intensity.
  • an aqueous solution of other interfering substances of the same concentration such as sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, glucose, ATP, DNA, RNA, LPA (lysophosphatidic acid), SDS, LTA (lipophosphoic acid), etc. , causing a small change in the resonant wavelength and relative light intensity.
  • the result is shown in Figure 4. It can be seen that the sensor chip of the present invention is selective for lipopolysaccharide.
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the gold film-coated glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule (PT1) solution having a concentration of 10 mg/mL, and the solvent is acetonitrile, and left at room temperature for 10 hours;
  • PT1 probe molecule
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the gold film-coated glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule (PT1) having a concentration of 100 mg/mL, the solvent is 10% tetrahydrofuran and 90% water, and the temperature is 20 Hour
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • step 1) using a vacuum evaporation technique, plating a thickness of 50 nm gold on the surface of the glass substrate; 2)
  • the gold film-coated glass substrate obtained in step 1) is completely immersed in a probe molecule (PT2) solution having a concentration of 1 mg/mL, and the solvent is 10% acetonitrile and 90% water, and left at room temperature. 3 hours;
  • PT2 probe molecule
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the surface plasmon resonance sensor chip prepared in Example 6 is incorporated into a wavelength modulation type surface plasmon resonance sensing device, and different concentrations of the lipopolysaccharide aqueous solution are introduced into the flow cell, which causes a change in the resonance wavelength, and the detection is performed.
  • the change in the resonant wavelength is linear with the concentration of the introduced lipopolysaccharide.
  • the results are shown in Fig. 5.
  • the offset of the surface plasmon resonance peak is linear with the concentration of the introduced lipopolysaccharide in the range of 10 - 1Q ⁇ 10 - 8 M.
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the gold film-coated glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule (PT2) solution having a concentration of 1 mg/mL, and the solvent is phosphate buffer solution water, and left at room temperature for 13 hours;
  • PT2 probe molecule
  • the glass substrate is taken out, and the glass substrate is repeatedly washed with ultrapure water to obtain a chip, which is stored in the secondary distilled water for use.
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the gold film-coated glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule (PT4) solution having a concentration of 15 mg/mL, and the solvent is physiological saline, and left at room temperature for 15 hours;
  • PT4 probe molecule
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • step 1) 1) using a vacuum evaporation technique, plating a thickness of 60 nm on the surface of the glass substrate; 2) completely immersing the gold film-coated glass substrate obtained in step 1) in a probe molecule (PT4) solution having a concentration of 100 mg/mL, and the solvent is hydroxyethylpiperazine ethanesulfonic acid buffer solution, g ⁇ HEPE, leave it at room temperature for 5 hours;
  • PT4 probe molecule
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the glass substrate obtained in the step 1) is immersed in a 0.01 mmol/L compound S1-1 solution, allowed to stand at room temperature for 1 hour; and repeatedly rinsed with double distilled water;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the glass substrate obtained in the step 1) is immersed in a lmmol/L compound S1-2 solution, allowed to stand at room temperature for 4 hours; and repeatedly rinsed with double distilled water;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the glass substrate obtained in the step 1) is immersed in a 10 mmol/L compound S1-3 solution, allowed to stand at room temperature for 10 hours; and repeatedly rinsed with double distilled water;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the glass substrate obtained in the step 1) is immersed in a lmmol/L compound S1-4 solution, allowed to stand at room temperature for 10 hours; and repeatedly rinsed with double distilled water;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the glass substrate obtained in the step 1) is immersed in a 100 mmol/L compound S1-5 solution, allowed to stand at room temperature for 10 hours; and repeatedly rinsed with double distilled water;
  • the surface plasmon resonance sensor chip prepared in Example 15 is loaded into a wavelength modulation type surface plasmon resonance sensing device, and different concentrations of the lipopolysaccharide aqueous solution are introduced into the flow cell, which causes a change in the resonance wavelength, and the detection is performed.
  • the change in the resonant wavelength is linear with the concentration of the introduced lipopolysaccharide.
  • the results are shown in Fig. 6.
  • the offset of the surface plasmon resonance peak is linear with the concentration of the introduced lipopolysaccharide in the range of 10-14 ⁇ 10 - 1Q M.
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the glass substrate obtained in the step 1) is immersed in a 0.1 mmol/L compound S1-6 solution, allowed to stand at room temperature for 24 hours; and repeatedly rinsed with double distilled water;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the gold film-coated glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule PE1 solution having a concentration of 10 mg/mL, and the solvent is acetonitrile, and left at room temperature for 10 hours;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the gold film-coated glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule PE2 solution having a concentration of 20 mg/mL, and the solvent is dimethyl sulfoxide, and left at room temperature for 10 hours;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the gold film-coated glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule PPV2 solution having a concentration of 10 mg/mL, and the solvent is tetrahydrofuran, and allowed to stand at room temperature for 1 hour;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the gold film-coated glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule PF solution having a concentration of 10 mg/mL, the solvent is water, and left at room temperature for 3 hours;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the gold film-coated glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule PF2 solution having a concentration of 10 mg/mL, the solvent is water, and left at room temperature for 5 hours;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • step 1) using a magnetron sputtering technique, plating a thickness of 48 nm gold on the surface of the glass substrate; 2)
  • the gold film-coated glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule PPP1 solution having a concentration of 10 mg/mL, and the solvent is dichloromethane, and left at room temperature for 10 hours;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip the specific steps are as follows:
  • the gold film-coated glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule PPP2 solution having a concentration of 10 mg/mL, the solvent is water, and left at room temperature for 10 hours;
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip comprising the following steps:
  • the glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule solution having a concentration of O.Omg/mL, and left for 5 minutes;
  • the glass substrate was taken out, and the glass substrate was repeatedly washed with water to obtain a surface plasmon resonance sensor chip.
  • the solvent of the probe molecule solution is hydrazine, hydrazine-dimethylformamide.
  • the probe molecule is ⁇ 2.
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip comprising the following steps:
  • the glass substrate obtained in the step 1) is completely immersed in a probe molecule solution having a concentration of 1000 mg/mL, and left for 24 hours;
  • the glass substrate was taken out, and the glass substrate was repeatedly washed with water to obtain a surface plasmon resonance sensor chip.
  • the solvent of the probe molecule solution is hydrazine, hydrazine-dimethylacetamide.
  • the probe molecule is PF2.
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip comprising the following steps:
  • the glass substrate obtained in the step (1) is immersed in the O.01 mmol/L compound S1 solution, allowed to stand for 1 hour, rinsed repeatedly with water, and used; the probe molecules, NHS, EDC, solvent are in accordance with the quality.
  • the structure of the compound S1 is:
  • Z 3 and R 16 are a hydrogen atom
  • the solvent of the compound S1 solution is physiological saline.
  • the solvent is HEPES buffer.
  • a method for preparing a surface plasmon resonance sensor chip comprising the following steps:
  • Gold is plated on the surface of the glass substrate, and the thickness of the gold film is 60 nm ;
  • the glass substrate obtained in the step (1) is immersed in a 1000 mmol/L compound S1 solution, allowed to stand for 24 hours, rinsed repeatedly with water, and used; the probe molecule, NHS, EDC, solvent are mass-produced.
  • 1 100: 100: 1000 mixed, to obtain a mixed solution; the aforementioned glass substrate was immersed in the mixed solution, allowed to stand for 24 hours, the glass substrate was taken out, and repeatedly washed with ethanol and water;
  • the structure of the compound S1 is:
  • R 16 is a polyethylene glycol group
  • the solvent of the compound S1 solution is dimethyl sulfoxide.
  • the solvent is hydrazine, hydrazine-dimethylacetamide.
  • the influence of the concentration of the probe molecule solution and the soaking time on the coverage of the probe molecule on the gold film was measured.
  • the probe molecule ⁇ 2 was taken as an example, and the results are shown in the following table: 30 minutes 7% 15% 35% 45% 50%

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Abstract

本发明公开了一种表面等离子体共振传感芯片，包括玻璃基片层、金膜层、探针分子层；玻璃基片层上设置金膜层，金膜层上设置探针分子层。本发明还公开了表面等离子体共振传感芯片的制备方法，利用玻璃基片上的金膜表面产生的表面等离子体共振光谱技术，快速、简便、定量、超灵敏地检测水溶液中的脂多糖的含量。

Description

一种表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、 应用 技术领域
本发明属于表面等离子体传感芯片制备领域， 具体地涉及一种可用于脂多糖检 测的表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、 应用。
背景技术
脂多糖 （lipopolysaccharide, 简称 LPS ) 是一种聚合物， 由脂和多糖通过共价 键相连组成的。 它是革兰氏阴性细菌外膜的主要组成部分， 是一种强力细菌毒素， 称作内毒素。 当革兰氏阴性菌如大肠杆菌及肠沙门氏菌倍增或裂解时， 即释放脂多 糖。 人体内的革兰氏阴性菌大量释放细胞壁内的脂多糖会引起人体感染发炎， 进一 步地会发展成为一种严重威胁人类健康的重大疾病——败毒症。 由于脂多糖的高毒 性， 为了有效控制微生物污染且同时控制细菌内毒素的水平， 纯化水、 注射用水中 必须检测 LPS的含量， 以确保水质安全。 因此科研人员一直都致力于发明一种高选 择性， 超灵敏检测水溶液中的脂多糖的方法。 到目前为止， 凝胶法是临床上最常用 的检测脂多糖的方法， 它能够定性、 半定量、 高灵敏度的检测脂多糖， 但是这种方 法必须用到一种古生物（鲎） 的血液， 因此， 长期大量的使用必定受到一定的限制。 此外， 这种方法操作步骤繁琐， 对环境的温度及 pH都很敏感， 并且对其它的一些 糖类物质也显示阳性。 而光化学传感器虽然具有高选择性， 方便快捷等优点， 但是 其灵敏度受制于荧光信号的局限， 无法达到脂多糖的实际检测要求 （pM)。 因此， 迫切需要发展一种高灵敏度、 高选择性、 成本低廉的检测方法用来检测水溶液中的 脂多糖含量。
表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance,简称 SPR)是指在光波的作用下， 金属和电介质的界面上形成的改变光波传输的谐振波， 即当以一特定角度的入射光 进入玻璃棱镜内时， 会产生全内反射倏逝波， 这种波穿透距离约为 300nm， 可以引 发金属表面的自由电子产生表面等离子体。 当表面等离子体子与倏逝波的频率相等 时， 二者将发生共振， 入射光被吸收， 导致反射光能量急剧下降， 因此反射光谱上 出现共振峰 (即反射强度最低值)。 表面介质折射率和构象的任何微小改变都将使入 射角度发生迁移， 这种变化被探测器捕获， 并转化为相应谱图。 由于表面等离子波 对介质的折射率和构象的微小变化非常敏感， 如果让被测样品与发生表面等离子共 振的金属薄膜相接触， 并发生相互作用， 薄膜的介电常数、 折射率和构象会发生变 化， 并因此而影响共振条件， 引起共振峰的偏移。 SPR传感器的共振原理决定了这 种传感器与传统的生物检测手段或者化学检测手段相比， 具有明显的优势， 如可实 现实时、 动态、 尤其是超灵敏检测。近年来， SPR传感器已经广泛应用于环境卫生， 食品安全， 疾病诊断等众多领域。 主要是应用在检测生物分子和其他物质之间的相 互作用及动力学分子等。但还没有出现适用于检测脂多糖的 SPR传感器， 也没有使 用 SPR技术来实时、 快速、 简便、 定量、 超灵敏地检测水溶液中的脂多糖含量， 特 别是注射用水中的脂多糖含量的方法。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种表面等离子体共振传感芯片。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种表面等离子体共振传感芯片的制 备方法。 利用玻璃基片上的金膜表面产生的表面等离子体共振光谱技术， 快速、 简 便、 定量、 超灵敏地检测水溶液中的脂多糖的含量。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种表面等离子体共振传感芯片的应 用。 本发明提供一种表面等离子体共振传感芯片， 包括玻璃基片层、 金膜层、 探针 分子层； 玻璃基片层上设置金膜层， 金膜层上设置探针分子层； 所述探针分子层是 结构为以下结构中的一种或者两种以上的探针分子的层：
Figure imgf000003_0001
X， Y， W分别为 O， S， N-R5或 Si-R6R Zi ? ， Ri， R2， R， ， ， R6， R7 ' R8， R9 ' Rl0， Rll， Rl2， Rl3， Rl4，
R15分别为氢原子； 1〜18个碳的垸基、 羟基、 巯基、 羧基、 酰胺、 酸酐、 烯基、 炔 基、 芳基、 酯基、 醚基， 氨基， 氰基， 季铵盐， 磺酸盐， 磷酸盐或聚乙二醇基； m， n， 0为 0〜10000， 且不同时为 0。
本文中， " 1〜18个碳的垸基、 羟基、 巯基、 羧基、 酰胺、 酸酐、 烯基、 炔基、 芳基、 酯基、 醚基"是指垸基、 羟基、 巯基、 羧基、 酰胺、 酸酐、 烯基、 炔基、 芳 基、 酯基、 醚基的碳为 1〜18个碳。
所述金膜层的厚度为 10~60nm; 所述探针分子层的厚度为 l~100nm; 探针分子 层在金膜层上的覆盖率为 5%~100%。 探针分子在金膜层上的覆盖率可以通过 AFM 半定量测定； 探针分子覆盖在金膜层上后， 会自组装地形成颗粒状结构； 探针分子 其表面修饰的巯基与金膜的接触。
所有探针分子， 都是可以市售购买或者通过现有文献合成。 本发明还提供一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 包括以下步骤：
1)将金镀在玻璃基片表面；
2)将步骤 1)得到的玻璃基片完全浸泡在浓度为 0.01~1000mg/mL的探针分子溶 液中， 放置 5分钟 ~24小时；
3)取出玻璃基片， 用水反复冲洗玻璃基片， 得到表面等离子体共振传感芯片； 所述探针分子溶液为具有以下结构中的一种或者两种以上的物质的溶液：
Figure imgf000004_0001
PT PPV PF PPP E
式中， 分别为噻吩， 吡咯， 苯， 萘， 蒽， 芘， 吲哚， 香豆素， 荧光素， 咔 唑， 罗丹明， 氰基染料， 芴或喹啉；
Ar2分别为下列结构中的一种：
Figure imgf000005_0001
X， Y， W分别为 O， S， N-R5或 Si-R6R7 ;
， ， Ri , R2， R3， R4 , R5 , R6， R7， R8， Rg， R10， Ru， R12， R13， R14， R15分别为氢原子； 1〜18个碳的垸基、 羟基、 巯基、 羧基、 酰胺、 酸酐、 烯基、 炔 基、 芳基、 酯基、 醚基， 氨基， 氰基， 季铵盐， 磺酸盐， 磷酸盐或聚乙二醇基； m， n， 0为 0〜10000， 且不同时为 0。
所述金膜的厚度为 10~60nm。 探针分子在金膜上的覆盖率为 5%~100%。
步骤 3 ) 中， 可选择的水有： 二次蒸馏水、 三次蒸馏水、 四次蒸馏水、 超纯水 等。
用水冲洗一次或几次后，用高效液相分析冲洗液，待检测不到探针分子的信号， 就可以认为已经冲洗干净。 冲洗的目的是为了除去通过物理吸收方式吸附在金膜表 面的探针分子。
探针分子的浓度、 浸泡时间将最终影响探针分子在金膜上的覆盖率， 进而影响 芯片的灵敏度。
最终制得的传感芯片保存于二次蒸馏水中备用。
上述反应在室温下进行即可。
步骤 1 ) 镀膜是采用真空蒸镀或磁控溅射技术。 镀金的实验设备中， 真空度在 1 X 10— 4Pa， 通过调节膜厚仪的频率变化 （10~60Hz ) 和蒸发速率为 0. lA/s， 可以精 确控制 10~60nm金膜的厚度。
进一步地， 探针分子溶液的溶剂为生理盐水、 HEPES缓冲液、 磷酸盐缓冲液； 或者为甲醇、 乙醇、 乙腈、 二氯甲垸、 三氯甲垸、 四氢呋喃、 二甲亚砜、 Ν,Ν-二甲 基甲酰胺， Ν,Ν-二甲基乙酰胺等有机溶剂中的一种或两种以上混合溶剂； 或者为前 述有机溶剂中的一种或两种以上混合溶剂和水以任意比例混合的混合物。 本发明又提供一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 包括以下步骤: ( 1 ) 将金镀在玻璃基片表面；
(2) 将步骤 （1 ) 得到的玻璃基片浸泡在 0.01~1000mmol/L的化合物 S1溶液 中， 静置 1~24 小时， 用水反复冲洗干净， 备用； 将探针分子、 NHS、 EDC、 溶剂 按照质量比为 1 : 0.1~100： 0.1-100： 1-1000混合， 得到混合溶液； 将前述玻璃基 片浸泡在混合溶液中， 静置 5分钟〜 24小时， 取出玻璃基片， 用乙醇、 水反复冲洗； 其中， 化合物 S1的结构是为：
S1 ;
式中， ¾、 R16分别为氢原子； 1〜18个碳的垸基、 羟基、 巯基、 羧基、 酰胺、 酸酐、 烯基、 炔基、 芳基、 酯基、 醚基， 氨基， 氰基或聚乙二醇基；
(3 ) 取出玻璃基片， 用水反复冲洗玻璃基片， 得到表面等离子体共振传感芯 片。
探针分子的结构限定同上面段中的限定。 NHS为 N-羟基琥珀酰亚胺； EDC为 1-乙基- (3-二甲基氨基丙基） 碳二亚胺。
所述金膜的厚度为 10~60nm。 探针分子在金膜上的覆盖率为 5%~100%。
步骤 （2) 中， 可选择的水有： 二次蒸馏水、 三次蒸馏水、 四次蒸馏水、 超纯 水等。 通过用高效液相检测冲洗液， 待检测不到 S1 的信号， 就可以认为已经冲洗 干净。 冲洗不干净会影响探针分子在金膜上的覆盖率。 浸泡后的玻璃基片先用乙醇 冲洗， 然后再用水冲洗。 S1化合物， 都是可市售购买或者通过现有文献合成。
探针分子和其他物质的配比、 浸泡时间等的变化将最终影响探针分子在金膜上 的覆盖率， 进而影响芯片的灵敏度。
上述反应在室温下进行即可。
步骤 （1 ) 镀膜是采用真空蒸镀或磁控溅射技术。 镀金的实验设备中， 真空度 在 1 X 10— 4Pa， 通过调节膜厚仪的频率变化 （10~60Hz) 和蒸发速率为 0. lA/s， 可以 精确控制 10~60nm金膜的厚度。
进一步地， 所述化合物 S1溶解在生理盐水、 HEPES缓冲液、 磷酸盐缓冲液； 或者为甲醇、 乙醇、 乙腈、 二氯甲垸、 三氯甲垸、 四氢呋喃、 二甲亚砜、 Ν,Ν-二甲 基甲酰胺， Ν,Ν-二甲基乙酰胺等有机溶剂中的一种或两种以上混合溶剂； 或者为前 述有机溶剂中的一种或两种以上混合溶剂和水以任意比例混合的混合物中， 形成化 合物 S1溶液。
进一步地，所述溶剂为生理盐水、 HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液； 或者为甲醇、 乙醇、 乙腈、二氯甲垸、三氯甲垸、 四氢呋喃、二甲亚砜、 Ν,Ν-二甲基甲酰胺， Ν,Ν- 二甲基乙酰胺等有机溶剂中的一种或两种以上混合溶剂； 或者为前述有机溶剂中的 一种或两种以上混合溶剂和水以任意比例混合的混合物。 本发明还提供一种表面等离子体共振传感芯片的应用， 其可用于检测水溶液中 的脂多糖。
进一步地， 所述应用是将该传感芯片装入角度调制型或者波长调制型表面等离 子体共振传感设备中， 在流通池中通入不同浓度的脂多糖水溶液， 通过检测表面等 离子体共振峰的偏移来检测脂多糖。
进一步地， 所述表面等离子体共振峰的偏移的量与通入的脂多糖的浓度在相应 范围呈线性关系， 可用来定量检测脂多糖。
本发明具有以下优点-
1 )本发明首次提出利用表面等离子体共振传感技术检测水溶液中的 LPS,与传 统的检测方法相比， 灵敏度高， 选择性好， 在水溶液中的检测脂多糖浓度线性范围 为 lO -lO^M;
2) 本发明所用的修饰在金膜表面的探针分子结构明确， 分子易合成， 结构可 控；
3 ) 本发明制备 SPR芯片过程的操作步骤简单， 成本低廉， 使得制备的芯片重 现性好， 满足工业化生产中的批量制备的需求， 使得其极易实际推广应用。
附图说明
图 1为本发明的传感芯片的结构示意图。
图 2为本发明通过磁控溅射技术在玻璃基片上镀的金膜的原子力显微镜 (AFM) 成像图。
图 3为本发明的传感芯片在波长型表面等离子体共振传感设备对水溶液中脂多 糖的选择性测试。
图 4为本发明的传感芯片在波长型表面等离子体共振传感设备中对水溶液中脂 多糖的浓度滴定图； 纵坐标是共振波长蓝移 12nm处的相对光强值， 横坐标为脂多 糖的浓度。
图 5为实施例 6的传感芯片与脂多糖的浓度的变化图。
图 6为实施例 15的传感芯片与脂多糖的浓度的变化图。
图 7为实施例涉及的几种探针分子和化合物 S1的分子结构图。
具体实施方式 下面结合实施例和附图对本发明进行进一步说明。
实施例 1
一种表面等离子体共振传感芯片， 包括玻璃基片层、 金膜层、 探针分子层； 玻 璃基片层上设置金膜层，金膜层上设置探针分子层；所述金膜层的厚度为 10~60nm; 所述探针分子层的厚度为 l~100nm; 所述探针分子层是结构为以下结构中的一种或 者两种以上的探针分子的层：
Figure imgf000008_0001
X， Y， W分别为 O， S， N-R5或 Si-R6R7;
， R2， R3， R4 , R5 , R6， R7， R8， Rg， R10， Ru， R12， R13， R14， R15分别为氢原子； 1〜18个碳的垸基、 羟基、 巯基、 羧基、 酰胺、 酸酐、 烯基、 炔 基、 芳基、 酯基、 醚基， 氨基， 氰基， 季铵盐， 磺酸盐， 磷酸盐或聚乙二醇基； m， n， 0为 0〜10000， 且不同时为 0。
结构如图 1中所示。
实施例 2
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用真空蒸镀技术， 将厚度为 50nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 O.Olmg/mL的探 针分子 (PT1)溶液中， 溶剂为 Ν,Ν-二甲基甲酰胺， 室温放置 1小时； 3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
图 2为在玻璃基片上镀的金膜的原子力显微镜 （AFM) 成像图。 （a)金膜表面， 5um范围； （b)金膜表面， lum范围。 图 2 (C) 中的白色颗粒即为探针分子， 其覆 盖率大约在 20%。
将实施例 2制得的表面等离子体共振传感芯片装入角度调制型或者波长调制型 表面等离子体共振传感设备中， 在流通池中通入不同浓度的脂多糖水溶液， 会引起 反射角的变化， 通过检测角度的变化值与通入的脂多糖的浓度呈线性关系， 结果如 图 3。表面等离子体共振峰的偏移量与通入的脂多糖的浓度在 10— 14~10— 1QM范围呈线 性关系。
将此传感芯片装入波长型表面等离子体共振传感设备中， 在流通池中通入 10— 1QM脂多糖水溶液， 会引起共振波长和相对光强的较大的变化。 而通入相同浓度 的其他干扰物质的水溶液，如氯化钠，氯化钾，氯化钙，葡萄糖， ATP， DNA， RNA， LPA (溶血磷脂酸）， SDS， LTA (脂磷壁酸） 等， 引起共振波长以及相对光强的变 化较小。 结果如图 4。 可以看出， 本发明的传感芯片对脂多糖具有选择性。
实施例 3
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 50nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 10mg/mL 的探 针分子 (PT1)溶液中， 溶剂为乙腈， 室温放置 10小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 4
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 50nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 lOOmg/mL的探 针分子 (PT1)中， 溶剂为 10%的四氢呋喃与 90%的水， 室温放置 20小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 5
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用真空蒸镀技术， 将厚度为 50nm金镀在玻璃基片表面上； 2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 lmg/mL的探针 分子 (PT2)溶液中， 溶剂为 10%的乙腈与 90%的水， 室温放置 3小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 6
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 50nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 O.Olmg/mL的探 针分子 (PT3)溶液中， 溶剂为 30%的二甲亚砜与 70%的水， 室温放置 10小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用三次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
将实施例 6制得的表面等离子体共振传感芯片装入波长调制型表面等离子体共 振传感设备中，在流通池中通入不同浓度的脂多糖水溶液，会引起共振波长的变化， 通过检测共振波长的变化值与通入的脂多糖的浓度呈线性关系， 结果如图 5。 表面 等离子体共振峰的偏移量与通入的脂多糖的浓度在 10— 1Q~10— 8M范围呈线性关系。 实施例 7
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用真空蒸镀技术， 将厚度为 50nm金 （2) 镀在玻璃基片 （1 ) 表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 lmg/mL的探针 分子 (PT2)溶液中， 溶剂为磷酸盐缓冲溶液水， 室温放置 13小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用超纯水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保 存于二次蒸馏水中备用。
实施例 8
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 60nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 15mg/mL 的探 针分子 (PT4)溶液中， 溶剂为生理盐水， 室温放置 15小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 9
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用真空蒸镀技术， 将厚度为 60nm金镀在玻璃基片表面上； 2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 lOOmg/mL的探 针分子 (PT4)溶液中， 溶剂为羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液， g卩 HEPE, 室温放置 5小 时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 10
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 60nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 O.Olmg/mL的探 针分子 (PT5)溶液中， 溶剂为 50%的甲醇与 50%的水， 室温放置 18小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 11
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 60nm金镀在玻璃基片表面上；
2a) 将步骤 1 ) 中得到的玻璃基片浸泡在 0.01mmol/L的化合物 S1-1溶液中， 室温静置 1小时； 用二次蒸馏水反复冲洗干净；
2b) 将 10mg的探针分子（PT6)， lOmgNHS, lOmgEDC 溶解在 50mL磷酸盐缓 冲水溶液中；
2c) 将 2a)制备的玻璃基片浸泡在 2b)制备的混合溶液中， 室温静置 4小时， 分 别用乙醇、 二次蒸馏水反复小心冲洗干净；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 12
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 55nm金镀在玻璃基片表面上；
2a)将步骤 1 ) 中得到的玻璃基片浸泡在 lmmol/L的化合物 S1-2溶液中， 室温 静置 4小时； 用二次蒸馏水反复冲洗干净；
2b) 将 lOOmg的探针分子 （PT6)， 50mgNHS, 50mgEDC 溶解在 lOOmL含 5% 乙腈一 95%磷酸盐缓冲水溶液中；
2c) 将 2a)制备的玻璃基片浸泡在 2b)制备的混合溶液中， 室温静置 20小时， 分 别用乙醇、 二次蒸馏水反复小心冲洗干净； 3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 13
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用真空蒸镀技术， 将厚度为 48nm金镀在玻璃基片表面上；
2a) 将步骤 1 ) 中得到的玻璃基片浸泡在 10mmol/L的化合物 S1-3溶液中， 室 温静置 10小时； 用二次蒸馏水反复冲洗干净；
2b) 将 50mg的探针分子（PT6)， 50mgNHS, 50mgEDC 溶解在 lOOmL含 5%二 甲亚砜一 95%生理盐水溶液中；
2c) 将 2a)制备的玻璃基片浸泡在 2b)制备的混合溶液中， 室温静置 10小时， 分 别用乙醇、 二次蒸馏水反复小心冲洗干净；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 14
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用真空蒸镀技术， 将厚度为 50nm金镀在玻璃基片表面上；
2a)将步骤 1 ) 中得到的玻璃基片浸泡在 lmmol/L的化合物 S1-4溶液中， 室温 静置 10小时； 用二次蒸馏水反复冲洗干净；
2b) 将 50mg的探针分子 （PT7)， 50mgNHS, 50mgEDC 溶解在 90mL含 5%二 甲亚砜一 95%生理盐水溶液中；
2c) 将 2a)制备的玻璃基片浸泡在 2b)制备的混合溶液中， 室温静置 3小时， 分 别用乙醇、 二次蒸馏水反复小心冲洗干净；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 15
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 50nm金镀在玻璃基片表面上；
2a)将步骤 1 ) 中得到的玻璃基片浸泡在 100mmol/L的化合物 S1-5溶液中， 室 温静置 10小时； 用二次蒸馏水反复冲洗干净；
2b) 将 5mg的探针分子（PT7)， lOmgNHS, lOmgEDC 溶解在 20mL含 5%甲醇 95%生理盐水溶液中；
2c) 将 2a)制备的玻璃基片浸泡在 2b)制备的混合溶液中， 室温静置 3小时， 分 别用乙醇、 二次蒸馏水反复小心冲洗干净。
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
将实施例 15 制得的表面等离子体共振传感芯片装入波长调制型表面等离子体 共振传感设备中， 在流通池中通入不同浓度的脂多糖水溶液， 会引起共振波长的变 化， 通过检测共振波长的变化值与通入的脂多糖的浓度呈线性关系， 结果如图 6。 表面等离子体共振峰的偏移量与通入的脂多糖的浓度在 10— 14~10— 1QM范围呈线性关 系。
实施例 16
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 60nm金镀在玻璃基片表面上；
2a) 将步骤 1 ) 中得到的玻璃基片浸泡在 0.1mmol/L的化合物 S1-6溶液中， 室 温静置 24小时； 用二次蒸馏水反复冲洗干净；
2b) 将 15mg的探针分子（PT7)， 20mgNHS, 20mgEDC 溶解在 40mL含 10%乙 腈一 80%磷酸盐缓冲溶液中；
2c) 将 2a)制备的玻璃基片浸泡在 2b)制备的混合溶液中， 室温静置 13小时， 分 别用乙醇、 二次蒸馏水反复小心冲洗干净。
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 17
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 50nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 10mg/mL 的探 针分子 PE1溶液中， 溶剂为乙腈， 室温放置 10小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 18
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 45nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 20mg/mL 的探 针分子 PE2溶液中， 溶剂为二甲亚砜， 室温放置 10小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 19
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 50nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 10mg/mL 的探 针分子 PPV1溶液中， 溶剂为二氯甲垸， 室温放置 10小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 20
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 50nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 10mg/mL 的探 针分子 PPV2溶液中， 溶剂为四氢呋喃， 室温放置 1小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 21
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 45nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 10mg/mL 的探 针分子 PF溶液中， 溶剂为水， 室温放置 3小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 22
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 50nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 10mg/mL 的探 针分子 PF2溶液中， 溶剂为水， 室温放置 5小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 23
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 48nm金镀在玻璃基片表面上； 2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 10mg/mL 的探 针分子 PPP1溶液中， 溶剂为二氯甲垸， 室温放置 10小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 24
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 具体步骤为：
1)采用磁控溅射技术， 将厚度为 52nm金镀在玻璃基片表面上；
2)将步骤 1)中得到的已镀上金膜的玻璃基片完全浸泡在浓度为 10mg/mL 的探 针分子 PPP2溶液中， 溶剂为水， 室温放置 10小时；
3)浸泡完全后， 取出玻璃基片， 用二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片， 得到芯片， 并保存于二次蒸馏水中备用。
实施例 25
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 包括以下步骤：
1)将金镀在玻璃基片表面， 金膜的厚度为 lOnm;
2)将步骤 1)得到的玻璃基片完全浸泡在浓度为 O.Olmg/mL的探针分子溶液中， 放置 5分钟；
3)取出玻璃基片， 用水反复冲洗玻璃基片， 得到表面等离子体共振传感芯片。 所述探针分子溶液的溶剂为 Ν,Ν-二甲基甲酰胺。
所述探针分子为 ΡΡΡ2。
实施例 26
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 包括以下步骤：
1)将金镀在玻璃基片表面， 金膜的厚度为 60nm;
2)将步骤 1)得到的玻璃基片完全浸泡在浓度为 1000mg/mL的探针分子溶液中， 放置 24小时；
3)取出玻璃基片， 用水反复冲洗玻璃基片， 得到表面等离子体共振传感芯片。 所述探针分子溶液的溶剂为 Ν,Ν-二甲基乙酰胺。
所述探针分子为 PF2。
实施例 27
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 包括以下步骤：
( 1 ) 将金镀在玻璃基片表面， 金膜的厚度为 lOnm;
(2) 将步骤 （1 ) 得到的玻璃基片浸泡在 O.01mmol/L的化合物 S1溶液中， 静 置 1小时， 用水反复冲洗干净， 备用； 将探针分子、 NHS、 EDC、 溶剂按照质量比 为 0.1： 0.1： 1混合， 得到混合溶液； 将前述玻璃基片浸泡在混合溶液中， 静置 5分钟， 取出玻璃基片， 用乙醇、 水反复冲洗；
其中， 化合物 S1的结构是为：
S1 ;
式中， Z3、 R16为氢原子；
(3 ) 取出玻璃基片， 用水反复冲洗玻璃基片， 得到表面等离子体共振传感芯 片。
所述化合物 S1溶液的溶剂为生理盐水。
所述溶剂为 HEPES缓冲液。
实施例 28
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 包括以下步骤：
( 1 ) 将金镀在玻璃基片表面， 金膜的厚度为 60nm;
(2)将步骤（1 )得到的玻璃基片浸泡在 1000mmol/L的化合物 S1溶液中， 静 置 24 小时， 用水反复冲洗干净， 备用； 将探针分子、 NHS、 EDC、 溶剂按照质量 比为 1 : 100： 100： 1000混合， 得到混合溶液； 将前述玻璃基片浸泡在混合溶 液中， 静置 24小时， 取出玻璃基片， 用乙醇、 水反复冲洗；
其中， 化合物 S1的结构是为：
S1 ;
式中， ¾为氰基， R16为聚乙二醇基；
(3 ) 取出玻璃基片， 用水反复冲洗玻璃基片， 得到表面等离子体共振传感芯 片。
所述化合物 S1溶液的溶剂为二甲亚砜。
所述溶剂为 Ν,Ν-二甲基乙酰胺。
实施例 29
测定探针分子溶液浓度、 浸泡时间等对探针分子在金膜上的覆盖率的影响， 以 探针分子 ΡΤ2为例， 结果见下表：
Figure imgf000016_0001
30分钟 7% 15% 35% 45% 50%
1小时 9% 25% 40% 50% 60%
2小时 15% 35% 45% 60% 75%
5小时 20% 45% 50% 70% 80%
10小时 25% 50% 55% 75% 85%
24小时 40% 55% 65% 80% 100% 由上表可见， 随着浸泡时间的增加， 探针分子在金膜上的覆盖率也随着增加， 随着探针分子浓度的增加， 探针分子在金膜上的覆盖率也增加。 显然， 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例， 而并非是 对本发明的实施方式的限定。 对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基 础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。 这里无法对所有的实施方式予以穷 举。 凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的 保护范围之列。

Claims

权利要求书
1、 一种表面等离子体共振传感芯片， 其特征在于， 包括玻璃基片层、 金膜层、 探针分子层； 玻璃基片层上设置金膜层， 金膜层上设置探针分子层； 所述探针分子 层是结构为以下结构中的一种或者两种以上的探针分子的层：
Figure imgf000018_0001
X， Y， W分别为 O， S， N-R5或 Si-R6R7;
， R2， R3， R4 , R5 , R6， R7， R8， Rg， R10， Ru， R12， R13， R14， R15分别为氢原子； 1〜18个碳的垸基、 羟基、 巯基、 羧基、 酰胺、 酸酐、 烯基、 炔 基、 芳基、 酯基、 醚基， 氨基， 氰基， 季铵盐， 磺酸盐， 磷酸盐或聚乙二醇基； m， n， 0为 0〜10000， 且不同时为 0。
2、 根据权利要求 1 所述的表面等离子体共振传感芯片， 其特征在于， 所述金 膜层的厚度为 10~60nm; 所述探针分子层的厚度为 l~100nm; 探针分子层在金膜层 上的覆盖率为 5%~100%。
3、 如权利要求 1或 2所述的表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 其特征 在于， 包括以下步骤：
1)将金镀在玻璃基片表面；
2)将步骤 1)得到的玻璃基片完全浸泡在浓度为 0.01~1000mg/mL的探针分子溶 液中， 放置 5分钟 ~24小时； 3)取出玻璃基片， 用水反复冲洗玻璃基片， 得到表面等离子体共振传感芯片。
4、 根据权利要求 3 所述的表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 其特征在 于， 所述金膜的厚度为 10~60nm。
5、 根据权利要求 3 所述的表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 其特征在 于， 所述探针分子溶液的溶剂为生理盐水、 HEPES缓冲液、 磷酸盐缓冲液； 或者为 甲醇、 乙醇、 乙腈、 二氯甲垸、 三氯甲垸、 四氢呋喃、 二甲亚砜、 Ν,Ν-二甲基甲酰 胺， Ν,Ν-二甲基乙酰胺等有机溶剂中的一种或两种以上混合溶剂； 或者为前述有机 溶剂中的一种或两种以上混合溶剂和水以任意比例混合的混合物。
6、 如权利要求 1或 2所述的一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 其 特征在于， 包括以下步骤：
( 1 ) 将金镀在玻璃基片表面；
(2) 将步骤 （1 ) 得到的玻璃基片浸泡在 0.01~1000mmol/L的化合物 S1溶液 中， 静置 1~24 小时， 用水反复冲洗干净， 备用； 将探针分子、 NHS、 EDC、 溶剂 按照质量比为 1 : 0.1~100： 0.1-100： 1-1000混合， 得到混合溶液； 将前述玻璃基 片浸泡在混合溶液中， 静置 5分钟〜 24小时， 取出玻璃基片， 用乙醇、 水反复冲洗； 其中， 化合物 S1的结构是为：
S1 ;
式中， ¾、 R16分别为氢原子； 1〜18个碳的垸基、 羟基、 巯基、 羧基、 酰胺、 酸酐、 烯基、 炔基、 芳基、 酯基、 醚基， 氨基， 氰基或聚乙二醇基；
(3 ) 取出玻璃基片， 用水反复冲洗玻璃基片， 得到表面等离子体共振传感芯 片。
7、 根据权利要求 6所述的表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 其特征在 于， 所述金膜的厚度为 10~60nm。
8、 根据权利要求 6所述的表面等离子体共振传感芯片的制备方法， 其特征在 于，
所述化合物 S1溶解在生理盐水、 HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液； 或者为甲醇、 乙醇、 乙腈、二氯甲垸、三氯甲垸、 四氢呋喃、二甲亚砜、 Ν,Ν-二甲基甲酰胺， Ν,Ν- 二甲基乙酰胺等有机溶剂中的一种或两种以上混合溶剂； 或者为前述有机溶剂中的 一种或两种以上混合溶剂和水以任意比例混合的混合物中， 形成化合物 S1溶液； 所述溶剂为生理盐水、 HEPES缓冲液、 磷酸盐缓冲液； 或者为甲醇、 乙醇、 乙 腈、 二氯甲垸、 三氯甲垸、 四氢呋喃、 二甲亚砜、 Ν,Ν-二甲基甲酰胺， Ν,Ν-二甲基 乙酰胺等有机溶剂中的一种或两种以上混合溶剂； 或者为前述有机溶剂中的一种或 两种以上混合溶剂和水以任意比例混合的混合物。
9、 如权利要求 1~8任一所述的表面等离子体共振传感芯片的应用， 其可用于 检测水溶液中的脂多糖。
10、 根据权利要求 9所述的表面等离子体共振传感芯片的应用， 其特征在于， 所述应用是将该传感芯片装入角度调制型或者波长调制型表面等离子体共振传感 设备中， 在流通池中通入不同浓度的脂多糖水溶液， 通过检测表面等离子体共振峰 的偏移来检测脂多糖。
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