CN103698303B

CN103698303B - 一种表面等离子体共振(spr)传感芯片及其制备方法和应用

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Publication number: CN103698303B
Application number: CN201310718451.4A
Authority: CN
Inventors: 郝开红; 董海峰; 金时; 代文浩
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2033-12-23
Also published as: CN103698303A

Abstract

本发明涉及一种表面等离子体共振(SPR)传感芯片及其制备方法和应用，属于医学检测领域。所述SPR传感芯片的结构为，先在基质玻璃片表面依次镀上铬膜和金膜，在所镀的金膜表面修饰生物素‑miRNA探针；所述修饰生物素‑miRNA探针用三(2‑羧乙基)膦(TCEP)还原巯基，用6‑巯基1‑己醇(MCH)封堵。本发明的有益技术效果为，本发明公开了一种表面等离子体共振(SPR)传感芯片，此芯片可用于直接检测低分子量、超低浓度分子；并且公开了此SPR传感芯片的制备方法，此方法制备成本低、测试效果稳定；并公开了此传感芯片的应用，此芯片的使用方法简单、不需要特殊设备、并且测试原料可再生并且重复使用，而且测试效果良好。

Description

一种表面等离子体共振(SPR)传感芯片及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医学检测领域，尤其涉及一种microRNA (miRNA)的检测方法，具体是基于表面等离子体共振(SPR)以及金纳米棒信号放大的超灵敏和无标记快速microRNA(miRNA)检测方法，属于医学检测领域。

技术背景

MicroRNAs (miRNAs)是一类在进化上高度保守的非编码小分子单链RNA, 在基因转录后调控中发挥至关重要的作用，广泛存在于动植物体内，越来越多的证据表明,miRNAs参与很多重要的生理和病理过程, 例如发育、器官形成、调亡、细胞增殖、肿瘤发生等。因此，miRNAs分析检测就成了我们进一步研究其生物功能，疾病诊断和治疗以及相关基因药物开发的关键技术。

贵金属纳米材料由于其独特的光物理及化学性质、良好的生物相容性、低毒性，在miRNA分析中扮演者重要的角色并且被广泛应用于各种生物传感器。

SPR技术是一种基于芯片表面折射率或质量变化的光学检测技术，具有灵敏、快速、免标记等优点，可实时在线跟踪固液界面上的反应，在蛋白质和核酸等生物分子检测方面具有广阔的应用前景。但是传统的SPR检测方法难以直接检测低分子量、超低浓度的分子。miRNAs序列短、缺乏共同的特征、含量少、在细胞中表达丰度低，因此直接利用传统的SPR技术很难检测。大部分SPR传感器都是基于球形金纳米颗粒的，有关金纳米棒(GNRs)的研究较少。

发明内容

本发明解决的技术问题为，传统的SPR方法难以直接检测低分子量、超低浓度分子，本发明公开一种表面等离子体共振(SPR)传感芯片及其制备方法和应用，目的在于提供一种低成本、速度快的测试方法，及一种可再生并且重复使用、效果好的SPR传感芯片。

为实现上述目的本发明采取如下的技术方案。

本发明涉及一种表面等离子体共振(SPR)传感芯片，所述SPR传感芯片的结构为，先在基质玻璃片表面依次镀上铬膜和金膜，在所镀的金膜表面修饰生物素-miRNA探针。

所述SPR传感芯片的优选技术方案为，所述修饰生物素-miRNA探针用三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原巯基，用6-巯基1-己醇(MCH)封堵。

本发明还涉及上述传感芯片的制备方法，首先在基质玻璃片上制备厚度为1～3nm的铬膜，在其上制备厚度为40～60 nm的金膜；然后在金膜上固定探针，将包含三(2-羧乙基)膦(TCEP)的磷酸缓冲液(PBS)的生物素-miRNA探针滴到金膜上，过夜；固定探针后，用PBS溶液洗去未结合的探针，将得到的金膜用6-巯基1-己醇(MCH)封堵后冲洗，得到SPR传感芯片。

所述传感芯片制备方法的优选技术方案为，所述金膜上固定探针的方法为，将25μL 0.1 μM的生物素-miRNA探针滴到金膜上，其中包含0.1 M, pH 7.4磷酸缓冲液（PBS），在PBS中含有2 μM三(2-羧乙基)膦(TCEP)。

所述传感芯片制备方法的优选技术方案为，固定探针经过清洗后，用1.45×10⁻⁶M的6-巯基1-己醇(MCH)封堵。

本发明还涉及上述传感芯片的应用，所述SPR传感芯片与金纳米棒(GNRs)-链霉亲和素用于检测miRNA、DNA、蛋白质、抗原的含量。

所述传感芯片应用的优选技术方案为，所述miRNA含量的检测，是将SPR传感芯片置于SPR检测通道上、将不同浓度的目标miRNA注射到流动分析池，miRNA与生物素-miRNA探针杂交形成双链使生物素暴露出来，记录其对应的SPR信号响应。然后在低浓度miRNA时，注入GNRs-链霉亲和素，记录其对应的SPR信号响应，根据标准曲线，确定miRNA的浓度。

所述传感芯片应用的优选技术方案为，在低浓度miRNA时所用的缓冲液为10 mMPBS (pH=7.4)。

所述传感芯片应用的优选技术方案为，所述检测结束后，向SPR检测通道中分别注射2 mM的NaOH和2 mM的HCl，用于洗脱结合的GNRs-链霉亲和miRNA，即可测试下一个样品。

所述传感芯片应用的优选技术方案为，所述方法可测量的miRNA低浓度为0.1～100 pM。

所述传感芯片应用的优选技术方案为，所述金纳米棒、(GNRs)-链霉亲和素的制备步骤为：

（1） GNRs合成：将19.5 mL十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液(0.1 M,30 ℃溶解)和0.5 mL四氯金酸水合物(HAuCl₄·3H₂O)溶液(0.01 M)混合好后，加入1.2 mL配置好的硼氢化钠溶液(0.01 M)，快速搅拌混合2分钟，然后在25℃-27℃下熟化5-10分钟，即得种子溶液；将19 mL CTAB溶液和0.16 mL硝酸银溶液 (0.01 M，现配现用)在25℃-27℃下混合10分钟，将1 mLHAuCl₄·3H₂O溶液加入其中，约5-10分钟后加入抗坏血酸溶液(0.1 M)，手摇混匀，即得生长溶液。最后将0.032 mL种子溶液加入生长溶液中，搅动1分钟左右，放入25℃-27℃水浴中生长，不要任何搅拌静置17个小时，生长后将金纳米棒在13000 rpm下离心12分钟，重复三次除去多余的CTAB，最后将金纳米棒分散在等浓度的CTAB里；

（2） GNRs-链霉亲和素制备：用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)来活化硫辛酸(TA)的羧基，然后与链霉亲和素的胺基结合，将GNRs与链霉亲和素进行端部结合的步骤是：首先将3 mL再分散的GNRs溶液逐滴加入6 mL稀释的链霉亲和素(2×10^-8M)溶液中，轻摇4小时；反应后，将结合的金棒在12000 rpm下离心10分钟，重复三次，每次离心都用含0.1%聚乙二醇(PEG)的CTAB (0.005 M ,pH 3.8)溶液进行悬浮，最后将修饰的GNRs重新分散在300 μL含0.1%PEG 的CTAB (0.005 M ,pH 3.8)溶液中，4℃下保存，制得GNRs-链霉亲和素。

本发明中，所述GNRs-链霉亲和素用于信号放大。

所述的MCH溶液为MCH原液用纯乙醇稀释配制而成的。

所述的磷酸缓冲液(PBS)，是将储备溶液Na₂HPO₄ (0.2 M)与NaH₂PO₄(0.2 M)以大约81/19的比例混合，使其pH值为7.4，然后加入0.9%的NaCl配置成的。

上述方法中链霉亲和素的活化方法为将6mL TA (0.0026 M, 乙醇配置)与8mL 链霉亲和素(2×10^-7M)混合，然后逐滴加入1.5 mL EDC并慢慢倒转混合，在室温下反应4小时。反应后，将其在PBS溶液(0.01 M, pH7.4)中4℃下透析三天，每天更换三次透析液。

所述的CTAB (0.005 M ,pH 3.8)是用1M HCl来调节pH值。

所述的链霉亲和素分子量约为60 kDa。

所述的加入的GNRs-链霉亲和素用10 mM PBS (pH=7.4)进行稀释。

所述的GNRs-链霉亲和素与生物素-miRNA探针有强的相互亲和作用。

上述方法的优点还在于，完成一个样品测试后，向SPR检测通道中分别注射2 mMNaOH和2 mM HCl洗脱结合的GNRs-链霉亲和素和miRNA后，即可测试下一个样品。

所述的不同浓度的目标miRNA浓度分别位于0.1～100 nM和低浓度0.1～100 pM范围内。

上述方法中检测miRNA的流速为8 μL/min，检测GNRs-链霉亲和素的流速为12 μL/min。

本发明还可用于特异性检测，在生物素-miRNA探针修饰的表面分别注射20 nM目标miRNA序列、单碱基错配序列和三碱基错配序列，记录其对应的SPR信号。

本发明的有益技术效果为，本发明公开了一种表面等离子体共振(SPR)传感芯片，此芯片可用于直接检测低分子量、超低浓度分子；并且公开了此SPR传感芯片的制备方法，此方法制备成本低、测试效果稳定；并公开了此传感芯片的应用，此芯片的使用方法简单、不需要特殊设备、并且测试原料可再生并且重复使用，而且测试效果良好。

附图说明

图1为miRNA基于SPR检测方法的示意图；

图2为未与链霉亲和素结合的GNRs透射电子显微镜照片及粒径分布图；

图3为与链霉亲和素结合的GNRs透射电子显微镜照片及粒径分布图；

图4为GNRs(红色曲线)和GNRs-链霉亲和素(黑色曲线)的紫外吸收光谱；

图5为GNRs，GNRs-链霉亲和素和链霉亲和素样品的红外吸收光谱；

图6为经1.45×10^-6M MCH封堵1小时后，先后注入2 nM目标片段(a)和2×10^-9 MGNRs-链霉亲和素(b)后的SPR响应图；插图：两种情况下a与b的SPR响应柱状图，PBS为缓冲液；

图7为SPR响应与不同目标片段浓度(0.1 nM, 1 nM, 2 nM, 10 nM, 50 nM,100nM)对数的柱状图；插图：SPR响应值与目标浓度对数的线性图；

图8为在不同浓度miRNA (0.1 pM, 5 pM, 10 pM, 50 pM, 100 pM )存在下加入固定浓度的GNRs-链霉亲和素的SPR响应图，直线代表没加入GNRs-链霉亲和素前的基线；插图：SPR响应值与目标浓度对数的线性图；

图9为在金膜表面分别组装0.1 μM生物素-miRNA探针后注射20 nM不同目标片段(完全互补链，单碱基错配链，三碱基错配链)的SPR响应图；插图：三种情况下的SPR柱状图。

具体实施方式

实施例1

1.在载玻片上喷镀厚度为为40～60 nm金膜的方法为：

（1）将BK7载玻片在80℃水虎鱼（H₂O₂与浓H₂SO₄体积比为1:3的混合液）中清洗30分钟，待冷却到室温后，载玻片用去离子水冲洗干净，N₂吹干；

（2）将清洗干净后的载玻片置于真空镀膜机中镀膜：

a）先镀一层2 nm厚的铬膜；

b）在铬膜上继续镀一层50 nm厚的金膜。

2. 芯片的制备：

（1）将干净的金膜用100%的乙醇冲洗然后再用去离子水洗净，最后用N₂气吹干备用。

（2）配制0.1 μM的生物素-miRNA探针溶液，其中包含2 μM TCEP的PBS溶液(0.1 M,pH 7.4)。

（3）将25 μL生物素-miRNA探针溶液滴到准备好的金膜上，在4℃下过夜。

（4）固定探针后，用少量PBS溶液洗去未结合的探针并用N₂气吹干，将得到的金膜用1.45×10⁻⁶M的MCH封堵1个小时，最后去离子水冲洗，N₂气吹干以备SPR检测。

3. SPR仪器校准步骤：

（1）装上修饰好的金膜后，将注射阀搬到Load模式，模式选择阀搬到Serial模式，装上含去离子水的注射器进行校准。

（2）调整流速为50 μL/min，向样品环中注入 150 μL 1%的乙醇，将阀搬到inject模式，使其SPR响应为60.0 mDeg，重复几次。

4. miRNA传感器性能检测实验步骤为：

（1）校准后，将注射器缓冲液换为PBS (0.1 M, pH 7.4 )，调整流速为8 μL/min，待基线平稳后，分别注入150 μL 0.1、1、2、10、50、100 nM的目标片段溶液(PBS, 0.1M)，调整反应时间为10分钟，同时记录SPR响应信号。

（2）测完一个浓度片段后向SPR检测通道中注射2 mM盐酸溶液2分钟，将（1）中结合到芯片上的目标片段洗脱，为检测下一个样品做准备。

（3）实验准备和仪器校准步骤与上面相同，调整流速为8 μL/min，然后用缓冲液PBS (10 mM, pH7.4)跑基线，待基线稳定后，分别注入0.1、5、10、50、100 pM的目标片段，调整反应时间为10分钟，记录SPR响应信号，接着缓冲液冲洗5分钟，待基线平稳后流动注射等浓度的GNRs-链霉亲和素溶液(2×10^-9M)，反应时间为5分钟，缓冲液冲洗，记录SPR响应信号。

a）（3）中检测miRNA时所用的缓冲液为10 mM PBS (pH=7.4)。

b)用10 mM的PBS (pH=7.4)将制备好的GNRs-链霉亲和素(2×10^-8M)稀释10倍。

（4）测完一个浓度片段后向SPR检测通道中先后注射2 mM氢氧化钠溶液和盐酸溶液各2分钟，将（3）中结合到芯片上的GNRs-链霉亲和素和目标片段洗脱，为检测下一个样品做准备。

（5）从图7和图8中可以看出，在0.1～100 nM和0.1～100 pM的范围内，miRNA浓度与SPR的信号成线性关系。

5. miRNA传感器选择性检测步骤为：

在生物素-miRNA探针修饰的表面分别注射20 nM目标miRNA序列、单碱基错配序列和三碱基错配序列，步骤与上述相同，分别记录其对应的SPR响应信号。

图1：生物素-miRNA探针首先修饰到金膜上形成发卡结构，当与其互补的目标片段存在时，两者杂交形成双链使生物素暴露出来，产生一个SPR信号，接着GNRs-链霉亲和素与生物素识别并结合到DNA*RNA复合物上，加强了传感器对miRNA的响应，从而导致了SPR信号增强。

如图2所示：GNRs的平均长度为42.1±1.2 nm，宽为14.3±0.9 nm，根据粒径分布图可知它的纵横比为3.5，约占全部粒子的36%。

从图3可以看出修饰了链霉亲和素后，GNRs边缘与图2相比更模糊，说明链霉亲和素对金棒的形貌有一定影响。从粒径分布图可以看出GNRs的纵横比有所增加。

从图4可以看出GNRs在修饰了链霉亲和素后纵向吸收峰蓝移了大约18 nm，表明了纵向吸收峰比横向吸收峰敏感，说明了GNRs表面附近折射率发生了变化并且GNRs没有发生聚集现象。

从图5可以看出，链霉亲和素-金棒和链霉亲和素在1638 cm⁻¹左右时有一个明显的特征峰，即C=C、C=N键的振动峰，而GNRs没有，表明链霉亲和素已成功修饰在GNRs上。

从图6可以看出加入GNRs-链霉亲和素后，由于生物素与亲和素的强相互作用，SPR响应大大增加，当注射的GNRs-链霉亲和素完全流出流动分析池后，GNRs-链霉亲和素从金膜表面洗脱下来，信号开始下降(～3567s)，可能是由于金膜在长时间冲洗下遭到破坏，因而导致了SPR信号的不断下降，从小图两种情况的比较可以看出，加入GNRs-链霉亲和素后的SPR信号变化b比不加时a增加了16倍。

由图7可以看出在GNRs-链霉亲和素不存在时，可以观察到目标片段浓度大于0.1nM的SPR响应，随着目标片段浓度的增加对应的SPR响应逐渐上升，在0.1～100 nM之间表现出很好的线性关系。

从图8可以看出加入GNRs-链霉亲和素后检测浓度达到了0.1 pM，并且在低浓度目标片段0.1～100pM间有线性关系。

从图9可以看出，单碱基错配序列（红色）的SPR响应是完全互补序列（黑色）SPR响应值的63%，而完全互补序列的SPR响应值是三碱基错配序列（绿色）SPR响应值的2.96倍。

实施例2

1.金膜的制备：

（2）将清洗干净后的载玻片置于真空镀膜机中镀膜：

a）先镀一层2 nm厚的铬膜；

b）在铬膜上继续镀一层50 nm厚的金膜。

2. 芯片的制备：同实施例1。

3、GNRs-链霉亲和素的制备

用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)来活化硫辛酸(TA)的羧基，然后与链霉亲和素的胺基结合，将GNRs与链霉亲和素进行端部结合的步骤是：首先将3mL再分散的GNRs溶液逐滴加入6 mL稀释的链霉亲和素(2×10^-8M)溶液中，轻摇4小时；反应后，将结合的金棒在12000 rpm下离心10分钟，重复三次，每次离心都用含0.1%聚乙二醇(PEG)的CTAB (0.005 M ,pH 3.8)溶液进行悬浮，最后将修饰的GNRs重新分散在300 μL含0.1%PEG 的CTAB (0.005 M ,pH 3.8)溶液中，4℃下保存，制得GNRs-链霉亲和素。

4、测试步骤

（1）将制备好的生物素-miRNA探针芯片置于分析池上，参照实施例1进行校准；

（2）分别注入150 μL 0.1、1、2、10、50、100 nM的目标片段溶液(PBS, 0.1M)，调整反应时间为10分钟，同时记录SPR响应信号；

（3）测完一个浓度片段后向SPR检测通道中注射2 mM盐酸溶液2分钟，将（2）中结合到芯片上的目标片段洗脱，为检测下一个样品做准备。

（4）分别注入0.1、5、10、50、100 pM的目标片段，调整反应时间为10分钟，记录SPR响应信号，接着缓冲液冲洗5分钟，待基线平稳后分别注射等浓度的GNRs-链霉亲和素溶液(2×10^-9M)，反应时间为5分钟，缓冲液冲洗，记录SPR响应信号。

a）（4）中检测miRNA时所用的缓冲液为10 mM PBS (pH=7.4)。

（5）测完一个浓度片段后向SPR检测通道中先后注射2 mM氢氧化钠溶液和盐酸溶液各2分钟，将（4）中结合到芯片上的GNRs-链霉亲和素和目标片段洗脱，为检测下一个样品做准备。

实施例3

利用实施例1得到的miRNA传感器进行特异性检测的步骤为：

（1）在生物素-miRNA探针修饰的表面分别注射20 nM目标miRNA序列、单碱基错配序列和三碱基错配序列，步骤与实施例2中的4相同，分别记录其对应的SPR响应信号。

（2）传感器的再生步骤参照实施例2。

Claims

1.一种表面等离子体共振(SPR)传感芯片，其特征在于，所述SPR传感芯片的结构为，先在基质玻璃片表面依次镀上铬膜和金膜，在所镀的金膜表面修饰生物素-miRNA探针，所述修饰生物素-miRNA探针用三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原巯基，用6-巯基1-己醇(MCH)封堵。

2.如权利要求1所述传感芯片的制备方法，其特征在于，首先在基质玻璃片上制备厚度为1～3nm的铬膜，在其上制备厚度为40～60nm的金膜；然后在金膜上固定探针，将包含三(2-羧乙基)膦(TCEP)的磷酸缓冲液(PBS)的生物素-miRNA探针滴到金膜上，过夜；固定探针后，用PBS溶液洗去未结合的探针，将得到的金膜用6-巯基1-己醇(MCH)封堵后冲洗，得到SPR传感芯片。

3.根据权利要求2所述传感芯片的制备方法，其特征在于，所述金膜上固定探针的方法为，将25μL 0.1μM的生物素-miRNA探针滴到金膜上，其中包含0.1M,pH 7.4磷酸缓冲液(PBS)，在PBS中含有2μM三(2-羧乙基)膦(TCEP)。

4.根据权利要求2所述传感芯片的制备方法，其特征在于，固定探针经过清洗后，用1.45×10^-6M的6-巯基1-己醇(MCH)封堵。

5.如权利要求1所述传感芯片的应用，其特征在于，所述SPR传感芯片与金纳米棒(GNRs)-链霉亲和素用于检测miRNA、DNA、蛋白质、抗原的含量。

6.根据权利要求5所述传感芯片的应用，其特征在于，所述miRNA含量的检测，是将SPR传感芯片置于SPR检测通道上、将不同浓度的目标miRNA注射到流动分析池，miRNA与生物素-miRNA探针杂交形成双链使生物素暴露出来，记录其对应的SPR信号响应；然后在低浓度miRNA时，注入GNRs-链霉亲和素，记录其对应的SPR信号响应，根据标准曲线，确定miRNA的浓度；低浓度miRNA时所用的缓冲液是PH值为7.4的10mM PBS。

7.根据权利要求6所述传感芯片的应用，其特征在于，所述检测结束后，向SPR检测通道中分别注射2mM的NaOH和2mM的HCl，用于洗脱结合的GNRs-链霉亲和miRNA，即可测试下一个样品。

8.根据权利要求5所述传感芯片的应用，其特征在于，所述方法可测量的miRNA低浓度为0.1～100pM。

9.根据权利要求5所述传感芯片的应用，其特征在于，所述金纳米棒、(GNRs)-链霉亲和素的制备步骤为：

(1)GNRs合成：将19.5mL、0.1M，30℃溶解十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液和0.5mL、0.01M四氯金酸水合物(HAuCl₄·3H₂O)溶液混合好后，加入1.2mL、0.01M配置好的硼氢化钠溶液，快速搅拌混合2分钟，然后在25℃-27℃下熟化5-10分钟，即得种子溶液；将19mL CTAB溶液和0.16mL、0.01M现配现用硝酸银溶液在25℃-27℃下混合10分钟，将1mLHAuCl₄·3H₂O溶液加入其中，约5-10分钟后加入0.1M的抗坏血酸溶液，手摇混匀，即得生长溶液；最后将0.032mL种子溶液加入生长溶液中，搅动1分钟左右，放入25℃-27℃水浴中生长，不要任何搅拌静置17个小时，生长后将金纳米棒在13000rpm下离心12分钟，重复三次除去多余的CTAB，最后将金纳米棒分散在等浓度的CTAB里；

(2)GNRs-链霉亲和素制备：用1‐乙基‐(3‐二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)来活化硫辛酸(TA)的羧基，然后与链霉亲和素的胺基结合，将GNRs与链霉亲和素进行端部结合的步骤是：首先将3mL再分散的GNRs溶液逐滴加入6mL、2×10^-8M稀释的链霉亲和素溶液中，轻摇4小时；反应后，将结合的金棒在12000rpm下离心10分钟，重复三次，每次离心都用含0.1％、0.005M、PH为3.8聚乙二醇(PEG)的CTAB溶液进行悬浮，最后将修饰的GNRs重新分散在300μL、0.005M、PH为3.8含0.1％PEG的CTAB溶液中，4℃下保存，制得GNRs-链霉亲和素。