CN104962633A - 一种基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法,属于核酸分析领域。本发明结合杂交链聚合反应和卟啉沟槽嵌入技术制备了卟啉-dsDNA长链聚合纳米级高效仿生催化剂,利用该催化剂催化4-氯-1-萘酚和双氧水的氧化还原沉积反应,得到显著的SPR增强信号。本发明检测核酸时具有灵敏度高、价格低廉、制备简单、稳定性和重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于核酸分析领域,具体涉及一种基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法。
背景技术
癌症是死亡率第二高的疾病且死亡率仍在增加,而对此类疾病没有特效治疗药物,因此探索致癌基因早期检测的高灵敏核酸分析策略,尤其是针对低生理水平特定DNA/RNA序列的分析方法,显得非常必要。表面等离子体共振(SPR)技术是一种简单、直接的传感技术,是表面等离子体在金属和电介质的交界面上形成的一电荷层,在电磁波的激励下,表面等离子体发生共振现象。自80年代该技术首次运用于抗体与其抗原相互反应的测定后,已广泛应用于生物传感器领域并迅速渗透至基础生命科学研究中。该技术是一种基于质量变化的传感器,可方便灵活地应用于致癌基因的核酸检测。
现有的基于SPR核酸传感器,都是通过设计捕获探针直接和核酸杂交或利用纳米材料做标记来增强信号响应。如Homola课题组利用核酸分子直接增大SPR响应检测DNA,文献1:(Chemical Reviews.2008.108,462–493.),这种方法可直接、适时地进行核酸检测;Corn研究团队设计的纳米金正方形的合结构增强SPR信号,文献2:(J.Am.Chem.Soc.2011,133,4271-4273.),其响应信号有很大的提高且检测限低于飞摩尔级别;上述方法存在以下缺陷:
(1)核酸检测方法灵敏度低很难达到临床样品检测的要求,结构不够稳定重复性差,如文献1。
(2)纳米材料价格昂贵,合成需要特殊的设备,生物功能化困难且纳米金生产和纳米形貌控制复杂,制约其批量生产和应用,如文献2。
(3)在上述文献1和2的检测方法中,主要集中在以金属元素如金、银等合成特定形貌的纳米材料来增强SPR芯片金膜界面的位阻效应增强信号,易造成污染,且这些方法不具有通用性,因此难以广泛推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种简易、价廉的表面等离子体共振技术的信号放大技术,并将其应用于低浓度核酸的检测。
实现本发明目的的技术解决方案为:一种基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法,包括如下步骤:
(1)先以EDC和NHS的缓冲液活化的羧基化的SPR芯片表面,再用缓冲液配制氨基末端的cDNA序列为5’-NH2-TCA GCG GGG AGG AAG GGA GTA AAG TTAATA-3’溶液,将氨基末端的cDNA溶液加入SPR芯片表面,将cDNA以酰胺反应组装在SPR芯片表面,乙醇胺封闭界面作为传感界面对目标核酸的进行检测;
(2)加入目标DNA序列为5’-TCA GCG GGG AGG AAG GGA GTA AAG TTAATA-3’缓冲液与传感界面进行杂交反应得到Au/cDNA/目标DNA组装层,实现对目标DNA的结合捕捉,完成检测步骤;
(3)用缓冲液分别配制序列为5’-CTT CCT CCC CGC TGA CAA AGT TCA GCGGGG-3’的颈环DNA H1溶液和序列为5’-TCA GCG GGG AGG AAG CCC CGC TGAACT TTG-3’的颈环DNA H2溶液,溶液浓度均为5~10μM,将两种溶液混合后加热至90~95℃,维持5~10分钟,再迅速用冰水浴冷却至室温,即可完成杂交链循环反应形成长链dsDNA,将其与步骤2得到Au/cDNA/目标DNA组装层反应Au/cDNA/dsDNA组装层,在加入铁卟啉的缓冲液形成Au/cDNA/铁卟啉-dsDNA仿生催化剂;
(4)配制10~30mM 4-氯-1-萘酚乙醇溶液,再取1~2mL 4-氯-1-萘酚乙醇溶液与6~8mL缓冲液和2~5μL双氧水混合均匀作为信号放大液,加入步骤3得到的Au/cDNA/铁卟啉-dsDNA仿生催化剂表面进行氧化还原沉积反应,用SPR仪记录其信号响应。
其中,步骤(1)中所述的羧基化的SPR镀金片表面是通过10~30mM巯基丙酸(MPA)浸泡SPR芯片10~15小时。
步骤(1)中,所述的氨基末端的cDNA溶液的浓度为1~5μM;乙醇胺浓度为10~30mM。
步骤(2)中,所述的目标DNA缓冲液浓度为1~105fM。
步骤(3)中,所述的铁卟啉为FeTMPyP。
步骤(1)、(2)、(3)和(4)中,采用的缓冲液均为磷酸缓冲液,其浓度为0.5~1M;pH为7.2~7.4;内含0.2~0.25M氯化钠。
本发明与现有技术相比,其显著优点是:
(1)该核酸检测方法对癌症基因DNA检测响应灵敏、性质稳定、特异性高、检测限达亚飞摩尔水平。
(2)该核酸检测方法利用简单的化学催化反应实现信号放大,成本低廉,操作便易,检测过程不会造成环境污染。
(3)该核酸检测方法不需要合成金属元素的特定形貌的纳米材料,通过简单的生物和化学反应即可实现,通用性好,易于推广应用。
(4)该检测方法不需要进行生物标记,通过仿生催化沉积即可实现检测,生物相容性好,可动态监测。
附图说明
图1为基于SPR的核酸检测方法示意图。
图2为实施例2中0-1分别为M、H1、H2、HCR1和HCR2的琼脂糖电泳图。
图3为实施例3中HCR过程的SPR响应,a为目标DNA杂交后的SPR响应,b为HCR反应后的SPR响应。
图4为实施例3中HCR产物dsDNA在金片表面组装3D AFM图。
图5为实施例4中(A)a、b、c分别为FeTMPyP、dsDNA和FeTMPyP-dsDNA的CD吸收峰;(B)1-7分别为dsDNA、FeTMPyP和不同浓度dsDNA混合FeTMPyP的UV吸收峰,内插为结合常数计算图。
图6为实施例5中(A)Fe元素XPS数据图,a为FeTMPyP,b为FeTMPyP-dsDNA,c为FeTMPyP-dsDNA催化信号放大液;(B)Cl元素XPS数据图,a为C1N,b为FeTMPyP-dsDNA催化信号放大液。
图7为实施例5中FeTMPyP-dsDNA催化信号放大液效果的3D AFM表征。
图8为实施例6基于SPR核酸检测方法步骤图
图9为实施例6中不同浓度目标DNA对应SPR信号响应图及对应的标准曲线图。
图10为实施例7中为错配组DNA对应的SPR信号响应。
具体实施方式
一种基于表面等离子体共振信号放大技术,以自组装的结合cDNA作为捕获探针,杂交检测低浓度目标核酸。借助于杂交链循环反应、卟啉分子沟槽嵌入方式技术和仿生催化沉积技术实现SPR信号放大,最终实现对低浓度核酸的超灵敏检测,其过程如图1。
上述基于SPR的核酸检测方法步骤如下:
(1)先以EDC和NHS缓冲液活化的羧基化的SPR芯片表面,再用缓冲液配制氨基末端的cDNA序列为5’-NH2-TCA GCG GGG AGG AAG GGA GTA AAG TTA ATA-3’溶液,将氨基末端的cDNA溶液加入SPR芯片表面,将cDNA以酰胺反应组装在SPR芯片表面,乙醇胺封闭界面作为传感界面对目标核酸的进行检测;
(2)加入目标DNA序列为5’-TCA GCG GGG AGG AAG GGA GTA AAG TTAATA-3’缓冲液与传感界面进行杂交反应得到Au/cDNA/目标DNA组装层,实现对目标DNA的结合捕捉,完成检测步骤;
(3)用缓冲液配制颈环DNA H1和颈环DNA H2其序列分别为5’-CTT CCT CCCCGC TGA CAA AGT TCA GCG GGG-3’和5’-TCA GCG GGG AGG AAG CCC CGC TGAACT TTG-3’至5~10μM混合加热至90~95℃,维持5~10分钟,再迅速用冰水浴冷却至室温,即可完成杂交链循环反应形成长链dsDNA,将其与步骤2得到Au/cDNA/目标DNA组装层反应Au/cDNA/dsDNA组装层,在加入铁卟啉缓冲液形成Au/cDNA/铁卟啉-dsDNA仿生催化剂;
(4)配制10~30mM 4-氯-1-萘酚乙醇溶液,再取1~2mL 4-氯-1-萘酚乙醇溶液与6~8mL缓冲液和2~5μL双氧水混合均匀作为信号放大液,加入步骤3得到的Au/cDNA/铁卟啉-dsDNA仿生催化剂表面进行氧化还原沉积反应,用SPR仪记录其信号响应。
下面结合附图和实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
基于SPR的核酸检测方法以羧基化的SPR镀金片为载体,EDC和NHS活化羧基基团,再通过酰胺化反应将氨基末端化cDNA和乙醇胺组装到镀金芯片表面作为捕获探针并封闭界面,具体过程如下:
(1)裸SPR芯片在水虎鱼酸(浓H2SO4:浓H2O2=1:3)浸泡10分钟后,然后再用沸腾的混合液(浓氨水:浓H2O2:超纯水=1:1:4)维持30min,最后用超纯水和乙醇冲洗两次后N2吹干;接着,将处理后的金片在10~30mM MPA浸泡10~15小时进行前处理,乙醇冲洗后N2吹干备用。
(2)用(0.4M EDC/0.1M NHS)浸泡镀金片30分钟,活化金片表面羧基。用1~5μM氨基末端化的cDNA溶液和4~10μM乙醇胺浸泡10~12小时,完成cDNA在金片表面的自组装并封闭表面消除非特异性吸附,得到Au/cDNA组装层。
实施例2
利用杂交链循环反应生成长链dsDNA,并验证其性质和结构特征:
首先利用杂交链循环反应生成长链dsDNA,合成步骤为:
(1)利用缓冲液(0.5~1M磷酸氢二钾和磷酸二氢钾加入0.2~0.25M氯化钠,调整pH至7~7.5;下同)溶解颈环DNA(H1和H2)溶液。
(2)稀释颈环DNA(H1、H2)至10μM,各取100μL混合后快速升温至90~95℃,维持5~10分钟,取出后用冰水浴迅速冷却至室温,即可完成杂交链循环反应,得到长链dsDNA。
(3)采用琼脂糖电泳验证HCR反应产物:配制2.5%琼脂糖凝胶,分别将H1、H2及HCR反应后产物dsDNA加入电泳槽内。以8V/cm施加电压,电泳时间为70分钟,以溴化乙锭染色,电泳结束后在荧光成像仪下观察电泳条带。
如图2所示,结果显示泳道1和2分别代表H1和H2的结果,其都有明亮的条纹,展示其结构有相同的核酸长度和浓度。HCR反应的dsDNA用很明显离散条带,展示了HCR反应后长链DNA形成,且长度不均匀。结果显示HCR反应的发生和长链dsDNA的合成。
实施例3
利用SPR技术表征HCR反应过程,其反应过程如下:
(1)用100uL缓冲液冲洗Au/cDNA组装层表面,平衡后得到基线a;加入100uL缓冲液稀释的1uM目标DNA溶液,与Au/cDNA组装层反应1~3小时得到Au/cDNA/目标DNA组装层,用缓冲液冲洗达到平衡基线b。
(2)用缓冲液稀释颈环DNA(H1、H2)至5~10μM,各取100μL混合后快速升温至90~95℃,维持5~10分钟,取出后用冰水浴冷却至室温后迅速加入Au/cDNA/目标DNA组装层内,反应10~12小时得到Au/cDNA/dsDNA组装层,用缓冲液冲洗达到平衡基线c。
如图3所示,结果显示加入目标DNA后,由于其可以和cDNA杂交,基线b相比基线a增加约90m°,根据SPR基本理论,固定在SPR镀金片表面的目标DNA浓度为7.9506×10-5nmol mm-2。当H1和H2进行HCR反应生成dsDNA后,其对应基线c相比基线b增加约280m°,相应dsDNA浓度为1.1945×10-4nmol mm-2。结果进一步显示单个cDNA点对应的HCR反应循环2次左右,证明杂交后目标DNA序列可引发HCR反应。图4显示3D-AFM表征HCR产物dsDNA,镀金片表面有许多独立位点和锥形体且其高度变化不统一,不同HCR循环过程中dsDNA长度不统一,表明基于SPR核酸检测平台有很好的灵活性和选择性。结合电泳结果显示:与金片表面的cDNA杂交后的目标DNA暴露的5’末端序列可以激发HCR反应,且松散的dsDNA长度不均匀。
实施例4
合成卟啉-dsDNA高效仿生催化剂,并研究卟啉与dsDNA的结合作用和结合常数,将实施例2合成的dsDNA用缓冲液浓缩至100μM,每次取5μL依次加入5μM FeTMPyP溶液。如图5显示:用圆二色光谱仪(CD)和紫外光谱仪(UV)对FeTMPyP-dsDNA高效仿生催化剂进行表征,结果显示游离的FeTMPyP没有特征的CD吸收,dsDNA的右手β-折叠在248nm和282nm处有明显CD吸收;当dsDNA和FeTMPyP结合后吡啶基团与dsDNA碱基结合导致其手性吸收下降,同时CD吸收峰转换为422nm,展示了dsDNA和FeTMPyP成功结合。同时游离的FeTMPyP的Sort带吸收峰为424nm,随着dsDNA浓度的增加,其吸收强度下降且Sort带吸收峰蓝移为422nm,同CD吸收峰也同样蓝移进一步证明了FeTMPyP-dsDNA结构的形成。因此总结UV和CD光谱吸收峰的变化证明了FeTMPyP成功地嵌入到dsDNA双链的大沟槽内。
设定其结合常数为K,其计算公式为:
εF-εA=(εB–εF)/([DNA]·K)+Δε
其中,εA为测定的卟啉混合物摩尔吸光率,εF和εB为为游离卟啉的摩尔吸光系数及结合后卟啉的摩尔吸收光系数,Δε=εF-εB。通过计算测定得到K和εB分别为6.49×105M-1和1.64×105M-1cm-1。对比其他卟啉和dsDNA双链的结合常数,FeTMPyP和dsDNA双链之间存在较强的结合作用力。
实施例5
在镀金芯片表面组装卟啉-dsDNA高效仿生催化剂,并研究其对信号放大溶液的氧化还原沉积反应的催化效果。
(1)用缓冲液配制0.5μM颈环DNA(H1、H2)混合液,快速升温至90~95℃,维持5~10分钟,在冰水浴下冷却至室温备用;用缓冲液液配制5μM FeTMPyP和混合液充分混合后与Au/cDNA/目标DNA组装层反应10~12小时,得到Au/cDNA/FeTMPyP-dsDNA组装层。
(2)配制信号放大溶液:取10~50mg 4-氯-1-萘酚固体加入10~15mL乙醇溶液,再取1~2mL乙醇溶液加入6~8mL缓冲液和2~5μL双氧水原液混合均匀。
(3)分别将信号放大溶液加入Au/cDNA/FeTMPyP-dsDNA组装层表面和实施例4所制备的卟啉-dsDNA高效仿生催化剂溶液中。用三维原子力显微镜(3D AFM)和X射线光电子能谱分析(XPS)对催化反应进行表征。
如图6A显示:XPS峰谱中Fe2p中2p3/2和2p1/2能量谱图,对比FeTMPyP的强度,当FeTMPyP与dsDNA结合后其结合能更低价位移动,证明卟啉-dsDNA的结构更稳定;在卟啉-dsDNA催化下,C1N的电子转移至H2O2后,BC1沉淀层包裹在表面导致Fe2p消失。图6B显示C1N中Cl1s结合能,在卟啉-dsDNA结构催化C1N和H2O2反应后,其结合能向高位结合能转移0.25eV,当C1N转化为BC1后,取代基Cl对π-共轭结构能量的影响。总之,以上分析证明该仿生催化沉积反应可以发生,且其氧化还原反应方程式为:
4-Chloro-1-naphthol(C1N)+H2O2→Benzo-4-chlorohexadienon(BC1)↓+H2O
如图7显示:3D AFM成像技术同样用来研究适时卟啉-dsDNA对信号放大液的氧化还原反应。对比,在卟啉-dsDNA催化C1N和H2O2反应后,金片表面高度明显增加其表面更加粗糙,展现介质表面BC1的沉积。通过上述数据结构可说明以下几点BC1沉淀层覆盖在卟啉-dsDNA表面掩盖Fe2p峰而使其很难被观察,同时大量的FeTMPyP作为仿生催化辅基成功地和dsDNA重组,其对信号放大液高效地催化。
实施例6
本发明构建基于SPR的核酸检测方法,具体检测步骤为为:
(1)取100μL的0.01μM~1.0fM如表1中的目标DNA与实施例1所制备的Au/cDNA组装层杂交,室温反应1~3小时,用缓冲液冲洗后得到基线。
(2)用缓冲液配制0.5μM颈环DNA(H1、H2)混合液,快速升温至90~95℃,维持5~10分钟,在冰水浴下冷却至室温备用;用缓冲液液配制5μM FeTMPyP和混合液充分混合后与Au/cDNA/目标DNA组装层反应10~12小时,得到Au/cDNA/FeTMPyP-dsDNA组装层。
(3)取100μL实施例5所配制的信号放大溶液与步骤2得到的组装层进行氧化还原沉积反应,用SPR仪器软件记录10分钟的SPR响应。
核酸检测步骤表征如图8。裸SPR镀金芯片用缓冲液做基线a,随着1μM cDNA和乙醇胺的组装其基线也随之增加基线b,目标DNA与cDNA杂交反应后其基线也增加至基线c,HCR反应形成dsDNA与卟啉结合形成卟啉-dsDNA,其基线也增大至基线d。最后当卟啉-dsDNA催化ClN与H2O2的氧化还原沉淀反应,其巨大的质量引起信号响应剧烈增加,说明该核酸检测方法十分有效。图9所示该核传感器可实现癌基因核酸的超灵敏检测,其检测线性范围为0.1nM~1.0fM。其线性良好,检测下限较低。
实施例7
检验实施例6所述的检测方法对癌症基因检测的特异性和稳定性,具体方法如下:
(1)取100μL的1pM如表1中的错配组(Single-Base Mismatch、Two-BaseMismatch、Three-Base Mismatch)分别与实施例1所制备Au/cDNA组装层杂交,室温反应1~3小时,用缓冲液冲洗后得到基线。
(2)用缓冲液配制0.5μM颈环DNA(H1、H2)混合液,快速升温至90~95℃,维持5~10分钟,在冰水浴下冷却至室温备用;用缓冲液液配制5μM FeTMPyP和混合液充分混合后与Au/cDNA/目标DNA组装层反应10~12小时,得到Au/cDNA/FeTMPyP-dsDNA组装层。
(3)取100μL实施例1所制配制信号放大溶液与步骤2得到的组装层进行氧化还原反应,用SPR仪器软件记录10分钟的SPR响应。
图10所示b,c,d,分别为相同浓度的单碱基(T1)、双碱基(T2)和三碱基(T3)错配DNA对应的信号响应,单碱基(T1)、双碱基(T2)和三碱基(T3)错配DNA与完全互补碱基序列对比的相对强度分别为29.8%、23.1%和9.85%,显示该核酸检测方法有很好的选择性和稳定性。
表1基于SPR的核酸检测方法内含各引物表
Claims (6)
1.一种基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)先以EDC和NHS的缓冲液活化的羧基化的SPR芯片表面,再用缓冲液配制氨基末端的cDNA序列为5’-NH2-TCA GCG GGG AGG AAG GGA GTA AAG TTAATA-3’溶液,将氨基末端的cDNA溶液加入SPR芯片表面,将cDNA以酰胺反应组装在SPR芯片表面,乙醇胺封闭界面作为传感界面对目标核酸的进行检测;
(2)加入目标DNA序列为5’-TCA GCG GGG AGG AAG GGA GTA AAG TTAATA-3’缓冲液与传感界面进行杂交反应得到Au/cDNA/目标DNA组装层,实现对目标DNA的结合捕捉,完成检测步骤;
(3)用缓冲液分别配制序列为5’-CTT CCT CCC CGC TGA CAA AGT TCA GCGGGG-3’的颈环DNA H1溶液和序列为5’-TCA GCG GGG AGG AAG CCC CGC TGAACT TTG-3’的颈环DNA H2溶液,溶液浓度均为5~10μM,将两种溶液混合后加热至90~95℃,维持5~10分钟,再迅速用冰水浴冷却至室温,即可完成杂交链循环反应形成长链dsDNA,将其与步骤2得到Au/cDNA/目标DNA组装层反应Au/cDNA/dsDNA组装层,在加入铁卟啉的缓冲液形成Au/cDNA/铁卟啉-dsDNA仿生催化剂;
(4)配制10~30mM 4-氯-1-萘酚乙醇溶液,再取1~2mL 4-氯-1-萘酚乙醇溶液与6~8mL缓冲液和2~5μL双氧水混合均匀作为信号放大液,加入步骤3得到的Au/cDNA/铁卟啉-dsDNA仿生催化剂表面进行氧化还原沉积反应,用SPR仪记录其信号响应。
2.如权利要求1所述的基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的羧基化的SPR芯片表面是将10~30mM巯基丙酸浸泡SPR芯片10~15小时实现。
3.如权利要求1所述的基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的氨基末端的cDNA溶液的浓度为1~5μM;乙醇胺浓度为10~30mM。
4.如权利要求1所述的基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的目标DNA缓冲液浓度为1~105fM。
5.如权利要求1所述的基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法,其特征在于,步骤(3)中,所述的铁卟啉为FeTMPyP。
6.如权利要求1所述的基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法,其特征在于,步骤(1)、(2)、(3)和(4)中,采用的缓冲液均为磷酸缓冲液,其浓度为0.5~1M;pH为7.2~7.4;内含0.2~0.25M氯化钠。
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2015
- 2015-07-03 CN CN201510388979.9A patent/CN104962633A/zh active Pending
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