KR20170090034A - 삽입제를 이용한 국소표면플라즈몬공명 기반 고감도 압타머 센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 압타머 센서는, 금속 나노입자가 형성되어 있는 기판, 상기 금속 나노입자 표면에 부착되어 검출하고자 하는 표적물질과 선택적으로 반응하여 구조체를 형성하는 압타머 및 상기 압타머와 표적물질 반응시 상기 압타머와 표적물질 사이에 삽입되어 상기 금속 나노입자 측으로 응집시켜 국소 표면 플라즈몬 공명 현상에 의한 흡수스펙트럼이 이동을 증가시키는 삽입제(intercalation agent)를 포함한다.

Description

삽입제를 이용한 국소표면플라즈몬공명 기반 고감도 압타머 센서{LSPR-based high sensitivity aptamer sensor using intercalation agent}
본 발명은 압타머 바이오 센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 민감도가 향상된 국소표면플라즈몬공명 현상을 이용한 압타머 센서에 관한 것이다.
생체분자를 신속히 측정하는 기술은 바이오센서의 개발의 기초연구와 함께 의료현장에서도 빠질 수 없는 기술로 인식되어 왔다. 인간 게놈의 분석에 의해 게놈과 질환의 관계가 보다 선명하게 밝혀지고 있는 지금, 의료현장에서는 간단하면서 보다 알기 쉬운 유전자 진단이 요구되며, 그에 따른 기술 개발이 진행되고 있다. 생체 분자 자체의 상호작용을 분석하는 것은 중요하다는 것은 말할 것도 없으나, 나노 스케일의 생체분자를 관찰하는 것은 어려운 일이다. 따라서, 최근에는 나노 크기의 공간에서 일어나는 현상을 관찰하기 위해 금속 나노입자와 같은 플라즈모닉스(plasmonics) 나노재료와 생체분자를 결합시켜서 관찰하는 광학 바이오센서에 대한 연구가 증가하고 있다. 이것은 나노테크놀로지의 발전에 의해 금속 나노입자와 같은 플라즈모닉스 나노재료의 제어가 가능하게 되었기 때문이다. 플라즈모닉스 나노재료는 단순한 광학재료로서 사용되는 것뿐만 아니라 바이오센서 분석의 도구로서도 활용이 기대되고 있다.
금속 나노입자와 같이 국소적인 표면에 존재하는 재료에 다양한 파장을 갖는 빛을 조사하면 벌크 금속과는 달리 금속 나노입자 표면에 분극이 발생하고 전기장의 강도를 증대하는 특이한 성질을 나타낸다. 분극에 의해 형성된 전자들은 집단(플라즈몬, plasmon)을 이루게 되며, 금속 나노입자의 표면에서 국소적으로 진동하게 되는데, 이러한 현상을 국소 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance : LSPR) 이라고 한다. 이러한 현상에 대해서는 오래 전부터 Mie 등에 의해 이론적으로 계산되고 예측되어 왔으나 최근 들어 나노 가공기술이 발전하게 되면서 다양한 센서와 결합시키는 유용한 연구결과들이 발표되고 있다.
표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance : SPR)과 마찬가지로 LSPR 광학특성은 나노입자 근처에서 발생하는 유전율 변화 즉, 굴절율 변화에 민감하게 응답하기 때문에 비교적 고감도로 간편하게 생체분자 상호작용의 분석이 가능하다. 따라서 LSPR 광학특성을 검출 원리로 하여 단일 바이오칩 위에 여러 가지 리간드를 고정화하는 것으로서, 종래의 바이오칩보다 다중검체의 동시 분석이 가능하기 때문에 비표지 바이오칩에서 요구되고 있는 온사이트 모니터링(on-site monitoring)도 가능하게 된다.
한편, SPR 현상이 전자가 풍부한 금속필름에서 발생하는 반면, LSPR 현상은 비교적 전자의 양이 제한된 나노미터 크기의 금속 입자의 표면에서 발생하기 때문에 금속 내 전자의 진동이 약하고, 전자의 진동으로 발생되는 전기장의 크기가 작다. 작은 전자기장으로 인하여 물질을 감지할 수 있는 범위가 작아지게 되며, 결국 표적물질을 감지할 고 있는 민감도가 떨어지게 된다. 특히 분자량이 작은 저분자 물질 측정시 전저기장이 받는 영향이 작아 감도 부분에서 한계가 분명하다. 따라서, 저분자 물질 측정시에 민감도를 향상시키는 기술이 필요한 실정이다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 압타머와 표적물질과의 결합에 의해 변화하는 금속 나노입자의 국소 표면 플라즈몬 공명 현상에 의한 흡수스펙트럼의 변화량을 증가시켜 민감도가 향상된 압타머 센서를 제공하는 데 있다.
위 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머 센서는, 금속 나노입자가 형성되어 있는 기판, 상기 금속 나노입자 표면에 부착되어 검출하고자 하는 표적물질과 선택적으로 반응하여 구조체를 형성하는 압타머 및 상기 압타머와 표적물질 반응시 상기 압타머와 표적물질 사이에 삽입되어 상기 금속 나노입자 측으로 응집시켜 국소 표면 플라즈몬 공명 현상에 의한 흡수스펙트럼의 이동을 증가시키는 삽입제(intercalation agent)를 포함한다.
상기 금속 나노입자는 금, 백금 또는 은일 수 있다.
상기 삽입제(intercalation agent)는 버버린일 수 있다.
상기 표적물질과 상기 압타머에 의해 형성된 결합체는 G-사중구조(G-quadplex structure)일 수 있다.
상기 표적물질은 오크라톡신 A(OTA) 또는 아플라톡신 B1(AFB1)일 수 있다.
상기 표적물질을 검출할 수 있는 범위는 1pM ~ 10 μM 일 수 있다.
본 발명에 의한 압타머 센서에 따르면 표적물질의 감지 범위가 증가하여 민감도와 탐지범위를 크게 증가시킬 수 있다. 특히, 버버린을 삽입제로 사용하는 경우에는 기존의 1 nM ~ 1 μM의 감지 범위가 1 pM ~ 10 μM의 범위로 늘어났고, 민감도 면에서 약 1000배 증가하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머 센서를 간단하게 나타낸 모식도이다.
도 2는 삽입제의 종류에 따른 압타머 센서의 LSPR 흡수 스펙트럼의 적색이동량을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머 센서의 버버린의 존부에 따른 LSPR 흡수 스펙트럼의 적색이동량을 나타내는 그래프이다.
여기서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
다르게 정의하지는 않았지만, 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고, 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 의한 압타머 센서에 대하여 설명하기로 한다.
표면 플라즈몬 공명 현상이 전자가 풍부한 금속 필름에서 발생하는 반면, 국소 표면 플라즈몬 공명 현상은 비교적 전자의 양이 제한되어 있는 나노미터 크기의 금속에서 발생하기 때문에 금속 내 전자의 진동이 약하고 전자의 진동으로 발생되는 전자기장의 크기가 작다. 작은 전자기장으로 인하여 표적분자를 감지할 수 있는 탐지 범위가 작아지게 되며, 결국 표적물질을 감지할 수 있는 민감도가 떨어지게 된다. 특히 분자량이 작은 물질들을 측정하는 경우에는 전자기장이 받는 영향이 작아 민감도 부분에서 한계를 드러낸다.
본 발명자는 이러한 민감도를 향상시키고자 실험을 거듭하여 금속 나노입자의 표면에 형성되어 있는 압타머와 표적물질이 형성하는 G-사중구조(G-quadplex sturucture)의 결합체가 금속 나노입자 측으로 보다 근접하게 응집되는 경우에 금속 나노입자의 국소 표면 플라즈몬 공명 현상에 의한 흡수 스펙트럼의 이동량이 증가하고 이에 따라 압타머 센서의 민감도가 향상되는 것을 알게 되었다. 따라서 이러한 현상을 착안하여 압타머와 표적물질을 결합하여 G-사중구조(G-quadplex sturucture)의 결합체를 형성할 때 금속 나노입자 표면의 굴절률 변화를 크게 하기 위해 상기 결합체에 추가적으로 별도의 분자가 결합할 수 있도록 삽입제(intercalation agent)를 도입하여 본 발명을 완성하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머 센서를 간단하게 나타낸 모식도이다. 도 1에 도시된 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머 센서는 기판과 압타머, 삽입제을 포함할 수 있다. 기본적으로 기판에 금속 나노입자가 형성된다. 이러한 금속나노입자는 국소 표면 플라즈마 공명 현상을 일으킬 수 있는 금속입자가 사용될 수 있으며, 금, 은, 또는 백금 입자가 사용될 수 있다. 본 실시예에서는 금 나노입자를 작은 막대 형태(금 나노로드, GNR)로 형성하여 유리기판에 도입하였다. 금 나노로드의 표면에 검출하고자 하는 표적 물질(target)과 선택적으로 반응하여 구조체를 형성시킬 수 있는 압타머가 고정된다. 압타머는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표절물질에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)에 해당한다. 압타머 사이에는 일정한 공간을 형성할 수 있도록 Poly-T3 가닥이 위치될 수 있다. 이러한 Poly-T3 가닥들은 압타머와 표적물질에 의해 결합체가 형성될 때 일정한 공간을 유지하는 역할을 수행한다. 본 실시예에서 사용되는 압타머는 OTA 압타머 (5'-SH-TTTTTGATCGG GTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA) and AFB1 압타머 (5'-SH-TTTTTGT TGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA)가 사용되었으나, 검출하고자 하는 표적물질에 따라 다양하게 변화시킬 수 있다. 또한, 압타머와 표적물질이 결합하여 결합체를 이룰 때 이 결합체에 더 많은 분자를 응집시킬 수 있도록 삽입제(intercalating agent)가 사용되었다. 이러한 삽입제(intercalating agent)로 버버린(berberine)이 바람직하다. 삽입제는 표적물질에 의해서 금 나노로드의 표면에 고정되어 있는 압타머가 G-사중구조(G-quadplex sturucture)의 결합체를 형성할 때, 삽입제(intercalation agent)가 달라붙게 되며 이로 인해 금 나노로드 주위의 전자기장이 영향을 받아 흡광도 파장 변화의 폭이 커지게 된다.
실험예를 통하여 본 발명에 대하여 보다 자세하게 설명한다.
1. 금 나노로드의 합성
씨드성장법에 의해 본 발명에서 사용될 수 있는 금 나노로드를 합성하였다. 간단하게 설명하면, 씨드용액을 제조하기 위해0.01M HAuCl4 0.125 mL, 0.01M NaBH4 0.3 mL를 0.1 M CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 용액에 혼합하고 30℃에서 2시간동안 유지하였다. 한편, 0.1 M CTAB 33.04ml, 0.01M HAuCl4 1.4ml, 0.01M AgNO3 0.21ml 및 0.1M 아스코르브산 0.21ml를 혼합하여 성장용액을 제조하였다. 성장용액에 씨드 용액 0.14ml를 투입한 후에 30℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 금 나노로드 용액의 UV/vis 흡수 스펙트럼을 96 well plaste reader(Infinite M200pro, TECAN Group, Ltd., Switzerland)를 통하여 얻었다. 크기와 종횡비(aspect ratio)를 고해상도 투과전자현미경(HR-TEM, JEM-2100, JEOL Ltd., Japan)을 통하여 측정하였다. 금 나노로드는 길이가 35.85±3.27 nm 이고 폭이 11.17±1.03 nm 으로서 3.21의 평균 종횡비를 나타내며 고르게 분포하는 것을 확인하였다.
2. 금 나노로드 기판의 제작
다음과 같은 방법을 사용하여 본 발명에서 사용된는 금 나노로드가 부착된 기판을 제작하였다. 유리 슬라이드(10mm X 25mm X 0.7mm)를 피라나 용액(H2SO4:H2O2 = 3:1)에서 65℃에서 30분 동안 세척하였다. 아민 표면을 형성하기 위해서 상기 유리 슬라이드를 초순수수(DI water)와 에탄올을 이용하여 세척하고 에탄올 2% APTMS((3-aminopropyl)trimethoxysilane) 용액에 실온에서 1시간동안 담가두었다. 아민이 형성된 유리 슬라이드를 DMF(N,N-dimethylformamide)에서1M의 숙신산무수물에 37℃에 8시간동안 처리하고, 초순수수(DI Water)를 이용하여 세척하였다. 숙신산무수물로 처리된 슬라이드를 50 mN 의EDC()와 25mM의 NHS()에 10분동안 처리함으로써 아마이드 결합 형성 반응을 수행하고, 초순순수에서의 0.1 M 시스테아민염산염(cyteamine hydrochloride) 용액에 담금처리 하였다. 최종적으로 티올(thiol) 처리된 유리 슬라이드를 금나노로드가 분산된 용액에 20시간 동안 노출시킨 후, 금 나노로드의 CTAB를 제거하기 위해 15분 동안 10000 rpm의 속도로 3회 원심분리하였다.
3. 압타머 결합 과정
OTA(ochratoxin A)와 AFB1(aflatoxin B1)에 반응성을 지니는 2종류의 압타머를 동일한 농도의PolyT3와 1:1 또는 1:2의 부피비로 혼합하였다. 각 올리고뉴클레오티드의 초기 농도는 10 μM이며, 최종 올리고뉴클레오티드 혼합물의 부피는 20 μL로 유지하였다. 올리고뉴클레오티드 혼합물은 올리고튜클레오티드의 5' 말단에서 결합된 티올(thiol)기의 이황화결합의 쪼개기 위해 5 mM의 TCEP(tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride )에 반응 시킨다. 올리고뉴클레오티드의 활성화된 티올(thiol)기는 0.1M의 글리신 버퍼(pH 3.0)용액과 함께 1시간동안 처리되어 금 나노로드 기판의 표면에 고정된다. 초순수수(DW)에 의해 세척한 후 OTA, AFB1, 버버린은 압타머가 고정된 금 나노로드 기판의 표면에서 25℃에서 30분 동안 결합 버퍼용액(20 mM tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, pH 7.2) 150 μl과 함께 처리하여 표지 물질이 압타머와 결합할 수 있도록 배양하였다. 이와 같은 방법을 버버린이 없는 경우도 똑같이 수행하였다.
4. 국소 표면 플라즈몬 공명( LSPR ) 신호 검출
압타머가 처리된 금 나노로드 기판을 투명한 96 well plate에 고정하였다. 고정된 기판 위에는 표적분자와 5μM의 버버린을 포함하는 결합 버퍼용액 150μl를 기판 위에 도포하였다. 25℃에서30분간 반응 후, 650 nm에서부터 900 nm까지의 파장 범위에서 흡수 스펙트럼을 측정하였다.
먼저, 상기와 같은 방법으로 흡수 스펙트럼을 측정하되, 버버린(berberrine : BB), 티오플라빈 T(thioflavin T: TFT), 크리스탈 바이올렛(crystal violet : CV), 티아졸 오렌지(thiazole orange : TO), 말라카이트 그린(malachite green, MG) 및 Zn-PPix의 총 6가지 삽입제(intercalating agent)를 G-사중구조에 대한 결합 친화도에 의한 신호증강효과를 확인하기 위해 사용하였다. 삽입제를 압타머가 고정화된 금 나노로드 기판에 표적물질 및 결합 버퍼용액과 함께 도포하여 30분 동안 반응 시키고 추가적인 국소 표면 플라즈몬 공명에 의한 흡광 스펙트럼의 적색이동를 측정하였다. 본 실험예에서 사용된 삽입제의 분자구조는 다음과 같다. (표1 참조)
Thiozole Orange (TO) Malachite Green (MG)
Figure pat00001
Figure pat00002
Crystal Violet (CV) Protoporphyrin IX zinc (Zn-PPIX)
Figure pat00003
Figure pat00004
Thioflavin T (TFT) Berberine (BB)
Figure pat00005
Figure pat00006
도 2는 삽입제의 종류에 따른 압타머 센서의 LSPR 흡수 스펙트럼의 적색이동량을 나타내는 그래프이다. 도 2에 도시된 바와 같이 각 삽입제에 의해 LSPR shift가 발생한 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서도 버버린이 약 5.5 nm의 LSPR shift가 발생하여 가장 많은 양의 흡수스펙트럼의 적색이동이 발생한 것을 알 수 있으며, 버버린이 압타머와 표적물질과의 결합에 의해 형성되는 G-사중구조(G-quadplex structure)의 결합체에 더욱더 응집되어 민감도 향상이 가장 우수한 것을 알 수 있다.
또한 표적물질로서 OTA와 AFB1의 농도를 변화시킨 후 삽입제로서 버버린이 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우의 압타머 센서의 LSPR shift를 비교하였다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머 센서의 버버린의 존부에 따른 LSPR 흡수 스펙트럼의 적색이동량을 나타내는 그래프이다. 도 3에 도시된 바와 같이, 버버린의 존재로 인하여 최소 검출 가능 농도는 0.001 nM의 농도까지 검출할 수 있는 것을 확인 할 수 있었으며, 전체 검출 영역이 0.001 nM ~ 10 μM의 농도범위까지 확장된 것을 알 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 압타머 센서는 삽입제를 도입함으로써 금속 나노입자의 국소 표면 플라즈몬 공명 현상에 의한 흡수 스펙트럼의 적색이동량이 증가하게 되어 아주 적은 양의 표적물질도 검출할 수 있는 장점이 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

  1. 금속 나노입자가 형성되어 있는 기판;
    상기 금속 나노입자 표면에 부착되어 검출하고자 하는 표적물질과 선택적으로 반응하여 구조체를 형성하는 압타머; 및
    상기 압타머와 표적물질 반응시 상기 압타머와 표적물질 사이에 삽입되어 상기 금속 나노입자 측으로 응집시켜 국소 표면 플라즈몬 공명 현상에 의한 흡수스펙트럼의 이동을 증가시키는 삽입제(intercalation agent)를 포함하는 압타머 센서.
  2. 청구항1에 있어서,
    상기 금속 나노입자는 금, 백금 또는 은인 것을 특징으로 하는 압타머 센서.
  3. 청구항1에 있어서,
    상기 삽입제(intercalation agent)는 버버린인 것을 특징으로 하는 압타머 센서.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 표적물질과 상기 압타머에 의해 형성된 결합체는 G-사중구조(G-quadplex structure)인 것을 특징으로 하는 압타머 센서.
  5. 청구항1에 있어서,
    상기 표적물질은 오크라톡신 A(OTA) 또는 아플라톡신 B1(AFB1)인 것을 특징으로 하는 압타머 센서.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 표적물질을 검출할 수 있는 범위는 1pM ~ 10 μM 인 것을 특징으로 하는 압타머 센서.
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