CN115627270B - 一种免标记比率型孔雀石绿发光适配体生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免标记比率型孔雀石绿发光适配体生物传感器，包括：（1）分子对接指导的适配体裁剪策略；（2）免标记比率型生物传感器的构建策略；（3）免标记比率型孔雀石绿生物传感器序列；（4）免标记比率型孔雀石绿生物传感器条件优化；（5）孔雀石绿的检测。设计原理是基于孔雀石绿靶标和小分子核酸染料硫磺素T（Thioflavin T，ThT）与发光核酸适配体之间的竞争结合作用，致使孔雀石绿与ThT的荧光被不同程度激发，进而使得二者荧光信号比值与靶标浓度呈线性关系，最终实现了孔雀石绿的低成本、快速、免标记、超灵敏的比率型荧光检测。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器领域，具体是一种免标记比率型孔雀石绿发光适配体生物传感器。
背景技术
孔雀石绿是一种人工合成的染料，因此在水产养殖和运输过程中常作为杀菌剂，以延长水产品的存活时间。但孔雀石绿具有致癌、致畸和致突变特性，食用后会对人体产生不可逆的毒副作用。因此，孔雀石绿已被中国、欧盟、加拿大及美国等列入水产养殖禁用药物。但是，由于其理想的抗菌性能和低成本，近年来在鱼类养殖领域添加孔雀石绿的情况时有发生，对消费者的健康和环境生态造成严重威胁。由此可见，亟需快速、灵敏和低成本的孔雀石率检测方法为鱼类产品质量安全监测提供技术支撑。
核酸适配体于1990年被Ellington和Szostak首次通过指数富集进化技术（systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX）体外筛选得到。在随后三十年的发展中，越来越多的核酸适配体被分离得到。为了提升核酸适配体的性能，衍生出了适配体裁剪策略，其通过剪短、替代、融合、劈裂及延长等方式对核酸适配体进行定向改造，以推动产生更加多元的应用。最常用的孔雀石绿RNA适配体和DNA适配体分别在1999年和2016年被提出。孔雀石绿分子一旦与适配体结合，则自身荧光被显著激发，产生荧光信号。然而，孔雀石绿DNA适配体的激发强度较弱，且亲和力有待提升。因此，利用适配体裁剪策略对孔雀石绿DNA适配体进行改造和性能优化，则可进一步推动其应用性，提升适配体传感器的检测性能。
核酸适配体生物传感器近年来发展迅猛，能够以靶标响应的模式产生输出信号，且其性质稳定，便于运输和存储。但是，一些适配体传感器需要修饰信号输出分子，这会致使成本提高并影响核酸的折叠动力学。此外，为了提升信号稳定性和检测灵敏度，减少由于环境和仪器因素引起的系统误差，迫切需要免标记及比率型适配体传感策略。硫磺素T（Thioflavin T，ThT）是一种小分子荧光染料，可以嵌入特殊核酸构象中产生较高的荧光量子产率，例如G-四链体、发夹结构或B-DNA双链等。
本发明将适配体裁剪与生物信息学融合，提出了分子对接指导的适配体裁剪策略。该策略通过“分子对接”、“粗裁剪”和“精细裁剪”三个步骤对孔雀石绿DNA适配体进行裁剪优化，提升了其亲和力及发光强度。并且，通过引入荧光小分子ThT，成功构建了一种免标记比率型孔雀石绿发光适配体生物传感器，最终实现了孔雀石绿快速、低成本、超灵敏的比率型荧光检测。
发明内容
基于此，本发明提出了一种分子对接指导的适配体裁剪策略和比率型适配体传感的通用方法，且成功构建了一种免标记比率型孔雀石绿发光适配体生物传感器。
一方面，本申请提出了一种分子对接指导的适配体裁剪策略。
所述分子对接指导的适配体裁剪策略是利用计算机软件对适配体序列进行高级结构模拟，随后与配体分子对接，根据分子对接结果明晰潜在的结合域及相互作用位点，并基于此对孔雀石绿适配体MG-org（SEQ ID NO.1）进行合理裁剪，后通过荧光法和亲和力表征方法验证裁剪后适配体的功能特性，所述适配体序列为：
MG-org：5’- CTCAGATCTAACCTTGTTAAATTGAG -3’，如SEQ ID NO.1所示；
所述分子对接指导的适配体裁剪策略是指对孔雀石绿的DNA适配体通过“分子对接”、“粗裁剪”和“精细裁剪”三个步骤提升适配体发光强度和结合能力的双重功能；
所述“分子对接”是指利用计算机软件预测适配体的二级结构和三级结构，并针对孔雀石绿与适配体的相互作用进行分子对接，明晰潜在的受体-配体结合域及相互作用位点；
所述“粗裁剪”是指参照分子对接结果，利用突变和剪短等策略对孔雀石绿适配体进行大范围改造，通过荧光分光光度计验证裁剪后适配体对孔雀石绿的激发强度，对有效序列进行亲和力表征，初步确定结合域，把握裁剪方向，所述适配体序列为：
MG-CM-A：5’- CTCAAATCTAACCTTGTTAAATTGAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
MG-CT-5：5’- CTCAAATCTAACTTAAATTGAG -3’，如SEQ ID NO.3所示；
MG-CT-7：5’- CTCAAATCTACTAAATTGAG -3’，如SEQ ID NO.4所示；
MG-CT-9：5’- CTCAAATCTAAATTGAG -3’，如SEQ ID NO.5所示；
MG-CB-6：5’- AAATCTAACCTTGTTAAATT -3’，如SEQ ID NO.6所示；
MG-CB-8：5’- AATCTAACCTTGTTAAAT -3’，如SEQ ID NO.7所示；
所述“精细裁剪”是指结合分子对接和粗裁剪的结果，在适配体的关键作用位点进行定点突变或小范围删除等，通过荧光分光光度计验证裁剪后适配体对孔雀石绿的激发强度，对有效序列进行亲和力表征，获得发光强度和亲和力双重功能提升的孔雀石绿适配体，并明晰适配体与靶标的作用机制，所述适配体序列为：
MG-FM-L：5’- AAAACTAACCTTGTTAAATT -3’，如SEQ ID NO.8所示；
MG-FM-R：5’- AAATCTAACCTTGTTATTTT -3’，如SEQ ID NO.9所示；
MG-FB-6GC：5’- GAATCTAACCTTGTTAAATC -3’，如SEQ ID NO.10所示；
MG-FB-7T：5’- AATCTAACCTTGTTAAATT -3’，如SEQ ID NO.11所示；
MG-FB-7A：5’- AAATCTAACCTTGTTAAAT -3’，如SEQ ID NO.12所示；
MG-FB-6-T：5’- TGTTAAATTAAATCTAACCT -3’，如SEQ ID NO.13所示；
具体地，通过“分子对接”预测适配体MG-org（SEQ ID NO.1）与孔雀石绿的结合位点，根据结果对适配体MG-org（SEQ ID NO.1）进行“粗裁剪”。先在其基础上将中间环部的G5突变为A5，命名为MG-CM-A（SEQ ID NO.2），再对MG-CM-A（SEQ ID NO.2）的顶部及底部B-DNA进行大范围剪短，即删除顶部茎的5、7、9个核苷酸及底部茎的6、8个核苷酸，分别得到MG-CT-5（SEQ ID NO.3）、MG-CT-7（SEQ ID NO.4）、MG-CT-9（SEQ ID NO.5）和MG-CB-6（SEQ IDNO.6）、MG-CB-8（SEQ ID NO.7）。随后，在MG-CB-6（SEQ ID NO.6）的基础上进行“精细裁剪”，将T4突变为A4得到MG-FM-L（SEQ ID NO.8），将A17和A18突变为T17和T18得到MG-FM-R（SEQID NO.9）。为了探究MG-CB-6（SEQ ID NO.6）的A1-T20碱基对支架的作用和相对空间位置，将其突变至G1-C20得到MG-FB-6GC（SEQ ID NO.10），删除A1、T20分别得到MG-FB-7T（SEQ IDNO.11）和MG-FB-7A（SEQ ID NO.12），改变适配体开口位点得到MG-FB-6-T（SEQ ID NO.13）。
所述的裁剪后孔雀石绿适配体在孔雀石绿检测中的应用。
另一方面，本申请开发了一种免标记比率型孔雀石绿发光适配体生物传感器，其特征在于，（1）免标记比率型生物传感器的构建策略；（2）免标记比率型孔雀石绿生物传感器反应条件优化；（3）孔雀石绿的检测。
所述免标记比率型生物传感器的构建策略是基于荧光分子竞争发光适配体的结合位点实现的。裁剪后的孔雀石绿发光适配体与靶标结合后能够显著激发孔雀石绿的荧光，本发明引入了嵌入式小分子荧光染料，其能够和孔雀石绿竞争适配体的结合位点，进而改变ThT和孔雀石绿的荧光发光强度，通过二者荧光信号的比值对孔雀石绿进行比率型定量检测；
所述免标记比率型孔雀石绿发光适配体生物传感器序列为：5’-AAATCTAACCTTGTTAAATT -3’，如SEQ ID NO.6所示；
所述免标记比率型孔雀石绿生物传感器反应条件优化包括传感器溶液ThT浓度、离子条件、pH以及试剂加入顺序；
所述免标记比率型孔雀石绿生物传感器溶液中ThT荧光染料的浓度范围为0.25~25 μmol·L-1；
优选地，免标记比率型孔雀石绿生物传感器溶液中ThT荧光染料浓度为2.5 μmol·L-1；
所述免标记比率型孔雀石绿生物传感器的缓冲溶液20 mmol·L-1 Tris-HCl （pH7.4）的例子条件为：不加离子或加入1 mmol·L-1 Na+, K+, Mg2+和Pb2+；
优选地，免标记比率型孔雀石绿生物传感器的缓冲溶液20 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.4）例子条件为：不引入离子；
所述免标记比率型孔雀石绿生物传感器的缓冲溶液20 mmol·L-1 Tris-HCl的pH值范围为5.4~9.4；
优选地，免标记比率型孔雀石绿生物传感器的缓冲溶液20 mmol·L-1 Tris-HCl的pH值为7.4；
所述免标记比率型孔雀石绿生物传感器的试剂加入顺序包含先加孔雀石绿后加ThT，先加ThT后加孔雀石绿以及二者同时加入；
优选地，向免标记比率型孔雀石绿生物传感器溶液中同时加入孔雀石绿和ThT；
所述孔雀石绿的检测是基于孔雀石绿与ThT竞争孔雀石绿适配体的结合位点，进而使得二者的荧光的激发强度变化，特定激发条件下的孔雀石绿荧光值与ThT荧光值的比值与溶液孔雀石绿浓度呈现梯度变化，实现孔雀石绿的检测；
具体的标准曲线建立步骤：
将不同浓度的孔雀石绿和2.5 μmol·L-1 ThT同时加入至包含1 μmol·L-1适配体溶液的20 mmol·L-1 Tris-HCl （pH 7.4）缓冲溶液中，使孔雀石绿的终浓度分别为0，0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，4，6 μmol·L-1，室温振荡混匀后孵育1min。利用荧光分光光度计测定溶液体系在617 和 443 nm处的孔雀石绿和ThT荧光强度，显示孔雀石绿与ThT的荧光峰值的比值与孔雀石绿浓度在5 nmol·L-1~6 μmol·L-1范围内具有良好线性关系（R2=0.991），线性回归方程为Y=7.009 X + 0.9102，检出限低至1.49nmol·L-1。
另一方面，证明孔雀石绿生物传感器对孔雀石绿的选择性。
选用孔雀石绿结构类似物：结晶紫（crystal violet，CV）、亮绿（brilliantgreen，BG）和隐性孔雀石绿（leucomalachite green，LMG）代替孔雀石绿，用免标记比率型孔雀石绿生物传感器进行实验，检测孔雀石绿和ThT特征波长处的荧光比率。
另一方面，孔雀石绿生物传感器对含有孔雀石绿的实际样品检测，具体操作如下：
将鱼类样品剁碎，用1~3 mL盐酸羟胺（20%）和2~4 mL醋酸铵（0.05 mol·L-1，pH4.5）进行均质处理，获得5.0 g匀浆。随后在1.0 g匀浆中分别加入终浓度为0、0.2或2 µmol·L-1的孔雀石绿溶液进行加标回收实验，并用1~3 mL乙腈处理，超声处理1~10 min后再离心（10,000 rpm） 5 min，检测上清液信号输出分子孔雀石绿和ThT的荧光强度比值，荧光激发波长分别为617 和443 nm。随后将孔雀石绿和ThT的荧光值比值代入标准曲线，计算得到待测样品中孔雀石绿的含量，实现对孔雀石绿的定量检测；
优选地，将鱼类样品剁碎，用1.5 mL盐酸羟胺（20%）和3.5 mL醋酸铵（0.05 mol·L-1，pH 4.5）进行均质处理，获得5.0 g匀浆。随后在1.0 g匀浆中分别加入终浓度为0、0.2或2 µmol·L-1的孔雀石绿溶液进行加标回收实验，并用2 mL乙腈处理，超声处理5 min后再离心（10,000 rpm） 5 min，检测上清液信号输出分子孔雀石绿和ThT的荧光强度比值，荧光激发波长分别为617 和443 nm。随后将孔雀石绿和ThT的荧光值比值代入标准曲线，计算得到待测样品中孔雀石绿的含量，实现对孔雀石绿的定量检测。
另一方面，涉及该生物传感器在在孔雀石绿检测方法开发中的应用，以及在孔雀石绿食品安全及环境检测试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提出了分子对接指导的裁剪策略，实现了孔雀石绿适配体的发光强度和结合亲和力双功能提升；
2、本发明提出了一种通用的比率型传感方法，即在发光适配体体系内引入嵌入式的小分子核酸染料，通过位点竞争原理实现稳定的比率型传感检测；
3、本发明利用裁剪优化得到的孔雀石绿适配体序列提升了生物传感器的检测灵敏度和信号稳定性，拓展了传感器的应用广泛性。
4、本发明提出的孔雀石绿生物传感器能够实现快速、低成本、稳定和超灵敏的孔雀石绿比率型检测，具有一定的通用性和产业化潜力。
5、本发明提出的孔雀石绿生物传感器在5 nmol·L-1~6 μmol·L-1范围内具有良好线性关系（R2=0.991），线性回归方程为Y=7.009 X + 0.9102，检出限低至1.49 nmol·L-1。
附图说明
图1为MG-org与孔雀石绿的分子对接结果。（A）为MG-org与孔雀石绿复合物的三维结构图；（B）为（A）的正交视图；（C）为MG-org与孔雀石绿分子对接的二维展示；（D）为MG-org与孔雀石绿分子对接的三维展示；（E）为MG-org与孔雀石绿之间的氢键相互作用；（F）为MG-org与孔雀石绿之间的电荷相互作用。
图2为MG-CM-A和MG-CB-6与孔雀石绿的分子对接结果。（A）为MG-CM-A与孔雀石绿复合物的三维结构图；（B）为（A）的正交视图；（C）为MG-CM-A与孔雀石绿分子对接的二维展示；（D）为MG-CB-6与孔雀石绿复合物的三维结构图；（E）为（D）的正交视图；（F）为MG-CB-6与孔雀石绿分子对接的二维展示。
图3为孔雀石绿适配体变体的二级结构及对应的荧光激发结果。（A）为不同孔雀石绿适配体变体的二级结构图；（B）为不同孔雀石绿适配体变体对靶标的荧光激发图。
图4为孔雀石绿适配体的亲和性评估及结合机制分析。（A）为AuNPs比色实验的结果图；（B）为利用荧光滴定法测定MG-org亲和常数的结果图；（C）为利用荧光滴定法测定MG-CM-A亲和常数的结果图；（D）为利用荧光滴定法测定MG-CB-6亲和常数的结果图；（E）为孔雀石绿适配体与靶标结合的机制分析图。
图5为免标记比率型孔雀石绿生物传感器构建策略的可行性验证。（A）为MG-CB-6与ThT复合物的三维结构图；（B）为（A）的正交视图；（C）为MG-CB-6与孔雀石绿分子对接的二维展示；（D）为孔雀石绿和ThT与MG-CB-6结合的荧光光谱；（E）、（F）和（G）为不同试剂添加顺序下孔雀石绿和ThT与MG-CB-6的竞争效应验证。
图6为免标记比率型孔雀石绿生物传感器的检测性能评估。（A）为不同孔雀石绿浓度下双信号的荧光谱图；（B）为传感器检测孔雀石绿的标准曲线图。
图7为免标记比率型孔雀石绿生物传感器的特异性评估。
图8为免标记比率型孔雀石绿生物传感器的反应条件优化。（A）ThT浓度；（B）离子条件；（C）pH值；（D）试剂加入顺序。
图9为免标记比率型孔雀石绿生物传感器原理图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.分子对接指导的孔雀石绿适配体裁剪
1.孔雀石绿适配体的分子对接
已报道的孔雀石绿DNA发光适配体的亲和力和荧光激发强度均有待提高，为了提升适配体的性能，将原孔雀石绿适配体进行分子对接指导的裁剪，并通过荧光分光光度计和亲和力测定实验验证裁剪后结果。首先，经过“分子对接”预测适配体和靶标的潜在结构域与结合位点。
MG-org（SEQ ID NO.1）的二级结构通过mfold网站预测得到，在此基础上利用RNAComposer获得适配体的RNA 3D结构，再通过BIOVIA Discovery Studio Visualizer软件将RNA 3D结构转化为DNA 3D结构，并进行能量最小化。利用ChemOffice对从PubChem获得的孔雀石绿的化学结构进行能量最小化。最后，使用HDOCK网站对MG-org（SEQ ID NO.1）和孔雀石绿的结合进行分子对接，通过BIOVIA Discovery Studio Visualizer软件分析获得的适配体-靶标相互作用模型。
如图1A和B可知，MG-org（SEQ ID NO.1）的高级结构主要由顶部茎环结构、中部空腔和底部B-DNA螺旋组成。在适配体与靶标相互作用模型中，可以发现T7、A19和A20核苷酸以不同形式的键和作用与孔雀石绿结合（图1C-F）。综上，推测孔雀石绿有较大可能与MG-org（SEQ ID NO.1）中部空腔的顶部发生相互作用。
所用到的适配体序列：
MG-org：5’- CTCAGATCTAACCTTGTTAAATTGAG -3’
2. 孔雀石绿适配体的粗裁剪
为了进一步通过实验手段证明孔雀石绿与适配体的潜在结合口袋，我们基于分子对接结果对适配体进行粗裁剪，所得新序列的二级结构如图3A所示。
首先，采用缩环策略将MG-org（SEQ ID NO.1）的G5核苷酸突变为A5，命名为MG-CM-A（SEQ ID NO.2）。利用分子对接模拟适配体和孔雀石绿的相互作用，具体方法同上。随后，将1 μmol·L-1适配体与2 μmol·L-1孔雀石绿混合孵育后，利用荧光分光光度计测定溶液在617 nm激发处的荧光值。如图2 A-C所示，MG-CM-A（SEQ ID NO.2）不仅保留了T7和T18核苷酸与孔雀石绿的相互作用，还增加了C8核苷酸与靶标的结合。并且，单核苷酸突变使得MG-CM-A（SEQ ID NO.2）对孔雀石绿的荧光激发强度是原适配体的1.3倍（图3B）。
为了探究顶端发夹和底部双链在孔雀石绿荧光激发过程中的作用，随后在MG-CM-A（SEQ ID NO.2）的顶部及底部B-DNA进行大范围剪短，即删除顶部茎的5、7、9个核苷酸及底部茎的6、8个核苷酸，分别得到MG-CT-5（SEQ ID NO.3）、MG-CT-7（SEQ ID NO.4）、MG-CT-9（SEQ ID NO.5）和MG-CB-6（SEQ ID NO.6）、MG-CB-8（SEQ ID NO.7）。如图3所示，顶端发夹被改造的孔雀石绿适配体，其发光强度显著降低，说明顶部茎环结构对维持适配体正确的高级构象具有重要作用。然而，删除底部茎6和8个核苷酸后得到的MG-CB-6（SEQ ID NO.6）和MG-CB-8（SEQ ID NO.7）对孔雀石绿的荧光激发分别是原始配体的1.2倍和0.34倍。随后对MG-CB-6（SEQ ID NO.6）与孔雀石绿的结合进行分子对接模拟，具体方法同上，结果表明该序列保留了T4和T19核苷酸与孔雀石绿的相互作用，因此保留了荧光激发能力（图2 D-F）。
实验中用到的适配体序列如下：
MG-org：5’- CTCAGATCTAACCTTGTTAAATTGAG -3’
MG-CM-A：5’- CTCAAATCTAACCTTGTTAAATTGAG-3’
MG-CT-5：5’- CTCAAATCTAACTTAAATTGAG -3’
MG-CT-7：5’- CTCAAATCTACTAAATTGAG -3’
MG-CT-9：5’- CTCAAATCTAAATTGAG -3’
MG-CB-6：5’- AAATCTAACCTTGTTAAATT -3’
MG-CB-8：5’- AATCTAACCTTGTTAAAT -3’
3. 孔雀石绿适配体的精细裁剪
为了更加系统地探究适配体与孔雀石绿的互作机制，随后在MG-CB-6（SEQ IDNO.6）的基础上进行“精细裁剪”，所得新序列的二级结构如图3A所示。将T4突变为A4得到MG-FM-L（SEQ ID NO.8），将A17和A18突变为T17和T18得到MG-FM-R（SEQ ID NO.9）。为了探究MG-CB-6（SEQ ID NO.6）的A1-T20碱基对支架的作用和相对空间位置，将其突变至G1-C20得到MG-FB-6GC（SEQ ID NO.10），删除A1、T20分别得到MG-FB-7T（SEQ ID NO.11）和MG-FB-7A（SEQ ID NO.12），改变适配体开口位点得到MG-FB-6-T（SEQ ID NO.13）。
利用荧光分光光度计测定裁剪后适配体对孔雀石绿的荧光激发作用，具体方法同上。如图3C所示，相比于原始配体对孔雀石绿的激发强度，基于精细裁剪改造的适配体对孔雀石绿的激发能力均有下降。
实验中用到的适配体序列如下：
MG-org：5’- CTCAGATCTAACCTTGTTAAATTGAG -3’
MG-CB-6：5’- AAATCTAACCTTGTTAAATT -3’
MG-FM-L：5’- AAAACTAACCTTGTTAAATT -3’
MG-FM-R：5’- AAATCTAACCTTGTTATTTT -3’
MG-FB-6GC：5’- GAATCTAACCTTGTTAAATC -3’
MG-FB-7T：5’- AATCTAACCTTGTTAAATT -3’
MG-FB-7A：5’- AAATCTAACCTTGTTAAAT -3’
MG-FB-6-T：5’- TGTTAAATTAAATCTAACCT -3’
4. 孔雀石绿适配体的亲和性验证及机制解析
随后，利用金纳米粒子（AuNPs）比色实验和荧光滴定法，对原始配体MG-org（SEQID NO.1）及发光性能提升的MG-CM-A（SEQ ID NO.2）、MG-CB-6（SEQ ID NO.6）进行亲和性验证。
AuNPs比色实验验证DNA适配体亲和性。其原理为：高盐（NaCl）条件下，AuNPs会受到盐的作用而发生团聚，溶液颜色由红色变成蓝色。核酸可以通过静电作用吸附在AuNPs表面，对AuNPs起到保护作用，可使AuNPs在高盐溶液中不发生聚集而呈红色。基于此，孔雀石绿适配体可以吸附于AuNPs上，并在高盐条件下稳定AuNPs；而当体系中存在孔雀石绿时，孔雀石绿会与适配体特异性结合，使适配体从AuNPs表面脱离，游离的AuNPs遇盐发生聚集呈蓝色。通过测定溶液525/626 nm处的吸光度判断适配体与靶标的亲和性。
具体的AuNPs比色实验步骤如下：
5 μL适配体（1 μmol·L-1）和5 μL不同浓度的孔雀石绿溶液，孵育40 min，加入100μL柠檬酸盐包被的AuNPs孵育40 min。向体系中加入8 μL 0.5 mol·L-1氯化钠溶液，孵育15min，拍照并利用酶标仪同时记录溶液525 nm和626 nm处的吸光度。数据处理利用626和525nm处吸光度的比值表明孔雀石绿适配体的亲和性，分散状态下A525值高，A626值低，即A626/A525值低。
具体的荧光滴定法实验步骤如下：
向含有1 μmol·L-1孔雀石绿适配体的缓冲溶液20 mmol·L-1 Tris-HCl （pH7.4）中加入不同浓度的孔雀石绿溶液，室温混合孵育1 min，利用荧光分光光度计测定溶液在617 nm激发处的荧光值，随后根据荧光值与孔雀石绿浓度关系拟合曲线，得到亲和亲和常数。
如图4A所示，AuNPs比色实验结果显示MG-org（SEQ ID NO.1）、MG-CM-A（SEQ IDNO.2）和MG-CB-6（SEQ ID NO.6）三条适配体序列的亲和性较好，且与发光强度趋势相同。荧光滴定法实验结果也观察到了同样的现象，测得三条适配体序列的亲和常数分别为1.402、0.791和0.839 μmol·L-1（图4 B-D）。
基于分子对接指导的系统的适配体裁剪结果，可总结得到孔雀石绿适配体与靶标的相互作用机制。如图4E所示，MG-org（SEQ ID NO.1）的顶端发夹对于适配体正确二级结构的折叠具有重要作用，中间环部的T7、C8和T9核苷酸通过氢键和范德华力参与孔雀石绿的结合及荧光激活，而T18、T19、A20和A21则可能通过氢键、范德华力和疏水作用与孔雀石绿结合。此外，将G5核苷酸突变为A5后，形成的A5-T22核苷酸对有利于孔雀石绿结合口袋的形成，从而使得核苷酸A6、T7、C8、T9、A10、T17和T18能够通过氢键、范德华力和疏水及静电相互作用与靶标互作，进而显著增强了孔雀石绿的荧光激活和结合亲和力。并且，底部茎的末端三个核苷酸对可能对靶标结合没有显著作用，而A4-T23支架则对于适配体的构象稳定具有重要意义。在实际情况下，A4-T23支架的两个核苷酸很可能在空间上保持着一定距离。
实验中用到的适配体序列如下：
MG-org：5’- CTCAGATCTAACCTTGTTAAATTGAG -3’
MG-CM-A：5’- CTCAAATCTAACCTTGTTAAATTGAG-3’
MG-CB-6：5’- AAATCTAACCTTGTTAAATT -3’
实施例2. 免标记比率型孔雀石绿生物传感器可行性验证
1. 免标记比率型生物传感器的构建策略
为了构建免标记比率型生物传感器，通过分子对接指导的裁剪策略对原始配体MG-org（SEQ ID NO.1）进行裁剪改造，在缩短序列长度的同时提升了适配体的发光性能及亲和性，得到了双功能提升的裁剪后适配体MG-CB-6（SEQ ID NO.6）。生物传感器的构建策略是基于荧光分子竞争发光适配体的结合位点实现的。裁剪后的孔雀石绿发光适配体与靶标结合后能够显著激发孔雀石绿的荧光，体系中引入的嵌入式小分子荧光染料，其能够和孔雀石绿竞争适配体的相同结合位点，并在溶液中产生基于竞争实现的动态平衡效应。基于此原理，溶液中孔雀石绿含量的变化会改变ThT和孔雀石绿的荧光发光强度，通过二者荧光信号的比值对溶液中的孔雀石绿含量进行比率型检测。
2. 免标记比率型生物传感器的可行性验证
为了验证比率型传感器构建策略的可行性，我们对MG-CB-6（SEQ ID NO.6）和ThT进行了分子对接预测。如图5 A-C和图2F所示，MG-CB-6（SEQ ID NO.6）与ThT和孔雀石绿的结合位点部分相同，如T4和T19通过氢键相互作用结合，辅因子结合位点也有较大重叠（A3、C5、T14和A18）。因此，基于计算机预测模拟可知，ThT和孔雀石绿的双信号组合能够通过竞争MG-CB-6（SEQ ID NO.6）的相同结合位点实现比率型传感。
随后，在实验层面对比率型传感器可行性进行探究。如图5D所示，孔雀石绿的加入会明显改变ThT及其自身的发光强度。经过进一步探究，发现孔雀石绿与ThT的荧光变化呈现竞争平衡现象（图5 E-G），证明了免标记比率型生物传感器的构建策略可行。
实施例3. 免标记比率型孔雀石绿生物传感器的检测性能评估
1. 免标记比率型孔雀石绿生物传感器的灵敏度评估
利用MG-CB-6（SEQ ID NO.6）对已知浓度的孔雀石绿进行检测，依据溶液中孔雀石绿和ThT荧光比值的变化制作标准曲线。将不同浓度的孔雀石绿和2.5 μmol·L-1 ThT同时加入至包含1 μmol·L-1适配体溶液的20 mmol·L-1 Tris-HCl （pH 7.4）缓冲溶液中，使孔雀石绿的终浓度分别为0，0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，4，6 μmol·L-1，室温振荡混匀后孵育1 min。最后，利用荧光分光光度计测定溶液体系在617 和 443 nm处的孔雀石绿和ThT荧光强度，基于二者荧光比值绘制标准曲线。
如图6所示，免标记比率型孔雀石绿生物传感器在5 nmol·L-1~6 μmol·L-1范围内具有良好线性关系（R2=0.991），线性回归方程为Y=7.009 X + 0.9102，检出限低至1.49nmol·L-1。
2. 免标记比率型孔雀石绿生物传感器的特异性评估
选用孔雀石绿结构类似物结晶紫（crystal violet，CV）、亮绿（brilliant green，BG）和隐性孔雀石绿（leucomalachite green，LMG）对孔雀石绿生物传感器的特异性进行评估。将1 μmol·L-1孔雀石绿或10 μmol·L-1 CV、BG、LMG与2.5 μmol·L-1 ThT同时加入至包含1 μmol·L-1适配体溶液的20 mmol·L-1 Tris-HCl （pH 7.4）缓冲溶液中，室温振荡混匀后孵育1 min。最后，利用荧光分光光度计测定溶液体系在617 和 443 nm处的孔雀石绿和ThT荧光强度，将二者比值带入标准曲线中计算对应的孔雀石绿含量。
如图7所示，加入CV、BG和LMG未能对孔雀石绿的检测结果产生显著影响，表明该孔雀石绿适配体具有较好的选择性。
实施例4. 免标记比率型孔雀石绿生物传感器的检测条件优化
首先，优化了孔雀石绿传感器体系的ThT浓度。将1 μmol·L-1孔雀石绿和0.25、1、2.5、10和25 μmol·L-1 ThT同时加入至包含1 μmol·L-1适配体溶液的20 mmol·L-1 Tris-HCl （pH 7.4）缓冲溶液中，室温振荡混匀后孵育1 min。最后，利用荧光分光光度计测定溶液体系在617 和 443 nm处的孔雀石绿和ThT荧光强度。如图8A所示，ThT终浓度为2.5 μmol·L-1时具有较高的检测信噪比和较低的检测成本。
随后，优化了孔雀石绿传感器体系的离子条件。将1 μmol·L-1孔雀石绿和2.5 μmol·L-1 ThT同时加入至包含1 μmol·L-1适配体溶液的20 mmol·L-1 Tris-HCl （pH 7.4）缓冲溶液中，缓冲溶液的离子条件分别为不加离子或加入1 mmol·L-1 Na+, K+, Mg2+和Pb2 +，室温振荡混匀后孵育1 min。最后，利用荧光分光光度计测定溶液体系在617 和 443 nm处的孔雀石绿和ThT荧光强度。如图8B所示，当缓冲溶液20 mmol·L-1 Tris-HCl （pH 7.4）中无离子时即可出现高强度的荧光信号，因此选择在检测系统中不加入离子溶液。
此外，还优化了孔雀石绿传感器体系的pH。将1 μmol·L-1孔雀石绿和2.5 μmol·L-1 ThT同时加入至包含1 μmol·L-1适配体溶液的20 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲溶液中，缓冲溶液pH分别为5.4、6.4、7.4、8.4和9.4，室温振荡混匀后孵育1 min。最后，利用荧光分光光度计测定溶液体系在617 和 443 nm处的孔雀石绿和ThT荧光强度。如图8C所示，缓冲溶液20 mmol·L-1 Tris-HCl的pH为7.4时具有最高的检测信噪比。
最后，对孔雀石绿传感器体系的加样顺序也进行了优化。在包含1 μmol·L-1适配体溶液的20 mmol·L-1 Tris-HCl （pH 7.4）缓冲溶液中加入1 μmol·L-1孔雀石绿和2.5 μmol·L-1 ThT，试剂加入顺序包含先加孔雀石绿后加ThT，先加ThT后加孔雀石绿以及二者同时加入，室温振荡混匀后孵育1 min。最后，利用荧光分光光度计测定溶液体系在617 和443 nm处的孔雀石绿和ThT荧光强度。如图8D所示，向免标记比率型孔雀石绿生物传感器溶液中同时加入孔雀石绿和ThT可以在保证检测信噪比的同时减少检测时间。
实施例5. 免标记比率型生物传感器用于真实样品中孔雀石绿的检测
真实样品加标回收实验中，将鱼类样品剁碎，用1.5 mL盐酸羟胺（20%）和3.5 mL醋酸铵（0.05 mol·L-1，pH 4.5）进行均质处理，获得5.0 g匀浆。随后在1.0 g匀浆中分别加入终浓度为0、0.2或2 µmol·L-1的孔雀石绿溶液进行加标回收实验，并用2 mL乙腈处理，超声处理5 min后再离心（10,000 rpm） 5 min，检测上清液信号输出分子孔雀石绿和ThT的荧光强度比值，荧光激发波长分别为617 和443 nm。随后将孔雀石绿和ThT的荧光值比值代入标准曲线，计算得到待测样品中孔雀石绿的含量，实现对孔雀石绿的定量检测。
如表1所示，基于孔雀石绿生物传感器的鱼类样品加标回收率比较理想，说明该生物传感器能够实现真实样品中孔雀石绿的定量检测。
表1 基于免标记比率型生物传感器的鱼类样品中孔雀石绿加标实验
Claims (8)
1.一种基于理性裁剪的孔雀石绿双功能适配体，其特征在于，所述适配体序列为：
MG-CM-A：5’- CTCAAATCTAACCTTGTTAAATTGAG-3’；
MG-CB-6：5’- AAATCTAACCTTGTTAAATT -3’。
2.根据权利要求1所述的孔雀石绿双功能适配体在孔雀石绿检测中的应用。
3.一种免标记比率型孔雀石绿发光适配体生物传感器，其特征在于，一、免标记比率型生物传感器的构建策略；二、免标记比率型孔雀石绿生物传感器序列；三、免标记比率型孔雀石绿生物传感器条件优化；四、孔雀石绿的检测；
所述免标记比率型生物传感器的构建策略，为发光靶标与嵌入式小分子核酸染料进行位点竞争，双荧光信号的比率与靶标浓度呈现线性关系，根据荧光比率值对靶标进行定量检测；
所述免标记比率型孔雀石绿生物传感器序列，生物传感器的序列为：5’-AAATCTAACCTTGTTAAATT -3’。
4.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，免标记比率型孔雀石绿生物传感器的溶液中ThT荧光染料的浓度范围为0.25~25 μmol·L-1；
在免标记比率型孔雀石绿生物传感器的缓冲溶液20 mmol·L-1 Tris-HCl pH 7.4 中不加离子或加入1 mmol·L-1 Na+, K+, Mg2+和Pb2+；
免标记比率型孔雀石绿生物传感器的缓冲溶液20 mmol·L-1 Tris-HCl的pH值范围为5.4~9.4；
免标记比率型孔雀石绿生物传感器的试剂加入顺序包含先加孔雀石绿后加ThT，先加ThT后加孔雀石绿以及二者同时加入。
5.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，传感器对孔雀石绿的选择性；
选用孔雀石绿结构类似物：结晶紫、亮绿和隐性孔雀石绿代替孔雀石绿，用免标记比率型孔雀石绿生物传感器进行实验，检测孔雀石绿和ThT特征波长处的荧光比率。
6.根据权利要求3~5任一所述的生物传感器对孔雀石绿进行定量检测的方法，其特征在于，标准曲线的建立：
将不同浓度的孔雀石绿和2.5 μmol·L-1 ThT同时加入至包含1 μmol·L-1适配体溶液的20 mmol·L-1 Tris-HCl ，pH 7.4 缓冲溶液中，使孔雀石绿的终浓度分别为0，0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，4，6 μmol·L-1，室温振荡混匀后孵育1 min；利用荧光分光光度计测定溶液体系在617 和 443 nm处的孔雀石绿和ThT荧光强度。
7.根据权利要求3~5任一项所述的生物传感器对含有孔雀石绿的实际样品进行检测的方法，其特征在于，具体操作如下：
将样品粉碎，均质处理；在匀浆中加入终浓度为0、0.2或2 µmol·L-1的孔雀石绿溶液进行加标回收实验，并用1~3 mL乙腈处理，超声处理1~10 min后再离心10,000 rpm，5 min，检测上清液信号输出分子孔雀石绿和ThT的荧光强度比值，荧光激发波长分别为617 和443nm，随后将孔雀石绿和ThT的荧光值比值代入标准曲线，计算得到待测样品中孔雀石绿的含量，实现对孔雀石绿的定量检测。
8.根据权利要求1所述的适配体或权利要求3~5任一项所述的生物传感器或权利要求6或7所述的方法在孔雀石绿检测方法开发、孔雀石绿食品安全或环境检测试剂盒中的应用。
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