CN108715847A - 一种基于dna增强孔雀石绿荧光的快速检测法及其应用 - Google Patents
一种基于dna增强孔雀石绿荧光的快速检测法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于DNA增强孔雀石绿荧光的快速检测法及其应用，属于渔药残留(水产)检测领域。本发明解决了现有的检测方法测定流程复杂、前处理困难、耗时长、成本高的问题。本检测方法主要包括如下步骤：a、在缓冲溶液中依次加入DNA，待测水溶液，剧烈混匀后，室温静置一段时间；b、使用荧光光谱仪在630nm激发光波长下进行荧光强度测定；c、测定不同浓度孔雀石绿标准水溶液的荧光强度，制作标准曲线，计算待测水溶液中孔雀石绿浓度。与现有的检测方法相比，本发明通过DNA的G四联体结构来增加孔雀石绿的刚性以此来增加其自身的荧光强度，建立了一种快速、简便、高效的养殖水体中孔雀石绿的定性定量快速检测方法，可应用于养殖水体中孔雀石绿的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于DNA增强孔雀石绿荧光的快速检测法及其应用，属于渔药残留(水 产)检测领域。
背景技术
孔雀石绿(MG)是一种三苯甲烷类染料，由于其杀菌效果好，且价格低廉，很多养殖者 会在养殖过程中滥用孔雀石绿这种违禁药物。经研究发现，孔雀石绿进入水生动物体内后， 会快速代谢成脂溶性的无色孔雀石绿，孔雀石绿具有潜在的致癌、致畸、致突变的作用。
目前，测定孔雀石绿的主要方法是色谱分析方法，包括高效液相色谱法、液相色谱一质 谱联用法，还有酶联免疫吸附(ELISA)法，电化学法等检测方法，但这些方法测定流程复杂、 耗时长、成本高。而且孔雀石绿本身荧光强度很小，不能直接使用荧光光谱仪进行检测。
发明内容
针对现有的孔雀石绿检测方法所存在的上述问题，本发明提出了一种利用单链DNA来 增强孔雀石绿的荧光强度的快速检测方法。本发明利用在Na+或K+存在下，单链DNA能够 形成G四联体结构，与孔雀石绿结合从而增加孔雀石绿结构的刚性使得孔雀石绿的荧光强度 大大增强，从大量理论上能形成G四联体结构的DNA中筛选得到了能够显著增强孔雀石绿 的荧光强度的DNA，并建立了孔雀石绿的荧光强度的快速检测方法。
本发明的第一个目的是提供一种能够增强孔雀石绿的荧光强度的DNA，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:11所示。
本发明的第二个目的是提供一种增强孔雀石绿的荧光强度的方法，所述方法是将核苷酸 序列如SEQ ID NO:11所示的DNA与含有孔雀石绿的样品进行混合。
本发明的第三个目的是提供一种孔雀石绿的检测方法，包括利用本发明的核苷酸序列如 SEQ ID NO:11所示的DNA。
在一些实施方式中，所述方法包括：将核苷酸序列如SEQ ID NO:11的DNA与含有孔雀 石绿的待测样品进行混合，进行荧光强度的测定。
在一些实施方式中，所述方法还包括：将核苷酸序列如SEQ ID NO:11的DNA与不同标 准浓度的孔雀石绿的标准样品进行混合，并测定荧光强度，绘制荧光强度与雀石绿浓度对应 关系的标准曲线。
在一些实施方式中，所述方法还包括：将待测样品中检测到的荧光强度代入到标准曲线 中，从而获知待测样品中孔雀石绿的浓度。
在一些实施方式中，所述荧光强度的测定，是使用荧光光谱仪在630nm激发光波长下 进行荧光强度测定。
在一些实施方式中，所述将DNA与含有孔雀石绿的待测样品进行混合具体是：在缓冲 液中添加DNA和待测样品，混合，静置。
在一些实施方式中，所述缓冲溶液可以是一下任意一种或者多种：磷酸钠缓冲液(0.2 mol/L，pH＝6.6)，Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH＝6.5，100mmol/L K+)，Tris-HCl缓冲 液(0.05mol/L，pH＝6.5，100mmol/L Na+)。
在一些实施方式中，所述缓冲液与DNA、待测样品的体积比为：170:10:20。
在上述的检测方法中，所述静置的时间为0.5-1.5h。
在一些实施方式中，所述方法具体包括：
a、在170μL缓冲溶液中依次加入10μL DNA(100μmol/L)，20μL待测水溶液，使检 测体系总体积为200μL，剧烈混匀后，室温静置1h；
b、使用荧光光谱仪在630nm激发光波长下进行荧光强度测定；
c、测定不同浓度孔雀石绿标准水溶液的荧光强度，制作标准曲线，计算待测水溶液中孔 雀石绿浓度。
本发明的第四个目的是提供所述方法在实际水样检测中的应用。
在一些实施方式中，所述应用包括在实际养殖水样中加入DNA，充分混合，用荧光光谱 仪在630nm的激发波长下测定其荧光强度，制作标准曲线，即可计算出养殖水样中的孔雀石 绿含量。
本发明的有益效果：
与现有的检测方法相比，本发明通过核苷酸序列如SEQ ID NO:1的DNA的G四联体结 构来增加孔雀石绿的刚性以此来增加其自身的荧光强度，建立了一种快速、简便、高效的养 殖水体中孔雀石绿的定性定量快速检测方法，对养殖用水中孔雀石绿的筛查具有现实意义。
附图说明
图1：用3种缓冲溶液及11种不同的DNA序列检测体系测定孔雀石绿荧光强度对比结 果图；
图2：DNA 11与Tris-HCl 100mmol/L K+缓冲溶液体系检测MG的荧光光谱图；
图3：利用DNA增强MG荧光检测法的标准曲线；
图4：A为7种抗生素及MG检测相对荧光强度；B为MG分别添加7种抗生素检测荧 光强度；
图5：MG标准曲线和实际样品检测回收率表。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施方式并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本 发明并不限于这些实施例。
实施例1
按照以下方法进行检测：
a、在170μL缓冲溶液中依次加入10μL DNA(100μmol/L)，20μL待测水溶液，使检 测体系总体积为200μL，剧烈混匀后，室温静置1h；
b、使用荧光光谱仪在630nm激发光波长下进行荧光强度测定；
c、测定不同浓度孔雀石绿标准水溶液的荧光强度，制作标准曲线，计算待测水溶液中孔 雀石绿浓度。
其中，所用的缓冲液为如下任意一种：磷酸钠缓冲液(0.2mol/L，pH＝6.6)，Tris-HCl 缓冲液(0.05mol/L，pH＝6.5，100mmol/L K+)，Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH＝6.5，100 mmol/L Na+)
所用的DNA有11种，均为富G序列，种类如下，
表1 11种寡核苷酸名称及其序列
| 编号 | 名称 | 序列(5’-3’) | 序列编号 |
| 1 | AGRO100 | GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG | SEQ ID NO:1 |
| 2 | PS2.M | GTGGGTAGGGCGGGTTGG | SEQ ID NO:2 |
| 3 | PW17 | GGGTAGGGCGGGTTGGG | SEQ ID NO:3 |
| 4 | G3T4 | GGGTTTTGGGTTTTGGGTTTTGGG | SEQ ID NO:4 |
| 5 | PS5.M | GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG | SEQ ID NO:5 |
| 6 | c-Myc | TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA | SEQ ID NO:6 |
| 7 | T30695 | GGGTGGGTGGGTGGGT | SEQ ID NO:7 |
| 8 | G3T3 | GGGTTTGGGTTTGGGTTTGGG | SEQ ID NO:8 |
| 9 | TBA | GGTTGGTGTGGTTGG | SEQ ID NO:9 |
| 10 | Oxy28 | GGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGG | SEQ ID NO:10 |
| 11 | H22 | AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG | SEQ ID NO:11 |
最佳检测条件的选择：
在170uL缓冲溶液中依次加入10uL DNA(100μmol/L)，20uL孔雀石绿标准水溶液(100μmol/L)，使检测体系总体积为200uL，剧烈混匀后，室温静置1h，在630nm波长 下进行荧光测定，使用荧光光谱仪，以氙灯作为激发源，并且激发和发射的狭缝宽度均设定 为20nm。再分别改变缓冲溶液的种类和DNA种类进行上述检测过程。荧光测定使用酶标仪。
测定结果如图1，得到结果是序列如SEQ ID NO:11的编号11的DNA与Tris-HCl100mM K+缓冲溶液所形成的体系才是检测的最优条件。
如图2所示，编号11的DNA与Tris-HCl 100mmol/L K+缓冲溶液体系检测MG得到的荧 光强度最大。
实施例2：检测方法的标准曲线、最低检测线
在170uL的Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH＝6.5，100mmol/L K+)中依次加入10uLDNA (100μmol/L，序列如SEQ ID NO:11所示)，20uL孔雀石绿标准水溶液，使检测体系总体积为200uL，剧烈混匀后，室温静置1h，在630nm波长下进行荧光测定，使用荧光光谱仪， 以氙灯作为激发源，并且激发和发射的狭缝宽度均设定为20nm。荧光测定使用酶标仪。
其中改变孔雀石绿溶液的浓度，分别配制0μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、 0.6μmol/L,、0.8μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、6.0μmol/L的孔雀石绿标准水 溶液。将测定结果绘制成标准曲线。
如图3所示，此检测方法测定MG与其浓度有很好的线性相关性，相关性系数达0.994， 并得出线性为y＝5206.902x+277.866(x为浓度，单位为μmol/L，y为荧光强度)，线性范围 从0.1μmol/L到6.0μmol/L。根据标准曲线，并采用3倍噪声值时的浓度作为最低检测限， 得到此方法的最低检测限为0.083μmol/L。
实施例3：选择性实验
选择了水产养殖常用的7种抗生素作为对照，分别为甲砜霉素、盐酸四环素、罗红霉素、 氟苯尼考、氯霉素琥珀酸钠、氯霉素、头孢拉定。检测方法同实施例2。
过程1：分别用SEQ ID NO:11的DNA和Tris-HCl缓冲(0.05mol/L，pH＝6.5，100mmol/L K+)体系检测孔雀石绿及7种抗生素；
过程2：在孔雀石绿标准水溶液中分别添加七种抗生素，用SEQ ID NO:11的DNA和Tris-HCl缓冲(0.05mol/L，pH＝6.5，100mmol/L K+)体系检测。
过程1的结果如图4A所示，激发波长为630nm，检测结果差异非常显著，说明本方法检测MG有非常大的荧光强度，而其他7种抗生素则并无显著性荧光强度，可知此方法检测MG具有非常好的选择性。
过程2如图4B所示，MG分别添加七种抗生素后检测的相对荧光强度与未添加的MG检 测结果相近，其荧光强度并未出现显著性变化，故研究得到这七种抗生素均不会对用此方法 检测MG的结果产生干扰。
实施例4：回收率及实际样品检测
在170uL Tris-HCl K+缓冲溶液(0.05mol/L，pH＝6.5，100mmol/L K+)中依次加入10uL DNA(100μmol/L)，20uL待测水样，使检测体系总体积为200uL，剧烈混匀后，室温静置1h，在630nm波长下进行荧光测定。
为检测该方法在实际样品中的应用，进行了回收率测定，将取至江南大学小蠡湖的水样 作为基质，向其中加入MG标准溶液，使其浓度分别为0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L 进行模拟检测。检测过程同上。
用此方法直接检测小蠡湖水样，结果显示未检出。制作标准曲线如图4A所示，线性拟 合y＝5127x+1607(x为浓度，单位为μmol/L，y为荧光强度)，相关性系数为0.979。
如图4B所示，0.5μmol/L MG模拟样品的回收率在100％-112％之间，1.0μmol/L MG模 拟样品的回收率在118％左右，5.0μmol/L MG模拟样品的回收率在93％-112％。此检测方法 整体检测回收率将在90％-120％。
应该理解，在本发明的权利要求书、说明书中，所有“包括……”均应理解为开放式的 含义，也就是其含义等同于“至少含有……”，而不应理解为封闭式的含义，即其含义不应 该理解为“仅包含……”。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动、补充与修饰，因此本发明的保护范围 应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种基于DNA增强孔雀石绿荧光的快速检测法及其应用
<130> 1
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gtgggtaggg cgggttgg 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gggtagggcg ggttggg 17
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gggttttggg ttttgggttt tggg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gtgggtcatt gtgggtgggt gtgg 24
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tgagggtggg gagggtgggg aa 22
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gggtgggtgg gtgggt 16
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gggtttgggt ttgggtttgg g 21
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ggttggtgtg gttgg 15
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ggggttttgg ggttttgggg ttttgggg 28
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
agggttaggg ttagggttag gg 22
Claims (10)
1.一种能够增强孔雀石绿的荧光强度的DNA，其特征在于，所述DNA的核苷酸序列如SEQID NO:11所示。
2.一种增强孔雀石绿的荧光强度的方法，其特征在于，所述方法包括：将核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的DNA与含有孔雀石绿的样品进行混合。
3.一种孔雀石绿的检测方法，其特征在于，所述方法包括利用核苷酸序列如SEQ IDNO:11所示的DNA。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括：将核苷酸序列如SEQID NO:11的DNA与含有孔雀石绿的待测样品进行混合，进行荧光强度的测定。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：将核苷酸序列如SEQID NO:11的DNA与不同标准浓度的孔雀石绿的标准样品进行混合，并测定荧光强度，绘制荧光强度与雀石绿浓度对应关系的标准曲线。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：将待测样品中检测到的荧光强度代入到标准曲线中，从而获知待测样品中孔雀石绿的浓度。
7.根据权利要求3-6任一所述的检测方法，其特征在于，所述荧光强度的测定，是使用荧光光谱仪在630nm激发光波长下进行荧光强度测定。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述将DNA与含有孔雀石绿的待测样品进行混合具体是：在缓冲液中添加DNA和待测样品，混合，静置。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液是以下任意一种或者多种：磷酸钠缓冲液，Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液。
10.权利要求3-9所述方法在实际水样检测中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181030 |
|
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