CN114989806B - 一种快速检测孔雀石绿的复合探针及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测孔雀石绿的复合探针及其检测方法。本发明制备的锆金属‑有机骨架化合物可在水中保持结构稳定，并将其与G‑四链体‑ThT荧光探针混合，使其自组装形成快速、灵敏检测孔雀石绿的复合探针G‑四链体‑ThT@ZrMOFs；复合探针中G‑四链体与ZrMOFs协同增强荧光染料ThT的荧光，形成强荧光信号，ZrMOFs高效吸附、富集水中的孔雀石绿，ThT快速产生荧光响应信号，提高了检测孔雀石绿的速度与灵敏度。本发明的检测过程无其他分离、富集、洗涤等步骤，尤其是可利用酶标仪进行高通量、快速检测，检测所需时间控制在1h以内，可准确定量孔雀石绿的浓度低至0.5μg/kg，具有良好的应用前景。

Description

一种快速检测孔雀石绿的复合探针及其检测方法
技术领域
本发明属于孔雀石绿的快速检测技术领域，具体涉及一种复合探针G-四链 体-ThT@ZrMOFs的设计、组装及其应用于孔雀石绿的快速检测。
背景技术
孔雀石绿(Malachite Green,MG)是三苯甲烷类工业染料。20世纪30年代， 人们发现孔雀石绿可以用来杀死鱼体表面的细菌、真菌和寄生虫，尤其是对水 霉病有特效，许多国家将孔雀石绿作为杀虫剂和杀菌剂广泛用于水产养殖业中， 预防和治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病以及小瓜虫病等。自20世纪90年 代起，国内外的研究者陆续发现，孔雀石绿的官能团“三苯甲烷 (triphenylmethane)”有致癌、致畸、致突变(三致)等毒副作用。
因此，快速、灵敏检测水中孔雀石绿，是监控和保障生鲜水产品和食品质 量安全的有效手段之一。目前，检测孔雀石绿的国家标准方法有液相色谱串联 质谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱荧光检测法。这些色谱及其联用技术 发展成熟，准确度高、重现性好，但需要专业技术人员进行精细且严格的样本 提取、净化以及进样等操作，检测耗时长，只能在装备精良的实验室内进行检测，不能完全满足生产实际的需求。近年来，随着材料科学和纳米技术的发展， 国内外研究人员提出了多种快速检测孔雀石绿的方法。例如，利用新型纳米材 料修饰电极改善检测性能的电化学方法(Analytical Methods 2012,4(12),4257-4263；Electroanalysis 2017,29(11),2602-2609；Journal of ElectroanalyticalChemistry 2017,792,23-30.)，基于功能化金纳米材料的拉曼光谱法(ACS AppliedMaterials&Interfaces 2016,8(44),29968-29976)，基于抗体的酶联免疫分析法(J.Agric.Food Chem.2014,62(34),8752-8758)，但这些方法由于检测步骤繁 复，稳定性较差，仍难以满足生产和监管中简便、快速、灵敏检测痕量孔雀石 绿的需求。
实现对水中痕量孔雀石绿的灵敏、快速检测，需要：1、高效吸附、富集水 中的孔雀石绿；2、检测分子探针快速、灵敏响应孔雀石绿。有文献(Analyst,2013, 138,2592-2597)报道，富含G碱基的DNA序列形成的G-四链体结构可与孔雀 石绿结合，增强孔雀石绿分子结构的刚性，从而使其在适当的激发光激发下发 出荧光。但是，由于孔雀石绿的消光系数较小，其与G-四链体形成的复合物发 出的荧光较弱，无法实现低浓度孔雀石绿的检测。联想到一些G-四链体可显著 增强水溶性荧光染料硫黄素T(ThT)的荧光，且构建G-四链体-ThT荧光探针 成本低廉、简便快速，我们尝试利用G-四链体-ThT荧光探针快速检测孔雀石绿。然而，实验结果表明，孔雀石绿浓度较低时，例如50μg/kg，产生的检测信号仍 然较弱。
发明内容
为了解决背景技术中的问题，本发明提出了一种提高G-四链体-ThT荧光探 针检测孔雀石绿速度和灵敏度的方法。本发明制备一种可在水中稳定的锆金属- 有机骨架(Zr-Metal-Organic Frameworks，ZrMOFs)化合物，并将其与G-四链 体-ThT荧光探针混合，使其自组装形成快速、灵敏检测孔雀石绿的复合探针G- 四链体-ThT@ZrMOFs。在该复合探针中：1、G-四链体与ZrMOFs协同增强荧 光染料ThT的荧光，形成强荧光信号；2、ZrMOFs高效吸附、富集水中的孔雀 石绿，ThT快速产生荧光响应信号，提高了检测孔雀石绿的速度与灵敏度。
本发明采用的技术方案如下：
一、G-四链体-ThT荧光探针的制备方法
包括以下步骤：
S1：在离心管中设置体积为186μL的反应体系，其中包含160μL H2O、20 μL浓度为1M的KCl、3μL浓度为50μM的DNA和3μL浓度为20μM的ThT (硫黄素T)；
S2：将步骤S1中的反应混合物于室温反应0.5h即得到G-四链体-ThT荧光 探针。该荧光探针可大批量制备并较长时间贮存备用。
所述步骤S1中的DNA为富含G碱基的DNA序列。
所述步骤S1中的KCl用于在反应体系中提供K+，以促进富含G碱基的DNA 序列自组装形成G-四链体。
所述步骤S2中，富含G碱基的DNA自组装形成G-四链体，并与ThT结 合，形成G-四链体-ThT荧光探针。
二、锆金属-有机骨架化合物(Zr-Metal-Organic Frameworks，ZrMOFs)的 制备方法
包括以下步骤：
S1：称取四氯化锆(ZrCl4)、1,2,4,5-四(4-羧苯基)苯(H4TCPB)和苯甲 酸(benzoicacid)超声溶解于二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶剂中；
S2：将步骤S1得到的反应混合物转入含有聚四氟乙烯内衬的50mL反应釜 中，于120℃反应6h；
S3：将步骤S2合成反应结束得到的白色浑浊液体自然冷却至室温(25℃)， 然后过滤得到白色晶体粉末，将白色晶体粉末分别用DMF清洗2次、甲醇 (methanol)清洗1次，最后在60℃烘箱中干燥过夜，即得到ZrMOFs材料， 置于密闭聚乙烯离心管中4℃避光保存备用。
所述ZrMOFs由ZrCl4提供的高价态金属离子Zr4+与疏水性有机配体 H4TCPB的羧基(-COOH)通过较强的配位键配位结合组成；
所述疏水性有机配体用于与锆离子形成较强的配位键且阻隔水分子进入 ZrMOFs材料，从而提高了ZrMOFs在水溶液中的稳定性。
所述步骤S1中的benzoic acid作为步骤S2合成反应时的结构调节剂， benzoicacid纯度为99.5％。
所述步骤S1中ZrCl4、H4TCPB和benzoic acid的称取量分别为50mg、70mg、 2700mg，DMF用量为32mL。
所述的ZrMOFs的荧光性质使用酶标仪表征。
所述的ZrMOFs的形貌使用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM) 表征。
三、基于复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs的水中孔雀石绿快速检测方法
包括以下步骤：
S1：称取上述制备好的ZrMOFs，将其超声分散于水中，制成250μg/mL的 悬浮液；
S2：取步骤S1中的ZrMOFs悬浮液4μL，加入到前述体积为186μL的G- 四链体-ThT荧光探针中，振荡混匀后于室温反应15min，即得到复合探针G-四 链体-ThT@ZrMOFs；
S3：取10μL含有孔雀石绿的样品溶液，加入到上述体积为190μL的复合 探针G-四链体-ThT@ZrMOFs中，振荡混匀后于室温反应15min；
S4：将反应混合物用移液器转移至96孔酶标板的样品孔中，用酶标仪检测 样品的发射光谱，激发光波长设置为300nm，发射光谱采集范围设置为350～750 nm；
S5：从发射光谱可以观察到，孔雀石绿浓度越大，复合探针G-四链体 -ThT@ZrMOFs中ThT在495nm处的荧光被淬灭越多。复合探针495nm处的 荧光强度FI与孔雀石绿浓度C的对数值Log(C/μg/kg)呈负相关，将荧光强度 FI与孔雀石绿浓度的对数值Log(C/μg/kg)拟合得线性回归方程。
检测时，在200μL反应体系中，ZrMOFs悬浮液的浓度固定为5μg/mL， ThT的浓度在0.2～0.5μM(MG-G1与ThT的物质的量之比为5:2)范围内皆具 有较好的检测效果，ThT的浓度为0.3μM时效果最佳。
本发明的有益效果：
1、本发明利用ZrMOFs、G-四链体与荧光染料ThT自组装形成荧光复合探 针G-四链体-ThT@ZrMOFs，复合探针中ZrMOFs与G-四链体协同增强了ThT的荧光；
2、本发明复合探针中的ZrMOFs高效吸附、富集水中的孔雀石绿，ThT快 速产生荧光响应信号，提高了检测孔雀石绿的速度与灵敏度；
3、本发明的检测过程只包含“混匀-孵育”操作，无其他分离、富集、洗涤 等步骤，可利用酶标仪进行高通量、快速检测，简单、便捷，检测孔雀石绿所 需时间可控制在1h以内，检测的线性范围为0.5至100μg/kg，准确定量孔雀石 绿的浓度低至0.5μg/kg，低于目前常用的基于胶体金和抗体的速测卡的检测限 (1μg/kg)。
附图说明
图1为复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs的制备及其用于孔雀石绿快速检 测的示意图。
图2为制备得到的ZrMOFs材料的晶体粉末实物照片及其扫描电镜与透射 电镜图；(A)为晶体粉末实物照片，(B)为扫描电镜图，(C)为透射电镜 图。
图3为复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs的紫外-可见吸收光谱与荧光发射 光谱图。
图4为使用复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs快速检测孔雀石绿的荧光响 应及线性回归方程。(A)为孔雀石绿的浓度由0逐渐增大到1000μg/kg时复合 探针G-四链体-ThT@ZrMOFs的荧光响应光谱图；(B)为复合探针G-四链体 -ThT@ZrMOFs在495nm处的荧光强度与孔雀石绿浓度对数值的关系；(C) 为复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs快速检测孔雀石绿的线性范围与回归方程 拟合图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。应当理解，本文所描述的 优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
如图1所示，利用ZrCl4与H4TCPB，并以benzoic acid作为结构调节剂， 合成水中稳定的ZrMOFs材料。
S1：称取50mg ZrCl4、70mg H4TCPB和2700mg benzoic acid，将ZrCl4、 H4TCPB和benzoic acid加入32mL DMF中，超声10min使其充分溶解、混匀。 将反应物转入50mL含有聚四氟乙烯内衬的反应釜中，于120℃反应6h。
S2：反应结束后，待反应得到的白色浑浊液体降至室温，然后过滤，得白 色晶体粉末。
S3：将上述白色晶体粉末先后分别用DMF清洗2次、methanol清洗1次。 然后，烘箱中60℃干燥过夜。制备好的ZrMOFs材料置于密闭聚乙烯离心管中， 4℃避光保存。
如图2(A)所示，制备好的ZrMOFs晶体材料为白色粉末。
实施例2
对ZrMOFs材料进行形貌表征。利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对 ZrMOFs材料进行形貌表征，结果如图2(B)和图2(C)所示，该ZrMOF晶 体材料呈球形，大小较均匀，主要粒径约为250nm。
实施例3
制备复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs。
S1：在体积为600μL的离心管中依次加入160μL H2O、20μL浓度为1M 的KCl、3μL浓度为50μM的DNA和3μL浓度为20μM的ThT；
S2：将步骤S1中的反应物混合均匀，并于室温反应0.5h，得到体积为186μL 的G-四链体-ThT荧光探针；
S3：称取预先制备好的ZrMOFs粉末，将其超声分散于水中，制成250μg/mL 的悬浮液；
S4：取步骤S3中的ZrMOFs悬浮液4μL，加入到步骤S2体积为186μL的 G-四链体-ThT荧光探针中；
S5：将步骤S4中的反应物混合均匀，于室温反应15min，即得到体积为 190μL的复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs。
实施例4
对复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs进行光谱表征。
S1：将实施例3得到的复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs加入到石英比色 皿中，以超纯水为空白对照，利用紫外-可见分光光度计，扫描获得复合探针 G-四链体-ThT@ZrMOFs的紫外-可见吸收光谱，波长扫描范围设置为200至800 nm。结果如图3(A)所示。
S2：用移液器将复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs从石英比色皿中取出， 加入到适用于测量荧光光谱的96孔酶标板样品孔中，将酶标仪激发光波长设置 为300nm，发射光谱采集范围设置为350～750nm，步长设置为5nm，扫描获得 复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs的荧光发射光谱。结果如图3(B)所示，复 合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs在400nm与495nm处各有1个明显发射峰。
实施例5
利用G-四链体-ThT@ZrMOFs快速检测水中的孔雀石绿。
S1：按照实施例3中的步骤，分别在体积为600μL的离心管中平行制备多 份复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs；
S2：向制备好的190μL复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs中加入10μL含 有孔雀石绿的标准样品溶液，振荡混匀，室温避光静置反应15min；
S3：用移液器将S2中反应好的样品溶液全部取出，加入到适用于测量荧光 光谱的96孔酶标板样品孔中，将酶标仪激发光波长设置为300nm，发射光谱采 集范围设置为350～750nm，步长设置为5nm，扫描荧光发射光谱。
按照上述S1至S3的步骤，将含有相同浓度的孔雀石绿样品溶液平行测量3 次。
测试结果：
如图4(A)所示，随着孔雀石绿的终浓度由0增加至1000μg/kg(由低至 高，依次为0、0.5、1、5、10、20、50、100、200、500及1000μg/kg)，复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs在400nm与495nm处的发光强度皆逐渐减弱， 其中，495nm处的荧光发射峰对不同浓度的孔雀石绿具有更好的区分度，灵敏 度最佳。
如图4(B)所示，将复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs在495nm处的荧 光强度FI与孔雀石绿浓度的对数值Log(C/μg/kg)做图，可观察到孔雀石绿浓度 在0.5至100μg/kg区间范围内时，495nm处的荧光强度FI与孔雀石绿浓度的 对数值Log(C/μg/kg)呈线性关系。
如图4(C)所示，拟合得到孔雀石绿浓度与荧光强度的线性回归方程y＝ -6441.1Log C+14430.8，线性相关系数r2为0.97，检测线性范围为0.5至100μg/kg。 由此得到，复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs可快速检测准确定量孔雀石绿的浓度低至0.5μg/kg。
实施例6
水产品暂养池水实际样品中的添加回收试验。
S1：分别向暂养池水、河水中添加孔雀石绿，3档添加浓度分别为2.00μg/kg、 20.0μg/kg和200μg/kg。
S2：直接取S1中的添加样品检测。在体积为600μL的离心管中，依次加入100μL添加了孔雀石绿的暂养池水或河水、62μL超纯水、20μL浓度为1M 的KCl、4μL浓度为50μM的DNA和10μL浓度为20μM的ThT，振荡混匀， 室温避光反应0.5h；
S3：加入4μL浓度为250μg/mL的ZrMOFs悬浮液(至此检测反应体系体 积为200μL，孔雀石绿浓度为1.00μg/kg、10.0μg/kg和100μg/kg，)，振荡混 匀，室温避光反应15min；
S4：用移液器将S2中反应好的样品溶液全部取出，加入到适用于测量荧光 光谱的96孔酶标板样品孔中，将酶标仪激发光波长设置为300nm，发射光谱采 集范围设置为350～750nm，步长设置为5nm，扫描荧光发射光谱。
S5：按照上述S2至S4的步骤，含有相同添加浓度的孔雀石绿样品溶液平 行测量3次。
S6：根据实施例5中确定的LI和线性回归方程计算回收率、相对标准偏差。
测试结果：如下表1所示，暂养池水、河水实际样品中的添加回收试验回 收率在79.3％至104％之间，相对标准偏差在1.36％至6.23％之间。添加回收试 验结果满意。
表1添加回收试验结果
注：添加浓度是向样品中添加已知量的孔雀石绿后计算得到的浓度；检测浓度是添加样品中 检测出的浓度。添加回收试验用于验证方法的可靠性。

Claims (6)

1.一种快速检测孔雀石绿的复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs，其特征在于，所述的复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs主要由DNA G-四链体、ThT与锆金属-有机骨架化合物自组装形成；
所述的G-四链体由富含G碱基的DNA链MG-G1在K+的存在下折叠而成；DNA链MG-G1的碱基序列为：5′-GGGTTTGGGTTTGGGTTTGGG-3′；
所述的锆金属-有机骨架ZrMOFs由ZrCl4提供的高价态金属离子Zr4+与疏水性有机配体H4TCPB的羧基通过配位键配位结合组成；
所述的ThT为硫磺素T。
2.根据权利要求1所述的快速检测孔雀石绿的复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs，其特征在于，所述的复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs制备方法如下：
1)取富含G碱基的DNA链MG-G1和ThT于含有K+的水溶液中振荡混匀，室温下避光反应0.5h，结合形成G-四链体-ThT荧光探针；
2)取超声分散均匀的ZrMOFs悬浮液，加入到G-四链体-ThT荧光探针中，振荡混匀后于室温反应15min，即完成自组装得到复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs。
3.根据权利要求2所述的快速检测孔雀石绿的复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs，其特征在于，MG-G1与ThT的物质的量之比为5:2。
4.根据权利要求2所述的快速检测孔雀石绿的复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs，其特征在于：通过ZrMOFs将G-四链体-ThT的发光增强20倍。
5.采用权利要求1～4任一所述的复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs快速检测孔雀石绿的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取含有孔雀石绿的样本溶液，加入到复合探针G-四链体-ThT@ZrMOFs中，振荡混匀后于室温反应15min；
2)将酶标仪激发光波长设置为300nm，检测步骤1)反应混合物在495nm处的荧光强度；
3)根据预先绘制的线性回归曲线和反应混合物在495nm处的荧光强度推算得到样本溶液中孔雀石绿的浓度。
6.根据权利要求5所述的快速检测孔雀石绿的方法，其特征在于，所述的预先绘制的线性回归曲线通过下述方法得到：
复合探针中的ThT在495nm处的荧光强度与孔雀石绿浓度的对数值呈负相关；将复合探针分别与多份不同浓度且浓度已知的孔雀石绿溶液反应，检测反应混合物在495nm处的荧光强度，将反应混合物在495nm处的荧光强度与孔雀石绿浓度的对数值做图得到线性回归曲线。
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