CN109406475A - 双标记快速响应核酸适配体探针及其检测黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents
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Abstract
一种双标记快速响应核酸适配体探针，该探针由5’端、3’端分别被荧光显色基团标记的核酸适配体和5’端、3’端分别被荧光淬灭基团标记的互补探针组成，该核酸适配体为可特异性识别黄曲霉毒素B1的核酸适配体核，即AFB1核酸适配体，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，该互补探针与AFB1核酸适配体双端互补，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示。使用本发明所述方法可对黄曲霉毒素B1快速检测，其加入黄曲霉毒素B1后的识别过程可在一分钟完成，并且一个黄曲霉毒素B1分子可引发两个荧光基团信号的恢复，灵敏度高，整个反在均相和恒温的溶液环境中进行，操作简单。
Description
技术领域
本发明属于黄曲霉毒素B1检测领域，涉及一种双标记快速响应核酸适配体探针，包括双端标记荧光显色基团的可特异性识别黄曲霉毒素B1的核酸适配体，即AFB1核酸适配体，与该核酸适配体互补并且双端标记荧光淬灭基团的互补探针，以及利用该探针进行非酶依赖扩增的快速均相检测黄曲霉毒素B1的方法。
背景技术
黄曲霉毒素是由黄曲霉菌产生的次生代谢产物，在湿热地区，比如我们四川省，农产品中出现黄曲霉毒素的机率非常高。它是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素，其中，黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，简称AFB1）是一种毒性最强的黄曲霉毒素，被国际癌症研究机构确认为一种最主要的致癌物。目前，尚无绝对有效的措施避免和杜绝黄曲霉毒素的污染。从我国粮油食品安全角度出发，有必要对黄曲霉毒素在农产品中的含量进行快速可靠监测和有效限制。例如花生、花生油等是最易受黄曲霉毒素污染的粮油食品，国家对食品中的黄曲霉毒素含量有着严格的控制，中国食品卫生标准中规定了花生、花生油中黄曲霉毒素B1允许量为≤12 μg/kg。因此，需要进一步规范和加强对黄曲霉毒素B1的检测和监控，黄曲霉毒素B1的快速临场检测方法对农产品的品质控制、污染防范和产品溯源体系的建立至关重要。
目前黄曲霉毒素B1的分析方法主要基于两类：（1）依赖大型仪器的薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱串联质谱法（LC-MS）；（2）基于抗体-抗体作用的酶联免疫法（ELISA）。依赖大型仪器的检测方法在时效性和应用场景上受到非常多限制，并且需要专业的仪器操作人员，而基于抗体识别的方法也存在诸多限制因素，如抗体制备繁琐、保存困难，成本较高，不利于现场快速检测。
核酸适配体（aptamer）一类具有分子识别性的单链核酸（DNA或者RNA）链，具有易合成修饰、稳定和廉价等优势，并在在基础研究、分子诊断以及农产品及农田环境污染物监测等诸多领域中展示出广阔的应用前景，目前已公开的利用核酸适配体检测黄曲霉毒素B1的方法大多采用单标记信号，一个毒素靶分子只能引发一个荧光信号的响应，因而检测灵敏度较低，或者需要结合其它纳米材料或者酶催化放大过程，程序较为复杂繁琐，耗时较长，不能做到在同一反应体系中快速的完成整个检测过程。
发明内容
本发明提供一种双标记快速响应核酸适配体探针及非酶依赖扩增的黄曲霉毒素B1均相、快速检测方法，可在一分钟完成对黄曲霉毒素B1的识别过程，操作简便，节约检测时间。
本发明中所述的双标记快速响应核酸适配体探针由5’端、3’端分别被荧光显色基团标记的核酸适配体和5’端、3’端分别被荧光淬灭基团标记的互补探针组成，该核酸适配体为可特异性识别黄曲霉毒素B1的核酸适配体核，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，简称“AFB1核酸适配体”，该互补探针与AFB1核酸适配体双端互补，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示。
进一步的，所述荧光显色基团为FITC、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、Cy5、Alexa Fluor 488；所述的荧光淬灭基团为BHQ-1、BHQ2、Dabcyl。
进一步的，所述的双标记快速响应核酸适配体探针的制备方法包含以下步骤：
将双端标记荧光显色基团的核酸适配体和双端标记荧光淬灭基团的互补探针溶解在结合缓冲溶液中，混匀后在室温静止反应30~40min即可完成双标记快速响应核酸适配体探针的组装，组装完成后核酸适配体和互补探针形成双链末端互补结构，即得双标记快速响应核酸适配体探针，该探针可在低温（4℃）下保存。
进一步的，所述双端标记荧光淬灭基团的互补探针和双端标记荧光显色基团的核酸适配体的摩尔比为1~1.2:1。
进一步的，所述结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT。
本发明所制得的双标记快速响应核酸适配体探针可以应用于黄曲霉毒素B1的快速检测。
本发明所述黄曲霉毒素B1的均相、快速检测方法，步骤如下：
本发明所述，步骤如下：
（1）制备双标记快速响应核酸适配体探针
将双端标记荧光淬灭基团的互补探针、双端标记荧光显色基团的AFB1核酸适配体溶解在结合缓冲溶液(成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mMDTT)中并混合均匀形成反应体系，然后在室温下静止反应30~40min即形成含双标记快速响应核酸适配体探针的溶液，形成的双链互补结构，可使荧光淬灭基团和荧光显色基团互相靠近，因此带来荧光淬灭；反应体系中，互补探针与AFB1核酸适配体的摩尔比为1~1.2:1；
（2）建立黄曲霉毒素B1浓度与荧光信号的标准曲线
配制一系列含不同浓度黄曲霉毒素B1标准品水溶液，然后将一定量不同浓度黄曲霉毒素B1标准品水溶液分别与一定量步骤（1）制备的双标记快速响应核酸适配体探针体系溶液混合均匀，进行黄曲霉毒素B1识别，该识别过程可在一分钟内完成。黄曲霉毒素B1可与AFB1核酸适配体结合，从而使已形成双链互补结构的标记快速响应核酸适配体探针解离成单链，从而使荧光显色基团与荧光淬灭基团分离，荧光显色基团的荧光信号恢复增加，继后进行荧光检测，并根据荧光检测结果建立以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标的标准曲线；
（3）对实际样品中黄曲霉毒素B1的分析
将实际物质进行前处理后得到待测液体，将一定量的待测液与一定量步骤（1）中制备的双标记快速响应核酸适配体探针溶液体系混合均匀，使得黄曲霉毒素B1可以识别并结合AFB1核酸适配体，然后双标记快速响应核酸适配体探针的双链互补结构发生解离，继而引发荧光显色基团的信号恢复，然后进行荧光检测得到荧光强度，将所得荧光强度带入步骤（2）建立的标准曲线的方程中，即可计算出实际物质所含黄曲霉毒素B1的浓度；
上述方法的步骤（3）中，将待测实际物质前处理过程如下：
在室温下将待测实际物质加入由甲醇和去离子水组成的提取液（甲醇和去离子水体积比为6:4）中先震荡30 min后离心5 min，离心转速为7000 rpm，然后取上清液作为待测样品；待测实际物质与提取液的体积比为1:（3~5），或待测实际物质与提取液的质量与体积之比为1:（3~5），所述质量的单位为g，所述体积的单位为mL。
上述方法的步骤（2）中，黄曲霉毒素B1标准品水溶液与双标记快速响应核酸适配体探针溶液的体积比优选1:9；上述方法的步骤（3）中，待测样品与双标记快速响应核酸适配体探针溶液的体积比优选1:9。
上述方法的步骤（2）和步骤（3）中，荧光检测的激发波长均为488 nm，发射波长均为515~650 nm。
本发明所述黄曲霉毒素B1均相、快速检测方法，其检测原理如图1所示，带双端标记荧光淬灭基团的互补探针与双端标记荧光显色基团的AFB1核酸适配体通过杂交结合以后会形成双端互补的稳定结构，该结构会使得标记在互补探针上的荧光淬灭基团和标记在AFB1核酸适配体上的荧光显色基团相互靠近，从而带来荧光淬灭的效果。但该互补探针与AFB1核酸适配体的结合力弱于黄曲霉毒素B1与AFB1核酸适配体的结合力，因此当加入黄曲霉毒素B1后，黄曲霉毒素B1会与AFB1核酸适配体相结合，使AFB1核酸适配体与互补探针发生解离，解离后的AFB1核酸适配体会使得荧光显色基团与荧光淬灭基团分开，从而导致荧光信号的恢复，产生较强的荧光信号。由于一个黄曲霉毒素B1分子对应结合一条核酸适配体链，因此每个黄曲霉毒素B1分子可触发两个荧光信号的恢复，因此荧光信号强度的恢复会随着AFB1浓度的增加而增加，并且灵敏度较传统的单标记荧光基团的探针更高，响应更快速。由此原理，可配制一系列不同浓度AFB1标准品水溶液，将AFB1标准品水溶液与含双标记快速响应核酸适配体探针的溶液混合进行AFB1识别，再进行荧光检测，整个反应在均相的体系中进行，并根据荧光检测结果建立以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标的标准曲线，在此基础上构建黄曲霉毒素B1均相、快速检测方法。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种双标记快速响应核酸适配体探针，与传统单标记的荧光探针先比，该探针具有一个目标物分子可触发两个荧光基团信号响应恢复的特性，实现非酶依赖的信号扩增，因此相比传统的单标记荧光探针，可以提高检测灵敏度，同时缩短了检测时间，在一分钟时荧光恢复可达最大值，因此可以在一分钟内完成对黄曲霉毒素B1的识别（如图2）。
2、本发明所述黄曲霉毒素B1均相、快速检测方法操作简单，可在一个反应离心管内均相溶液中完成整个过程，不需要大型仪器设备，提高了检测效率，在临场检测中具有极大的应用潜力和推广价值。
3、本发明所述黄曲霉毒素B1均相、快速检测方法所用试剂及检测操作对人员无害，对环境无污染。
4、本发明所述方法各个步骤在室温下（25℃）即可进行，不需要复杂的控温过程。
附图说明
图1是本发明所述黄曲霉毒素B1均相、快速检测方法的原理图，图中，AFB1为黄曲霉毒素B1，F为标记的荧光显色基团，Q为标记的荧光淬灭基团。
图2是本发明检测方法识别黄曲霉毒素B1的时间-荧光信号图，可在一分钟内使荧光信号恢复，在一分钟内完成黄曲霉毒素B1检测过程。
图3是黄曲霉毒素B1浓度与荧光信号的标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明所述双标记快速响应核酸适配体探针及黄曲霉毒素B1均相、快速检测方法作进一步说明。
下述实施例中，结合缓冲溶液(成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70mM钾盐离子和1 mM DTT)由实验室配置；黄曲霉毒素B1购自北京伊诺凯科技有限公司；甲醇购自成都市科隆化学品有限公司；荧光分光光度计型号为F-7000，由日本日立集团生产。
下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：双标记快速响应核酸适配体探针的设计与合成
本实施例利用https://sg.idtdna.com/calc/analyzer和http://www.nupack.org网站，通过核酸杂交热力学辅助计算，设计与AFB1核酸适配体双端互补的互补探针。所述AFB1核酸适配体从现有技术中获得（见Patent:PCT/CA2010/001292），其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，所述互补探针的苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示。
将所上述核苷酸序列交由DNA合成公司——生工生物工程（上海）股份有限公司，委托其合成并在AFB1核酸适配体双端标记荧光显色基团（FITC）；在互补探针双端标记荧光淬灭基团（BHQ1）。
实施例2：制备双标记快速响应核酸适配体探针并建立黄曲霉毒素B1浓度与荧光信号的标准曲线
（1）在洁净透明容器中加入结合缓冲溶液(成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT)、双端标记荧光显色基团的AFB1核酸适配体（浓度为10 μM）、双端标记荧光淬灭基团的互补探针（浓度为12 μM）和去离子水（体积比分别为2:1:1:14），总体积为1 mL，混匀后在室温下静止反应30 min，使得双标记快速响应核酸适配体探针制备完成；
（2）在七个洁净的200 μL离心管中分别加入18 μL实施例中制备好的溶液，并分别加入含不同浓度黄曲霉毒素B1标准品的溶液2 μL至20 μL，混合后静置1min，以终体积20 μL计算，黄曲霉毒素B1标准品的浓度分别为0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL；
（3）然后在激发波长488 nm，发射波长范围515-650 nm参数下对七只离心管中的溶液进行荧光检测，根据荧光检测结果建立以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标、荧光信号为纵坐标的标准曲线，如图3所示，所述标准曲线的方程为y= 1.102x+301.56381，R2=0.9907，式中，x为黄曲霉毒素B1浓度，y为荧光信号。
实施例3：豆瓣酱中所含黄曲霉素B1的检测及回收率计算
本实施例的步骤依次如下：
（1）取三只洁净50 mL离心管，分别加入5g不含黄曲霉毒素B1的豆瓣酱、12 mL甲醇、8mL去离子水和不同量的黄曲霉毒素B1并混合均匀，然后震荡30 min，震荡完成后在7000rpm转速下离心5 min，取上清液作为待测样品备用，三只离心管中黄曲霉毒素B1的浓度分别为50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL；
（2）另取三只洁净的200 μL离心管，向三只200 μL离心管中分别加入18 μL实施例2制备好的含双标记快速响应核酸适配体探针的溶液和2 μL黄曲霉毒素B1浓度分别为50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL的待测样品，然后混匀后在室温下静置反应1 min；
（4）向然后用荧光分光光度计分别对三只洁净的200 μL离心管中的液态物质进行荧光检测，荧光检测的激发波长为488 nm，发射波长范围为515~650 nm，将测得的荧光强度值分别代入实施例3所建立标准曲线的方程，计算各测试样品中黄曲霉毒素B1的浓度及回收率，结果见表1。
表1各测试样品中黄曲霉毒素B1的浓度及回收率表
。
从表1可以看出，本发明所述方法对豆瓣酱中黄曲霉毒素B1检测回收率在96.96%~114.8%之间，证明该方法可行性高。
实施例4：花生油中所含黄曲霉素B1的检测
本实施例的步骤依次如下：
（1）取三只洁净50 mL离心管，分别加入5 mL不含黄曲霉毒素B1的花生油、12 mL甲醇、8mL去离子水和不同量的黄曲霉毒素B1并混合均匀后震荡30 min，之后在7000 rpm转速下离心5 min，取上清液作为待测样品备用，三只离心管中黄曲霉毒素B1的浓度分别为50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL；
（2）另取三只洁净的200 μL离心管，向三只200 μL离心管中分别加入18 μL实施例2制备好的含双标记快速响应核酸适配体探针的溶液和2 μL黄曲霉毒素B1浓度分别为50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mLmL、300ng/mLmL的待测样品，然后混匀后在室温下静置1 min；
（4）向然后用荧光分光光度计分别对三只洁净的200 μL离心管中的液态物质进行荧光检测，荧光检测的激发波长为488 nm，发射波长范围为515~650 nm，将测得的荧光强度值分别代入实施例3所建立标准曲线的方程，计算各测试样品中黄曲霉毒素B1的浓度及回收率，结果见表2。
表2各测试样品中黄曲霉毒素B1的浓度及回收率表
。
从表2可以看出，本发明所述方法对豆瓣酱中黄曲霉毒素B1检测回收率在90.3%~102.91%之间，证明该方法可行性高。
序列表
<110> 四川大学
<120> 双标记快速响应核酸适配体探针及其检测黄曲霉毒素B1的方法
<160> 2
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
Gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
Tgtgggccta tattttattt atttattttt tattttttca cgtgcccaac 50
Claims (10)
1.一种双标记快速响应核酸适配体探针，其特征在于：该探针包含5’端、3’端分别被荧光显色基团标记的可特异性识别黄曲霉毒素B1的核酸适配体，即AFB1核酸适配体，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，5’端、3’端分别被荧光淬灭基团标记的互补探针，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示，双标记快速响应核酸适配体探针为AFB1核酸适配体和互补探针构成的双链末端互补结构。
2.根据权利要求1中所述的双标记快速响应核酸适配体探针，其特征在于：所述荧光显色基团为FITC、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、Cy5、Alexa Fluor 488；所述的荧光淬灭基团为BHQ-1、BHQ2、Dabcyl。
3.一种如权利要求1或2所述的双标记快速响应核酸适配体探针的制备方法，其特征在于：该制备方法包含以下步骤：
将双端标记荧光显色基团的AFB1核酸适配体和双端标记荧光淬灭基团的互补探针溶解在结合缓冲溶液中，混匀后在室温静止反应30~40min即可完成双标记快速响应核酸适配体探针的组装，组装完成后AFB1核酸适配体和互补探针形成双链末端互补结构，即得双标记快速响应核酸适配体探针，该探针可在低温（4℃）下保存。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述双端标记荧光淬灭基团的互补探针和双端标记荧光显色基团的AFB1核酸适配体的摩尔比为1~1.2:1。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT。
6.权利要求1或2所述的双标记快速响应核酸适配体探针或权利要求3或4所述制备方法得到的双标记快速响应核酸适配体探针在检测黄曲霉毒素B1中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述双标记快速响应核酸适配体探针检测黄曲霉毒素B1的方法包括以下步骤：
（1）制备双标记快速响应核酸适配体探针
将双端标记荧光显色基团的核酸适配体和双端标记荧光淬灭基团的互补探针溶解在结合缓冲溶液中，混匀后在室温静止反应30~40min即可完成双标记快速响应核酸适配体探针的组装，组装完成后AFB1核酸适配体和互补探针形成双链末端互补结构，即得双标记快速响应核酸适配体探针，所述结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT；
（2）建立分析黄曲霉毒素B1标准曲线
将不同浓度黄曲霉毒素B1标准品水溶液分别与含双标记快速响应核酸适配体探针的溶液混合均匀，进行黄曲霉毒素B1识别，黄曲霉毒素B1和核酸适配体的结合会导致双标记快速响应核酸适配体探针双链末端互补结构的解链，从而引发标记在AFB1核酸适配体两端荧光显色基团信号的恢复，然后进行荧光检测，并根据检测结果建立以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标、荧光信号为纵坐标的标准曲线；
（3）对实际样品中黄曲霉毒素B1的分析
将待测样品与步骤（1）制备的含双标记快速响应核酸适配体探针的溶液混合均匀，在室温静止1 min进行黄曲霉毒素B1的识别过程，然后进行荧光检测得到荧光信号，将所得荧光信号带入步骤（2）所建立的标准曲线方程，即可计算出待测样品中所含黄曲霉毒素B1的浓度。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述双端标记荧光淬灭基团的互补探针和双端标记荧光显色基团的AFB1核酸适配体的摩尔比为1~1.2:1。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）中，荧光检测的激发波长均为488 nm，发射波长均为515~650 nm。
10.一种检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）制备双标记快速响应核酸适配体探针
将双端标记荧光显色基团的核酸适配体和双端标记荧光淬灭基团的互补探针溶解在结合缓冲溶液中，混匀后在室温静止反应30~40min即可完成双标记快速响应核酸适配体探针的组装，组装完成后AFB1核酸适配体和互补探针形成双链末端互补结构，即得双标记快速响应核酸适配体探针，所述结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT；所述双端标记荧光淬灭基团的互补探针和双端标记荧光显色基团的AFB1核酸适配体的摩尔比为1~1.2:1；
（2）建立分析黄曲霉毒素B1标准曲线
将不同浓度黄曲霉毒素B1标准品水溶液分别与含双标记快速响应核酸适配体探针的溶液混合均匀，进行黄曲霉毒素B1识别，黄曲霉毒素B1和核酸适配体的结合会导致双标记快速响应核酸适配体探针双链末端互补结构的解链，从而引发标记在AFB1核酸适配体两端荧光显色基团信号的恢复，然后进行荧光检测，荧光检测的激发波长均为488 nm，发射波长均为515~650 nm，并根据检测结果建立以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标、荧光信号为纵坐标的标准曲线；
（3）对实际样品中黄曲霉毒素B1的分析
将待测样品与步骤（1）制备的含双标记快速响应核酸适配体探针的溶液混合均匀，在室温静止1 min进行黄曲霉毒素B1的识别过程，然后进行荧光检测得到荧光信号，荧光检测的激发波长均为488 nm，发射波长均为515~650 nm，将所得荧光信号带入步骤（2）所建立的标准曲线方程，即可计算出待测样品中所含黄曲霉毒素B1的浓度。
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