CN107084961A - 检测黄曲霉毒素b1的适配体分子对、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

检测黄曲霉毒素b1的适配体分子对、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供检测黄曲霉毒素B1的适配体分子对、试剂盒及其检测方法。该适配体分子对是由SEQ ID NO.1所示分子的5’端经FAM标记与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示分子的3’端经BHQ‑1标记所得分子组成的分子对，或者是由SEQ ID NO.2所示分子的5’端经FAM标记与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示分子的3’端经BHQ‑1标记所得分子组成的分子对，或者是由SEQ ID NO.3所示分子的5’端经FAM标记与SEQ ID NO.8所示分子的3’端经BHQ‑1标记所得分子组成的分子对。本发明的产品和方法成本低、稳定性高，检测限达0.2nM。

Description

检测黄曲霉毒素B1的适配体分子对、试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素B1的适配体分子对、试剂盒及其检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素是具有强毒性的真菌毒素，可污染玉米、花生等粮食、谷物和食品，动物和人食用被黄曲霉毒素污染的食品后，黄曲霉毒素会造成肝脏损伤、导致癌症、对动物和人的健康造成重大危害，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)污染广泛，毒性最强。检测黄曲霉毒素B1对于食品安全、食品质量控制和人类健康等具有重要意义。常用的一些检测方法主要包括薄层色谱分析、酶联免疫分析、液相色谱分析等方法。这些方法往往需要昂贵的仪器和复杂的操作步骤。采用免疫抗体的分析方法需要采用免疫抗体作为识别试剂，往往还需要采用黄曲霉素和蛋白偶联的抗原，免疫抗体的制备成本高，制备批间重现性差，抗体稳定性对温度比较敏感，抗体试剂的保存和运输的条件要求高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种检测黄曲霉毒素B1的适配体分子对、试剂盒及其检测方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。
为实现上述目的，本发明提供一种检测黄曲霉毒素B1的适配体分子对，其是如下的分子对：
(1)序列如SEQ ID NO.1所示核酸分子的5’端经FAM(fluorescein，荧光素)标记得到的分子与序列如SEQ ID NO.4所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1(Black HoleQuencher-1)标记得到的分子组成的分子对；或
(2)序列如SEQ ID NO.1所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQID NO.5所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对；或
(3)序列如SEQ ID NO.2所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQID NO.6所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对；或
(4)序列如SEQ ID NO.2所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQID NO.7所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对；或
(5)序列如SEQ ID NO.3所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQID NO.8所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对。
上述技术方案换一种表述方式如下：一种检测黄曲霉毒素B1的适配体分子对，其是如下的分子对：
由SEQ ID NO.1所示分子的5’端经FAM标记与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示分子的3’端经BHQ-1标记所得分子组成的分子对，或者是由SEQ ID NO.2所示分子的5’端经FAM标记与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示分子的3’端经BHQ-1标记所得分子组成的分子对，或者是由SEQ ID NO.3所示分子的5’端经FAM标记与SEQ ID NO.8所示分子的3’端经BHQ-1标记所得分子组成的分子对。
本发明还提供一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其包括上述的适配体分子对。
本发明还提供一种检测黄曲霉毒素B1的方法，其是将上述适配体分子对与待测样本混合后温育，测定荧光强度值。
与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：
本发明采用核酸适配体作为特异性识别黄曲霉毒素B1的亲和配体，不同于以往利用免疫抗体检测黄曲霉毒素的分析方法。核酸适配体具有易制备、稳定性高、易引入荧光标记等优点。荧光检测技术具有灵敏、简单、快速、无需分离等优点。本发明的产品和方法在应用时，采用荧光染料标记的核酸适配体和猝灭剂修饰的短链核酸所构成的荧光开关方法，具有荧光背景低，荧光变化显著，荧光增强倍数高、检测灵敏度高等优势。本发明的检测限可达到0.2nM。
附图说明
图1显示实施例1中采用荧光素标记的核酸适配体AF31-5F和BHQ-1标记的短链核酸分子AF31-C13B或AF31-C14B检测不同浓度的黄曲霉毒素B1的结果。
图2显示实施例2中采用荧光素标记的核酸适配体AF29-5F和BHQ-1标记的短链核酸分子AF29-C14B或AF29-C13B检测不同浓度的黄曲霉毒素B1的结果。
图3显示实施例3中采用荧光素标记的核酸适配体AF27-5F和BHQ-1标记的短链核酸分子AF27-C14B检测不同浓度的黄曲霉毒素B1的结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
核酸适配体是从寡聚核苷酸文库中筛选得到的可高亲和力高选择性识别目标分子的单链核酸分子。核酸适配体的出现为检测黄曲霉毒素提供了新的研究手段。作为核酸类的亲和配体，核酸适配体在分析检测领域的应用具有很多优点，如合成制备方便，热稳定性高，易于引入功能团如荧光染料标记等。核酸适配体在亲和力和选择性方面都可以和免疫抗体相媲美，核酸适配体的分析方法可以克服免疫分析中免疫抗体的在稳定性和制备等方面的一些局限，显示出潜力，核酸适配体的应用也受到广泛的关注，在分析传感领域显示出很大的潜力和应用前景。
本申请的发明人基于本领域的现状，经过大量的实验探究和反复的实践验证，终于发现能够检测黄曲霉毒素B1的DNA核酸适配体及与其配对使用的互补短链核酸分子，并将其开发制备成试剂盒应用于实际检测中，从而得到了本发明。本发明的DNA核酸适配体可以与黄曲霉毒素B1选择性作用，具有很强的亲和力，利用核酸适配体可以发展检测黄曲霉毒素B1的检测方法。
本发明的原理是：荧光素(fluorescein，简称FAM)标记的核酸适配体与猝灭剂BHQ-1(Black Hole Quencher-1)标记的互补短链核酸杂交，由于荧光素和猝灭剂靠近，荧光素的荧光被猝灭。当黄曲霉毒素B1存在时，FAM标记的核酸适配体与黄曲霉毒素B1结合，BHQ-1标记的短链核酸不与FAM标记的核酸适配体杂交，BHQ-1远离FAM，FAM的荧光恢复。随着黄曲霉毒素B1的加入，FAM标记的核酸适配体荧光强度逐渐增加，从而实现对黄曲霉毒素B1的检测。
本发明提供的检测黄曲霉毒素B1的适配体分子对，其是如下的分子对：
(1)序列如SEQ ID NO.1所示核酸分子的5’端经FAM(fluorescein，荧光素)标记得到的分子与序列如SEQ ID NO.4所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1(Black HoleQuencher-1)标记得到的分子组成的分子对；或
(2)序列如SEQ ID NO.1所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQID NO.5所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对；或
(3)序列如SEQ ID NO.2所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQID NO.6所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对；或
(4)序列如SEQ ID NO.2所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQID NO.7所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对；或
(5)序列如SEQ ID NO.3所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQID NO.8所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对。
本发明提供的检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其包括上述的适配体分子对。
优选地，所述试剂盒还包括阳性对照黄曲霉毒素B1。
优选地，所述试剂盒还包括pH为6～10的结合缓冲液，更优选地，所述结合缓冲液的pH为7.5，包括10mM Tris-HCl、50mM MgCl2、50mM NaCl和0.1％Tween20。
本发明提供的黄曲霉毒素B1的检测方法，其是将上述适配体分子对与待测样本混合后温育，测定荧光强度值。
其中，优选地，所述适配体分子对的使用浓度为50～100nM，更优选地，其中，5’端经FAM标记得到的分子的使用浓度为50nM，3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子的使用浓度为100nM。
优选地，所述待测样本进行预处理，即将待测的样本采用结合缓冲溶液稀释。
优选地，所述温育的温度为2～8℃，更优选地，所述温育的温度为4℃。
优选地，所述温育是在pH为6～10的结合缓冲液中进行，更优选地，所述结合缓冲液的pH为7.5，包括10mM Tris-HCl、50mM MgCl2、50mM NaCl和0.1％Tween20。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
下面列举一些具体实施例，以对本发明的实施和技术效果作更进一步的说明。
下述具体实施例中，检测所用的激发波长为485nm，发射波长为528nm，狭峰宽度均为5nm。适配体分子对由生工生物工程(上海)股份有限公司合成纯化。
实施例1：采用荧光素(FAM)标记的核酸适配体AF31-5F和BHQ-1标记的短链核酸分子AF31-C13B或AF31-C14B检测黄曲霉毒素B1
FAM标记的核酸适配体AF31-5F的序列为SEQ ID NO.1(5’-TGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCC-3’)，5’端标记FAM。BHQ-1标记的短链核酸AF31-C14B的序列为SEQ ID NO.4(5'-GACAACACGTGCCA-3')，3’端标记BHQ-1。BHQ-1标记的短链核酸AF31-C13B序列为SEQ ID NO.5(5'-ACAACACGTGCCA-3')，3’端标记BHQ-1。在结合缓冲溶液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)、50mM MgCl2、50mM NaCl、0.1％Tween20)中，AF31-5F(50nM)与AF31-C14B(100nM)或AF31-C13B(100nM)以及黄曲霉毒素B1温育，然后测FAM的荧光强度(激发波长为485nm，发射波长为528nm)。随着黄曲霉毒素B1的加入，荧光强度逐渐增强。黄曲霉毒素B1的检测限为0.2nM，结果如图1所示。
实施例2：采用荧光素(FAM)标记的核酸适配体AF29-5F和BHQ-1标记的短链核酸分子A29-C14B或A29-C13B检测黄曲霉毒素B1
FAM标记的核酸适配体AF29-5F序列为SEQ ID NO.2(5'-TGC ACG TGT TGT CTCTCT GTG TCT CGT GCC-3')，FAM标记在序列的5’端。BHQ-1标记的短链核酸AF29-C14B序列为SEQ ID NO.6(5'-AGA CAA CAC GTG CA-3')，猝灭剂BHQ-1标记在序列的3’端。BHQ-1标记的短链核酸AF29-C13B序列为SEQ ID NO.7(5'-GACAACACGTGCA-3')，BHQ-1标记在序列的3’端。在结合缓冲溶液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)、50mM MgCl2、50mM NaCl、0.1％Tween20)中，AF29-5F(50nM)与AF29-C14B(100nM)或AF29-C13B(100nM)以及黄曲霉毒素B1温育，然后测FAM的荧光强度(激发波长为485nm，发射波长为528nm)。随着黄曲霉毒素B1的加入，荧光强度逐渐增强，结果如图2所示。
实施例3：采用荧光素(FAM)标记的核酸适配体AF27-5F和BHQ-1标记的短链核酸分子AF27-C14B检测黄曲霉毒素B1
FAM标记的核酸适配体AF27-5F序列为SEQ ID NO.3(5’-TCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTG-3’)，FAM标记在序列的5’端。BHQ-1标记的短链核酸A27-C14B的序列为SEQ ID NO.8(5’-GAGACAACACGTGA-3’)，猝灭剂BHQ-1标记在序列的3’端。在结合缓冲溶液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)、50mM MgCl2、50mM NaCl、0.1％Tween20)中，AF27-5F(50nM)与AF27-C14B(100nM)以及黄曲霉毒素B1温育，然后测FAM的荧光强度(激发波长为485nm，发射波长为528nm)。随着黄曲霉毒素B1的加入，荧光强度逐渐增强，结果如图3所示。
上述实施例的结果说明，本发明检测所用的适配体分子对和检测方法对目标分子的响应特异性强，检测精度高，检测限低。
综上所述，本发明提供的检测黄曲霉毒素B1的适配体分子对、试剂盒及其检测方法为检测黄曲霉毒素B1提供了新的技术手段，本发明的适配体分子对具有易合成、易标记、成本低、稳定性高等优点，具有非常好的应用前景。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院生态环境研究中心
<120> 检测黄曲霉毒素B1的适配体分子对、试剂盒及其检测方法
<130> IB177076
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AF31-5F
<400> 1
tggcacgtgt tgtctctctg tgtctcgtgc c 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AF29-5F
<400> 2
tgcacgtgtt gtctctctgt gtctcgtgcc 30
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AF27-5F
<400> 3
tcacgtgttg tctctctgtg tctcgtg 27
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AF31-C14B
<400> 4
gacaacacgt gcca 14
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AF31-C13B
<400> 5
acaacacgtg cca 13
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AF29-C14B
<400> 6
agacaacacg tgca 14
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AF29-C13B
<400> 7
gacaacacgt gca 13
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A27-C14B
<400> 8
gagacaacac gtga 14

Claims (10)

1.一种检测黄曲霉毒素B1的适配体分子对，其特征在于，其是如下的分子对：
(1)序列如SEQ ID NO.1所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQ IDNO.4所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对；或
(2)序列如SEQ ID NO.1所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQ IDNO.5所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对；或
(3)序列如SEQ ID NO.2所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQ IDNO.6所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对；或
(4)序列如SEQ ID NO.2所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQ IDNO.7所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对；或
(5)序列如SEQ ID NO.3所示核酸分子的5’端经FAM标记得到的分子与序列如SEQ IDNO.8所示核酸分子的3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子组成的分子对。
2.一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其包括如权利要求1所述的适配体分子对。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照黄曲霉毒素B1。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pH为6～10的结合缓冲液，更优选地，所述结合缓冲液的pH为7.5，包括10mM Tris-HCl、50mM MgCl2、50mM NaCl和0.1％Tween20。
5.一种检测黄曲霉毒素B1的方法，其是将如权利要求1所述的适配体分子对与待测样本混合后温育，测定荧光强度值。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述适配体分子对的使用浓度为50～100nM。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中，5’端经FAM标记得到的分子的使用浓度为50nM，3’端经猝灭剂BHQ-1标记得到的分子的使用浓度为100nM。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样本进行预处理，即将待测的样本采用结合缓冲溶液稀释。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述温育的温度为2～8℃，更优选地，所述温育的温度为4℃。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述温育是在pH为6～10的结合缓冲液中进行，更优选地，所述结合缓冲液的pH为7.5，包括10mM Tris-HCl、50mM MgCl2、50mM NaCl和0.1％Tween20。
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