CN110872588A - 一种同时识别黄曲霉毒素b1、b2、g1、m1的适配体及其应用 - Google Patents

一种同时识别黄曲霉毒素b1、b2、g1、m1的适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

一种同时识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的适配体，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述适配体的5’端或3’端标记FAM、琉基基团、FITC或生物素用于识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1；该适配体还可以组成适配体亲和柱。本发明以已有的适配体为母链，根据其二级结构，通过等温滴定量热法，对剪裁的12条适配体进行亲和力和特异性的检验，选出能以高亲和力和高特异性识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的寡核苷酸适配体，具有稳定性高、合成方便、易标记功能基团等特点，将广泛应用于食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的快速检测。

Description

一种同时识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的适配体及其应用
技术领域
本发明涉及食品安全生物技术领域，特别涉及一种用等温滴定量热法剪裁优化得到一条能同时特异性识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的最优寡核苷酸适配体及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一类具有致癌和致突变较强的化合物，是由寄生曲霉及黄曲霉产生的。现在己发现AFT有18种，其中最重要的类型是B1，B2，G1，G2和代谢产物M1，M2。AFT是食品及粮食作物中最常见的毒素，它可在粮食的生长或者收获之后对粮食造成污染。由于AFT性质的稳定，在食物加工过程中很难破坏它的结构造成其毒性降低或者失活。为了避免人类受AFT的毒害，很多国家规定了AFB1及AFT总量的最大残留量。欧盟规定花生、坚果、干果制品和谷物中的AFB1的残留量要小于2μg/kg，AFT总残留量需小于4μg/kg；同时规定牛奶中的AFM1的量必须小于0.050μg/kg。近40年以来，AFT中毒事件频有发生，造成了人员的死亡和大量的经济损失，因此，实现食品中AFT准确、快速、灵敏地检测，对于预防AFT的暴发传染、保障食品安全和保护人类健康都有极其重要的意义。
目前，黄曲霉毒素的分析方法中，常用的有高效液相色谱、毛细管电泳、液质联用等。这些仪器分析方法对样品纯度要求较高，需要经过一些前处理，传统的前处理技术有免疫亲和柱、多功能净化柱等，这些净化柱价格较贵，多为一次性的。建立高选择、快速有效的样品前处理技术已成为黄曲霉毒素检测分析中需要解决的重要问题。
适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)从体外合成的随机核苷酸序列文库中筛选获得能够特异性识别结合靶标的一段短的单链脱氧核糖核苷酸(ssDNA)或核糖核苷酸(RNA)序列，具有靶分子范围广、高亲和力和高特异性、筛选周期短的显著特点，与抗体相比合成方便，成本低，易标记各种功能基团，不易受温度等环境因素影响，可以在长期保存过程保持很好的稳定性。这些独特优势使适配体在化学分析、医药和食品安全等领域具有广阔的应用前景。但是仅通过筛选所得的适配体通常碱基数目较多，合成成本较大，且多余碱基对痕量检测、材料应用等技术形成空间阻碍，因此，对已筛选得到的适配体进行剪裁优化，精准保留其作用部位，是提高适配体作用效率、降低合成成本、拓宽应用范围的必然要求。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种同时识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的适配体及其应用。本发明以已有的适配体为母链，根据其二级结构，通过等温滴定量热法，对剪裁的12条适配体进行亲和力和特异性的检验，选出能以高亲和力和高特异性识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的寡核苷酸适配体，具有稳定性高、合成方便、易标记功能基团等特点，将广泛应用于食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的快速检测。
本发明的技术方案如下：
一种同时识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的适配体，所述适配体的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
一种同时识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的适配体的应用，所述适配体的5’端或3’端标记FAM、琉基基团、FITC或生物素用于识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1。
一种同时识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的适配体的应用，所述适配体在食品和临床医学中检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1。
一种所述适配体组装的适配体亲和柱，所述亲和柱的载体为链霉亲和素琼脂糖凝胶与适配体的偶联物质。
所述亲和柱的制备方法包括以下步骤：
(1)链霉亲和素琼脂糖凝胶的准备：取出1mL链霉亲和素琼脂糖凝胶并用2mL结合缓冲液(20mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH7.4)进行洗涤，6000rpm离心3min，重复5次；
(2)适配体准备：取2OD的5’端修饰生物素的Apt-2核酸适配体，溶解于结合缓冲液中，使其浓度达到5μM，制得Apt-2溶液；
(3)偶联结合：以琼脂糖凝胶:适配体＝1:2的体积结合比向步骤(1)洗涤后的载体中加入步骤(2)的Apt-2溶液，孵育10min；
(4)封闭：将步骤(3)偶联后的产物用结合缓冲溶液洗涤5次，每次2mL，然后加入2％的牛血清蛋白溶液，于25℃孵育器震荡反应12h，封闭剩余活性基团，得到适配体与载体的偶联胶体；
(5)洗涤：将步骤(4)所得到的偶联胶用结合缓冲溶液和100mM pH为3.0的甘氨酸-盐酸，先后交替洗涤3次，每次用量为2mL；除去未偶联的适配体及剩余的BSA，洗涤后的偶联胶用2mL的结合缓冲溶液重悬，所得悬液准备装柱；
(6)装柱：取容积5mL的固相萃取管，垫好孔径10μm的下筛板，然后加入1mL结合缓冲液，使其自然流干；加下方出样口的堵塞，用步骤(5)所得偶联胶悬液装柱，静置5min，在重力作用下使偶联胶自然下落，形成均匀的胶床，至胶高度为1cm，放置孔径10μm的上筛板，轻缓按压筛板，使其到达偶联胶上方，防止后续上样冲坏胶床；拔掉出样口的堵塞，取5mL结合缓冲液，将其接在进样口上，以1mL/min的速度缓慢将结合缓冲液注入亲和柱中，直至全部液体注入，加下方出样口堵塞，加入3mL结合缓冲液，并加上方进样口堵塞，于4℃冰箱保存。
所述亲和柱的应用，用于富集或纯化样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1。
所述样品为粮食、坚果、饲料、乳及乳制品、水产、中药、体液或水。
本发明有益的技术效果在于：
本发明提供了黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1适配体亲和柱及其制备方法。基于此条适配体组装适配体亲和柱，用于实际样品中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的分离纯化，之后与超高效液相色谱连用可以定性与定量的分析样品中毒素的含量。
本发明方法利用等温滴定量热法，以黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1为靶标，筛选获得1条与靶细胞高亲和性、高特异结合的最优适配体Apt-2。通过生物素与链霉亲和素的结合，将生物素化的适配体固定于链霉亲和素琼脂糖凝胶载体上，组装成适配体亲和柱，可以用于实际环境样品、食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的分离纯化，达到快速、准确诊断的目的。
本发明适配体，能够特异识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1；与识别单一黄曲霉毒素的适配体相比，序列Apt-2能够识别4种黄曲霉毒素，具有靶标范围更广的特点，能够更灵敏、全面地检测出环境中、食品中存在的黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1。
本发明基于优化得到的适配体Apt-2建立适配体亲和柱，与传统的亲和柱相比，具有柱容量更大、柱效能更加稳定、使用环境更加广泛、净化程度更高等的优点。样品提取液经此适配体亲和柱净化后，所得到的黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1纯度高，无需后续其他纯化处理，可直接用于超高效液相色谱等仪器检测。
本发明中的适配体亲和柱中使用的核酸适配体通过体外化学合成法获得，能够保证序列的准确性、批间的一致性，大幅度降低了不同批次的差异，保证了非同批次适配体亲和柱的效能的一致高效性。
附图说明
图1是Apt-2等温滴定量热法测定的亲和力饱和结合曲线；
其中，A为黄曲霉毒素B1曲线、B为黄曲霉毒素B2曲线、C为黄曲霉毒素G1曲线、D为黄曲霉毒素M1曲线；
图2是从黄曲霉毒素原始适配体与Apt-2二级结构图谱；
图3是亲和柱的结构示意图；
其中，1-进样口堵塞、2-亲和柱柱体、3-上筛板、4-偶联胶载体、5-下筛板、6-出样口堵塞；
图4是黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1适配体亲和柱特异性的结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
下面是通过等温滴定量热法筛选高特异亲和的黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1核酸适配体及其快速检出黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1方面的应用。
实施例1、合成黄曲霉毒素适配体原始序列及剪裁优化序列(由上海生工公司完成)
适配体原始序列:
5’-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCACA-3’
根据DNAMAN软件和Mfold软件拟合的适配体的二级结构，分别从适配体的5’端、3’端、两端共3种方式同时进行剪裁优化。从原始适配体的两端同时剪裁，首先去除构成茎环结构以外的多余碱基，得到序列Apt-1，之后以3个碱基为单位进行剪裁，直至茎环结构被破坏，依次得到序列Apt-2、Apt-3、Apt-4。从原始适配体的5’端开始，在去除5’端构成原有序列茎环结构以外的多余碱基后，以3个碱基为单位进行剪裁，直至原有的茎环结构被破坏，依次得到序列Apt-5、Apt-6、Apt-7、Apt-8。从原始适配体的3’端开始，在去除3’端构成原有序列茎环结构以外的多余碱基后，以3个碱基为单位进行剪裁，直至原有的茎环结构被破坏，依次得到序列Apt-9、Apt-10、Apt-11、Apt-12。
表1
Figure BDA0001984036920000051
将各条序列均用Tris-HCl缓冲液配制成100μM贮存液存于-20℃备用。
实施例2黄曲霉毒素的处理
根据黄曲霉毒素常见6种类型的分子结构，选取和黄曲霉毒素B1在分子结构上只存在一处差异的其他3种毒素，即黄曲霉毒素B2、G1、M1。将黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1固体粉末分别加DMSO溶解，终浓度均为2mg/mL，震荡均匀，存于-4℃备用。
实施例3基于等温滴定量热法的黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1适配体的优化
(1)试剂与样品的配制：首先，配制0.1M的Tris，用HCl调pH至7.4，过滤，超声脱气即可。取975μL Tris-HCl，加入25μL DMSO，缓冲液中最终含有2.5％DMSO。黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1分别配制成64μM含2.5％DMSO的Tris-HCl体系。各优化剪裁适配体配制成5μM含2.5％DMSO的Tris-HCl体系。
(2)滴定条件设置：在测定解离平衡常数时，一般采用每一针的体积很小，滴定多次的方法。初始选择0.5μL，之后的每一滴都是2μL。滴定总次数为18滴。除第1滴的滴定持续时间为1s以外，实验的每一滴的持续时间均为4s。每2滴的间隔时间为150s。参考功率为10μcals·sec-1，进样针的搅拌速度为1000rpm。滴定温度为25℃。
(3)亲和力分析滴定实验：在实验之前，首先对样品池和进样针进行清洗。清洗完成后，进行水滴水实验，确保仪器的清洁。注射器中吸入64μM黄曲霉毒素B1约40μL，将约300μL缓冲液放入样品池中，进行空白对照实验。之后，注射器中吸入64μM黄曲霉毒素B1约40μL，样品池中放入约300μL 5μM的核酸适配体溶液，进行实验滴定。黄曲霉毒素B2、G1、M1分别重复上述条件，各程序、参数不变。将实验数据导入到MicroCal PEAQ的等温滴定量热法分析软件中，根据数据拟合曲线，得到各条适配体分别对黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的亲和力(Kd值)，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0001984036920000061
Figure BDA0001984036920000071
综合上述实验结果如图1所示，结合DNAMAN软件和Mfold软件模拟的剪裁优化适配体的二级结构(图2所示)，Apt-1、Apt-2、Apt-5、Apt-6、Apt-9、Apt-10亲和力良好，其中尤以适配体Apt-2的综合Kd值最低，亲和力最好，所以最终选定适配体Apt-2进行特异性的优化验证。
(4)特异性分析滴定实验。与黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1亲和力较强即Kd值较小的Apt-2适配体进行特异性分析。在实验之前，首先对样品池和进样针进行清洗。清洗完成后，进行水滴水实验，确保仪器的清洁。注射器中吸入64μM其他真菌毒素(玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素)约40μL，将约300μL缓冲液放入样品池中，进行空白对照实验。之后，注射器中吸入64μM其他真菌毒素(玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素)约40μL，样品池中放入约300μL 5μM的Apt-2核酸适配体溶液，进行实验滴定。将实验数据导入到MicroCal PEAQ的等温滴定量热法分析软件中，根据数据拟合曲线，得到Apt-2适配体分别对其他真菌毒素(玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素)的特异性，结果如表3所示。
表3
真菌毒素种类 特异性结果
ZEN N/A
OTA N/A
DON N/A
3-DON N/A
15-DON N/A
FB1 N/A
Apt-2适配体表现出较好的特异性，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1及混合液均呈现高亲和力，而对此4种毒素以外的真菌毒素均不结合。综合以上考虑，选择Apt-2作为能够高特异结合黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的适配体。
因此通过等温滴定量热法剪裁优化得到的黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的适配体Apt-2具有高亲和性和高特异性，以整个序列形成的茎环结构为基础捕捉黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1，为黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1快速、准确、灵敏检测提供重要基础，具有广泛的应用前景。
实施例4适配体亲和柱的组装建立(图3)
基于Apt-2对黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的高亲和力，及对其他真菌毒素的高特异性，组装适配体亲和柱。该亲和柱以链霉亲和素琼脂糖凝胶与生物素化的Apt-2核酸适配体为载体进行非共价结合，结合后的黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1适配体复合载体装填完成亲和柱。
(1)链霉亲和素琼脂糖凝胶的准备：取出1mL链霉亲和素琼脂糖凝胶并用2mL结合缓冲液(20mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH7.4)进行洗涤，6000rpm离心3min，重复5次。
(2)适配体准备：取2OD的5’端修饰生物素的Apt-2核酸适配体，溶解于一定量的结合缓冲液中，使其浓度达到5μM。
(3)偶联结合：以琼脂糖凝胶：适配体＝1：2的体积结合比向步骤(1)洗涤后的载体中加入步骤(2)的Apt-2溶液，孵育10min。
(4)封闭：将步骤(3)偶联后的产物用结合缓冲溶液洗涤5次，每次2mL，然后加入2％的牛血清蛋白溶液，于25℃孵育器震荡反应12h，封闭剩余活性基团，得到适配体与载体的偶联胶体。
(5)洗涤：将步骤(4)所得到的偶联胶用结合缓冲溶液和100mM甘氨酸-盐酸(pH3.0)先后交替洗涤3次，每次用量为2mL。除去未偶联的适配体及剩余的BSA。洗涤后的偶联胶用2mL的结合缓冲溶液重悬，所得悬液准备装柱。
(6)装柱：取容积5mL的固相萃取管，垫好下筛板(孔径10μm)，然后加入1mL结合缓冲液，使其自然流干。加下方出样口的堵塞，用步骤(5)所得偶联胶悬液装柱，静置5min，在重力作用下使偶联胶自然下落，形成均匀的胶床，至胶高度为1cm。放置上筛板(孔径10μm)，防止后续上样冲坏胶床，并轻缓按压筛板，使其到达偶联胶上方。
拔掉出样口的堵塞，取5mL结合缓冲液，将其接在进样口上，以1mL/min的速度缓慢将结合缓冲液注入亲和柱中，直至全部液体注入。加下方出样口堵塞，加入3mL结合缓冲液，并加上方进样口堵塞，于4℃冰箱保存。
利用黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1适配体亲和柱纯化坚果样品(巴旦木)中的黄曲霉毒素。
通过向正常购买的巴旦木样品中定量加入黄曲霉毒素标准品，然后用制备的适配体亲和柱进行净化，后用超高效液相色谱-荧光检测器检测，测定回收率以验证亲和柱效能。
具体步骤如下：
(1)样品处理。将巴旦木粉碎，分别按照每千克样品0.5，5，50μg的标准，向粉碎后的样品中分别加入黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1(4种毒素按1：1：1：1的比例添加，毒素的总浓度为0.5，5，50μg/kg)。
(2)称取5g样品于50mL离心管中，加入25mL甲醇-水(70+30)，涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min)，在6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤)，取上清液备用。
(3)取5mL滤液，50℃氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用结合缓冲液定容至1mL，涡旋30s溶解残留物，0.22μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。
(4)取出适配体亲和柱，打开进样口的堵塞，进样口与注射器针筒相连，注射器置于自动进样泵上。
(5)打开出样口堵塞，用5mL结合缓冲液平衡亲和柱，调节进样泵压力，使液体以1mL/min的速度流出。
(6)将步骤(4)最后的滤液加入亲和柱中，保持均匀流速，直至样品全部流出亲和柱。收集流出液。
(7)用1mL的结合缓冲液洗涤亲和柱。加入1mL的洗脱液，收集洗脱产物。
(8)步骤(6)的流出液和(7)的洗脱产物均用超高效液相色谱-荧光检测器检测。检测结果如下表4所示。
表4
加标量 加标回收率(％) RSD(％)
0.5μg/kg 92.57±2.83 1.3
5μg/kg 86.53±5.14 2.1
50μg/kg 78.89±7.36 1.7
可见，巴旦木样品经黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1适配体亲和柱后，用超高效液相色谱可以检测到。从检测结果可以看出，本适配体亲和柱回收率在78.89-92.57％之间，RSD为1.3-2.1％之间。
为了探究适配体亲和柱对单一黄曲霉毒素、混和黄曲霉毒素以及其他真菌毒素的结合特性，在保持实验条件不变的情况下，2μM的其他真菌毒素上样液流经适配体亲和柱，收集流出液，进行超高效液相色谱-荧光检测器验证。
从检测结果(图4所示)可以看出，单一黄曲霉毒素、混和黄曲霉毒素在上样过程中的结合率以及洗脱过程中的洗脱回收率均接近100％，而其他真菌毒素则基本不被此适配体亲和柱结合，结合率与洗脱率均接近0％，因此次适配体亲和柱具有针对黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的良好的特异性。
虽然，上文中已经用具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
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<211> 45
<212> DNA
<213> Apt-6
<400> 6
gcacgtgttg tctctctgtg tctcgtgccc ttcgctaggc ccaca 45
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> Apt-7
<400> 7
cacgtgttgt ctctctgtgt ctcgtgccct tcgctaggcc cca 43
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> Apt-8
<400> 8
gtgttgtctc tctgtgtctc gtgcccttcg ctaggcccac a 41
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> Apt-9
<400> 9
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc ta 42
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> Apt-10
<400> 10
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgccc 35
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Apt-11
<400> 11
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tg 32
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> Apt-12
<400> 12
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctc 29

Claims (7)

1.一种同时识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1的适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述适配体的应用，其特征在于，所述适配体的5’端或3’端标记FAM、琉基基团、FITC或生物素用于识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1。
3.一种权利要求1所述适配体的应用，其特征在于，所述适配体在食品和临床医学中检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1。
4.一种权利要求1所述适配体组装的适配体亲和柱，其特征在于，所述亲和柱的载体为链霉亲和素琼脂糖凝胶与适配体的偶联物质。
5.根据权利要求4所述的亲和柱，其特征在于，所述亲和柱的制备方法包括以下步骤：
(1)链霉亲和素琼脂糖凝胶的准备：取出1mL链霉亲和素琼脂糖凝胶并用2mL结合缓冲液(20mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH7.4)进行洗涤，6000rpm离心3min，重复5次；
(2)适配体准备：取2OD的5’端修饰生物素的Apt-2核酸适配体，溶解于结合缓冲液中，使其浓度达到5μM，制得Apt-2溶液；
(3)偶联结合：以琼脂糖凝胶:适配体＝1:2的体积结合比向步骤(1)洗涤后的载体中加入步骤(2)的Apt-2溶液，孵育10min；
(4)封闭：将步骤(3)偶联后的产物用结合缓冲溶液洗涤5次，每次2mL，然后加入2％的牛血清蛋白溶液，于25℃孵育器震荡反应12h，封闭剩余活性基团，得到适配体与载体的偶联胶体；
(5)洗涤：将步骤(4)所得到的偶联胶用结合缓冲溶液和100mM pH为3.0的甘氨酸-盐酸，先后交替洗涤3次，每次用量为2mL；除去未偶联的适配体及剩余的BSA，洗涤后的偶联胶用2mL的结合缓冲溶液重悬，所得悬液准备装柱；
(6)装柱：取容积5mL的固相萃取管，垫好孔径10μm的下筛板，然后加入1mL结合缓冲液，使其自然流干；加下方出样口的堵塞，用步骤(5)所得偶联胶悬液装柱，静置5min，在重力作用下使偶联胶自然下落，形成均匀的胶床，至胶高度为1cm，放置孔径10μm的上筛板，轻缓按压筛板，使其到达偶联胶上方，防止后续上样冲坏胶床；拔掉出样口的堵塞，取5mL结合缓冲液，将其接在进样口上，以1mL/min的速度缓慢将结合缓冲液注入亲和柱中，直至全部液体注入，加下方出样口堵塞，加入3mL结合缓冲液，并加上方进样口堵塞，于4℃冰箱保存。
6.一种权利要求5所述亲和柱的应用，其特征在于，用于富集或纯化样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、M1。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述样品为粮食、坚果、饲料、乳及乳制品、水产、中药、体液或水。
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