CN107764784A - 一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素b1的荧光方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法，属于生物检测领域。本发明借助于黄曲霉毒素B1适配体特异性识别黄曲霉毒素B1分子，从而使得与适配体部分互补的DNA分子解离下来，以未解离下的DNA分子为模板，合成聚胸腺嘧啶单链DNA分子，以此聚胸腺嘧啶单链DNA为模板合成具有荧光性能的铜纳米簇，黄曲霉毒素B1含量越高，未解离下的互补DNA分子越少，用于合成铜纳米簇的模板越少，则合成的铜纳米簇越少荧光越弱，根据黄曲霉毒素B1和荧光强度的对应关系，可以实现黄曲霉毒素B1的检测。本发明方法灵敏度高、特异性强、稳定性好、成本低廉，并且可以应用于实际样本的检测，是一种基于适配体检测的理想方法。
Description
技术领域
属于生物检测领域，具体涉及一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法。
背景技术
随着人民生活水平的不断提高，对食品安全意识不断增强，而农产品作为食品原材料，其质量安全成为不容忽视的问题。近年来，真菌毒素引起的农产品安全问题日益突出，真菌毒素是由不同种属的丝状真菌产生的次级有毒代谢产物，镰刀菌、曲霉菌、青霉菌是产生这类毒素最多的霉菌，当高等动物摄食后会产生严重的毒性反应，严重威胁的人类及动物的健康和生命安全。真菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）是黄曲霉毒素家族中毒性最强的一种。因此，目前全世界已经有60多个国家制订了食品和饲料中的黄曲霉毒素限量标准和法规。
目前黄曲霉毒素的常规检测方法为仪器检测方法，如博层色谱法、高效液相色谱法、气相质谱法和液相质谱法等。虽然这些方法具有较高的灵敏度并能实现黄曲霉毒素的检测，但是样品的前处理复杂、仪器价格昂贵，需要专门的操作人员进行操作，因此限制了其应用范围。对黄曲霉毒素的快速检测方法主要是基于抗原抗体的免疫检测方法，但是这种方法依赖于高质量的抗体，要想获得理想的抗体需要较长的制备周期，并且抗体的稳定性与所处环境密切相关，环境的改变极易导致抗体性能的改变，因此制约了免疫学方法在黄曲霉毒素检测中的应用。因此，不断开发高灵敏、高特异性、广泛适用性、低成本的黄曲霉毒素检测方法显得尤为重要。核酸适配体是通过体外筛选获得的单链DNA或RNA分子，可以通过其特殊而稳定的三维结构的空间构型与不同靶目标物高亲和力、高特异性的结合，并且具有优于抗体的性质，如易于体外合成、易于化学修饰、稳定性不易受环境影响等优点，可以代替抗体作为目标物的识别分子。
近年来，金属纳米簇作为一种新兴的纳米材料引起了研究者广泛关注，金属纳米簇是由两个至几十个原子构成的超小纳米颗粒，具有超小粒径、生物相容性、低毒性以及独特的物理化学性质。其尺寸介于金属原子和纳米颗粒之间，与电子费米波长相近，因此，连续电子能级会分裂成离散能级，使金属纳米簇的化学、光学及电学等方面的性质与纳米颗粒有所不同。金属纳米簇能够产生强烈的光吸收和光发射，显示出了优越的荧光特性，具有良好的生物相容性、较强的光稳定性以及较高的荧光量子产率。铜纳米簇是处于研究初期的一种纳米簇，
其具有合成简单，荧光性能优越等优点，引起了研究工作这广泛的关注。
发明内容
要解决的技术问题：传统的仪器检测黄曲霉毒素B1的方法仪器价格昂贵，样品前处理复杂耗时，限制了其广泛应用。并且基于抗原抗体的免疫学快速检测方法依赖抗体的性能，而高质量的抗体需要较长的制备周期，并且制备的抗体稳定性易受环境的影响，从而使得应用免疫学检测方法产生弊端。
技术方案：本发明公开了一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法，包括如下步骤：
（1）磁纳米粒子修饰链霉亲和素
将表面羧基基团修饰的1mg/mL的磁纳米粒子用0.01M Ph6.5的MES缓冲液稀释10倍，称取30mg N-羟基琥珀酰亚胺和50mg 碳二亚胺加入1mL修饰好的磁纳米粒子中，在缓慢振荡的条件下进行磁纳米粒子羧基基团的活化反应1~2h，外加磁场吸附磁纳米粒子并弃掉上清液，将缓冲液更换为等体积的0.01M pH7.4的PBS缓冲液，将其加入到1mL浓度为2mg/mL的链霉亲和素溶液中，在缓慢振荡的条件下继续振荡4h，外加磁场吸附磁纳米粒子并将上清去掉，以除去为反应的链霉亲和素，再用0.01M pH7.4的PBS缓冲液将磁纳米粒子进行重悬，重新分散后的磁纳米粒子即为修饰链霉亲和素的磁纳米粒子。
（2）磁纳米粒子修饰黄曲霉毒素B1适配体
将生物素修饰的黄曲霉毒素B1适配体加入步骤（1）制备的磁纳米粒子中，使得适配体的终浓度为2μM， 在37℃条件下缓慢振荡反应30~60min后，引入磁场吸附磁纳米粒子，去掉上清并用50mM的TE缓冲液将磁纳米粒子进行重悬，从而得到适配体修饰的磁纳米粒子；
生物素修饰的黄曲霉毒素B1适配体的序列为：
5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-Biotin-3’。
（3）磁纳米粒子修饰的黄曲霉毒素B1适配体与其互补序列杂交成双链结构
将与黄曲霉毒素B1适配体5’端互补的DNA分子加入到步骤（2）制备的适配体修饰的磁纳米粒子中，并使得互补DNA分子的终浓度为2~4μM，在37℃水浴条件下静置反应1~2h后，外加磁场吸附磁纳米粒子，并用结合缓冲液将磁纳米粒子进行重悬，得到杂交双链修饰的磁纳米粒子；
互补DNA分子：5’ –CAACACGTGCCCAACGGCTA-3’。
（4）黄曲霉毒素B1的检测以及荧光信号的测定
将步骤（3）制备的磁纳米粒子分装到PCR管中，每管100μL，在每管中加入10μL浓度为0ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的黄曲霉毒素B1标准品，在室温下反应0.5~2h后，外加磁场除去上清，加入10U的脱氧核苷酸末端转移酶（TdT）、1×TdT缓冲液（50mM醋酸钠、20mM Tris-醋酸、10mM醋酸镁，pH7.9）、5mM的dTTP、0.3mM的CoCl2，总的扩增体系为25μL，在37℃的条件下扩增2~4h，然后将温度升高到70℃并保持15min以终止扩增反应的进行；然后将抗坏血酸和CuSO4加入到反应体系中使得其终浓度分别为5mM和300μM，并在室温避光反应10min，最后在350nm的激发波长下测定617nm发射波长的荧光信号强度。
本发明所述的基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法中磁纳米粒子的粒径为50nm。
本发明所述的基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法中羧基基团的活化反应时间为1.5h。
本发明所述的基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法中适配体和链霉亲和素修饰的磁纳米粒子的反应时间为40min。
本发明所述的基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法的步骤（3）中互补DNA分子的终浓度为3μM。
本发明所述的基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法的步骤（3）中的结合缓冲液为含有1mM MgCl2的0.01M pH7.4的PBS缓冲液。
本发明所述的基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法的步骤（4）中的扩增时间为3h。
注：本发明所述的所有DNA分子、脱氧核苷酸末端转移酶、TdT缓冲液均购自上海生工生工工程有限公司。
有益效果：本发明借助于黄曲霉毒素B1适配体特异性识别黄曲霉毒素B1分子，从而使得与适配体部分互补的DNA分子解离下来，以未解离下的DNA分子为模板，合成聚胸腺嘧啶单链DNA分子，以此聚胸腺嘧啶单链DNA为模板合成具有荧光性能的铜纳米簇，荧光的强度与模板含量密切相关。黄曲霉毒素B1含量越高，未解离下的互补DNA分子越少，用于合成铜纳米簇的模板越少，则合成的铜纳米簇越少，荧光越弱，根据黄曲霉毒素B1和荧光强度的对应关系，可以实现黄曲霉毒素B1的检测。
附图说明
图1 黄曲霉毒素B1和荧光强度的对应关系。
图2 黄曲霉毒素B1检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法，包括如下步骤：
（1）磁纳米粒子修饰链霉亲和素
将表面羧基基团修饰的1mg/mL的粒径为50nm的磁纳米粒子用0.01M Ph6.5的MES缓冲液稀释10倍，称取30mg N-羟基琥珀酰亚胺和50mg 碳二亚胺加入1mL修饰好的磁纳米粒子中，在缓慢振荡的条件下进行磁纳米粒子羧基基团的活化反应1.5h，外加磁场吸附磁纳米粒子并弃掉上清液，将缓冲液更换为等体积的0.01M pH7.4的PBS缓冲液，将其加入到1mL浓度为2mg/mL的链霉亲和素溶液中，在缓慢振荡的条件下继续振荡2~5h，外加磁场吸附磁纳米粒子并将上清去掉，以除去为反应的链霉亲和素，再用0.01M pH7.4的PBS缓冲液将磁纳米粒子进行重悬，重新分散后的磁纳米粒子即为修饰链霉亲和素的磁纳米粒子。
（2）磁纳米粒子修饰黄曲霉毒素B1适配体
将生物素修饰的黄曲霉毒素B1适配体加入步骤（1）制备的磁纳米粒子中，使得适配体的终浓度为2μM，在37℃条件下缓慢振荡反应40min后，引入磁场吸附磁纳米粒子，去掉上清并用50mM的TE缓冲液将磁纳米粒子进行重悬，从而得到适配体修饰的磁纳米粒子；
生物素修饰的黄曲霉毒素B1适配体的序列为：
5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-Biotin-3’。
（3）磁纳米粒子修饰的黄曲霉毒素B1适配体与其互补序列杂交成双链结构
将与黄曲霉毒素B1适配体5’端互补的DNA分子加入到步骤（2）制备的适配体修饰的磁纳米粒子中，并使得互补DNA分子的终浓度为3μM，在37℃水浴条件下静置反应1~2h后，外加磁场吸附磁纳米粒子，并用含有1mM MgCl2的0.01M pH7.4的PBS缓冲液将磁纳米粒子进行重悬，得到杂交双链修饰的磁纳米粒子；
互补DNA分子：5’ –CAACACGTGCCCAACGGCTA-3’。
（4）黄曲霉毒素B1的检测以及灵敏度的分析
将步骤（3）制备的磁纳米粒子分装到PCR管中，每管100μL，在每管中加入10μL浓度为0ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的黄曲霉毒素B1标准品，在室温下反应0.5~2h后，外加磁场除去上清，加入10U的脱氧核苷酸末端转移酶（TdT）、1×TdT缓冲液（50mM醋酸钠、20mM Tris-醋酸、10mM醋酸镁，pH7.9）、5mM的dTTP、0.3mM的CoCl2，总的扩增体系为25μL，在37℃的条件下扩增3h，然后将温度升高到70℃并保持15min以终止扩增反应的进行；然后将抗坏血酸和CuSO4加入到反应体系中使得其终浓度分别为5mM和300μM，并在室温避光反应10min，最后在350nm的激发波长下测定617nm发射波长的荧光信号强度；根据荧光信号强度得出，在0.05~5ng/mL的浓度范围内，线性关系良好，并得出黄曲霉毒素B1检测限为0.035ng/mL。
（5）特异性分析
将五种其他的生物毒素（赭曲霉毒素、黄曲霉毒素B2、伏马菌素、呕吐毒素、玉米赤酶烯酮）作为目标物，用来验证此方法的特异性。在2ng/mL的检测浓度下，这几种生物毒素检测系统反应前后荧光强度均没有发生明显的变化，从而说明黄曲霉毒素B1的适配体没有与这几种生物毒素进行识别，因此此方法对黄曲霉毒素B1的检测具有良好的特异性。
（6）添加回收实验
在阴性玉米提取样本中，分别添加不同浓度的黄曲霉毒素B1测定添加回收结果，在0.08、0.1、0.2、0.6、0.8、1ng/mL的添加浓度下，黄曲霉毒素B1的回收范围在92.7%~97.5%之间，从而说明此方法可以用于实际样本中黄曲霉毒素B1的检测。
Claims (7)
1.一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）磁纳米粒子修饰链霉亲和素
将表面羧基基团修饰的1mg/mL的磁纳米粒子用0.01M Ph6.5的MES缓冲液稀释10倍，称取30mg N-羟基琥珀酰亚胺和50mg 碳二亚胺加入1mL修饰好的磁纳米粒子中，在缓慢振荡的条件下进行磁纳米粒子羧基基团的活化反应1~2h，外加磁场吸附磁纳米粒子并弃掉上清液，将缓冲液更换为等体积的0.01M pH7.4的PBS缓冲液，将其加入到1mL浓度为2mg/mL的链霉亲和素溶液中，在缓慢振荡的条件下继续振荡4h，外加磁场吸附磁纳米粒子并将上清去掉，以除去为反应的链霉亲和素，再用0.01M pH7.4的PBS缓冲液将磁纳米粒子进行重悬，重新分散后的磁纳米粒子即为修饰链霉亲和素的磁纳米粒子；
（2）磁纳米粒子修饰黄曲霉毒素B1适配体
将生物素修饰的黄曲霉毒素B1适配体加入步骤（1）制备的磁纳米粒子中，使得适配体的终浓度为2μM， 在37℃条件下缓慢振荡反应30~60min后，引入磁场吸附磁纳米粒子，去掉上清并用50mM的TE缓冲液将磁纳米粒子进行重悬，从而得到适配体修饰的磁纳米粒子；
生物素修饰的黄曲霉毒素B1适配体的序列为：
5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-Biotin-3’；
（3）磁纳米粒子修饰的黄曲霉毒素B1适配体与其互补序列杂交成双链结构
将与黄曲霉毒素B1适配体5’端互补的DNA分子加入到步骤（2）制备的适配体修饰的磁纳米粒子中，并使得互补DNA分子的终浓度为2~4μM，在37℃水浴条件下静置反应1~2h后，外加磁场吸附磁纳米粒子，并用结合缓冲液将磁纳米粒子进行重悬，得到杂交双链修饰的磁纳米粒子；
互补DNA分子：5’ –CAACACGTGCCCAACGGCTA-3’；
（4）黄曲霉毒素B1的检测以及荧光信号的测定
将步骤（3）制备的磁纳米粒子分装到PCR管中，每管100μL，在每管中加入10μL浓度为0ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的黄曲霉毒素B1标准品，在室温下反应0.5~2h后，外加磁场除去上清，加入10U的脱氧核苷酸末端转移酶（TdT）、1×TdT缓冲液（50mM醋酸钠、20mM Tris-醋酸、10mM醋酸镁，pH7.9）、5mM的dTTP、0.3mM的CoCl2，总的扩增体系为25μL，在37℃的条件下扩增2~4h，然后将温度升高到70℃并保持15min以终止扩增反应的进行；然后将抗坏血酸和CuSO4加入到反应体系中使得其终浓度分别为5mM和300μM，并在室温避光反应10min，最后在350nm的激发波长下测定617nm发射波长的荧光信号强度。
2.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法，其特征在于所述的磁纳米粒子的粒径为50nm。
3.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法，其特征在于所述的羧基基团的活化反应时间为1.5h。
4.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法，其特征在于所述的适配体和链霉亲和素修饰的磁纳米粒子的反应时间为40min。
5.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法，其特征在于所述的步骤（3）中互补DNA分子的终浓度为3μM。
6. 根据权利要求1所述的一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法，其特征在于所述的步骤（3）中的结合缓冲液为含有1mM MgCl2的0.01M pH7.4的PBS缓冲液。
7.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素B1的荧光方法，其特征在于所述的步骤（4）中的扩增时间为3h。
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Effective date of registration: 20200911 Address after: Room 12505, 25th floor, unit 1, building 1, science and technology road, Zhangba Street office, hi tech Zone, Xi'an City, Shaanxi Province Applicant after: Xi'an zhicaiquan Technology Transfer Center Co.,Ltd. Address before: 310000 Xihu District Wen two road, Hangzhou, Zhejiang Province, No. 207 Applicant before: Yang Lei |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210108 Address after: No.1 xc1001-2, Nanmen Gongnong Road, Chongfu Town, Tongxiang City, Jiaxing City, Zhejiang Province Patentee after: JIAXING JINJING E-COMMERCE Co.,Ltd. Address before: 710077 room 12505, 25th floor, unit 1, building 1, puyue project, Keji Road, Zhangba Street office, high tech Zone, Xi'an City, Shaanxi Province Patentee before: Xi'an zhicaiquan Technology Transfer Center Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210820 Address after: 530000 Room 408, floor 4, building 1, electronic industrial park, No. 8, Gaoke Road, high tech Zone, Nanning, Guangxi Zhuang Autonomous Region Patentee after: NANNING ZHONGCHUANG SPACE TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: No.1 xc1001-2, Nanmen Gongnong Road, Chongfu Town, Tongxiang City, Jiaxing City, Zhejiang Province Patentee before: JIAXING JINJING E-COMMERCE Co.,Ltd. Effective date of registration: 20210820 Address after: 545900 No. 6, Lane 2, Shangnan street, Wuxuan Town, Wuxuan County, Laibin City, Guangxi Zhuang Autonomous Region Patentee after: Wuxuan Rice Factory Food Co.,Ltd. Address before: 530000 Room 408, floor 4, building 1, electronic industrial park, No. 8, Gaoke Road, high tech Zone, Nanning, Guangxi Zhuang Autonomous Region Patentee before: NANNING ZHONGCHUANG SPACE TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20201009 |