CN103014000A - 一组特异性识别无乳链球菌的寡核苷酸适配子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组特异识别无乳链球菌的寡核苷酸适配子，属于食品卫生及临床医学检测领域。针对现有技术中尚无无乳链球菌寡核苷酸适配子的缺陷，本发明通过竞争SELEX技术结合无乳链球菌，经过12轮反复的孵育、清洗、解离、扩增、λ核酸外切酶消化制备单链次库，从一个单链DNA随机文库中筛选出了能与无乳链球菌特异性结合的寡核苷酸适配子，经过测序、亲和力和特异性分析，获得3条效果最好的适配子，其核苷酸序列选自序列表中1～3。该组寡核苷酸适配子为分析检测食品卫生、临床血样中无乳链球菌提供了一种特异高效的识别配体，为开发替代现有依赖抗体检测无乳链球菌的方法提供了新的选择。

Description

一组特异性识别无乳链球菌的寡核苷酸适配子

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一种与无乳链球菌高特异性和高亲和力结合的核酸适配子，为该核酸适配子在检测无乳链球菌中的应用提供科学依据和理论基础。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)又称B族链球菌(Group B of streptococcus，GBS)，不仅可引起奶牛乳房炎，使得奶牛产奶量下降，乳汁质量下降，给奶业造成巨大的经济损失；同时，也是引起人类新生儿和妊娠妇女发病及死亡的最重要感染性病原菌。Boe研究报道，美国每年因GBS感染导致1300多名产妇死亡，Heath等研究报道，英国新生儿GBS感染的发病率为0.72/1000活产婴儿。因此，如何快速、准确检测无乳链球菌具有重要研究意义。

传统检测病原菌的方法往往是需要先分离病原微生物，然后通过微生物培养，再用经典的方法鉴定。耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。因此发展快速、灵敏检测病原微生物的技术十分必要。利用抗体虽然能够特异识别病原细菌，能够迅速、准确的对待检标本作出鉴定，但该技术受特异性抗体制备难度的制约。因为按照伯杰分类标准，生物学形状基本相同的细菌群体构成一个菌种，性状相近关系密切的若干菌种组成一个菌属。从本质上讲，同一菌属所含的表面抗原绝大多数是相同的，只有细微的差别，找到这些差别并制备相应特异性抗体显然是一项耗时而艰巨的任务。

近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，是一种研究核酸结构和功能的有效方法。其基本原理是体外化学合成一个随机单链寡核苷酸库，用它与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗去未与靶物质结合的核酸分子，分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下轮的筛选过程。通过数轮重复筛选与扩增，最后得到高亲和力和高特异性的寡核苷酸适配子，即aptamer。利用SELEX技术筛选获得的aptamer识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，适配子具有更明显的优越性，如不依赖动物细胞，不受免疫条件和免疫原性限制，适配子的筛选完全在体外进行，具有时间、质量和数量上的选择弹性，可以在合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子；适配子变性与复性可逆且速度快，可反复使用、长期保存和室温运输；靶分子范围更广，除蛋白质、核苷酸大分子外，还有小分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶碱等)、生长因子、肽链、类固醇、糖类、辅因子(如FMN等)，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子等；与靶分子结合具有更强的特异性和亲和力，不受组织或样品中非靶蛋白的干扰，可以在靶目标性质未知的情况下筛选出其相应的适配子；适配子通过占据靶物质表位，使疾病得到控制，作为临床药物的治疗，已显现了潜在的应用前景，已有研究通过SELEX技术筛选到相应靶物质的适配子作为拮抗剂，抑制肿瘤生长时的血管内皮生长因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白等的作用，以达到治疗目的。在微生物检测方面，特别是对一些致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX过程筛选到与其对应的适配子，检测靶物质，已成为该领域的研究探索热点。

本发明以临床上及奶牛业中常见的无乳链球菌为靶标，利用SELEX技术获得了与无乳链球菌特异性结合的核酸适配子序列，该序列可以快速、准确检测无乳链球菌，由于单链DNA寡核苷酸适配子性能稳定、合成方便且廉价、经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测靶细菌，因此操作简单、直接。该发明可以在生物、食品、医学等领域得到广泛应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种微生物分子生物学检测方法，特别涉及一种利用适配子技术快速、准确检测无乳链球菌的方法。

本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以无乳链球菌完整的菌细胞为靶标，筛选获得与靶细胞高亲和性、高特异结合的适配子，通过羧基荧光素(FAM)标记方法将获得的适配子转为报告适配子，用于从临床血、食品培养上清中检测到相应的靶细菌，达到快速、准确诊断的目的。

本发明的优点：

(1)与蛋白类的抗体相比，单链寡核苷酸更为稳定；aptamer可直接体外合成、标记，不需要标记的二抗，使得操作更为简单、迅速；aptamer的合成成本较抗体制备成本低，周期短。

(2)该序列是从结构显著、与靶细菌具有不同亲和力的7条适配子序列中选取出的亲和力和特异性均最强的适配子序列，能够特异识别无乳链球菌。

附图说明

图1是4B、6B及7B寡核苷酸适配子的饱和结合曲线图；

图2是4B、6B及7B寡核苷酸适配子的二级结构分析图；

图3是无乳链球菌适配子与五种对照细菌的结合率

表1是7个家族代表序列的解离常数Kd值

具体实施方式：

以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1：无乳链球菌特异性结合寡核苷酸适配子的竞争SELEX筛选

1、体外化学合成初始随机单链DNA(ssDNA)文库及引物(由美国Integrated DNATechnologies公司完成)，序列如下：5′-ATAGGAGTCACGACGACCAG(40N)TATGTGCGTCTACCTCTTGA-3′；构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量为10¹⁴以上；

引物I：5′-ATAGGAGTCACGACGACCAG-3′；

引物II：5′-TCAAGAGGTAGACGCACATA-3′；

5′磷酸化下游引物：5′-P-TCAAGAGGTAGACGCACATA-3′；

将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100 μM贮存液于-20℃贮存备用。

2、PCR扩增条件及Lambda核酸外切酶消化制备单链次库的条件

将合成的随机单链文库(ssDNA)稀释作为PCR模板扩增出磷酸化的双链DNA(dsDNA)产物，研究Lambda核酸外切酶消化磷酸化反义链制备单链次库的影响因素，最终确定制备单链次库的最佳条件。

PCR反应体系为：稀释随机文库作为模板DNA1μL(100 ng)，上游引物及磷酸化下游引物(20μM)各1μL，dNTP_mix(each 25 mM)1μL，10×PCR扩增缓冲液5μL，灭菌超纯水40μL，Taq酶1μL，总体积为50μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min； 95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；循环20次；最后72℃延伸10min。通过8％非变性PAGE验证扩增效果。

将电泳条带位置正确且单一的PCR扩增产物汇集在一个2mL离心管中，加入与PCR产物溶液等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(V∶V∶V＝25∶24∶1)，旋涡混匀管内容物使呈乳状，8000rpm，4℃离心5min，将上层液体小心移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。重复操作一次，直至两相界面上见不到蛋白质为止。向含样品的离心管中加入1/10体积的3 M醋酸钠(pH 5.2)溶液及2倍体积的无水乙醇，充分混匀后放-70℃冰箱内过夜。取出平衡，12000rpm，4℃离心15min。吸弃上清，用4℃预冷的70％乙醇0.5mL上下颠倒洗涤白色固体沉淀，12000rpm，4℃离心5min。吸弃上清，打开盖子将沉淀晾干后，重溶于适当体积的灭菌超纯水中，通过Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度计测定dsDNA浓度。

取确定浓度的纯化PCR产物溶液，往其中加入按酶活定义计算出的所需核酸外切酶(5U/μL)，加入1/10体积的10×反应液混合均匀，在37℃下反应0.5～2 h，75℃水浴10min使酶失活停止反应。通过7 M尿素变性8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，置0.5μg/mL溴化乙锭溶液中染色后，将胶置于凝胶成像仪中观察验证酶切反应是否完全，确定最佳酶切条件后再进行放大酶切。将酶切产物汇集在一个1.5 mL离心管中，以酚氯仿乙醇沉降法提纯，将ssDNA沉淀物重溶于适当体积的缓冲液中，通过Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度计测定ssDNA浓度。

3、筛选所用靶标细菌的获取与处理：

LB液体培养基培养无乳链球菌，37℃摇床培养至对数生长期(OD₆₀₀约为0.3)，停止培养，收集OD₆₀₀为0.3左右的菌液1mL，4℃，5000rpm离心5min，弃上清，用结合缓冲液(1×BB)冲洗两次，洗去多余的培养基成分，置4℃环境储存备用。

4、SELEX技术筛选12轮获得特异识别无乳链球菌的核酸适配子

第一轮筛选时，反应体系为600μL，取2nmol扩增后的随机dsDNA文库加入适量的1×BB于95℃变性5min，立即冰浴10min。将其加入处理好的菌细胞(1×10⁸个)离心管中，再加入5倍于随机ssDNA文库摩尔数的5％BSA溶液和酵母tRNA，以降低结合背景，于37℃振荡孵化1 h。孵化后需更换离心管，以去除与离心管壁结合的ssDNA，将新离心管于4℃，5000rpm离心5min，弃上清，去除未结合或结合不紧密的随机ssDNA文库，随后用含0.05％BSA的1×BB通过重悬浮和离心冲洗2次，最后加入100μL1 ×PCR缓冲液，于95℃变性5min，立即冰浴10min，经4℃，5000rpm离心10min，吸取上清至另一洁净的离心管中，即为第一轮筛选所得的适配子，作为PCR扩增的模板DNA。

PCR反应体系为：单链DNA解离液5μL，上游引物及磷酸化下游引物(20μM)各1μL，含Mg²⁺dNTP_mix1μL(25 mM)，10×PCR缓冲液5μL，Taq聚合酶(5 U/μL)1μL，加灭菌超纯水至50μL。反应程序为：95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；循环25次；72℃，5min。第1-12轮筛选的PCR产物，均通过非变性8％聚丙烯酰胺凝胶电泳验证扩增效果，然后将PCR总体积扩大为100μL/管进行大批量扩增纯化，并用Lambda核酸外切酶消化法制备单链次库作为下一轮SELEX筛选投入的次库，此步利用尿素变性8％PAGE电泳验证。对制备的单链次库进行核酸纯化后，使用Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度计测定ssDNA浓度计算下一轮文库投入体积。第二轮至第十二轮反应体系为350μL，其中随机ssDNA文库为100pmol，每轮筛选需用新鲜菌液，重复筛选12次获得无乳链球菌的适配体库。

为了筛选到富集快速且亲和力高的寡核苷酸适配子序列，在随后的筛选中逐渐缩短孵育时间及减少对解离ssDNA的扩增循环次数。此外，从第三轮筛选开始，逐轮加入化脓性链球菌进行反筛，以提高无乳链球菌适配子的亲和力和特异性。

5、克隆测序及序列分析

将第12轮筛选得到的寡核苷酸适配子扩增产物，送至上海生工生物技术公司，克隆测序共获得30条寡核苷酸适配子序列。采用DNAMAN软件对寡核苷酸适配子序列进行一级结构分析，获得30条序列的同源性信息；并用RNA Structure 4.2软件对寡核苷酸适配子序列的二级结构进行分析。根据无乳链球菌寡核苷酸适配子的一、二级结构特征，将30条序列分为7个家族，从每个家族中选出1条能级较低、结构稳定的序列为代表，由上海生工合成5’端FAM荧光标记的序列，以作进一步的亲和力和特异性分析。

6、一组无乳链球菌寡核苷酸适配子亲和力和特异性的分析

6.1亲和力分析

将7条FAM荧光标记的无乳链球菌寡核苷酸适配子分别用1×BB稀释为不同的浓度梯度(10，20，50，100，200，500 nM)各300μL，与无乳链球菌1×10⁸室温孵育1h，孵化后更换离心管，将新离心管于4℃，5000rpm离心5min，弃上清，用1×BB反复离心冲洗2次后，将菌体重悬于500μL1×BB，用BD FACSC alibur流式细胞分析仪检测结合上FAM标记的适配子的菌体百分率(测三次取平均值)，利用GraphPad Prism 5软件计算各寡核苷酸适配子的解离常数Kd值。下表为7条寡核苷酸适配子代表序列的Kd值：

分析可知，与无乳链球菌亲和力最强即Kd值最小的寡核苷酸适配子序列为4B、6B、7B序列，图1为其饱和结合曲线图，图2为其二级结构图。

6.2特异性分析

根据6.1的分析结果，挑选4B、6B、7B三条寡核苷酸适配子进行特异性分析。取5′FAM荧光标记的寡核苷酸适配子(100nM)各300μL，分别与金黄色葡萄球菌、李斯特菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌(1×10⁸)于37℃孵育1h，用1×BB洗涤2次后，将菌体重悬于500μL1×BB，用BD FACSC alibur流式细胞分析仪检测结合上FAM标记的适配子的菌体百分率(测三次取平均值)，结果显示无乳链球菌寡核苷酸适配子竞争结合靶标的能力均强于它与其他五种常见致病菌，结合率如图4所示。

本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或局部该进，都将视为在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一组特异识别无乳链球菌的寡核苷酸适配子，其核苷酸序列为：

1)序列表1～3所示的核苷酸序列；

2)序列表1～3所示核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的序列；或，

3)含有序列表1～3所示核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列。

2.权利要求1所述的无乳链球菌寡核苷酸适配子，其特征在于其5′端或3′端可以进行FAM、生物素、FITC、地高辛等化学修饰，其特征还在于单独或联合使用修饰或不修饰适配子均能用于无乳链球菌的分析检测。

3.权利要求1所述无乳链球菌寡核苷酸适配子在食品、医学临床中检测无乳链球菌的应用。

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