CN110819632B - 用于结合曲妥珠抗体的核酸适体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于结合曲妥珠抗体的核酸适体,其序列为SEQ ID NO.:1所示,或其一个或多个不降低其结合功能的突变。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,尤其是涉及能够结合曲妥珠抗体的核酸适体及其应用。
背景技术
核酸适体是通过特定空间结构和靶标高特异性、高亲和力结合的一种单链寡核苷酸(参考文献1和2)。经过三十年的发展,核酸适体作为一种靶向识别工具被广泛应用于体外诊断(参考文献3和4)、靶向成像(参考文献5)、药物递送(参考文献6)等诸多领域。核酸适体的靶分子范围非常广泛,靶分子不仅可以是细胞因子、多肽等大分子,还可以是有机物、氨基酸、染料、金属离子等小分子(参考文献3和4),与靶标结合的解离常数(Kd)可以在nM甚至pM水平。目前绝大多数的核酸适体都是通过体外的SELEX技术筛选获得(参考文献7和8)。SELEX技术即配体指数富集系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byEXponential enrichment),可以从随机的单链核酸文库中筛选出与靶标特异性地高度亲和力结合的核酸适体序列(参考文献9)。传统的SELEX筛选过程包括以下几个步骤:(1)文库构建。通过合成构建一个库容量约为1013-15的单链寡核苷酸的文库。文库两端为固定序列,中间为20-60个碱基的随机序列。(2)筛选富集。将随机文库和靶标进行孵育,通过洗涤分离等技术富集与靶标分子高亲合力结合的核酸分子,淘汰不结合及弱结合分子。同时加入对负筛选,淘汰与负靶标结合的分子,提高筛选的特异性。(3)文库扩增。解离下可以结合靶标分子的核酸,以它为模板进行PCR扩增,生成次级文库,用于下一轮筛选。随着筛选轮数的增加,结合能力强的序列逐步富集。(4)序列表征。对最终富集文库进行测序,选出结合能力最佳且特异性最好的序列,表征其结合能力以及特异性。通过SELEX技术可以筛选出与各种靶标高特异性、高度亲和力结合的一条或者多条核酸适体序列,用于后续的研究。
基于核酸适体的检测制剂:核酸适体因其具有高亲和、高特异性、规模化合成易化学修饰合成等优势,常用于各类蛋白、小分子等的检测,如:人凝血酶(thrombin)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、黄曲霉毒素等的检测(参考文献10-13)。有别与传统的传统的酶联免疫吸附方法(ELISA),核酸适体可以巧妙的设计为荧光探针,当核酸适体与靶标结合后发生构象变化,产生易于检测的荧光信号。如:Nutiu等设计了一种核酸适体探针,实现对ATP高灵敏检测(参考文献14)。Sharma等通过核酸适体结构转换以及荧光信号的变化测定了牛奶当中的黄曲霉毒素M1(AFM1)(参考文献15)。
曲妥珠单抗及其检测制剂和分离纯化方法:曲妥珠单抗(Trastuzumab)是人源化IgG1型单克隆单抗,商品名叫赫赛汀(Herceptin),可与人源HER2靶点特异结合,它通过结合在HER2上阻止人体表皮生长因子与HER2的结合,同时使免疫细胞来杀伤癌细胞,从而阻断癌细胞的生长(参考文献16)。曲妥珠单抗由CHO细胞生产,纯化方式为使用Protein A的进行纯化,现有的检测手段主要为使用传统的ELISA的方法进行。目前为止尚未有针对曲妥珠单抗的核酸适体及基于核酸适体的检测制剂和分离纯化方法的报道。
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发明内容
本发明的一方面涉及用于结合曲妥珠单抗的核酸适体,其序列为SEQ ID NO.:1所示,即
5’-CAGCACCGTCAACTGAATCGAGAGTGTCCAGGGTTCCAAGGTGCTTCGTGGACACGGTGTGATGCGATGGAGATGT-3’,或其中一个或多个不影响其结合功能的突变。
本发明的优选的实施例涉及用于结合曲妥珠单抗的核酸适体,其序列为SEQ IDNO.:2所示,即,
5’-GTCCAGGGTTCCAAGGTGCTTCGTGGAC-3’,或其中一个或多个不影响其结合功能突变。
本发明涉及的用于结合曲妥珠单抗的核酸适体,其结构如下所示,
本发明另一方面涉及利用如上所述的核酸适体用于制备检测曲妥珠单抗的试剂的应用和/或用于制备纯化曲妥珠单抗试剂的应用;本发明的优选的实施例涉及利用核酸适体制备用于检测曲妥珠单抗的核酸适体探针的应用,和/或纯化曲妥珠单抗磁珠载体的应用。
本发明另一方面涉及利用如上所述的核酸适体的制备用于结合曲妥珠单抗的核酸适体探针,其包含了如上所述的核酸适体。
附图说明
图1是本发明SELEX技术筛选核酸适体时HR1到HR8的核酸适体与曲妥珠单抗结构情况。
图2是本发明得到CH3S-3核酸适体与曲妥珠单抗结合能力的Kd值。
图3是本发明实施例涉及的核酸适体荧光探针示意图。
图4是本发明实施例涉及的核酸适体荧光探针检测曲妥珠单抗特异性的结果。
图5是本发明实施例涉及的核酸适体探针检测不同浓度曲妥珠单抗的检测结果。
图6是本发明实施例涉及的核酸适体探针在不同提携中检测曲妥珠单抗的检测结果。
图7是本发明实施例涉及的核酸适体探针检测不同表达量细胞株分泌的曲妥珠单抗的检测结果。
图8是本发明实施例涉及的核酸适体探针和Fc片段抗体识别热变性的曲妥珠单抗的检测结果。
图9是本发明实施例涉及的采用核酸适体分离纯化曲妥珠单抗的流程示意图。
图10是本发明实施例涉及的采用核酸适体磁珠纯化曲妥珠单抗的电泳图。
图11是本发明实施例涉及的采用核酸适体纯化曲妥珠单抗的活性图。
具体实施方式
在本发明的范围中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互组合,从而构成优选的技术方案。
目前,现有技术中缺乏能够识别曲妥珠单抗核酸配体;现有的曲妥珠单抗的生产检测和含量检测均利用传统的ELISA(酶联免疫吸附实验)方法,此方法反应速度慢,通量不高,周期长等问题,并且缺乏实时快速的检测方法。
本发明提供了一种用于结合曲妥珠单抗的核酸适体,其序列为SEQ ID NO.:1所示,即
5’-CAGCACCGTCAACTGAATCGAGAGTGTCCAGGGTTCCAAGGTGCTTCGTGGACACGGTGTGATGCGATGGAGATGT-3’。
本发明的某些实施例,用于结合曲妥珠单抗的核酸适体包括不降低其与曲妥珠单抗结合能力的一个或多个突变,例如置换突变,其可以在其发卡结构的茎杆区或环状区。
本发明优选的实施例中涉及的结合曲妥珠单抗的核酸适体,在SEQ ID NO.:1所示的核酸序列基础上进行修改,例如增长或截短处理。本发明一个具体实施例涉及将SEQ IDNO.:1所示的核酸序列进行截短,其具体序列如SEQ ID NO.:2所示,即
5’-GTCCAGGGTTCCAAGGTGCTTCGTGGAC-3’。优选地,此核酸适体的结构如下:
本发明涉及利用核酸适体制备用于检测曲妥珠单抗的试剂的应用,和\或利用核酸适体制备纯化曲妥珠单抗试剂的应用;优选地,所述核酸适体制备用于检测曲妥珠单抗的核酸适体探针的应用,和/或用于制备纯化曲妥珠单抗磁珠载体的应用。
本发明实施例涉及曲妥珠单抗核酸适体的检测试剂,具体涉及曲妥珠单抗核酸适体的检测探针,其利用SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示的核酸适体序列,序列末端加入多T序列(T-strand)和颈部互补序列(C-strand)。本方面的一个具体实施方式涉及的曲妥珠单抗核酸适体的检测探针的序列如SEQ ID NO.:3所示,即
5’-AGTCCACGTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCCAGGGTTCCAAGGTGCTTCGTGGACT-3’;
另外,序列两端分别进行荧光基团和淬灭基团的耦连,当核酸适体探针不予靶标结合时,两基团靠近,荧光信号低,当给核酸适体探针与靶标蛋白结合时,原来的分子结构发生改变,荧光基团与淬灭基团分离,获得可检测的荧光信号输出。本发明具体实施例中,在核酸适体的5’端连接荧光物质、放射性物质、生物素或酶标记和/或3’端连接荧光淬灭剂或抑制剂;优选地,其序列的5’端连接荧光物质,优选为其序列的5’端由FAM荧光物质修饰;其序列3’端由BHQ1荧光淬灭剂修饰。
本发明另外的具体实施例涉及用于检测曲妥珠单抗的检测试剂盒,其中,包括如上所述的核酸适体或如上所述的核酸适体探针;其能够用于曲妥珠单抗药物在生产制备、质量控制和含量分析方面的定量和定性分析。
本发明其他实施例中涉及用于曲妥珠单抗纯化,具体涉及使用核酸适体偶联分离材料,例如磁珠、Ni珠、纳米材料等,本发明的一些具体实施例涉及使用磁珠或凝胶树脂,所述磁珠或凝胶树脂偶联如上所述的核酸适体。
本发明的部分实施例如下所示,实施例中未提及的其他方法及所用的材料,均为本领域常规的方法和材料。
实施例1曲妥珠单抗核酸适体的筛选
利用SELEX技术,以空羧基磁珠为负筛,以偶联曲妥珠单抗的羧基磁珠作为正筛。binding buffer由0.1mg/mL tRNA、1mg/mL BSA、0.55mM MgCl2和DPBS配制。具体方法如下:
(1)准备以下序列所示的单链DNA文库:
5'-CAG CAC CGT CAA CTG AAT-(N40)-GTG ATG CGA TGG AGA TGT-3'(SEQ IDNO.:4),溶于binding buffer;
(2)反筛:将步骤(1)准备的文库与空羧基磁珠共同孵育,孵育完成后收集孵育后的上清;
(3)正筛:将步骤(2)所得的上清与偶联曲妥珠单抗的羧基磁珠孵育,孵育完成后,对获得的磁珠进行清洗;
(4)PCR富集:将步骤(3)所得的清洗过的磁珠进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;其中,PCR扩增所用的引物为:
引物F:5’-CAG CAC CGT CAA CTG AAT-3’(SEQ ID NO.:5),
引物R:5’-biotin-ACA TCT CCA TCG CAT CAC-3’(SEQ ID NO.:6);
(5)单链DNA的纯化:将PCR扩增产物与链霉亲和素包被的琼脂糖球珠进行孵育,再进行200mM NaOH变性解链之后,过柱脱盐,收集到ssDNA,进行冻干;
(6)核酸适体循环筛选:将步骤(5)所得的ssDNA作为下一轮筛选的次级文库,并重复步骤(2)-(5)的筛选过程。
(7)共进行了8轮(HR1到HR8)筛选,如下图1所示,随着轮数的增加,每轮核酸适体文库与靶标曲妥珠单抗的结合在持续增加,我们选择第8轮进行T载体连接,挑单克隆和测序。
本发明通过上述方法,获得一条核酸适体CH3,序列为
5’-CAGCACCGTCAACTGAATCGAGAGTGTCCAGGGTTCCAAGGTGCTTCGTGGACACGGTGTGATGCGATGGAGATGT-3’(SEQ ID NO.:1);并进行了截短处理,获得一条核酸适体CH3S-3,序列为
5’-GTCCAGGGTTCCAAGGTGCTTCGTGGAC-3’(SEQ ID NO.:2)。CH3S-3结构如下所示,
检测CH3S-3与曲妥珠单抗的结合能力(kd),如图2所示,kd=10.3nM。
实施例2曲妥珠单抗核酸适体探针
根据文献中构建DNA适体探针的相关结构与方法,如图3所示,将茎环结构的DNA适体进行改造,在序列中加入多T序列(T-strand)和茎部互补序列(C-strand),并在两端进行荧光基团(FAM)和淬灭基团(BHQ1)偶联,当核酸适体探针不与靶标结合时,两基团靠近,荧光信号低,当该核酸适体探针与靶标蛋白结合时,原来的分子结构发生改变,荧光基团与淬灭基团分离,将有较高的荧光信号输出,示意图如图3。根据该原理,在筛选过程中得到的茎环结构的ssDNA适体中加入T-strand和C-strand,并在一端进行FAM修饰,而另一端进行BHQ1修饰。在构建过程中通过DNA分子构象模拟,尝试不同序列的C-strand序列,通过测定构建的DNA适体探针与人IgG1型抗体曲妥珠单抗的荧光值变化,构建出最优的探针。设计核酸适体探针RC7,序列如下:
AGTCCACGTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCCAGGGTTCCAAGGTGCTTCGTGGACT(SEQ ID NO.3)。
检测核酸适体探针RC7与其他蛋白的作用,结果如图4,探针RC7只与曲妥珠单抗蛋白进行相互作用,作用后荧光值为之前的2.5倍,对于其他蛋白作用后荧光值为与之前相同。
使用RC7检测曲妥珠单抗,发现随着曲妥珠单抗浓度的增加,无论在单纯样本还是复杂样本里信号值都在增加,如图5。所以,使用RC7可以检测曲妥珠单抗的含量或者浓度。
实施例3利用曲妥珠单抗的核酸适体探针用于单抗生产过程的检测
CHO细胞是用于抗体药物及其他大分子蛋白质药物生产的一种最为重要的工程细胞,基因工程化的CHO细胞将分泌抗体药物在培养基中。由于需检测培养基中抗体含量,检测环境复杂,使用该探针对生产抗体的CHO细胞的培养基中抗体含量进行检测,实现对抗体药物生产过程中抗体表达情况的实时快速监控,则可根据表达情况,进行工艺优化,例如加入葡萄糖、增加溶氧量等等,提高抗体的表达水平。所以检测了在不同复杂环境中,使用RC7探针检测曲妥珠单抗的情况,如图6所示:
同时模拟了细胞分泌曲妥珠单抗的过程,发现随着曲妥珠单抗的分泌即含量的增加,如图7,RC7可以检测到培养基中曲妥珠单抗的浓度的上升,区分出不同细胞株,所以,使用核酸适体探针可以进行CHO细胞生产抗体过程中的抗体含量检测和监控。
实施例4抗体质量检测
抗体药物的质量受环境,如紫外线、温度等影响明显,易发生抗体失活,丧失疗效的情况。如图8,使用核酸适体CH3S和CH3S-3,以及识别Fc片段的抗体(antibody)对95℃变性0min、5min、10min和20min的曲妥珠单抗进行检测。结果显示核酸适体探针仅识别正常活性的抗体,而不能识别热变性的抗体。但Fc片段的抗体(antibody)不能区分正常活性和热变性的抗体,均有响应。因此,核酸适体探针可实现曲妥珠单抗的质量控制检测,区分变性和非变性抗体。
实施例5基于核酸适体的抗体分离纯化
使用核酸适体进行曲妥珠单抗的分离纯化的步骤如图9所示,将核酸适体CH3S-3与珠子进行连接固定之后,加入含有曲妥珠单抗的复杂样品,进行孵育,即进行Binding步骤,30分钟之后,去除上清留下珠子并清洗,加入核酸适体的互补链,进行洗脱(Elution)步骤,之后收集上清,上清中即为曲妥珠单抗。
如图10所示,将使用核酸适体(Apt)进行纯化和使用传统的Protein A方法(ProA)进行纯化的曲妥珠单抗进行SDS-PAGE分析蛋白条带大小即可分析纯化出蛋白的正确性,发现核酸适体确实可以分离纯化出曲妥珠单抗。
将使用核酸适体(Apt)进行纯化和使用传统的Protein A进行纯化的曲妥珠单抗与HER2阳性的细胞进行孵育结合,通过流式细胞术验证纯化出蛋白的活性,如图11所示,使用核酸适体(Apt)进行纯化和使用传统的Protein A进行纯化的曲妥珠单抗与原始的曲妥珠单抗(Herceptin)相比,它们识别并结合HER2阳性的细胞能力基本相同,说明使用核酸适体可纯化出复杂样本中的曲妥珠单抗,并且具有较好活性。
本发明虽然已以较佳实施例公开如上,但其并不是用来限定本发明,任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内,都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改,因此,凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰,均属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (8)
1.用于结合曲妥珠抗体的核酸适体,其特征在于,其序列为SEQID NO.:2所示,即,5’-GTCCAGGGTTCCAAGGTGCTTCGTGGAC-3’。
3.权利要求1-2任一项所述的核酸适体用于制备用于检测曲妥珠抗体的试剂的应用或用于制备纯化曲妥珠抗体试剂的应用。
4.用于结合曲妥珠抗体的核酸适体探针,其特征在于,其包含权利要求1-2任一项所述的核酸适体序列,序列末端加入多T序列T-strand和颈部互补序列C-strand。
5.如权利要求4所述的核酸适体探针,其特征在于,其序列为SEQ ID NO.3所示,其序列的5’端连接荧光物质、放射性物质、生物素或酶标记,3’端连接荧光淬灭剂或抑制剂。
6.如权利要求5所述的核酸适体探针,其特征在于,其序列的5’端由FAM荧光物质修饰;其序列3’端由BHQ1荧光淬灭剂修饰。
7.用于检测曲妥珠抗体的检测试剂盒,其特征在于,
其包括权利要求1-2任一项所述的核酸适体或权利要求4-6任一项所述的核酸适体探针;
所述检测试剂盒能够用于曲妥珠抗体药物在生产制备、质量控制和含量分析方面的定量和定性分析。
8.用于曲妥珠抗体纯化的磁珠或凝胶树脂,其特征在于,所述磁珠或凝胶树脂耦联如权利要求1-2任一项所述的核酸适体。
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2019
- 2019-11-29 CN CN201911202428.3A patent/CN110819632B/zh active Active
Patent Citations (3)
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