CN117343933A - 一种特异性结合h-fabp的核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种特异性结合H‑FABP的核酸适配体及其应用，本发明涉及基因检测领域，核酸适配体的靶标为：5’‑TTCAGCACTCCACGCATAGC‑36N‑CCTATGCGTGCTACCGTGAA‑3’SEQ ID NO 01，或与靶标同源性至少为88％的序列，或与靶标具有不多于3个不同核苷酸的序列；36N表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。本发明筛选发现的H‑FABP适配体具有高特异性以及灵敏性，因为适配体为化学合成物质，所以在检测使用过程中不会有批间差异性的问题，同时在检测过程中避免使用了抗体物质大大降低了检测成本。

Description

一种特异性结合H-FABP的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药基因治疗领域，特别是一种特异性结合H-FABP的核酸适配体及其应用。
背景技术
适配体(Aptamer)是一种经体外筛选技术得到的寡核苷酸序列，与相应的配体有严格的识别能力和高度的亲和力,大小一般约6-40kDa。单链寡核苷酸，特别是RNA的一些二级结构，如发夹、茎环、假节、凸环、G-四聚体等，可使核酸分子形成多种三维结构，成为适配体与靶物质特定区域结合的基础，二者之间的结合主要通过“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、静电作用和形状匹配等产生高特异性的结合力。适配体具有高特异性、靶分子广、易于体外合成和修饰等优点，已经在基础研究、临床诊断和治疗中显示了广阔的应用前景。
核酸适配体在病毒方面的应用：SELEX技术发展至今，已针对广泛类型的病毒靶分子如逆转录酶、解螺旋酶、核衣壳蛋白和调节因子等筛选出了各自的适体。在多种病毒病研究中显示适配体能够识别和结合到病毒的特定部位上，适配体可以作为功能阻断剂直接影响病毒的复制、翻译中特定步骤，从而中断疾病发生；适配体也可以特异性的识别被病毒感染的细胞，从而用于诊断。
核酸适配体在细菌方面的应用：适配体检测抗原是近年来发展起来的新技术，将一个适配体末端交联到固相载体上作为捕获分子，去捕获待测标本中的靶物质，另一个适配体的5′端标有相应的指示剂，如荧光素、生物素、放射性同位素或胶体金等标记转化为检测分子，当检测分子与相应的待测标本结合后就会产生信号，以达到检测的目的。
在细菌治疗方面的应用：虽然SELEX技术的研究应用依然在初级阶段，但是适配子作为直接蛋白配体、抑制剂以及临床疾病的治疗药物已展现出潜在的应用前景，SELEX技术出现8年后就已经有应用于临床试验的产品。适配体可以直接结合于靶物质表位，使病原不能和机体结合而使疾病得到控制。因此在理论上，适配体可以被用于治疗任何由有害基因的表达而引起的疾病，例如细菌感染、病毒感染、炎性疾病等。
此外，适配体可以作为分子探针用于很多疾病的诊断，例如通过筛选出特异性的适配体，可以用于肿瘤的诊断；适配体具有广泛的应用场景。
脂肪酸结合蛋白(FABP)是脂质结合蛋白超家族的成员，它们都是膜结合蛋白，可能在脂肪酸转运，细胞生长，细胞信号传导和基因转录中有关键作用，对于细胞长链脂肪酸到代谢转化部位的细胞内运输至关重要。主要分布在心肌细胞中，也被命名为心脏型脂肪酸结合蛋白。
心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是一种分子量为15kDa的小蛋白，有助于长链脂肪酸的摄取、细胞内代谢和运输，其将脂肪酸和其他亲脂性物质从细胞质转运到细胞核，在那里这些脂质被释放到一组核受体。这种蛋白质具有一种心脏特异性的脂肪酸结合蛋白形式，在心肌细胞中含量丰富，H-FABP的过表达通过细胞周期的负调节和细胞生长因子的下调抑制细胞生长和增殖，但在缺氧或缺血条件下增强细胞存活。
H-FABP可用于检测评估不良心脏事件的风险。心脏损伤后30-90分钟内血液中的H-FABP含量升高，在6-8h时达到最大值，24-36h恢复基线水平，由于其快速释放到血液中，因此H-FABP可以作为急性冠脉综合征(ACS标志物；另一方面，由其释放更快且具有特异性，在心肌损伤后，它迅速从细胞质基质释放进入循环，所以H-FABP被鉴定为急性心肌梗死(AMI)标志物。
核酸适配体是短的单链DNA、RNA或合成的异种核酸(XNA)分子，可以与相应的靶标相互作用，具有高亲和力。由于其独特的特性，包括生产成本低、易于化学修饰、高热稳定性、可重复性以及低水平的免疫原性和毒性，核酸适配体可用作诊断和治疗中抗体的替代品。通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)对适配体进行系统进化是一种用于适配体筛选的实验方法，允许选择和鉴定具有高亲和力和特异性的体外适配体。
目前，对H-FABP检测技术常用的方法有如下几种：放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、酶联免疫测定法(ELISA)、免疫胶体金技术、胶乳增强免疫比浊法等。其中，胶乳增强免疫比浊法因其成本较低，且检测耗时短，因而在目前使用最为广泛，但是其精密度和灵敏度较差。但是，其他检测方法则存在检测成本高、耗时长的缺陷，且对操作人员的专业度要求较高。而本发明筛选发现的H-FABP适配体具有高特异性以及灵敏性，因为适配体为化学合成物质，所以在检测使用过程中不会有批间差异性的问题，同时在检测过程中避免使用了抗体物质大大降低了检测成本，所以H-FABP适配体在临床检测应用市场上具有广阔前景。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种特异性结合H-FABP的核酸适配体及其应用，本发明筛选发现的H-FABP适配体具有高特异性以及灵敏性，因为适配体为化学合成物质，所以在检测使用过程中不会有批间差异性的问题，同时在检测过程中避免使用了抗体物质大大降低了检测成本。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种特异性结合H-FABP的核酸适配体，核酸适配体的靶标为：5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-36N-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’SEQ ID NO 01，或与靶标同源性至少为88％的序列，或与靶标具有不多于3个不同核苷酸的序列；36N表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。
一种特异性结合H-FABP的核酸适配体，核酸适配体的序列为：ATTGGCACTCCACGCATAGGCCTACCACGGTAGAAGTGCCATCCCCTCCGACATCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA SEQ ID NO 06。
前述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体，核酸适配体的空间结构由两个茎环组成。
前述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体，核酸适配体的空间结构由5'-GCCTACCACG-ACATCCC-3'组成的第一茎环，5'-GTAGAAGTGCCATCCCCTC-3'组成的第二茎环组成。
前述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体，适配体中的一个或多个核苷酸在5’位置以-F、-NH2、-OCH3修饰，在3’端以反式胸苷修饰。化学修饰提高抗核酸酶能力并提高亲和力，修饰方式不受限制，只要是根据本发明的序列的基础上进行的修饰得到的产品均在本发明的保护范围内。
前述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，应用于病毒诊断、抗原检测、疾病诊断试剂盒或用于细菌感染、病毒感染、炎性疾病的治疗药物。这里的应用不是穷举，只要是采用本发明的序列或与本发明的序列有1、2或3个不同的类似序列均在本发明的保护范围内。
前述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，应用于多个核酸适配体联用的组合物。
前述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，用于制备H-FABP捕获、分离、纯化制剂。
前述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，用于在制备H-FABP检测或诊断试剂、试剂盒或传感器。
前述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，用于在制备或构建H-FABP靶向给药系统中。
前述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，用于检测评估不良心脏事件的早期筛查和快速诊断的产品。
本发明的有益之处在于：
本发明的H-FABP蛋白核酸适配体在整个发明过程中都不会使用到抗体物质，并且其对于H-FABP蛋白具有高特异性结合、生产合成比较简单廉价、使用稳定性强等特点，在提供新的检测策略的同时提高经济效益；
本发明的H-FABP蛋白核酸适配体的核酸序列在空间构型上由两个茎环组成，其中5'-GCCTACCACG-ACATCCC-3'组成第一茎环，5'-GTAGAAGTGCCATCCCCTC-3'组成第二茎环，茎环结构使得H-FABP蛋白核酸适配体与H-FABP蛋白具有较好的结合稳定性以及构象稳定性，为后续应用的开发提供了原材料。
专业术语：
靶标可以是氨基酸、氨基酸相关分子、肽、类固醇、脂质、糖、碳水化合物、生物标志物、药物分子、药物代谢物、辅酶、核苷酸(nt)、核苷酸相关分子、吡啶核苷酸、环核苷酸或环二核苷酸。在另一个实施方案中，靶标也可以是感染因子、抗原、毒素、疾病生物标志物和/或特异性金属离子。
术语“文库”、“核酸文库”、“多核苷酸文库”等通常是指具有可变序列的核酸分子的混合物，从可变序列中选择适配子用于特定靶标或小分子的靶标家族。文库的核酸分子的长度范围为约5至约500个核苷酸。在一些实施方案中，文库的核酸分子具有约10个核苷酸和约100个核苷酸之间。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可用于指包含DNA、RNA、其衍生物或其组合的核酸。
适体可以部分或完全折叠以形成各种二级结构(例如，茎、环、凸起、假结、G-四链体和亲吻发夹)，其进而可以形成独特的三维结构，其能够通过利用各种相互作用如疏水和静电相互作用、氢键、范德华力和π-π堆积以及形状互补性特异性地识别它们的靶标。
适体可具有游离末端，例如，3’和5’末端可以不连接以形成环，尽管它们可以与其他分子缀合或以其他方式修饰。适体可采用三级结构，例如发夹环。在一些实施方案中，适体可以是环状的。例如，核酸的5’和3’末端共价键合以形成不具有任何自由末端的环。
本发明的适体包含至少一个茎、两个茎或三个茎。每个茎可以是完全或部分互补的。每个茎可以包含相同或不同数目的核苷酸。每个茎的示例性长度可以是1-15个碱基对。每个茎的也可以是2-40个核苷酸的长度。部分互补茎可以包含多于一个摆动碱基对。
适体包含至少一个接合部，接合部在两个或更多个茎相遇时形成。在某些实施例中，接头可以是两个杆之间的环，或三通接头(TWJ)。该连接可以包含例如10-30个核苷酸。适体中的连接可以充当小分子靶标的结合结构域。
适体可以具有发夹/茎环结构；环的长度可以具有10-60个核苷酸。环区是适体的靶标结合位点。在具体的实施方案中，所述适体包含茎和环区。环区域对结合感兴趣的小分子具有特异性。
附图说明
图1是本发明核酸适配体的一种实施例的空间结构示意图；
图2是本发明实施例1中迭代循环12轮得到各轮筛选保留率结果示意图；
图3是本发明实施例2中表面等离子共振法(SPR)检测筛选文库与H-FABP蛋白亲和力的实验结果示意图；
图4是本发明实施例3中核酸适配体H-FABP-Apt-006与H-FABP蛋白的亲和力检测结果示意图；
图5是本发明实施例4中ELISA实验验证H-FABP核酸适配体能与H-FABP蛋白结合实验结果示意图；
图6是本发明实施例4中ELISA实验验证H-FABP核酸适配体能与H-FABP蛋白结合实验吸光度与蛋白浓度的线性关系图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中受到启示，通过替换技术特征等方式实现与本发明相同或相似的技术效果，所以下文的详细描述仅仅是一种实施例，只要是在本发明的发明精神和范围的基础上通过人为修改1个、2个、3个核苷酸得到的序列。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
实施例1
特异性结合H-FABP核酸适配体的筛选：
随机单链DNA文库：5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-36N-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’SEQ ID NO 01；其中，“36N”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物信息如表1所示，由通用生物(安徽)股份有限公司合成。
表1H-FABP引物及其序列
其中，引物名称中的S代表正向引物，引物名称中A代表反向引物，序列中的25个A表示由25个腺苷酸(A)组成的polyA尾，“Spacer 18”表示18原子的六乙二醇间臂。在上述3’端引物中所用的“Spacer 18”结构式如式(I)所示。
引物分别用DPBS缓冲液(DPBS：100mM，NaCl：150mM，KCl：1mM，MgCl2：1mM，CaCl2：1mM；PH6.0，25℃)配制成100μM的贮存液，于-20℃保存备用。
以第1轮为例，后续迭代循环筛选流程：
1.文库变复性
将文库按照设计浓度1uM至10uM稀释好，反应体系为100ul至140ul，混匀后进行快速变复性。
PCR仪PCR变复性程序：
95℃10min，25℃5min(速率为0.1℃/s降温)。
2.反筛磁珠偶联
1)洗磁珠：取400ul羧基磁珠(购买于博岳生物，M1000S3)，400ul超纯水洗4遍，最后一遍换离心管；
2)活化：EDC与NHS各100ul，溶解后将EDC加入到NHS中，混匀加入到去上清的磁珠中将磁珠活化15min；
3)清洗：活化完成后使用磁场吸附去除上清，然后使用400ul DPBS清洗磁珠一遍，备用；
4)偶联：取10ul BSA蛋白加入190ul NaAC溶液(ph4.0)混匀加入上步骤的磁珠中，室温下摇床孵育1h；
5)封闭：偶联完成后磁场吸附去除上清，然后加入100ul乙醇胺进行封闭，室温摇床孵育15min；
6)清洗：使用400ulDPBS缓冲溶液将封闭完成后的磁珠清洗4遍，清洗最后一遍转移新管，记为反筛磁珠，备用。
(本发明所有实施例中DPBS无特殊说明均为pH7.4)
3.正筛偶联
1)洗磁珠：取50ul羧基磁珠(购买于博岳生物，M1000S3)，200ul DPBS洗4遍，最后一遍换离心管；
2)活化：EDC与NHS各50ul，溶解后将EDC加入到NHS中，混匀加入到去上清的磁珠中将磁珠活化15min；
3)清洗：活化完成后使用磁场吸附去除上清，然后使用200ul DPBS清洗磁珠一遍，备用；
4)偶联：取10ul H-FABP蛋白加入30ulNaAC溶液(ph4.5)混匀加入上步骤的磁珠中，室温下摇床孵育1h；
5)封闭：偶联完成后磁场吸附去除上清，然后加入100ul乙醇胺进行封闭，室温摇床孵育15min；
6)清洗：使用200ulDPBS缓冲溶液将封闭完成后的磁珠清洗4遍，清洗最后一遍转移新管，记为正筛磁珠，备用。
(本发明所有实施例中DPBS无特殊说明均为pH7.4)
4.反筛
取50ul反筛磁珠，向清洗之后的反筛磁珠中加入变复性完成后的文库进行反筛孵育，筛选30min-60min，反筛完成后置于磁力架上静置取上清保留筛选文库留作正筛使用，然后将反筛后的磁珠使用DPBS缓冲溶液每次200ul清洗四遍，每次清洗的上清液都保存记wash1-、wash2-、was,3-、wash4-，清洗四遍之后向磁珠中加入200ulDPBS沸水浴10min，使得蛋白结合序列脱落下来，磁场吸附去除上清记为E-。
5.正筛
取50ul正筛磁珠，向清洗之后的正筛磁珠中加入反筛之后保留的文库进行正筛孵育，筛选30min-60min，正筛完成后置于磁力架上静置去除上清，然后将正筛后的磁珠使用DPBS缓冲溶液每次200ul清洗四遍，每次清洗的上清液都保存记wash1+、wash2+、wash3+、wash4+，清洗四遍之后向磁珠中加入200ulDPBS沸水浴10min，使得蛋白结合序列脱落下来，磁场吸附去除上清记为E+。
6.荧光定量PCR(qPCR)
将wash溶液、E-、E+充分离心，按量加入Evergreen(qPCR-mix体积的4％)、qPCR-mix进行荧光定量PCR,反应体系为32ul(30ul qPCR-mix以及2ul的洗脱液/筛选洗脱液)
7.PCR扩增
将做完荧光定量PCR的剩余E+全部加入到扩增mix中，加入8mL的矿物油，涡旋混匀3min-5min，100ul/孔分装到8联排中进行PCR扩增。
8.浓缩PCR产物
取出扩增好的产物，将其转移到15mL离心管中，加正丁醇到刻度线12.5mL处然后涡旋混匀1min，使用离心机将其离心浓缩——7500r，4min，浓缩至100ul体积，然后加入100ul loading-buffer，沸水浴中变性10min备用。
9.电泳分离制备单链
向制备好的胶板中加入已经预热的TBE缓冲液(500mL)，启动电泳仪进行预电泳3min，之后使用移液枪向胶板吹打，把变性好的文库使用移液枪加入到胶板上，使用300V电压进行跑胶约30min，然后使用一次性刀片将胶条切下来，使用0.5mL离心管套装2mL离心管将胶条离心破碎、向加入1.2mLDPBS沸水浴30min，重复操作一次即沸水浴煮两遍，通过针式滤膜得到单链DNA制备液。
10.浓缩单链DNA
将单链DNA制备液转移到15mL离心管中，然后加正丁醇到14mL刻度线处，使用离心机7500r,1min离心浓缩单链DNA，将单链DNA体积浓缩至100ul左右时即可转移到离心管盖中使用透析膜进行隔夜透析。
11.透析做下轮筛选文库
隔夜透析之后的文库首先取出测定其浓度，然后储存做后续筛选文库。
共筛选12轮，每轮筛选条件略有变化，具体如下表2所示：
表2H-FABP适配体筛选流程
迭代循环12轮筛选之后整理筛选数据进行处理分析，得到各轮筛选保留率如图2所示：
将得到的富集文库产物经克隆测序分析后，挑选若干条序列由上海生工合成，检测亲和力，亲和力检测方法详见实施例2和实施例3。确定了1条序列具有很强的结合能力，且验证后具有理想的结合H-FABP的亲和力，将它命名为H-FABP-Apt-006。这个核酸适配体的序列和二级结构预测图如图1所示。
H-FABP-Apt-006：
ATTGGCACTCCACGCATAGGCCTACCACGGTAGAAGTGCCATCCCCTCCGACATCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA SEQ ID NO 6。
实施例2
表面等离子共振法(SPR)检测筛选文库与H-FABP蛋白亲和力
试验方法：
(1)取一张CM5芯片(购买自GE公司，货号BR100530)，芯片用1％ SDS NaOH清洗芯片两次，流速为10μl/min，时间180s，400μl 50mM NaOH清洗一次，流速为10μl/min，时间180s；
(2)芯片活化，偶联，封闭。(FC＝1-1活化后偶联BSA蛋白，FC＝1-2活化后偶联H-FABP蛋白)；用0.1M NHS与0.4M EDC的混合试剂(1:1)活化FC＝1通道，时间600s，流速5μl/min；
(3)pH 4.5的醋酸钠溶液将BSA蛋白稀释，按照1:20的比例稀释，进样FC＝1-1通道，时间600s，流速5μl/min，连到芯片表面的值有3000Ru，偶联完成，进样PH 8.5乙醇胺溶液封闭，时间450s，流速5μl/min。同样方法在通道FC＝1-2偶联H-FABP蛋白，偶联到芯片表面3200Ru，并进样乙醇胺封闭通道；
(4)亲和力检测：将筛选所得文库选取第1、3、4、5、7、8和第12轮文库用DPBS稀释至500nM*100μl进样，设定程序：通道为1通道；进样240s，流速为10μl/min，解离时间160s；1.5M NaCl进行再生，再生条件为：进样时间60s，流速为15μl/min。
(5)实验结果：如图3所示，该结果为FC＝1-2与FC＝1-1的差减数据，随筛选进行，每轮文库亲和力递增，筛选效果良好，特异性良好。
实施例3
表面等离子共振法(SPR)检测筛H-FABP蛋白核酸适配体KD值
委托安徽通用生物合成核酸适配体H-FABP-Apt-006，用DPBS缓冲液稀释成：3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、400nM。
将H-FABP蛋白偶联到CM5芯片表面：先用50mM NaOH清洗芯片，进样20μl，流速10μl/min，然后用将等体积的EDC水溶液和NHS水溶液混合后进样50μl活化芯片，流速5μl/min。将H-FABP蛋白用pH 4.5的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积50μL，流速5μL/min，H-FABP蛋白偶联量为5200Ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5μL/min，进样50μL。
检测：使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore 8000)设定动力学检测参数，进样30μL/min*3min，解离30μL/min*5min，再生1M NaCl 30μL/min*0.5min，将稀释好各个浓度的核酸适配体H-FABP-Apt-006进样。
核酸适配体H-FABP-Apt-006与H-FABP蛋白的亲和力检测结果如图4所示，可以看出，随适配体浓度的不断升高，适配体结合蛋白的值也不断升高，且具有良好的线性关系，这些数据说明SPR仪均检测到H-FABP-Apt-006与H-FABP蛋白有很强的结合，经过系统的拟合，最终给出的KD值为5.78nM。
实施例4
ELISA实验验证H-FABP核酸适配体能与H-FABP蛋白结合：
试验方法：
1.取一块新的酶标板，A1-A8孔包被不同浓度的H-FABP蛋白(pH 9.6包被缓冲液稀释，0.05M Na2CO3/NaHCO3缓冲液pH9.6)，蛋白浓度分别为：1.95ng/ml、0.96ng/ml、0.48ng/ml、0.24ng/ml、0.12ng/ml、0.06ng/ml、0.03ng/ml和0ng/ml；每孔100μl，包被过夜。
2.蛋白包被完成后，用1×pH 9.6碳酸盐包被液将BSA蛋白稀释至10mg/ml，每孔加入150μl，封闭板上多余的位点，时间为24h，去上清，DPBS(含0.05％吐温20)清洗1遍，甩干。
3.A1-A8孔加入100ul 1nM的H-FABP-Apt-006单克隆(生物素修饰)，室温孵育1h。孵育结束后用DPBS(含0.05％吐温20)清洗3遍，清洗时放置在摇床上，每次10分钟，每次清洗结束，甩干。
4.加入SA-HRP(购自碧云天，货号A0303)用DPBS按照1:25000(v/v)配制，室温摇床孵育30分钟。用DPBS(含0.05％吐温20)清洗3遍，清洗时放置在摇床上，每次10分钟，每次清洗结束，甩干。
5.每孔加入100μl TMB显色液，在室温显色1分钟，肉眼观察颜色变化。
6.结果如图5所示，从左至右蛋白浓度依次为1.95ng/ml、0.96ng/ml、0.48ng/ml、0.24ng/ml、0.12ng/ml、0.06ng/ml、0.03ng/ml和0ng/ml，检测吸光度，吸光度与蛋白浓度的线性关系图如图6所示，由图可以看出吸光度依次降低，蛋白浓度与吸光度成正相关且在浓度0.24ng/ml-1.95ng/ml范围内，浓度与吸光度线性关系较好，说明H-FABP-Apt-006单克隆与H-FABP蛋白具有较好的亲和力。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
现在研究认为细菌是一个含有多种成分的复合物，以整个细菌作为靶分子进行筛选就可以在未知细菌的内部结构、功能的情况下筛选出与其特异性结合的一组适配体，与单个适配体相比，一组特异性的适配体必定能提高检出的敏感性和特异性；更重要的是组合应用能够提高适配体的通用性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种特异性结合H-FABP的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的靶标为：
5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-36N-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’SEQ ID NO 01，或与所述靶标同源性至少为88％的序列，或与所述靶标具有不多于3个不同核苷酸的序列；
所述36N表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。
2.一种特异性结合H-FABP的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列为：
ATTGGCACTCCACGCATAGGCCTACCACGGTAGAAGTGCCATCCCCTCCGACATCCC
CTATGCGTGCTACCGTGAA SEQ ID NO 06。
3.根据权利要求2所述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的空间结构由两个茎环组成。
4.根据权利要求3所述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的空间结构由5'-GCCTACCACG-ACATCCC-3'组成的第一茎环，
5'-GTAGAAGTGCCATCCCCTC-3'组成的第二茎环组成。
5.根据权利要求2所述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体，其特征在于，所述适配体中的一个或多个核苷酸在5’位置以-F、-NH2、-OCH3修饰，在3’端以反式胸苷修饰。
6.根据权利要求1或2所述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，其特征在于，应用于病毒诊断、抗原检测、疾病诊断试剂盒或用于细菌感染、病毒感染、炎性疾病的治疗药物。
7.根据权利要求5所述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，其特征在于，应用于多个核酸适配体联用的组合物。
8.根据权利要求5所述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，其特征在于，用于制备H-FABP捕获、分离、纯化制剂。
9.根据权利要求5所述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，其特征在于，用于在制备H-FABP检测或诊断试剂、试剂盒或传感器。
10.根据权利要求5所述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，其特征在于，用于在制备或构建H-FABP靶向给药系统中。
11.根据权利要求5所述的一种特异性结合H-FABP的核酸适配体的应用，其特征在于，用于检测评估不良心脏事件的早期筛查和快速诊断的产品。
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