CN104946655A - 一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子及其制备方法 - Google Patents
一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子及其制备方法，本发明的结核分枝杆菌标准株H37Rv的ssDNA适配子亲和性、特异性高，其用于细菌学检测能高特异性地检测出结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和非分枝杆菌，可以为结核病的实验室诊断提供有利依据。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子及其制备方法。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)感染引起的慢性传染性疾病，是国内外面临的严重的公共卫生问题，被列为我国重大传染病之一。结核病是历史上患病率和死亡率最高的疾病之一。2013年全球结核病感染患者约为900万，而因结核病死亡的人数达到150万；我国是全球结核病高负担国家之一，因此建立一种准确快速的检测结核分枝杆菌的方法对结核病早期诊断治疗有着重大意义。
目前，结核分枝杆菌的细菌学检测是结核病实验诊断的金标准。痰涂片直接镜检法是结核病实验室最基本的细菌学检查方法，其特点是简便、快速、价廉，但无法辨别死菌活菌；敏感性低，特异性差，各种抗酸杆菌均可着色。但仍具有实用性，对结核病早期诊断起到重要作用；目前国内外使用较多的细菌学检测方法如罗氏培养基时间较长、培养阳性率低。如今使用快速培养系统检测结核分枝杆菌虽能缩短培养时间、提高培养阳性率，但仍需4-6周，无法满足临床快速诊疗需求。分子生物学诊断虽然能满足速度快、特异性高、涂阳标本检出率高等要求。但其高成本，并且操作复杂，对实验条件和技术人员要求高，限制了其在临床检验中的普及应用。
当前结核病的诊断存在耗时长、灵敏度低等问题，探索快速简便的诊断方法一致是国内外学者研究的焦点。指数富集的配体系统进化技术(Systematicevolution of ligand by exponential enrichment，SELEX)是Ellington与Szostak(1990)最先报道使用，是一种新型体外筛选技术。该技术的基本原理是利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸文库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子，再经扩增、反复筛选，使该类寡核苷酸分子得到富集，该富集的寡核苷酸分子称为适配子。与抗体蛋白相比，适配子具有分子识别能力强、稳定性高、制备简单、经济、快速等优点。该技术已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、细胞，药物、氨基酸以及各种细胞因子等，可用于相应靶分子的检测识别。目前该技术在在人类病原微生物检测方面得到了广泛的应用。
已有研究通过SELEX技术筛选到相应靶物质的适配子作为拮抗剂，适用于肿瘤生长时的血管内皮生长因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白和促生长因子等，已达到治疗目的。在微生物检测方面，特别是对一些未知的致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能以及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX过程筛选到与其相对应的适配子，检测靶物质，已成为该领域的研究探索热点。
发明内容
为了解决上述现有技术中的问题，本发明提供了一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子及其制备方法。
为了实现本发明的目的，本发明的一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的ssDNA适配子，DNA适配子的核苷酸序列为：
5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATATCCCTATTCCGCTCCATGTTGCGTACCCGTGCCTTCGACATGAGGCCCGGATC-3’
本发明的另一个目的是应用上述适配子于细菌学检测，尤其是检测临床菌株，菌株包括结核分枝杆菌(MTB)，非结核分枝杆菌(Non-TuberculosisMycobacteria，NTM)和非分枝杆菌。
本发明的还提供一种结核分枝杆菌检测试剂盒，试剂盒中包含有上述的DNA适配子。
另一方面，本发明还提供上述结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，构建随机单链寡核苷酸文库：设计合成78碱基对的随机单链DNA文库：5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中N代表碱基AGCT中的任意一个，文库的容量为1014-1015，并进一步得到纯化的单链ssDNA文库用于结核分枝杆菌标准株H37Rv适配子的SELEX技术筛选；
步骤2，利用SELEX技术筛选H37Rv适配子：用包被缓冲液将结核分枝杆菌标准株H37Rv包被于微孔板中，同时设空白反筛孔，非结核分枝杆菌和非分枝杆菌反筛孔；ssDNA文库和SELEX结合缓冲液混匀后先与空白反筛孔进行孵育；然后转移到H37Rv包被孔进行孵育，SELEX冲洗缓冲液洗涤，甩干后加入SELEX洗脱缓冲液洗脱与H37Rv结合的ssDNA，产物经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化，PCR扩增后，进行10轮筛选，筛选后的饱和文库，经克隆测序，获得单个适配子。
为进一步优化上述的制备方法，本发明采取的措施还包括：
步骤1中还包括对结核分枝杆菌标准株H37Rv和其他细菌的培养，收集，磨菌和比浊。
步骤2中使用SELEX结合缓冲液为：20mmol/L Hepes，pH值7.35，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，1mmol/LCaCl2，1mmol/LMgCl2。
步骤2中使用SELEX冲洗缓冲液为：SELEX结合缓冲液+0.05％Tween20。
步骤2中使用SELEX洗脱缓冲液为：20mmol/L Tris-HCl，4mol/L异硫氰酸胍，1mmol/L DTT，pH值8.3。
最后一方面，本发明还提供应用上述结核分枝杆菌标准株H37Rv的ssDNA适配子进行三明治夹心ELISA的检测方法，选择本发明的适配子与其他合适的适配子组合构建基于适配子的三明治夹心ELISA检测体系。
本发明的结核分枝杆菌标准株H37Rv的ssDNA适配子亲和性、特异性高，其用于细菌学检测能高特异性地检测出结核分枝杆菌和非分枝杆菌，可以为结核病的实验室诊断提供有利依据。
附图说明
图1是本发明的结核分枝杆菌标准株H37Rv适配子的二级结构图谱；
图2是结核分枝杆菌标准株H37Rv与本发明的适配子荧光显微镜结果图；
图3是非结核分枝杆菌与本发明的适配子荧光显微镜结果图；
图4是非分枝杆菌与本发明的适配子荧光显微镜结果图；
具体实施方式
本发明提供了一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子和基于该适配子的细菌学检测方法和应用，以及该适配子的制备方法。
本发明的一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子，DNA适配子的核苷酸序列为：
5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATATCCCTATTCCGCTCCATGTTGCGTACCCGTGCCTTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。
本发明还提供上述的DNA适配子在细菌学检测中的应用，特别是在检测结核分枝杆菌中的应用。
本发明还提供一种结核分枝杆菌检测试剂盒，包含有上述的DNA适配子。
本发明还提供一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的ssDNA适配子制备方法，包括以下步骤：
步骤1，构建随机单链寡核苷酸文库：设计合成78碱基对的随机单链DNA文库：5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’,其中N代表碱基AGCT中的任意一个，容量为1014-1015，并进一步得到纯化的单链ssDNA文库用于标准株H37Rv适配子的SELEX技术筛选；
步骤2，以微孔板为分离介质利用适配子技术筛选H37Rv适配子：用包被缓冲液将H37Rv包被于微孔板中，同时设空白反筛孔，非结核分枝杆菌和非分枝杆菌反筛孔；ssDNA文库和SELEX结合缓冲液混匀后先与反筛孔进行孵育；然后转移到H37Rv包被孔进行孵育，SELEX冲洗缓冲液洗涤，甩干后加入SELEX洗脱缓冲液洗脱与H37Rv结合的ssDNA，产物经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化，PCR扩增后，进行10轮筛选，筛选后的饱和文库，经克隆测序，获得单个适配子。
应用上述结核分枝杆菌标准株H37Rv的ssDNA适配子进行三明治夹心ELISA检测的方法，选择上述适配子或适配子组合构建基于适配子的三明治夹心ELISA检测体系。
本发明在获得H37Rv适配子后，可通过选择H37Rv适配子或适配子组合构建基于适配子的三明治夹心ELISA检测体系来进行临床菌株的检测。
本发明将SELEX技术引进结核分枝杆菌的研究领域，以H37Rv为靶物质，筛选获得H37Rv的适配子，为进一步利用适配子技术进行结核分枝杆菌的诊断检测提供依据。
下面将通过本发明应用的具体实施例对本发明进行解释。
实施例1
在本实施例中，首先制备结核分枝杆菌标准株H37Rv的的ssDNA适配子，然后利用其进行细菌学检测，包括以下步骤：
步骤1：
(1)待测菌株制备：
将结核分枝杆菌标准株H37Rv和15种非结核分枝杆菌(NTM)转种至含有10％OADC(含油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶)营养添加剂的米氏7H9液体培养基中，37℃培养至对数生长期，转至1.5ml离心管中，12000rpm离心5min，1×PBS洗涤两遍，80℃水浴，灭火30min。灭火后转至磨菌管，磨菌后调整浊度至1mg/ml。
8种非分枝杆菌均从血平板上刮取生长良好的菌落，用上述同样的方法处理灭火待检。
(2)构建随机单链寡核苷酸文库并得到纯化的单链DNA文库：
构建随机单链寡核苷酸文库：设计合成78碱基对的随机单链DNA文库：5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中N代表碱基AGCT中的任意一个，容量为1014-1015；构建上游引物：5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’，构建下游引物5’--TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。并进一步得到纯化的单链ssDNA文库用于H37Rv适配子的SELEX技术筛选。
设计并得到纯化的单链DNA文库可以通过一般的PCR(聚合酶链式反应)扩增、不对称PCR法和酚氯仿法纯化得到。
步骤2
利用SELEX技术筛选结核分枝杆菌标准株H37Rv适配子：
用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6)将H37Rv包被于微孔板中，同时设空白反筛孔，非结核分枝杆菌和非分枝杆菌反筛孔；H37Rv包被孔和反筛孔均以3％BSA(牛血清白蛋白)封闭；ssDNA文库和SELEX结合缓冲液混匀后先与反筛孔于37℃下进行孵育，去除与BSA和微孔板结合的ssDNA；然后转移到H37Rv包被孔于37℃下进行孵育，SELEX冲洗缓冲液洗涤，甩干后加入SELEX洗脱缓冲液于80℃作用10min，洗脱与H37Rv结合的ssDNA，产物经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化，PCR扩增后，进行下一轮筛选。共进行10轮筛选。第1-4轮进行空白孔反筛，第5-7轮以非分枝杆菌为背景进行反筛，第8-10轮进行以非结核分枝杆菌为背景的反筛。
筛选后的饱和文库，经克隆测序，获得单个适配子。该适配子即为能与H37Rv结合的DNA适配子，其序列为：
5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATATCCCTATTCCGCTCCATGTTGCGTACCCGTGCCTTCGACATGAGGCCCGGATC-3’
并进行结构分析获得该适配子的二级结构图谱(图1)。
本发明的实施例所用的SELEX结合缓冲液为：20mmol/L Hepes，pH值7.35，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，1mmol/LCaCl2，1mmol/L MgCl2；SELEX冲洗缓冲液为：SELEX结合缓冲液+0.05％Tween 20；SELEX洗脱缓冲液为：20mmol/L Tris-HCl，4mol/L异硫氰酸胍，1mmol/L DTT，pH值8.3。
步骤3：
应用本发明H37Rv适配子构建检测体系，并检测临床菌株。
选择具有高亲和性的H37Rv适配子或适配子组合构建基于适配子的三明治夹心ELISA检测体系，用于102株临床菌株的检测(MTB共64株，NTM为28株和非分枝杆菌为10株)。
酶标板经30W 75cm的紫外灯照射处理12h。适配子用分光光度计测浓度，并经94℃变性5min，冰浴10min进行预处理；处理后的适配子用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6)稀释，按照每孔1μg的浓度作为捕获适配子包被酶联板，4℃过夜；然后3％BSA(牛血清白蛋白)37℃下封闭1h；
将菌体样品用PBS稀释至10μg/mL，以100μL/孔加入封闭后的酶标板，37℃孵育1h，加入PBST洗涤3次，3min/次；
将5`端生物素标记的另一个适配子作为检测适配子，SELEX结合缓冲液稀释至0.5μg/孔加入酶标板，37℃，40min，SELEX洗涤缓冲液洗涤5次，3min/次；
加入1:1000的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶100μl，37℃孵育30min；加入PBST洗涤5次，3min/次；
显色试剂A与显色试剂B按照1:1的比例混合加入，37℃孵育10min，加入终止液终止显色；加入PBST洗涤3次，3min/次；
利用酶标仪双波长(450nm和620nm)检测样本的吸光度值(A450，A620)。
结果判断：进行结果判断的OD值应为OD450nm与OD620nm的差值。阳性对照组(包括一株标准株H37Rv和63株MTB菌株)OD值平均0.66；阴性对照组平均OD值＝0.35(包括28株NTM和10株非分枝杆菌，OD均值分别为0.38和0.29)。其中结核分枝杆菌组和非结核分枝杆菌组之间的OD值差异有统计学意义(P<0.01；AUC＝0.9810，95％CI：0.9598-1.002)；结核分枝杆菌组和非分枝杆菌组之间的OD值差异有统计学意义(P<0.01；AUC＝0.9810，95％CI：1.000-1.000)。
结果解释：应用本发明中H37Rv的ssDNA适配子组合构建的检测体系可以特异性地检测出结核分枝杆菌菌株，非结核分枝杆菌和非分枝杆菌。
本发明的H37Rv适配子用于细菌学检测能特异性地检出结核分枝杆菌菌株。
步骤4：
FITC标记H37Rv适配子，荧光显微镜下观察临床菌株的结果。
待测菌株：结核分枝杆菌标准株H37Rv，3种NTM(堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、鸟分枝杆菌)和3种非分枝杆菌(大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌)。
将本发明中的H37Rv适配子用FITC荧光标记，并经94℃变性5min，冰浴15min进行预处理；用500μL的PBS混匀处理后的适配子和不同菌体(2×107CFU)，37℃温和震荡作用40min，12000rpm离心5min，用ddH2O洗涤沉淀四次，沉淀重悬于ddH2O中，分别取10μL沉淀涂片在荧光显微镜观察。
结果观察：结核分枝杆菌标准株H37Rv在荧光显微镜下均可见较强的绿色荧光(图2)，非结核分枝杆菌和非分枝杆菌在显微镜下均未观测到绿色荧光(图3和图4)。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
<110> 上海市肺科医院
<120> 结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子及其制备方法
<160> 4
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 适配子
<400> 1
gggagctcag aataaacgct caatatccct attccgctcc atgttgcgta cccgtgcctt 60
cgacatgagg cccggatc 78
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 随机单链DNA文库
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(58)
<223> n =a或g或c或t
<400> 2
gggagctcag aataaacgct caannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntt 60
cgacatgagg cccggatc 78
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR扩增引物
<400> 3
gggagctcag aataaacgct caa 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR扩增引物
<400> 4
ttcgacatga ggcccggatc 20
Claims (9)
1.一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子，其特征在于：所述DNA适配子的核苷酸序列为：
5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATATCCCTATTCCGCTCCATGTTGCGTACCCGTGCCTTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。
2.如权利要求1所述的DNA适配子在细菌学检测中的应用。
3.根据权利要求2所述的DNA适配子在细菌学检测中的应用，其特征在于，在检测结核分枝杆菌中的应用。
4.一种结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，包含有如权利要求1所述的DNA适配子。
5.一种制备如权利要求1所述的DNA适配子的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1，构建随机单链寡核苷酸文库：设计合成78碱基的随机单链DNA文库：5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中N代表碱基AGCT中的任意一个，文库容量为1014-1015，并进一步纯化单链ssDNA文库用于结核分枝杆菌标准株H37Rv适配子的SELEX技术筛选；
步骤2，利用SELEX技术筛选H37Rv适配子：用包被缓冲液将结核分枝杆菌标准株H37Rv包被于微孔板中，同时设空白反筛孔，非结核分枝杆菌和非分枝杆菌反筛孔；ssDNA文库和SELEX结合缓冲液混匀后先与空白反筛孔进行孵育；然后转移到H37Rv包被孔进行孵育，SELEX冲洗缓冲液洗涤，甩干后加入SELEX洗脱缓冲液洗脱与H37Rv结合的ssDNA，产物经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化，PCR扩增后，进行10轮筛选，筛选后的饱和文库，经克隆测序，获得单个适配子。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2中使用的SELEX结合缓冲液成分为：20mmol/L Hepes，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，1mmol/LCaCl2，1mmol/L MgCl2；SELEX结合缓冲液pH为7.35。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2中使用SELEX冲洗缓冲液成分为：20mmol/L Hepes，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，1mmol/L CaCl2，1mmol/L MgCl2，0.05％Tween 20。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2中使用SELEX洗脱缓冲液成分为：20mmol/L Tris-HCl，4mol/L异硫氰酸胍，1mmol/L DTT；SELEX洗脱缓冲液pH为8.3。
9.一种三明治夹心ELISA检测方法，其特征在于：利用如权利要求1所述的结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子进行检测。
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