CN103558380A - 一种基于生物芯片快速检测pp65的方法 - Google Patents

一种基于生物芯片快速检测pp65的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，属于分子生物学领域。本发明利用与PP65具有特异性的适配子，应用生物芯片技术检测HCMV PP65抗原，并优化相关试剂体系及建立相应操作流程，提高了PP65检验效率。针对传统检测方法检测时间长、受临床应用限制、检测费用高等问题，采用生物芯片快速检测PP65，能在早期预测HCMV病。本发明具有流程少、操作简单、检测时间短、便于普及等优点，可为自动化检验提供理论及实践基础。

Description

一种基于生物芯片快速检测PP65的方法
技术领域
本发明涉及人巨细胞病毒的检测方法，尤其涉及一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，属于分子生物学领域。 
背景技术
人巨细胞病毒(hμMan cytomegalovirus，HCMV)属于疱疹病毒科乙组疱疹亚科，是一种双螺旋DNA病毒。HCMV呈世界性分布，在人群中广泛传播，病毒长期潜伏于宿主细胞，呈隐性感染。当妊娠，易造成胎儿宫内感染，导致流产、早产、死胎或胎儿先天畸形；当骨髓移植，肝、肾、心脏等器官移植患者免疫功能受损时，潜伏病毒被激活、增值而发生严重感染，将导致患者器官移植失败甚至死亡。近年来，有研究表明巨细胞病毒感染与一些炎症性疾病和增殖性疾病有着密切的关系，包括某些心血管疾病和癌症。现今，巨细胞病毒感染已对人类健康造成极大的威胁，故对HCMV感染的早期诊断显得尤为重要。研究表明，一旦出现HCMV感染的临床症状，抗病毒药物不能控制该病的病理进程，这意味着抗病毒药物必须在HCMV感染的临床症状出现前就使用，这就有赖于实验室的分析。 
在HCMV实验检测技术中，病毒分离是检测的金标准，但耗时长，结果受标本保存时间影响大。抗体检测需在患者感染一定时间后才可以检出，受患者自身免疫状态影响较大，且不能区分潜伏感染和活动性感染。抗原血症检测技术是一项快速、敏感的诊断技术，但是传统检测方法多以白细胞为病毒抗原检 测载体，限制了其临床应用。而核酸诊断其敏感性与特异性均佳，但检测费用高且核酸提取方法还有待改进。 
PP65是HCMV病毒复制的早期蛋白，它出现于病毒感染的早期，在细胞感染后3-4小时即开始出现，是HCMV病毒含量最丰富的蛋白。其功能是将病毒的DNA锚定在受感染细胞的核膜上，在胞浆的高尔基体内合成，然后运回核内。随着研究的深入，HCMV-PP65抗原被认为是HCMV感染表达的早期抗原，PP65抗原分析能敏感地在早期预测HCMV病。HCMV常规病毒培养（CCC）往往需要4周才能获阳性结果，对早期诊断帮助不大。HCMV特异性抗体IgM，在严重免疫抑制患者可不出现或延迟出现。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于生物芯片快速检测PP65的方法。 
本发明的技术方案如下：一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，包括以下步骤： 
（1）取两张晶芯基因芯片，用Binding buffer将100ng FITC绿色荧光标记PP65巨细胞病毒抗体2稀释至100μL，并加入等体积的DMSO，然后点样于基因芯片中央，37℃孵育10～14小时； 
（2）取出玻片，用Washing buffer清洗3～5次，加入80～100μL0.1～0.3%BSA封闭12小时以上； 
（3）取出玻片，用Washing buffer清洗3～5次，加入待检样品，37℃孵育10～14小时； 
（4）用Washing buffer清洗3～5次，加入1～3μM HEX红色荧光标记的与人巨细胞病毒PP65抗原具有特异性的适配子，37℃孵育10～14小时，所述适配子为SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的序列之一； 
Figure BDA0000410079300000031
（5）用Washing buffer清洗3～5次，荧光显微镜下观察；如果待检样品中有PP65抗原，则在显微镜下既能看到红色荧光又能看到绿色荧光；如果待检样品中没有PP65抗原，则在显微镜下只能看到红色荧光，不能看到绿色荧光。 
所述步骤（4）中的适配子SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的二级构象依次分别为： 
Figure BDA0000410079300000041
Figure BDA0000410079300000051
Figure BDA0000410079300000061
所述Binding buffer为：PBS,5mM MgCl2,0.05%tween-20,pH7.5。 
所述Washing buffer为：PBS,5mM MgCl2,0.01%tween-20,pH7.5。 
有益效果：本发明利用与PP65具有特异性的适配子，应用生物芯片技术检测HCMV PP65抗原，并优化相关试剂体系及建立相应操作流程，提高了PP65检验效率。针对传统检测方法检测时间长、受临床应用限制、检测费用高等问题，采用生物芯片快速检测PP65，能在早期预测HCMV病。本发明具有流程少、操作简单、检测时间短、便于普及等优点，可为自动化检验提供理论及实践基础。 
说明书附图 
图1为本发明基于生物芯片快速检测PP65的原理图； 
图2为本发明的检测结果示意图。 
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明： 
本发明中的DMSO为Dimethyl sμLfoxide，中文名称为二甲基亚砜 
FITC为Fluorescein Isothiocyanate，中文名称为：异硫氰酸荧光素 
HEX为5’-Hexachlorofluorescein phosphoramidite，中文名称为：5’-六氯荧光素氨基磷酸酯 
实施例一、一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，按照以下步骤完成：（1）取两张晶芯基因芯片，用Binding buffer将100ng FITC绿色荧光标记PP65巨细胞病毒抗体2稀释至100μL，并加入等体积的DMSO，然后点样于基因芯片中央，37℃孵育10～14小时； 
（2）取出玻片，用Washing buffer清洗3～5次，加入0.1%BSA封闭12小时以上； 
（3）取出玻片，用Washing buffer清洗3～5次，加入待检样品，37℃孵育12 小时；待检样品制备方法为：取尿液1.5ml，12000rpm离心5min，分离上清，在尿液沉渣中加入100μL的细胞裂解液PIPA室温裂解2～5min，12000rpm离心5min，取上清进行检测。 
（4）用Washing buffer清洗3～5次，加入2μM HEX红色荧光标记的适配子A4，37℃孵育12小时； 
（5）用Washing buffer清洗3～5次，荧光显微镜下观察。观察结果如图2所示，实验组中检测到了PP65抗原，在荧光显微镜下既能看到红色荧光又能看到绿色荧光。对照组中没有PP65抗原，在荧光显微镜下只能看到红色荧光，看不到绿色荧光。 
实施例二、人巨细胞病毒PP65抗原适配子的筛选方法，按照以下步骤完成： 
一、构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物 
构建长度为78个碱基的ssDNA文库，两端为固定序列，中间35个核苷酸为随机序列，其中N代表A，T，C，G中的任意一个，库容量约为1015-1016：5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。上游引物为5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’，下游引物为 
5′-biotin-(CH2)-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3′。随机单链DNA文库和引物可由引物合成公司合成。 
双链DNA(dsDNA)文库的PCR扩增及回收： 
PCR反应体系 
反应参数 加入量(单位：μl)
10*PVR缓冲液 2.0
MgC12(25mmol/I.) 1.2
dNTP(2.5mmol/L) 1.6
引物1(10pmol/L) 1.0
引物2(10pmol/L) 1.0
模板(ssDNA文库） 0.1
TaqDNA聚合酶 1.0
ddH20 12.1
总体积 20.0
PCR反应条件 
温度(℃) 作用 时间(S)
94 预变性 300
94 变性 30
65 退火 30
72 延伸 30
一共进行18个循环，最后72℃延伸5min.，得到的产物进行下一步实验(或4℃保存)PCR产物纯化及回收：往DNA溶液中加入0.1倍体积的3mol/L pH5.2的乙酸钠和2-2.5倍体积的冰冷无水乙醇，在蜗旋混合振荡器上振荡混匀并置于-20℃冰箱里放置30min，然后12000rpm离心5min，弃上清，加入1ml预冷的70％乙醇，颠倒离心管数次，12000rpm离心5min，弃上清，晾干沉淀后(可置于烘箱10min)溶于20μLTE缓冲液(pH8.0)或ddH2O，4℃保存过夜。 
单链DNA(dsDNA)文库的PCR扩增及回收： 
采用不对称PCR进行扩增， 
PCR反应体系 
反应参数 加入量(单位:μl)
10*PCR缓冲液 2.0
MgC12(25mmol/L) 0.2
dNTP(2.5mmol/L) 1.6
引物1(0.4pmol/L) 0.5
引物2(10pmol/L) 2.0
模板（dsDNA文库) 0.5
TaqDNA聚合酶 0.4
ddH20 12.8
总体积 20.0
PCR反应条件 
温度(℃) 作用 时间(S)
94 预变性 300
94 变性 30
65 退火 30
72 延伸 45
一共进行40个循环，最后72℃延伸7min.，得到的产物进行下一步实验(或4℃保存)回收方法同双链DNA(dsDNA)文库的回收。 
琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果 
配制2％的琼脂糖凝胶：精确称取2g电泳级琼脂糖，加入100ml1XTAE电泳缓冲液，在微波炉内加热至溶化，待凝胶冷却至55℃左右时，加入溴化乙锭(终浓度为0.5μg/mL)轻轻旋转摇匀，倒入胶膜，插入合适的梳子，让凝胶溶液凝结后使用。 
PCR产物电泳：将凝胶置于电泳槽，取3μLPCR产物加入1μl6X loading buffer(0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯氰、30％甘油水溶液)，混合后上样，另取5μLDL Marker，分别加入琼脂糖凝胶孔内，在1XTAE电泳缓冲液中80V电泳15-20min，在凝胶成像仪上观察电泳结果。 
二、SELEX筛选 
1.蛋白的包被 
用pH9.60.05mol/L的碳酸盐缓冲液将PP65蛋白稀释至所需浓度，在每个SELEX96孔板(聚苯乙烯板)的每个孔中加100μl，同时设空白对照孔和反筛对照孔，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液PBST洗三次。 
2.封闭 
3％的BSA(小牛血清)，37℃封闭1小时或4℃过夜。 
3.ssDNA文库的结合 
加入SELEX binding buffer稀释好的ssDNA文库100μl，先与空白对照孔（或反筛对照空）37℃孵育，反筛去除与靶蛋白非特异性结合的ssDNA，然后转移到PP65蛋白包被孔中37℃孵育，用SELEX washing buffer洗涤5次。 
4.洗脱 
加入SELEX eluting buffer，于80℃水浴作用10min，洗脱下与蛋白结合的ssDNA。 
5.酚－氯仿抽提、乙醇沉淀纯化结合的ssDNA 
往盛有待纯化的DNA溶液的1.5mL Ep管中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体积比），蜗旋混合振荡器上振荡混匀，室温12000rpm离心15s。用移液枪将含有DNA的上层（水相）小心的移入一只新的Ep管中，往ssDNA溶液中加入0.1倍体积的3mol/L pH5.2的乙酸钠（NaAc）和2～2.5倍体积冰冷的无水乙醇，在蜗旋混合振荡器上振荡混匀并置于-20℃30min，然后12000rpm离心5min，弃上清，加入1mL预冷的70%乙醇，颠倒离心管数次，12000rpm离心5min，弃上清，晾干沉淀后溶于20μLTE缓冲液（PH8.0）或ddH20,4℃保存。 
通过PCR和不对称PCR得到筛选后的ssDNA文库，然后进行电泳检测。最后一共进行8轮筛选达到饱和，得到特异性最高，亲和力最强的ssDNA文库。 
三、克隆和测序 
1.回收产物连接 
将筛选饱和的文库连接到pMD18-T Simple Vector（TaKaRa公司）。 
将第8轮得到的ssDNA文库经过不对称PCR扩增获得生物素标记的ssDNA文库，将巨细胞病毒PP65蛋白用碳酸盐(PH9.6)缓冲液稀释至10μg/ml，取100μl包被酶联板，4℃过夜，PBST(PBS+Tween)洗涤4次，3min/次；3％BSA37℃封闭1小时，PBST洗涤4次，3min/次；用SELEX binding buffer稀释的第8轮生物素标记的ssDNA0.05μg/孔，37℃温育60min，PBST洗涤6次，3min/次；1∶1000稀释的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶37℃孵育30min，PBST洗涤6次，3min/次；加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)显色液37℃显色15min；2mol/L浓硫酸终止反应，酶标仪于450nm处测定A值。A值大于0.1，回收产物，将筛选产物连接到pMD18-T simple vector(TaKaRa公司)。参考TaKaRa公司pMD18-T Simple Vector产品说明，将纯化后的目的基因PCR产物与克隆载体pMD18-TSimple Vector连接，16℃连接过夜。 
2.连接产物的转化 
A：将目的基因片段与pMD18-T Simple Vector的连接产物20μL加入含有100μL的E.coli DH5a感受态细胞的EP管中，冰浴30min。 
B：放入42℃水浴热休克1min，快速将管取出冰浴2min。 
C：每管加SOC培养液600μl，37℃摇床，150rpm，培养1h，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。 
D：将适当体积已转化的感受态细胞涂布于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB平板上，将平板置于室温直至液体被吸收。 
E：倒置平板，于37℃恒温培养，12～16h后出现菌落，随机挑取几个菌落PCR鉴定。 
F：随机挑取110个单克隆，加入盛有600μL LB液体培养基（含氨苄青霉素100μg/ml）的1.5ml EP管中，37℃摇床，200rpm，培养过夜。次日加入600μL（等量）80%高压灭菌甘油，密封管口，于-70℃保存菌种。 
3.重组质粒的提取 
取50μL单克隆菌液接种于5ml含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基，37℃摇床，250rpm，培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取重组质粒。 
4.PCR鉴定 
以提取质粒为模板，加入SELEX引物I和引物II进行PCR扩增反应，产物电泳确定阳性克隆，并送测序公司测序。 
人巨细胞病毒PP65抗原适配子的序列: 
A4 
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGCATGGTCCTCGATCGTATGGCTTTGCGGTCGTGTTCGACATGAGGCCCGGATC 
A5 
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATATCCCTATTCCGCTCCATGTTGCGTACCCGTGCCTTCGACATGAGGCCCGGATC 
A6 
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGGATTAGTCAATAGACTGGTGGCTTTGTGTGGTGTTCGACATGAGGCCCGGATC 
A7 
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATATCCCTATTCCGCTCCATGCTGCGTACCCGTGCCTTCGACATGAGGCCCGGATC 
A10 
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATGTGTTCATTTTTGGGGCTTGCGGGTGGTTCGCTGTTCGACATGAGGCCCGGATC 
A19 
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGTCCCTCTCGTGTTGCTGCTGCTTTTTCCTGTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 
5.适体亲和性检测 
将挑选的单个克隆经SELEX引物I和引物Ⅲ不对称PCR扩增后得到ssDNA， 将此ssDNA与包被好的蛋白结合，酶联法测定其亲和性。按每孔1μg ssDNA与2μg蛋白包被孔在100μLselex binding buffer中37℃孵育40min；selex washing buffer洗涤5次，，加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶100μL，37℃孵育30min；洗涤缓冲液洗涤5次，然后每孔加入底物显色液A、B各50μL，37℃显色15min；2mol/L浓硫酸50μL终止反应，酶标仪于450nm处测定吸光度（A）值，测得适体亲和性如下： 
编号 OD值 编号 OD值
A4 2.726 A10 1.271
A5 1.054 A19 1.137
A6 1.522 NC 0.067
A7 1.629    
注：NC为阴性对照 。

Claims (4)

1.一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，包括以下步骤：
（1）取两张晶芯基因芯片，用Binding buffer将100ng FITC绿色荧光标记PP65巨细胞病毒抗体2稀释至100μL，并加入等体积的DMSO，然后点样于基因芯片中央，37℃孵育10～14小时；
（2）取出玻片，用Washing buffer清洗3～5次，加入80～100μL0.1～0.3%BSA封闭12小时以上；
（3）取出玻片，用Washing buffer清洗3～5次，加入待检样品，37℃孵育10～14小时；
（4）用Washing buffer清洗3～5次，加入1～3μM HEX红色荧光标记的与人巨细胞病毒PP65抗原具有特异性的适配子，37℃孵育10～14小时，所述适配子为SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的序列之一；
（5）用Washing buffer清洗3～5次，荧光显微镜下观察；如果待检样品中有PP65抗原，则在显微镜下既能看到红色荧光又能看到绿色荧光；如果待检样品中没有PP65抗原，则在显微镜下只能看到红色荧光，不能看到绿色荧光。
2.根据权利要求1所述的一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，其特征在于：步骤（4）中所述适配子SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的二级构象依次分别为：
Figure FDA0000410079290000021
Figure FDA0000410079290000031
3.根据权利要求1或2所述的一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，其特征在于：所述的Binding buffer为：PBS,5mM MgCl2,0.05%tween-20，pH7.5。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，其特征在于：所述Washing buffer为：PBS,5mM MgCl2,0.01%tween-20，pH7.5。
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