CN102912037A - 猪传染性胃肠炎tge 的rt-lamp检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了猪传染性胃肠炎TGE的RT-LAMP检测方法，包括如下具体步骤：1）根据GenBank中TGEVN基因的保守区域，用在线软件设计LAMP引物；2）制备病毒液，-80℃备用；3）提取TGEV的RNA；4）以步骤3)所得的TGEV的RNA为模板，进行RT-LAMP反应；5）琼脂糖凝胶检测RT-LAMP反应结果。本发明所述猪猪传染性胃肠炎TGE的RT-LAMP检测方法与传统方法相比，具有以下优点1.操作简单。2.快速高效。3.高特异性。4.高灵敏度。

Description

猪传染性胃肠炎TGE 的RT-LAMP检测方法

 

技术领域

本发明适用于临床和基层实验室快速、准确地诊断猪传染性胃肠炎。

 

背景技术

猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种高度接触传染性肠道疾病，临床上以病猪呕吐、严重腹泻和失水为主要特征，不同品种、年龄的猪只都可感染发病，尤以两周龄以内仔猪、断奶仔猪易感性最强，致死率高，可达100%^[1]。该病是一种世界性疾病，给畜牧业生产带来巨大的经济损失，早发现、早确诊对该病的防治意义重大。要做到早确诊就需要快速、敏感、特异的诊断方法。

目前，检测 TGEV 的常规方法主要有: 病原学检测，包括：病毒的分离鉴定、电镜检测、免疫荧光法和免疫过氧化物酶法等；血清学检测，包括血清中和试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）^[2]等；分子诊断技术，包括：核酸探针杂交技术^[3]、聚合酶链式反应（RT-PCR）技术^[4]、多重RT-PCR 和RT-nPCR方法等。

作为传统的检测方法，TGEV的病原学检测存和血清学检测在着许多问题。

TGEV的分离只能在实验室进行，需要较高的技术水平和较先进的实验条件，操作困难，所需周期长，且TGEV与多种病毒接种细胞后CPE相同或相似，如诸呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻等，因此病毒分离方法显得并不可靠。病毒分离以后为了最终确认该猪组织中的病毒，还需借助其它得检测手段, 如特异性抗TGEV血清做中和试验、免疫荧光(IF)等方法进行最终的鉴定^[5]；通过电镜观察病毒证明，在感染猪肠内容物和粪便中可以发现有TGEV的存在^[6]。实践证明免疫电镜(IEM)比常规电镜(EM)的检测效果更好，前者对检测临床样品或细胞培养物中的TGEV更为敏感，并可以提供病毒血清学的鉴定。但是最终还必须使用特殊的单克隆抗体检测。虽然该两种方法可以作为确诊该病的最终诊断依据，但是成本高、过程复杂、操作时间长。

TGEV抗体的血清学方法检测，最常用的是SN试验，其中微量滴定板和抑制试验和蚀斑减数试验使用最为普遍^[7]。已经建立的间接荧光抗体试验方法不如VN试验的敏感和可靠^[8-9]。相对敏感的被动血凝试验则需要浓缩纯化病毒及致敏红细胞。其他发展的血清学试验包括：检测免疫球蛋白特异性抗体的间接免疫过氧化物酶试验、放射性免疫沉淀试验和“似及对流免疫电泳”^[10-11]。但是，该实验法存在严重的非特异性。

酶联免疫吸附实验 (ELISA)是当前应用最广泛的一种免疫学检测方法，己发展了间接ELISA、双抗体夹心ELESA、竞争ELISA和阻断ELISA等。不同的ELISA方法可检测TGEV抗体或抗原。ELISA方法是常用检测方法，但由于单克隆抗体是针对特定抗原位点，而不同TGEV株这些抗原位点有差异，导致某些样品的漏检^[12]。

分子诊断技术的蓬勃发展给TGEV的检测提供了更多的方法，如RT-PCR、基因芯片技术^[13]、核酸序列依赖性扩增（NASBA）^[14]、实时荧光RT-PCR^[15]、错配扩增突变试验( MAMA) 等，同样，诸多新型核酸扩增技术法均存在不同的缺点，例如：试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等^[16]， 应用于临床鉴别诊断的实用意义不大^[17]，不适合在基层实验室推广应用^[18]。因此 ，建立一种快速简便的、适用于临床和基层实验室的检测方法十分重要。

环介导等温核酸扩增技术（LAMP）最初是Notomi等^[19] 设计并应用于病毒及其他病原体基因的检测，其特点是针对靶基因的不同区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，于恒温条件下几十分钟内即可完成核酸的扩增反应, 具有较高的敏感性和特异性。逆转录环介导等温核酸扩增技术（RT-LAMP）是在LAMP反应体系中加入一定量的逆转录酶从而实现RNA到DNA的一步扩增。

RT-LAMP方法具有独特的引物设计方案，针对靶基因六个区域而设计出四条引物，进而对自身进行链置换扩增，扩增过程中，任何一个不匹配将导致反应无法进行，几乎不可能出现非特异性扩增^[20]；同时，在链置换反应过程中，不需要模板的热变性、退火和长时间温度循环等过程，只需要恒温几十分钟即可完成，且扩增效率极高, 一般能检测到10拷贝以下的样品，故该方法具有高特异性和高敏感性的特点，对于低浓度的病毒或无症状的病毒携带者的检测敏感性较常规PCR高。

RT-LAMP是恒温扩增反应，反应温度对LAMP的影响方式与常规PCR不同, 它不作用于DNA而作用于Bst酶。在Bst酶活性范围内温度对LAMP的影响不大, 但实验过程中需综合考虑各方面因素，确定最合适温度^[21]。

RT-LAMP法的检测方法有肉眼观察法、荧光染料显色观察法、琼脂糖凝胶电泳法和浊度仪检测法四种。在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行染色，来检测扩增是否发生；基于同样的原因，日本荣研株式会社利用LAMP反应过程中产生焦磷酸镁白色沉淀，研制出专门用于LAMP检测的实时终点浊度仪，以实现对LAMP扩增过程的实时监控，使扩增和检测同时完成；由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构，因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯状条带。以方便观察为原则，绿色荧光检测法简便、快速和可靠, 用肉眼即可对结果进行判定, 完全可以满足临床和基层部门检测猪传染性胃肠炎病毒的需要，具有广泛的应用前景^[22-23]。

RT-LAMP与常规PCR相比，具有如下优点：它要求四种引物在靶基因上的不同部位完全匹配才能进行扩增，具有很高特异性；等温扩增，省去了昂贵的热循环仪的费用；多引物且不用控制温度变化促使链置换反应使靶基因利用酶反应系统搞笑扩增，靶核酸序列呈指数扩增，扩增效率高。

.    综上所述，RT-LAMP方法具有操作简便可行、结果判断简单等多方面的有点，故本法经面世就被应用到很多方面，包括人类、动物和植物致病微生物的检测、动物胚胎性别和转基因食品的检测等^[24]。近年来已有一些成功应用该技术对病原体进行检测的文献报道，但尚未见将其应用于TGEV检测的研究。建立针对TGEV的快速灵敏特异的RT-LAMP检测方法，为野外及基层实验室检测TGEV提供无需特殊仪器、更为简便、快速、特异的方法。

 

发明内容

鉴于现行TGEV检测方法不适用于临床和基层部门实验室，而RT-LAMP与其它检测方法相比, 具有简便、快速、特异等优势, 不需PCR仪, 在水浴锅中即可完成扩增, 特别适合于基层实验室推广使用。本研究应用环介导等温扩增技术建立了猪传染性胃肠炎RT-LAMP检测方法, 旨在为野外及基层实验室检测TGEV提供无需特殊仪器, 更为简便、快速、特异的方法。

本发明的技术方案如下：猪传染性胃肠炎TGE 的RT-LAMP检测方法，包括如下具体步骤：

1）根据GenBank中TGEV N基因的保守区域，用在线软件设计LAMP引物如下： 

 FIP  5’GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA3’

BIP 5’CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC3’

F3    5’GCTATCGCATGGTGAAGG3’

B3    5’CAAGTTGAAATTCGCCTGG3’；

2）用常规方法将PK-15细胞传代培养，待其长成单层，将TGEV Purdue株冻干毒用DMEM稀释后接种于细胞上，在37℃，5% CO2 培养箱中吸附1h后，弃病毒液，加入DMEM维持液，重新置于37℃，5% CO2培养箱中，待细胞出现明显病变，刮取细胞收获病毒液，-80℃备用；

3）提取 TGEV的RNA；

4）以步骤3)所得的TGEV的RNA为模板，按照下述条件进行RT-LAMP反应：

10×Bst buffer 2.5μL、AMV（5U/μL）0.5μL、Bst DNA 聚合酶8U、Betaine（1mol/L）3μL、Calcein（250μmol/L）3μL、MnCl2 （25mmol/L）0.5μL、MgSO4（100mmol/L）0.5μL、BIP（10mmol/mL）3μL、FIP（10mmol/mL）3μL、LB（10mmol/mL）2μL、F3（10mmol/mL）0.5μL、B3（10mmol/mL）0.5μL、dNTPs （10mmol/L）3μL、模版RNA（7.28μg/μL）2μL，用去离子水补足25μL；反应条件为：62℃1h，80℃10min；

5） 可视化观察RT-LAMP反应结果;

6）琼脂糖凝胶验证可视化RT-LAMP反应结果。

 

步骤3）提取 TGEV的RNA的方法为：

3-1 )用移液器将20μL蛋白酶K加入一个干净的1.5 mL离心管中;

3-2) 向离心管中加入200μL步骤2）获得的病毒液；

3-3)加入200μL Carrier RNA工作液盖上管盖，涡旋振荡15秒混匀；为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀；Carrier RNA工作液为缓冲液GB与Carrier RNA溶液的混合液，配制方法按照公式计算, 配制公式为：

n×0.22mL=y mL         mL×28 uL/mL=zμL

n=同时提取的样品个数

y=需要加入缓冲液GB的体积

z=需要加入Carrier RNA

3-4) 在56℃孵育15分钟；简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；

3-5) 加入250μL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15秒，在15-25℃放置5分钟；如果周围环境高于25℃，乙醇需要再在冰上预冷后再加入；

3-6) 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；

3-7) 将RNase-free吸附柱CR2放在收集管中，仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-free吸附柱CR2，盖上管盖，8000 rpm（~6000 x g)离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

3-8)小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液RW，盖上管盖，静置2分钟，8000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管；

3-9) 重复3-8)步骤一次；

3-10)小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8000 rpm离心1分钟，弃废液；

3-11)将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液；

3-12) 将吸附柱放入一个RNase-free的1.5 ml离心管中，小心打开吸附柱的盖子，向膜中央加入20-150ul RNase-free ddH20，盖上盖子，室温放置5分钟12,000 rpm离心1分钟;离心结束后，离心管中收集液即为TGEV病毒基因组RNA。

 

目前，检测 TGEV 的常规方法主要有病原学检测，包括：病毒的分离鉴定、电镜检测、免疫荧光法和免疫过氧化物酶法等；血清学检测，包括血清中和试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）等；分子诊断技术，包括：核酸探针杂交技术、聚合酶链式反应（RT-PCR）技术、多重RT-PCR 和RT-nPCR方法等。诸多实验技术在检测TGEV时都存在一定的优越性和先进性，是检测病毒的常用方法。但是，诸方法也存在许多不足之处，绝大多数检测方法都要求较高的实验条件和实验技术，或者试验周期很长、或者检测方法敏感性和特异性较低，均不适合临床和基层实验室使用。

与上述方法相比，本实验优化的RT-LAMP方法对于检测TGEV具有许多优点：

1.操作简单。

与病毒分离法、电镜检测法、血清学检测法和分子诊断技术相比，RT-LAMP方法不需要特殊的试剂及仪器，扩增是在等温条件下进行，临床及基层实验室只需要水浴锅即可；反应体系中加入Calcein+MnCl₂，反应结束后不需要再加入SYBR Green I即可显色，用肉眼观察即可判断实验结果。  2.快速高效。

因为不需要预先的双链_DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失。核酸扩增在l h内即可完成，同时观察实验结果，快速高效。

3.高特异性。

由于是针对靶序列不同区域设计的4种特异性引物。任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。同时，Calcein+MnCl₂ 只有在特异反应产物存在时才会变色，且避免了开盖加入SYBR Green I时产生的假阳性，增强了反映的特异性。

4.高灵敏度。

RT-LAMP对于病毒扩增模板可达几个拷贝，敏感度比PCR高出几个数量级。本试验优化的RT-LAMP方法对TGEV RNA的最小检测限为10^-6稀释度，即7.28×10^-6μg/μL，而常规一步法RT-PCR试剂盒最小检测限为10^-3稀释度，即7.28×10^-3μg/μL。RT-LAMP敏感性为RT-PCR方法的1000倍。且反应体系中加入的Calcein+MnCl2只在特异性扩增的情况下才显示呈绿色，且显色明显，灵敏度高，诸多条件大大增加了RT-LAMP反应的灵敏度。

 

附图说明

图1  正常PK-15细胞图（100×）

图2  接毒48h以后的PK-15细胞图（100×）

图3  TGEV RT-LAMP温度梯度试验产物的电泳检测结果，其中，M:DL2000分子标准量；1:55℃；2:57℃；3:59℃；4:61℃；5:63℃；6:65℃

图4  TGEV RT-LAMP温度梯度试验产物的可视化结果，其中，1:55℃；2:57℃；3:59℃；4:61℃；5:63℃；6:65℃

图5 TGEV RT-LAMP特异性试验产物的可视化结果，其中，1:TGEV;2:PRRSV;3:PCV2;4:PEDV;5:CSFV;6:阴性对照

图6 TGEV RT-LAMP特异性试验产物的电泳检测结果，其中，M:DL2000分子标准量；1:TGEV;2:PRRSV;3:PCV2;4:PEDV;5:CSFV;6:阴性对照  

图7 TGEV RT-LAMP敏感性试验产物的可视化结果，其中，1-8.TGEV RNA100~10-8稀释度

图8 TGEV RT-LAMP敏感性试验产物的电泳检测结果，其中，。M.DL2000分子标准量；1-8.TGEV RNA100~10-8稀释度

图9 一步法RT-PCR试剂盒检测结果，其中，M.DL2000分子标准量；1-8.TGEV RNA100~10-8稀释度。

 

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明所述猪传染性胃肠炎TGE 的RT-LAMP检测方法进一步说明。

除另有说明外，本申请中所有的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而不应理解为对本发明的限制。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的权利要求范围之内。

在本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的常规技术。

1  实验材料

1.1 病毒和质粒

TGEV Purdue株冻干毒，PK-15细胞系，猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪圆环2型病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒等由华南农业大学兽医学院人畜共患病重点实验室室保存。

1.2 主要试剂 

Bst DNA聚合酶（大片段）、Betaine、Calcein购自New England Biolabs公司；AMV、dNTP及one step RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自北京天根生化生化科技有限公司，胶体金检测试剂盒产自韩国，品牌：Anigen Rapid,品名：PED Ag Test Kit；MgSO₄、MnCl₂等化学试剂购自广州康龙生物科技有限公司。

1.3 引物的设计与合成 

1.3.1 根据GenBank中TGEV N基因的保守区域，用在线软件Primer Explorer V4设计LAMP引物，见表1。

表1  LAMP引物序列

1.3.2  根据穆杨（2011）等的报道确定RT-PCR引物，见表2，和反应体系、条件，见表3，进行RT-PCR检测。

表2  RT-PCR引物序列

表3  RTK基因片段扩增PCR反应体系及反应条件

2． 试验方法与结果

2.1 TGEV的繁殖与收获 

用常规方法将PK-15细胞传代培养，待其长成单层，如图1所示。将本实验保存的TGEV Purdue株冻干毒用DMEM稀释后接种于细胞上，在37℃，5% CO₂ 培养箱中吸附1h后，弃病毒液，加入DMEM维持液，重新置于37℃，5% CO₂培养箱中，培养48 h，细胞出现明显病变，如图2所示，刮取细胞收获病毒液，-80℃备用。

 

2.2病毒RNA和DNA的提取 

参考TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取 TGEV的DNA和RNA，方法如下：

1 用移液器将20μL蛋白酶K加入一个干净的1.5 mL离心管中。

2 向离心管中加入200μL步骤2）获得的病毒液；

3 加入200μL Carrier RNA工作液(为缓冲液GB与Carrier RNA溶液的混合液，配制方法按照公式计算)盖上管盖，涡旋振荡15秒混匀。为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀。Carrier RNA工作液为缓冲液GB与Carrier RNA溶液的混合液，配制方法按照公式计算, 配制公式为：

n×0.22mL=y mL         mL×28 uL/mL=zμL

n=同时提取的样品个数

y=需要加入缓冲液GB的体积

z=需要加入Carrier RNA

4 在56℃孵育15分钟。简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

5 加入250μL无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀。盖上管盖并涡旋振荡15秒，彻底混匀。在室温( 15-25℃)放置5分钟。如果周围环境高于25℃，乙醇需要再在冰上预冷后再加入。

6 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

7仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-free吸附柱CR2(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，8000 rpm（~6000 x g)离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中。如果吸附柱上的液体未能全部离心至收集管中，请加大转速，延长离心时间至液体完全转移到收集管中。

8小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液RW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，静置2分钟，8000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管。

9 重复8步骤一次。

10小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8000 rpm离心1分钟，弃废液。乙醇的残留可能会对后续实验造成影响。

11将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液。

12可进步骤：将吸附柱放回2ml收集管中，打开吸附柱盖子，室温放置3 分钟，使吸附膜完全变干。

13 将吸附柱放入一个RNase-free离心管(1.5 ml)中，小心打开吸附柱的盖子，向膜中央加入20-150ul RNase-free ddH20，盖上盖子，室温放置5分钟12,000 rpm离心1分钟。离心结束后，离心管中收集液即为TGEV病毒基因组RNA。

注意事项

确保洗脱液、RNase-free ddH₂0)在室温平衡后再使用。如果加入洗脱液的体积很小(小于50μL)，为了将膜上的DNA/RNA充分洗脱下来，应注意将洗脱液加到膜的中央位盖。洗脱体积可以根据后续的实验要求灵活处理。

 

2.3 LAMP反应条件的优化

将温度按55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃依次递增，多次重复后确定最佳反应温度；配置1mol/L Betaine,250umol/L Calcein,25mmol/L MnCl₂,100mmol/L MgSO₄,连同AMV和Bst DNA聚合酶参考相关文献对反应体系在一定范围内进行优化；配置5条引物的工作浓度（10mmol/mL)后对引物浓度配比进行优化；对反应时间在30min，45min，60min和75min依次增加确定最佳反应时间。

通过对反应条件的优化，确定最佳反应体系：10×Bst buffer 2.5μL、AMV（5U/μL）0.5μL、Bst DNA 聚合酶8U、Betaine（1mol/L）3μL、Calcein（250μmol/L）3μL、MnCl₂ （25mmol/L）0.5μL、MgSO₄（100mmol/L）0.5μL、BIP（10mmol/mL）3μL、FIP（10mmol/mL）3μL、LB（10mmol/mL）2μL、F3（10mmol/mL）0.5μL、B3（10mmol/mL）0.5μL、dNTPs （10mmol/L）3μL、模版RNA（7.28μg/μL）2μL，用去离子水补足25μL。反应条件为：62℃1h，80℃10min。具体实验结果参见图3和图4。

 

2.4  RT-LAMP方法的特异性检测 

为验证建立的RT-LAMP方法的特异性，分别以猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪圆环2型病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒的基因组为模板按优化的体系进行扩增，扩增结束后观察颜色的变化，可视化观察结果见图5；再取5μL反应产物上样1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电泳结果见图6。由结果可知，仅以TGEV为模板可扩增出条带并见到绿色荧光，其它为阴性，表明该优化的RT-LAMP方法对TGEV具有良好的特异性。

 

2.5 RT-LAMP方法的重复性检测

提取等量6份不同代的PEDV Purdue株细胞培养物的RNA，进行RT-LAMP检测确定批内重复性；3d后再提取同样6代培养物，提取病毒RNA同一反应条件下进行实验，确定批间重复性。

6份不同代的PEDV株细胞培养物RNA，检测结果均无差异，批内重复性好；3d后再提取同样6代培养物，检测结果均无差异，批间重复性好。

 

2.7 LAMP方法的敏感性检测

将提取的TGEV RNA经核酸测定仪测定后，做10^-1~10^-8系列的倍比稀释，各取2μL模板，用优化的RT-LAMP方法和穆杨（2011）等所提供的RT-PCR方法对10倍梯度稀释的模板进行RT-PCR反应，根据该反应的引物和所提供的反应条件用TAKARA one step RT-PCR试剂盒进行扩增，经多次重复试验，扩增结束后观察颜色的变化，可视化观察结果见图7；再取5μL反应产物上样1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电泳结果见图8。同时，按照梯度稀释后的TGEV RNA模板进行RT-PCR反应，反应结束后将产物进行电泳检测，检测结果见图9。由结果可知，显示本研究所建立的RT-LAMP对TGEV RNA的最小检测限为10^-6稀释度，即7.28×10^-6μg/μL ，而常规一步法RT-PCR试剂盒最小检测限为10^-3稀释度，即7.28×10^-3μg/μL。RT-LAMP敏感性为RT-PCR方法的1000倍。

  

2.8 RT-LAMP方法的临床检测

应用建立的RT-LAMP方法对实验室送检的37份疑似猪传染性胃肠炎样品进行检测，同时使用常规RT-PCR方法和胶体金试剂盒对该病料进行检测，结果显示RT-LAMP方法检出18份阳性病料，阳性检出率为48.65%，RT-PCR方法检出15份阳性病料，阳性检出率为40.54%，胶体金试剂盒检出12份阳性病料，阳性检出率为32.44%，说明本试验建立的RT-LAMP方法更为敏感，特异性更高。

 

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (2)

1.猪传染性胃肠炎TGE 的RT-LAMP检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

1）根据GenBank中TGEV N基因的保守区域，用在线软件设计LAMP引物如下： 

 FIP  5’GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA3’

BIP 5’CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC3’

F3    5’GCTATCGCATGGTGAAGG3’

B3    5’CAAGTTGAAATTCGCCTGG3’；

2）用常规方法将PK-15细胞传代培养，待其长成单层，将TGEV Purdue株冻干毒用DMEM稀释后接种于细胞上，在37℃，5% CO2 培养箱中吸附1h后，弃病毒液，加入DMEM维持液，重新置于37℃，5% CO2培养箱中，待细胞出现明显病变，刮取细胞收获病毒液，-80℃备用；

3）提取 TGEV的RNA；

4）以步骤3)所得的TGEV的RNA为模板，按照下述条件进行RT-LAMP反应：

10×Bst buffer 2.5μL、AMV（5U/μL）0.5μL、Bst DNA 聚合酶8U、Betaine（1mol/L）3μL、Calcein（250μmol/L）3μL、MnCl2 （25mmol/L）0.5μL、MgSO4（100mmol/L）0.5μL、BIP（10mmol/mL）3μL、FIP（10mmol/mL）3μL、LB（10mmol/mL）2μL、F3（10mmol/mL）0.5μL、B3（10mmol/mL）0.5μL、dNTPs （10mmol/L）3μL、模版RNA（7.28μg/μL）2μL，用去离子水补足25μL；反应条件为：62℃1h，80℃10min；

5） 可视化观察RT-LAMP反应结果;

6）琼脂糖凝胶验证可视化RT-LAMP反应结果。

2.如权利要求1所述的猪传染性胃肠炎TGE 的RT-LAMP检测方法，其特征在于，步骤3）提取 TGEV的RNA的方法为：

3-1 )用移液器将20μL蛋白酶K加入一个干净的1.5 mL离心管中;

3-2) 向离心管中加入200μL步骤2）获得的病毒液；

3-3)加入200μL Carrier RNA工作液盖上管盖，涡旋振荡15秒混匀；为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀；Carrier RNA工作液为缓冲液GB与Carrier RNA溶液的混合液，配制方法按照公式计算, 配制公式为：

n×0.22mL=y mL         mL×28 uL/mL=zμL

n=同时提取的样品个数

y=需要加入缓冲液GB的体积

z=需要加入Carrier RNA

3-4) 在56℃孵育15分钟；简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；

3-5) 加入250μL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15秒，在15-25℃放置5分钟；如果周围环境高于25℃，乙醇需要再在冰上预冷后再加入；

3-6) 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；

3-7) 将RNase-free吸附柱CR2放在收集管中，仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-free吸附柱CR2，盖上管盖，8000 rpm（~6000 x g)离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

3-8)小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液RW，盖上管盖，静置2分钟，8000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管；

3-9) 重复3-8)步骤一次；

3-10)小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8000 rpm离心1分钟，弃废液；

3-11)将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液；

3-12) 将吸附柱放入一个RNase-free的1.5 ml离心管中，小心打开吸附柱的盖子，向膜中央加入20-150ul RNase-free ddH20，盖上盖子，室温放置5分钟12,000 rpm离心1分钟;离心结束后，离心管中收集液即为TGEV病毒基因组RNA。

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