CN103484563B - 检测绵羊痘病毒的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于检测绵羊痘病毒的试剂盒。本发明的用于检测绵羊痘病毒的试剂盒内至少包括有四条引物，分别是SEQ ID №1、SEQ ID №2、SEQ ID №3和SEQ ID №4，以及dNTP 、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween 20和Bst 酶，以及模板DNA。本发明具有特异性高、检测操作相对简单、快速的优点，可在羊痘病毒流行病学研究中应用及疾病的防控中应用。

Description

检测绵羊痘病毒的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，确切讲是一种用于检测绵羊痘病毒的试剂盒。
背景技术
羊痘（Capripox，CP）包括绵羊痘、山羊痘和牛的皮肤疙瘩病，其中前两者是由绵羊痘病毒（Sheeppox virus，SPPV）和山羊痘病毒（Goatpox virus，GTPV）分别引起绵羊和山羊发生的接触性传染病。病畜体温升高，全身出现丘疹或结节、水疱、内脏病变甚至死亡，给世界养羊业造成了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其规定为法定必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。
绵羊痘和山羊痘的鉴别诊断一直是研究的热点。研究表明，SPPV 和GTPV 基因序列同源性达到96%-97%, 仅在基因组末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差异，见：Tulman, E.R., Afonso, C.L., Lu, Z., Zsak, L., Sur, J.H., Sandybaev, N.T., Kerembekova, U.Z., Zaitsev, V.L., Kutish, G.F.,Rock, D.L., 2002. The genomes of sheeppox and goatpox viruses. J Virol. 76, 6054-6061. 。一般来说, SPPV、GTPV 具有较严格的宿主嗜性, 但有一些研究表明试这两种病毒也可发生宿主嗜性改变, 引起交叉感染，见：M.G. Garner, S.D. Sawarkar, E.K. Brett, J.R. Edwards, V.B. Kulkarni, D.B. Boyle;S.N. the Extent and Impact of Sheep Pox and Goat Pox in the State of Maharashtra, India , Tropical Animal Health and Production.2000,32(4):205-223. ,继而可能导致错误的临床诊断和获得不准确的流行病学信息, 不利于对该病的有效防控。对羊痘病毒分离株进行准确的种属鉴别有助于解决生产中遇到的这个问题, 但SPPV 和GTPV 之间抗原性具有明显交叉, 用血清学方法很难区别开来, 需通过分子生物学方法进行鉴别，Sheeppox and goatpox virus. World Organisation for Animal Health (2009). - Terrestrial Animal Health Code. OIE,Paris. 。准确鉴定分离株种属和弄清其来源将有助于羊痘的流行病学分析, 具有重要意义。
目前为止，基于基因序列分析的分子生物学鉴别绵羊痘病毒和山羊痘病毒的方法并不十分成熟，前期本实验室通过克隆结合酶切的方法分析P32基因和GPCR基因建立了PCR-RFLP方法，见：颜新敏,吴国华,李健等.山羊痘病毒感染绵羊的诊断及其基因的分子分析.中国兽医科学,2011,41(01):14.，但是该方法需要专用的PCR仪器和酶切操作，相对来说比较繁琐且费用较多，不利于生产实践中的实际应用。而国内肖雯等建立的绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR方法扩增灵敏度仅为1.725×107 copies/μL 的SPPV模板，且同样需要专门的PCR仪器，因此该方法在生产实践中也存在这局限性，见：肖雯，聂福平，王昱 等.绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR检测方法的建立及应用.中国预防兽医学报.2012, 7(7):551-554.。目前O. Mangana-Vougiouka等用PCR技术检测了绵羊痘病毒，但该方法没有指出可以区分绵羊痘病毒和山羊痘病毒，Sheep poxvirus identification by PCR in cell culture. Journal of Virological Methods.77(1999) 75-79.而C. A. Balinsky等人以及Hong Tian等人建立的real time PCR 方法可以检测绵羊痘病毒，但是同样不能区分绵羊痘病毒和山羊痘病毒。Rapid Preclinical Detection of Sheeppox Virus by a Real-Time PCR Assay, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Feb. 2008, p. 438–442；Hong Tian 等Development of a SYBR green real-time PCR method for rapid detection of sheep pox virus. Virology Journal 2012, 9 :291. 而且Real time PCR所需要的试剂昂贵，仪器昂贵且操作设置繁琐，在生产实践中也有一定的局限。
环等温介导技术（loop mediated isothermal amplication, LAMP）由于其具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被广泛应用于各种疾病病原的检测中。尽管国内外均已有人针对羊痘病毒属基因设计并建立了能够检测羊痘病毒属的Lamp方法，如美国科学家Amaresh Das等人建立了灵敏度比较高的Lamp方法，见：Amaresh Das, Shawn Babiuk,and Michael T. McIntosh.Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Capripoxviruses. Journal of Clinical Microbiology.2012, 1613–1620.，该研究靶向SPPV、GTPV和LDSV三种病原共有的保守的VP39基因；国内重庆出入境检验检疫局李应国，等人也建立了检测羊痘病毒属的Lamp诊断试剂盒，见：羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法，专利申请公开号：CN102373302A.，但该方法也是以SPPV、GTPV和LSDV三种病原共有的基因组1119272bp-120322bp保守序列为靶标基因。可见，上述已公布的方法或者试剂盒不能够区别出同属不同种的病毒，也就是说不能够把山羊痘病毒属从羊痘病毒书中区别开来。此外已经公开的这些检测试剂盒检测的灵敏度也较低。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足的，用于检测绵羊痘病毒的试剂盒。
本发明的用于检测绵羊痘病毒的试剂盒内至少包括有四条引物，分别是SEQ ID  №1、SEQ ID №2、SEQ ID №3和SEQ ID №4。
为方便使用，本发明的检测绵羊痘病毒的试剂盒盒内还有dNTP 、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween 20和Bst 酶，以及模板DNA。
本发明是一种用于检测绵羊痘病毒的LAMP检测试剂盒，其相应的检测是应用特定的引物进行LAMP扩增，而环等温介导技术（loop mediated isothermal amplication, LAMP）具有快速、简便、无需特殊仪器等优点。相关的实验表明，本发明的序列可特异性快速扩增绵羊痘病毒的核酸，并通过核酸电泳检测到特异性条带确定被检样品是否有绵羊痘病毒，但同等条件下本发明的引物却不能扩增山羊痘病毒的核酸及其它的病毒，因此本发明具有特异性。本发明具有特异性高、检测操作相对简单、快速的优点，可在羊痘病毒流行病学研究中应用及疾病的防控中应用。
本发明中，设计选取绵羊痘病毒基因组的反向末端重复序列ITR区为靶基因，专门设计了只能匹配绵羊痘病毒而不能匹配山羊痘病毒的特异性Lamp引物。本发明的试剂盒能够检测绵羊痘病毒的试剂盒能够快捷高效灵敏的检测出绵羊痘病毒，而不与同属的山羊痘病毒发生交叉反应。因此，本发明可快速特异性地从病料中或者培养的细胞毒中检测出绵羊痘病毒，从而判定是绵羊痘病毒而不是山羊痘病毒或别的病原体感染。而且本发明涉及的试剂盒最低可检测出1.037×104个拷贝的模板，灵敏度高于同类能区分检测出绵羊痘病毒的分子生物学方法中的双重PCR方法和PCR-RFLP方法，且不需要使用专门的PCR仪和DNA酶，因此在使用成本和时间上都占有一定的优势。
附图说明    
图1为绵羊痘病毒lamp引物扩增温度梯度优化，扩增60min后核酸电泳检测结果。其中60℃、62、64℃和66℃均有扩增条带产生，对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的山羊痘病毒lamp引物扩增温度可选择60℃、62℃、64℃和66℃中任意一个温度。
图2为绵羊痘病毒lamp引物扩增在62℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果。其中扩增30min、45min和60min后均有扩增条带产生，扩增对照组无条带产生，此图可看出本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增时间可在30min之后扩增出特异性条带。
图3为以羊的不同病原体基因组为模板，以绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增45 min后核酸电泳检测结果。其中M表示100bp DNA Ladder marker；1为绵羊痘病毒扩增产物；2为山羊痘病毒扩增产物；3为羊水泡病毒扩增产物；4为支原体扩增产物；5为衣原体扩增产物；6为螺旋体扩增产物；7为弓形虫扩增产物；8为羊泰勒虫扩增产物；9为羊巴贝斯虫扩增产物；10为无形体扩增产物；11为阴性对照。由图可见，绵羊痘病毒lamp引物特异性扩增出了绵羊痘病毒基因片段，而其他病原体均无特异性产物产生，阴性对照组无条带产生，说明绵羊痘病毒lamp引物特异性很高。
图4为绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果,扩增时间为45min。其中M代表100bp DNA marker；1为1.037×109个拷贝，2为1.037×108个拷贝；3为1.037×107个拷贝，4为1.037×106个拷贝；5为1.037×105个拷贝，6为1.037×104个拷贝，7为1.037×103个拷贝，8为1.037×102个拷贝，9为1.037×101个拷贝，10为1.037×100个拷贝，C为阴性对照。由图可见，1.037×109-1.037×104个拷贝的模板均有特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。对照组无条带产生，此图可看出本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物在62℃下，扩增45min之后最少可检出1.037×104个拷贝的模板。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细解说.
1. 序列的制备
对羊痘病毒基因组反向重复末端（1-2000bp内）设计三个组引物，从获得的数百对引物中选择评分较高的引物在进行将设计好的序列发送至南京金斯瑞生物工程有限公司进行5’端修饰合成。
2．病毒基因组提取
将Vero细胞接种细胞培养瓶，单层细胞长至80%以上融合后，接种羊痘病毒病毒，37℃孵育1h后弃去毒液。加入细胞维持液含有1%胎牛血清DMEM，37℃5%CO2培养，定期观察细胞病变（CPE），待90%以上细胞出现CPE后收毒。将病毒反复冻融3次，置-20℃冰箱保存备用。使用TaKaRa公司DNA提取试剂盒提取细胞毒株中的DNA，获得的病毒DNA即可用于检测。
3.Lamp扩增条件优化
以提取纯化的病毒DNA 为模板进行扩增，实验体系如下：
12.5 μL LAMP 反应缓冲液(40 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、20 mmol/L KCl、16 mmol/L MgSO4、20 mmol/L (NH4)2SO4、0.2% Tween 20、1.6 mol/L 甜菜碱、2.8 mmol/L dNTPs)、0.9 μL 引物混合液 (40 pmol FIP、BIP、5 pmol F3、B3)、2.0 μL DNA 样 品、1.0 μL (8U) Bst DNA 聚合酶 (New England Biolabs, M0275L) 和 8.2 μL 灭菌水。反应条件为在60-64℃之间，反应30-60min可特异性检测出绵羊痘病毒。
3.1反应温度的优化
在进行lamp引物的反应温度的确定时，按照上述体系加入反应物。使用模板为绵羊痘病毒；反应温度设为 60℃、62℃、64℃的水浴锅或PCR仪中进行，反应时间为60 min，结束后 80℃加热 2 min，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。
经检测，绵羊痘病毒lamp引物扩增温度梯度优化，扩增60min后核酸电泳检测结果。其中60℃、62、64℃和66℃均有扩增条带产生，对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物扩增温度可选择60℃、62℃、64℃和66℃中任意一个温度。
3.2 反应时间的优化
在进行lamp引物的反应时间的确定时，按照上述体系加入反应物，使用模板为绵羊痘病毒。反应温度设为 62℃的水浴锅或PCR仪中进行，反应时间为30~60 min，结束后 80℃加热 2 min，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。
检测结果显示，绵羊痘病毒lamp引物扩增在62℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果。其中扩增30min、45min和60min后均有扩增条带产生，扩增对照组无条带产生，可看出本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增时间可在30min之后扩增出特异性条带。
3.3 反应特异性检测
在进行lamp引物的反应特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。模板分别为绵羊痘病毒、山羊痘病毒、羊水泡病毒、支原体、为衣原体、螺旋体、弓形虫、羊泰勒虫、羊巴贝斯虫。反应温度设为 62℃的水浴锅或PCR仪中进行，绵羊痘病毒lamp引物反应45min。反应结束后 80℃加热 2 min，之后取出反应管，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。
检测结果显示以羊的不同病原体基因组为模板，以绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增45 min后核酸电泳检测结果。结果显示绵羊痘病毒lamp引物特异性扩增出了绵羊痘病毒基因片段，而其他病原体均无特异性产物产生，阴性对照组无条带产生，说明绵羊痘病毒lamp引物特异性很高。
3.4 反应灵敏度检测
在进行lamp引物的反应灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。模板为绵羊痘病毒基因组DNA，所有模板均通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为1.037×109-1.037×100个拷贝共计10个梯度作为模板。反应温度设为 62℃的水浴锅或PCR仪中进行，反应时间按优化结果，绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物设为45min、绵羊痘病毒lamp引物设为45min、山羊痘病毒lamp引物为60 min。反应结束后 80℃加热 2 min，之后取出反应管，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。
为绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果,扩增时间为45min。结果显示，1.037×109-1.037×104个拷贝的模板均有特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。对照组无条带产生，此图可看出本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物在62℃下，扩增45 min之后最少可检出1.037×104个拷贝的模板。
综上可见，这里设计合成的4个基因序列以及其形成的LAMP方法可以单独使用快速特异性地检测绵羊痘病毒。
 
<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>  检测绵羊痘病毒的试剂盒
<160>  4
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列（SPPV F3）
<400> 
tgaggcatcc tttttgaaag                                                  20
 
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列（SPPV B3）
<400>
aagaaataac aagttcgggt ta                                               22
 
<210>  3
<211>  44
<212>  DNA
<213>  人工序列（SPPV FIP）
<400>
gccatctctg attatttgtt ttggtaacac atttccagca acct                       44
 
<210>  4
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列（SPPV BIP）
<400>
catctgaaaa gttgtttcgg tagacagaga cttttatccc gttca                      45

Claims (1)

1.用于检测绵羊痘病毒的试剂盒，其特征在于试剂盒中至少包括有四条引物，分别是SEQ №1、SEQ №2、SEQ №3和SEQ №4。
2.根据权利要求1所述的用于检测绵羊痘病毒的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有dNTP 、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween 20和Bst 酶，以及模板DNA。
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