CN113373268B - 一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的lamp引物组、试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的lamp引物组、试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP引物组、试剂盒和检测方法，涉及生物技术领域。本发明所述LAMP引物组和LAMP试剂盒，及开发的对应病毒检测方法，通过荧光信息直接实现对山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的快速鉴定，具有便捷、准确、灵敏、特异、操作简便等优点，最低检测限在6 copies，高于实时荧光定量PCR的检测结果，适于在疫情预爆发时现场快速诊断疫病，及时控制疫情。

Description

一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP引物组、试剂盒 和检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术
山羊痘病毒（Goatpox Virus，GTPV）、绵羊痘病毒（Sheeppox Virus，SPPV）和牛结节性皮肤病病毒（Lumpy skin disease Virus，LSDV）属于羊痘病毒属病毒（Capripoxvirus，CPV），能分别引起山羊、绵羊和牛的皮肤、器官表面广泛性结节和水肿，病畜产乳量急剧减少，皮毛品质极大下降，造成巨大经济损失。
羊痘病毒（Capripoxvirus，CPV）在分类上属于痘病毒科（poxviridae）脊椎动物痘病毒亚科（chordopoxrinae）中的羊痘病毒属（capripoxvirus）。羊痘病毒为砖形病毒，在细胞浆内复制，其基因组为双链DNA，大小约为290nm✕270nm，属于较小的痘病毒，病毒粒子由1个核心、2个侧体和2层脂质外膜组成，羊痘病毒的衣壳为对称型，有囊膜，囊膜内含有病毒特异性蛋白。
牛结节性皮肤病，是以患牛发热、皮肤、勃膜、器官表面广泛性结节，淋巴结肿大，皮肤水肿为特征的传染病，能引起感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡。山羊痘、绵羊痘和牛结节性皮肤病病毒具有很强的宿主特异性，自然条件下，不会发生交叉感染。
传统的羊痘病毒属检测方法主要是血清学检测（酶联免疫吸附试验ELISA 、微量中和试验、间接免疫荧光和蛋白印迹试验等）和病原学检测（PCR、实时荧光定量 PCR和高分辨率熔曲线分析法等）。我国目前最常用检测方法为荧光定量PCR，该检测方法灵敏度和特异性较好，但操作复杂，仪器昂贵，难以在基层实际生产中普及应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP引物组、试剂盒和检测方法，可对羊痘病毒属病毒进行快速、精确地检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括外引物对、内引物对和环引物对；
所述外引物对包括F3和B3，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述内引物对包括FIP和BIP，所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述环引物对包括LF和LB，所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述羊痘病毒属病毒包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒。
本发明还提供了一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP试剂盒，包括上述LAMP引物组。
优选的，还包括荧光反应液和酶反应液；所述荧光反应液的组分包括：10×Thermopol buffer、MgSO4、甜菜碱、dNTPs和荧光染料和上述LAMP引物组；
所述酶反应液包括Bst DNA聚合酶。
优选的，所述荧光染料包括SYTO9。
优选的，所述LAMP试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP荧光检测方法，包括以下步骤：利用上述LAMP试剂盒和待测样品DNA构建反应体系，置于60℃恒温反应，待测样品有明显扩增曲线，则判断为阳性，无明显扩增曲线，判断为阴性。
优选的，所述反应体系以25μL计，包括以下终浓度的组分：1×Thermopol buffer，7mmol/L MgSO4，0.5mmol/L甜菜碱，1.2mmol/L dNTPs，0.04mmol/L荧光染料，0.2μmol/LF3，0.2μmol/L B3，1.6μmol/L FIP ，1.6μmol/L BIP，0.8μmol/L LF，0.8μmol/L LB和10 U/μL Bst DNA 聚合酶。
优选的，还包括利用阳性对照和阴性对照分别构建相同的反应体系，置于60℃恒温反应40min。
有益效果：本发明提供了一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP引物组，并利用所述LAMP引物组制备成LAMP试剂盒，同时开发了基于所述LAMP引物组和LAMP试剂盒的检测方法，适用于荧光PCR仪、恒温荧光扩增检测仪等一系列荧光扩增检测设备，通过荧光信息直接实现对山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的快速鉴定，具有便捷、准确、灵敏、特异、操作简便等优点，最低检测限在6 copies，高于实时荧光定量PCR的检测结果，但操作上相对于后者更简便，成本也更低，因此本发明的LAMP引物组和试剂盒适于在疫情预爆发时现场快速诊断疫病，及时控制疫情。
附图说明
图1为本发明引物组A、B、C在山羊痘病毒DNA上的扩增效果验证；
图2为本发明引物组A、B、C在绵羊痘病毒DNA上的扩增效果验证；
图3为本发明引物组A、B、C在牛结节性皮肤病病毒DNA上的扩增效果验证；
图4 为利用本发明的引物组A进行LAMP的灵敏度检测结果；
图5为本发明的引物组A制备的试剂盒特异性检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括外引物对、内引物对和环引物对；
所述外引物对包括F3和B3，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述内引物对包括FIP和BIP，所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述环引物对包括LF和LB，所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明所述羊痘病毒属病毒优选包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒，在本发明实施例中，针对三种病毒，优选选取ORF068和ORF074基因保守区域进行引物的设计，运用在线生物软件（http://primerexplorer.jp/），通过调整Tm值、GC含量、dG临界值、扩增长度和片段区域等参数值，进行设计适用于LAMP的特异性外引物和内引物。本发明优选将所述Tm值调整到60~65℃，减少假阳性结果；调整F1c/B1c引物长度在20~22bp之间，F2/B2引物长度在18~20bp之间，F3/B3引物长度在18~20bp之间；为控制反应能够特异的发生，F1c和B1c引物的5’端与F3/B3，F2/B2的3’末端的△G值设定值优选小于-4Kcal/mol，更优选设定为-5、-6，dimer check设为-2；调整GC含量在40~60%之间，提高产物特异性与产量。本发明所述FIP是由F2和F1c组成，BIP是由B2和B1c组成，按照如上参数设定并通过实验筛选出最佳的外引物和内引物序列组合后，在此引物组的基础上按照上述参数设置设计环引物，根据引物设计软件推荐的环引物序列（而常规设计LAMP环引物时仅根据软件推荐环引物序列直接进行筛选），本研究为进一步提高灵敏度，在保证环引物长度不变的前提下，分别按照向上游移动4个碱基、5个碱基，向下游移动4个碱基、5个碱基，连同推荐环引物序列共5条环引物序列，进行实验，筛选出最佳环引物，以提高本发明灵敏度。
Figure 357784DEST_PATH_IMAGE002
本发明还提供了一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP试剂盒，包括上述LAMP引物组。
本发明所述LAMP试剂盒优选还包括荧光反应液和酶反应液；所述荧光反应液的组分包括：10×Thermopol buffer、MgSO4、甜菜碱、dNTPs和荧光染料和上述LAMP引物组；所述酶反应液包括Bst DNA聚合酶。
在本发明中，所述荧光反应液优选为包括以下组分的混合液：10×Thermopolbuffer、50mmol/L MgSO4溶液、5.0mmol/L甜菜碱溶液、10mmol/L dNTPs、1mmol/L 荧光染料、5 μmol/L的外引物F3、5 μmol/L的外引物B3、40 μmol/L的内引物FIP、40 μmol/L的内引物BIP、20 μmol/L的环引物LF、20 μmol/L的环引物LB。
本发明所述荧光染料优选包括SYTO9。
本发明所述酶反应液优选为10 U/μL的Bst DNA聚合酶。
本发明所述LAMP试剂盒优选还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照优选为含有羊痘病毒属ORF068基因的重组质粒，所述阴性对照优选为无DNA酶蒸馏水。在本发明实施例中，优选将所述羊痘病毒属ORF068基因通过SacI/SaII双酶切构建入大肠杆菌克隆质粒puc57中形成重组质粒puc57- ORF068。
本发明还提供了一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP荧光检测方法，包括以下步骤：利用上述LAMP试剂盒和待测样品DNA构建反应体系，置于60℃恒温反应，待测样品有明显扩增曲线，则判断为阳性，无明显扩增曲线，判断为阴性。
本发明所述待测样品DNA。本发明对所述基因组DNA提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规提取方法即可。
本发明所述反应体系以25μL计，优选包括以下终浓度的组分：1×Thermopolbuffer，7mmol/L MgSO4，0.5mmol/L甜菜碱，1.2mmol/L dNTPs，0.04mmol/L荧光染料，0.2μmol/L F3，0.2μmol/L B3，1.6μmol/L FIP ，1.6μmol/L BIP，0.8μmol/L LF，0.8μmol/L LB和10 U /μL Bst DNA 聚合酶。
在本发明所述LAMP荧光检测方法中，优选还包括利用阳性对照和阴性对照分别构建相同的反应体系，置于60℃恒温反应40min。在本发明中，检测结果中如果阳性对照出现明显扩增曲线；且阴性对照无特定扩增曲线，说明检测结果准确。如果检测结果中阴性对照也有扩增曲线，说明试剂被污染，应重新实验或用新的试剂进行检测；如果阳性对照没有扩增曲线，说明试剂失效，应重新实验或用新的试剂进行检测。
本发明所述LAMP荧光检测方法既可用于临床样品中病毒的检测，也可用于动物饲料、牛羊制品、环境等环境中的病毒检测，此外，本发明的方法也可用于实验室用途。
下面结合实施例对本发明提供的一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP引物组、试剂盒和检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、设计表1所示的引物组，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
2、引物的筛选及验证
（1）毒株与样品
山羊痘病毒阳性样本（灭活）、绵羊痘病毒阳性样本（灭活）、牛结节性皮肤病病毒阳性样本（灭活）和4种与羊痘病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体：小反刍兽疫病毒、羊口疮疫苗、水疱性口炎疫苗、口蹄疫病毒均由北京市动物疫病预防控制中心实验室保存。
（2）在荧光PCR仪上分别使用设计的引物组A、引物组B和引物组C进行LAMP扩增，扩增反应体系（25 μL）为：荧光反应液22μL，酶反应液1μL，样品DNA 2μL；扩增反应工作程序为：63℃，120 min。
其中，荧光反应液的配方为：10×Thermopol buffer 2.5μL、50mmol/L MgSO4溶液3.5μL、5.0mmol/L甜菜碱溶液2.5μL、10mmol/L dNTPs 3μL、1mmol/L荧光染料SYTO9 1μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5 μmol/L的外引物B3 1μL、40 μmol/L的内引物FIP 1μL、40 μmol/L的内引物BIP 1μL、20 μmol/L的环引物LF 1μL、20 μmol/L的环引物LB 1μL、无DNA酶的蒸馏水3.5μL；
酶反应液为10U/μL的 Bst DNA 聚合酶 1μL。
（3）扩增结果如图1、图2和图3所示，引物组A、引物组B、引物组C（对应图1中的编号1、2、3）分别在第18min、27min、45min左右检出山羊痘病毒阳性样本DNA，4种与羊痘病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体，在120min内均未检出（图1）；引物组A、引物组B和引物组C（对应图2中的编号1、2、3）分别在第17min、28min、47min左右检出绵羊痘病毒阳性样本DNA，4种与羊痘病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体在120min内均未检出（图2）；引物组A、引物组B和引物组C（对应图3中的编号1、2、3）分别在第15min、25min、21min左右检出牛结节性皮肤病病毒阳性样本DNA，4种与羊痘病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体在120min内均未检出（图3）。结果表明，本发明的引物组A具有较高的扩增效率和特异性。
实施例2
在等温荧光PCR扩增仪上检测山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛结节性皮肤病病毒的LAMP方法退火温度的优化
1、选择引物组合为：实施例1表1中的引物组A。
2、LAMP扩增反应体系如实施例1，即荧光反应液22μL，酶反应液1μL，样品DNA 2μL。
3、在环介导等温扩增仪上进行扩增，设置58℃、60℃、63℃和65℃ 四个温度。
4、分析结果：结果显示（如表2所示），60℃条件下扩增效果最好，选择60℃作为本发明的引物组A的扩增温度。
表2 不同反应温度下扩增结果
58℃ 60℃ 63℃ 65℃
TT值 06:55 06:26 09:17 24:29
实施例3
使用制备的LAMP荧光试剂盒检测山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛结节性皮肤病病毒
1、山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛结节性皮肤病病毒LAMP荧光检测试剂盒的组装
用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签，标示名称、批号、生产日期、有效期等。
规格及数量（48T/盒）。
荧光反应液1056µL /管；酶反应液48 µL/管；阳性对照100 µL/管；阴性对照100µL/管。
阳性质控标准品使用重组质粒 puc57-ORF068（基因组序列如SEQ ID NO.17所示）为阳性模板，使用 Tris-EDTA 缓冲液（0.01 M pH8.0）稀释后冷冻保存。使用ddH2O为阴性对照。
上述荧光反应液配制方法为：取10×Thermopol buffer 120μL、50mmol/L MgSO4溶液 168μL、5.0mmol/L甜菜碱溶液 120μL、10mmol/L dNTPs 144μL、荧光染料SYTO9 48μL，5 μmol/L的外引物F3 48μL、5 μmol/L的外引物B3 48μL、40 μmol/L的内引物FIP 48μL、40μmol/L的内引物BIP 48μL、20 μmol/L的环引物LF 48μL 、20 μmol/L的环引物LB 48μL、无DNA酶的蒸馏水 168μL，混合；
2、实验流程
（1）将样本（全血、组织和拭子上清）按照Takara Min BEST Viral RNA/DNAExtraction Kit 操作说明书提取DNA，用于后续检测。
（2）在室温下解冻保存于-20℃的检测试剂，解冻后立即置于冰上保存。
（3）按下表配制反应Mix（每份量反应Mix的配置）见表3：
表3 试剂配制组成
试剂 反应体系
荧光反应液 22×（n+1）μL
酶反应液（10U/μL的 Bst DNA 聚合酶） 1×（n+1）μL
合计 23×（n+1）μL
混合注意事项：涡旋混合器混合时采用1秒×3次的方式。混合过于激烈，则有可能导致酶失活。
（4）根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量准备反应管，向每个反应管加入23µL反应Mix。
（5）吸取已处理的样本DNA、阴性对照、阳性对照各2µL加入对应反应管中，盖好管盖，转移至扩增区。
加样注意事项：按照阴性对照、样本DNA、阳性对照顺序依次加样并盖好管盖。
（6）将PCR反应管按顺序放入环介导等温扩增仪，设置反应体系为25uL设置反应条件60℃，40min；热盖83℃（若无此功能则忽略）。
上机后注意事项：全程实验过程请不要打开反应管盖，防止核酸污染实验室。
（7）分析数据，显示检测结果。
质量控制：
（1）阳性对照：40分钟内阳性对照出现明显扩增曲线。
（2）阴性对照：40分钟内无特定扩增曲线。
待测样本结果判定：阴性对照和阳性对照荧光扩增结果符合质量控制要求，待测样本40分钟内有明显荧光扩增曲线判定为阳性；否则判定为阴性。
实施例4
1、DNA模板的制备：应用阳性质粒puc57-ORF068（SEQ ID NO.17），初始浓度3×103copies/μL ，进行10倍系列梯度倍比稀释，分别稀释成3×103 copies/μL、3×102copies/μL、3×101 copies/μL、3×100 copies/μL、3×10-1 copies/μL、3×10-2 copies/μL、3×10-3 copies/μL、3×10-4 copies/μL（依次编号为1-8）。采用上述建立的运用山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛结节性皮肤病病毒LAMP荧光检测方法（引物组A）进行灵敏度试验。
2、LAMP反应体系：荧光反应液22μL，酶反应液1μL，样品DNA 2μL，总体积25μL。反应程序为：60℃ 60 min。
3、检测结果LAMP荧光检测结果如图4所示，显示1-4均为阳性（40min内有扩增曲线），5-8未检测到所以不予显示编号，即该方法的检测最低限为6copies。
实施例5
1、用本发明制备的试剂盒按照实施例4表述的方法分别检测山羊痘病毒阳性样本（灭活）、绵羊痘病毒阳性样本（灭活）、牛结节性皮肤病病毒阳性样本（灭活）和4种与羊痘病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体，小反刍兽疫病毒、羊口疮疫苗、水疱性口炎疫苗、口蹄疫病毒，验证反应体系的特异性。
2、检测结果如图5所示，本发明的试剂盒可以成功检测出山羊痘病毒阳性样本（灭活）（编号1）、绵羊痘病毒阳性样本（灭活）（编号2）和牛结节性皮肤病病毒阳性样本（灭活）（编号3）和阳性对照（pos），4种与羊痘病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体，小反刍兽疫病毒、羊口疮疫苗、水疱性口炎疫苗、口蹄疫病毒、阴性对照均未检出，结果表明本发明的引物组合制备的试剂盒具有良好的特异性。
实施例6
1、用本发明的试剂盒和目前现有的国家标准牛结节性皮肤病诊断技术（GB/T39602-2020）中的实时荧光PCR检测方法同时检测28份临床样品（其中16份为阳性样品，12份为阴性样品），分析两种检测结果的符合率。
2、样品采集：病死牛羊，取皮肤结节、肺脏、肌肉组织或淋巴结等；待检牛羊，用注射器取血5mL、用棉签蘸取环境拭子放入装有PBS的1.5mL离心管中。采集的样品2~8℃ 保存，送实验室检测（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料）。
3、样品处理：每份样品分别处理。
（1）按照Takara Min BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 操作说明书从样品中提取DNA。
（2）重组质粒puc57- ORF068作为阳性对照，无DNA酶蒸馏水作为阴性对照，阳性对照与阴性对照无需处理。
4、LAMP反应体系：荧光反应液22μL，酶反应液1μL，样品DNA 2μL，总体积25μL。反应程序为：60℃ 40 min。
结果判定：阴性对照和阳性对照荧光扩增结果符合质量控制要求，待测样本40分钟内有明显荧光扩增曲线判定为阳性；否则判定为阴性。
5、国标中实时荧光PCR：
反应体系是：Premix Ex Taq 缓冲液15μL，正向引物1μL，反向引物1μL，MGB探针0.5μL，去离子水2.5μL，DNA 5μL，总体积25μL。反应程序为：95℃ 预变性3 min；95℃ 10s，58℃ 34s，循环数为45，每循环58℃时采集FAM通道中的荧光信号。
结果判定：当被检样本出现S型扩增曲线，Ct值＜40.0判为阳性；无特异性扩增曲线或Ct值＞45.0判为阴性；40.0≤Ct值≤45.0的样本应重做，重做结果无特异性扩增或Ct值＞45.0则为阴性；反之，有Ct值且有明显扩增曲线则为阳性。
6、检测结果显示，用所建立的LAMP荧光检测方法与国家标准中牛结节性皮肤病病毒实时荧光PCR方法检测结果一致（表4），符合率为100%。但LAMP扩增时间比荧光定量PCR短，LAMP方法在40min内完成扩增，实时荧光PCR扩增时间约为78min，证明本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、检测方便快捷、结果准确可靠。
Figure 353553DEST_PATH_IMAGE004
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京市动物疫病预防控制中心
<120> 一种同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP引物组、试剂盒和检测方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tattaaaacc agcagcatct 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atagaatcat cctttgtgat g 21
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttccgtgagg aatatagaaa tcttagttta aaatggcgat gtcc 44
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttcaaccat ttgcgcctaa atgctttata ggattaccgc ta 42
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttacccattg gtcagggaat 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttctgcagaa atgaggttaa taagt 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcatataagt tccttatatg gga 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgttatcatc ttctataaca acaa 24
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acaaagagca ttacataatc cagaaaaagg tagaaaaatc aggagg 46
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagaggcaaa aagttctatt gcgcagaatt ttttatatcc gcatcg 46
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actttagttt atggaaatcg tatgc 25
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaccctaaaa cttcagaaga 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgtccatcta ttaatatcca tct 23
<210> 14
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccatgtcttt gtaacttact cagaagccaa aaaaattacc atatcaagg 49
<210> 15
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggatgcacaa tagtatatgt tggaatccca tagataaaaa atgatctc 48
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcagctccag gaacacat 18
<210> 17
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggaagcag tatctatgga taaaccattt atgtattttg acgaaataga taacgaatta 60
gaatatgacc ctaaaacttc agaagaaaag ccaaaaaaat taccatatca aggtcaatta 120
aaattacttc tttgtgaatt attttttctg agtaagttac aaagacatgg aatattggat 180
ggatgcacaa tagtatatgt tggatcagct ccaggaacac atattaaata cttaagagat 240
cattttttat ctatgggatt agttataaga tggatattaa tagatggacg acaacatgac 300
acaattttaa atgggcttag agacgtgacg ttaataacta agtttgtaga tgaaagttat 360
ataagagttt taaaaaaaca gctatatcaa tcaaaaatag ttcttatttc tgatgttaga 420
tccaaaagag gaggaaacga acctagcaca tttgatttat taagcaatta cgcattacaa 480
aatataatgg taagtatatt aaaaccagca gcatctagtt taaaatggcg atgtccattc 540
cctgaccaat gggtaaaaga tttctatatt cctcacggaa atgaaatgct tcaaccattt 600
gcgcctaaat attctgcaga aatgaggtta ataagtattt atagcggtaa tcctataaag 660
cttagatgca tcacaaagga tgattctata aaatatgaaa aaaagatgtt ttattttaat 720
aaaataataa ggaatagaat tattataaac tttgattatt caaatcaaga atatgacttt 780
tatcacatgt ataatatgtt a 801

Claims (2)

1.一种非诊断和治疗目的的同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP荧光检测方法，包括以下步骤：利用同时检测若干种羊痘病毒属病毒的LAMP试剂盒和待测样品DNA构建反应体系，置于60℃恒温反应，待测样品有明显扩增曲线，则判断为阳性，无明显扩增曲线，判断为阴性；
所述LAMP试剂盒，包括LAMP引物组，所述LAMP引物组由外引物对、内引物对和环引物对组成；
所述外引物对包括F3和B3，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述内引物对包括FIP和BIP，所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述环引物对包括LF和LB，所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述羊痘病毒属病毒为山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒；
所述LAMP试剂盒还包括荧光反应液和酶反应液；所述荧光反应液的组分包括：10×Thermopol buffer、MgSO4、甜菜碱、dNTPs和荧光染料和LAMP引物组；
所述酶反应液包括Bst DNA聚合酶；
所述荧光染料包括SYTO9；
所述LAMP试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；
所述反应体系以25μL计，包括以下终浓度的组分：1×Thermopol buffer，7mmol/LMgSO4，0.5mmol/L甜菜碱，1.2mmol/L dNTPs，0.04mmol/L荧光染料，0.2μmol/L F3，0.2μmol/L B3，1.6μmol/L FIP，1.6μmol/L BIP，0.8μmol/L LF，0.8μmol/L LB和10 U /μL BstDNA 聚合酶。
2.根据权利要求1所述LAMP荧光检测方法，其特征在于，还包括利用阳性对照和阴性对照分别构建相同的反应体系，置于60℃恒温反应40min。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102373302A (zh) * 2011-11-29 2012-03-14 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法
CN103215384A (zh) * 2013-05-04 2013-07-24 中国农业科学院兰州兽医研究所 鉴别检测绵羊痘病毒和山羊痘病毒的试剂盒
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102373302A (zh) * 2011-11-29 2012-03-14 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法
CN103215384A (zh) * 2013-05-04 2013-07-24 中国农业科学院兰州兽医研究所 鉴别检测绵羊痘病毒和山羊痘病毒的试剂盒
CN103484563A (zh) * 2013-05-04 2014-01-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 检测绵羊痘病毒的试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Capripoxviruses;Amaresh Das;《J Clin Microbiol.》;20120222;第50卷(第5期);1613-1620 *
羊痘病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立;黄鹤;《中国畜牧兽医》;20120620;第39卷(第6期);72-75 *

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