KR102193749B1

KR102193749B1 - 인플루엔자 바이러스 아형 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 인플루엔자 바이러스 아형 검출 방법

Info

Publication number: KR102193749B1
Application number: KR1020200107035A
Authority: KR
Inventors: 송민석; 최영기; 백윤희; 안수정
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2020-12-21
Also published as: KR20200103593A

Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus) 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 인플루엔자 바이러스 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 역전사고리매개 등온증폭법(RT-LAMP)에 의하여 인플루엔자 바이러스를 빠른 시간에 높은 정확도로 검출할 수 있는 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 인플루엔자 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.

Description

인플루엔자 바이러스 아형 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 인플루엔자 바이러스 아형 검출 방법{primer set and detection method for influenza virus subtype}

본 발명은 인플루엔자 바이러스 아형 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 인플루엔자 바이러스 아형 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 역전사고리매개 등온증폭법에 의하여 인플루엔자 바이러스 아형을 빠른 시간에 높은 정확도로 검출할 수 있는 인플루엔자 바이러스 아형 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 인플루엔자 바이러스 아형 검출 방법에 관한 것이다.

인플루엔자는 매년 전 세계적으로 확산되어 약 3~500만건의 중증 질환과 약 25만~50만 건의 사망을 초래한다.

인플루엔자 바이러스는 바이러스성 호흡기 질환의 주요 원인 병원체로서 NP(nuleocapsid)와 M(matrix) 단백질의 항원성 차이에 의해 크게 A, B 및 C형으로 구분된다. 이 중 A형은 다시 HA(hemagglutinin) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H16형까지, NA 단백질 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류되고 (참고문헌: Wiely DC and Skehel TT, Ann Rev Biochem, 56:365-394, 1987), 사람에서는 주로 A/H1N1형, A/H3N2형과 B형이 유행한다.

2009년 A(H1N1) pdm09가 확인된 이후로 H1N1은 매년 약 25만에서 50만명의 사망자를 발생시키며 사람에서 계속 순환하고 있다. 또한 WHO의 보고서에 따르면 A(H3N2)와 B 바이러스가 전 세계적으로 공동 순환하고 있다.

또한 H5, H7의 아형과 같은 조류 인플루엔자가 지난 몇 년 동안 발생하고 있는데, H5N1과 H5N6의 사람 감염 사례에서 절반이 넘는 높은 사망률을 보였다. 또한 중국에서 H7N9 바이러스 사람 감염 사례가 2013년에 보고되었으며. 현재 사람 감염이 1,500건 이상으로 급격히 증가했다.

인플루엔자는 동절기 주요 급성 호흡기 질환의 병원체로서 호흡기를 통한 전염으로 높은 전파력을 가지며, 특히 인플루엔자 A의 경우는 조류를 포함하여 가축, 사람 등에 감염이 가능하여 교차 감염이 빈번하다. 인플루엔자는 음성가닥 RNA 바이러스로서 게놈 복제시 돌연변이가 빈번하고, 게놈이 8개의 분절된 형태를 포함하고 있어서 하나의 숙주에 동시 감염시 서로 다른 게놈이 재배열되어 새로운 인플루엔자가 발생될 수 있다. 이와 같은 결과로 인플루엔자는 매 발생시 마다 새로운 바이러스로 나타날 수 있으며, 따라서 백신의 효능이 오래 지속되지 못하는 단점이 있다.

인플루엔자는 뉴라미니다아제 저해제(neuraminidase inhibitor)와 같은 항 바이러스제를 이용하여 치료하는데, 뉴라미니다아제 저해제는 감염 후 처음 48시간 이내에 복용해야한다. 이를 위해서는 인플루엔자의 신속하고 정확한 진단이 필요하며, 이러한 신속하고 정확한 진단을 통해서 바이러스 확산을 완화시킬 수 있다.

동물 집단에 감염되는 인플루엔자 바이러스에 대한 효율적인 감시활동을 위해서는 특이도와 민감도가 높으면서도 일선 실험실에서 편리하게 이용할 수 있는 이용자-친화적인 진단법의 개발 및 적용이 필요하다. 세계보건기구나 세계동물보건기구에서는 인플루엔자 바이러스 진단법으로 전통적인 바이러스 배양법과 분자생물학적 진단법을 공통적으로 추천하고 있으나, 최근에는 대부분의 실험실에서 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)이나 real-time RT-PCR(rRT-PCR)과 같은 PCR 기반 유전자진단법을 1차적인 진단법으로 이용하고 있다[(Kim등, Virol J(2013), 10, 85), (OIE(2012) Manual of diagnostic test and Vaccines for terrestrial Animals), (WHO(2010), Pandemic (H1N1)2009~update100)]. 그러나 현재 상용되고 있는 PCR 기반 진단법들은 검사 비용이 많이 들고, 특수한 장비와 시약을 필요로 하기 때문에 전문 진단 기관 이외 일선 임상 진단실이나 현장에서는 쉽게 적용하기 어려운 단점이 있다. 따라서 이를 극복할 수 있는 새로운 방식의 유전자진단법에 대한 개발이 다각도로 진행되어 왔다(Sakurai와 Shibasaki, 2012, Viruses 4: 1235~1257).

유전자 분석 기술의 발달로 최근에는 분리된 인플루엔자 바이러스에 대한 전체 게놈 분석이 이루어지고 있으며, 국내에서는 질병관리본부에서 운영하는 인플루엔자 유전정보 데이터베이스에서 쉽게 그 정보를 확인할 수 있다. 실시간 PCR을 이용한 인플루엔자 진단법은 인플루엔자의 타입별로 A, B를 구분하고 인플루엔자 A의 경우는 2차로 헤마글루티닌 유전자를 이용한 아형 구분을 하고 있다. 이것은 인플루엔자의 정확한 아형 분석을 위해서 2번의 분석이 요구되고 있다.

그러나 이와 같은 기존 인플루엔자 바이러스의 핵산 검출을 통한 진단 방법은 전문 인력과 고가의 열순환 기계가 필요하다는 문제점이 있었다.

이를 극복하기 위해 최근 역전사 고리 매개 등온 증폭법(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification)이 개발되었다. 최근 RNA 바이러스를 진단하는데 유용하다고 여겨지는 Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification(RT-LAMP)방법은 특이성과 민감성이 높으며 빠른 시간 안에 바이러스 핵산을 검출할 수 있는 방법이다.

등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)은 반응 온도에 변화를 주어야 하는 기존의 PCR 기반 진단법과 달리 일정한 온도조건에서 유전자를 증폭할 수 있는 새로운 방식의 유전자진단법으로써 고도의 특이도와 민감도를 가지면서도 신속하게 목표 유전자를 증폭할 수 있는 것으로 알려져 있다(Notomi등, 2000, Nucleic Acids Res 28, 63-69). 특히 등온조건에서 반응이 이루어지는 LAMP의 특성상 일정한 온도가 유지되는 항온 수조만 있어도 활용이 가능하기 때문에, 향후 고가의 특수 장비가 없는 일선 임상 진단실이나 임상 현장에서의 간편 진단법으로도 응용될 수 있다.

그러나 대부분 인플루엔자 바이러스 RT-LAMP 방법은 특정한 아형, 혹은 제한된 아형에 대해서 진단하기 때문에 다양한 아형의 바이러스와 새로운 바이러스를 진단하는 것이 필요하다.

본 발명의 목적은 다양한 아형의 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 프라이머를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 조성물을 이용하여 인플루엔자 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해 본 발명은

서열번호 1 및 2로 이루어진 외부 프라이머 세트;

서열번호 3 및 4로 이루어진 내부 프라이머 세트; 및

서열번호 5 및 6으로 이루어진 루프 프라이머 세트;를 포함하는, 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

(서열번호 1) 5'-CAGGAAGAGTAAAACATACTGAGGA-3'

(서열번호 2) 5'-GATTCGCAAGGCCCTGTT-3'

(서열번호 3) 5'-GGTCTTTTTGCTGTGTAACTGTT-GCACATGCGGATTTGCCAG-3'

(서열번호 4) 5'-GTGGAGACTGATACAGCGGAA-TGCTTCCATCATTTGGTCTGG-3'

(서열번호 5) 5'-CTACAGGCACATTCTATGGTT-3'

(서열번호 6) 5'-ATAAGATTGATGTGCACA-3'를 제공하고

또한, 본 발명은

서열번호 7 및 8로 이루어진 외부 프라이머 세트;

서열번호 9 및 10으로 이루어진 내부 프라이머 세트; 및

서열번호 11 및 12로 이루어진 루프 프라이머 세트;를 포함하는, 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

(서열번호 7) 5'-AGCAAGAAGTTCAAGCCG-3'

(서열번호 8) 5'-CGTGAACTGGTGTATCTGAA-3'

(서열번호 9) 5'-GGCTCTACTAGTGTCCAGTAATAGT-AAATAGCAATAAGACCCAAAGTG-3'

(서열번호 10) 5'-ATAACATTCGAAGCAACTGGAAATC-TGATAATACCAGATCCAGCATT-3'

(서열번호 11) 5'-TCTCCCTTCTTGATCCC-3'

(서열번호 12) 5'-TAGTGGTACCGAGATATGCA-3'를 제공하며

또한 본 발명은

서열번호 13 및 14로 이루어진 외부 프라이머 세트;

서열번호 15 및 16으로 이루어진 내부 프라이머 세트; 및

서열번호 17 및 18로 이루어진 루프 프라이머 세트;를 포함하는, 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

(서열번호 13) 5'-GGGGTTACTTCAAAATACGAAG-3'

(서열번호 14) 5'-GTTGCCAATTTCAGAGTGTT-3'

(서열번호 15) 5'-GAGTGATGCATTCAGAATTGCATTT-TGGGAAAAGCTCAATAATGAGA-3'

(서열번호 16) 5'-AATGGAAGCATTCCCAATGACA-GCTTAACATATCTGGGACAGG-3'

(서열번호 17) 5'-CCAATGGGTGCATCTGA-3'

(서열번호 18) 5'-AACCATTCCAAAATGTAAAC-3'제공하고,

또한, 본 발명은

서열번호 19 및 20으로 이루어진 외부 프라이머 세트;

서열번호 21 및 22로 이루어진 내부 프라이머 세트; 및

서열번호 23 및 24로 이루어진 루프 프라이머 세트;를 포함하는, 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

(서열번호 19) 5'-GCTATAGCAGGTTTTATAGAGG-3'

(서열번호 20) 5'-GCCTCAAACTGAGTGTTCAT-3'

(서열번호 21) 5'-ACTCCCCTGCTCATTGCTAT-GGATGGCAGGGAATGGTA-3'

(서열번호 22) 5'-GGTACGCTGCAGACAAAGAAT-TGAGTTGACCTTATTGGTGAC-3'

(서열번호 23) 5'-GGTACCCATACCAACCATC-3'

(서열번호 24) 5'-CCACTCAAAAGGCAATAGATGGA-3'를 제공하며

또한, 본 발명은

서열번호 25 및 26으로 이루어진 외부 프라이머 세트;

서열번호 27 및 28로 이루어진 내부 프라이머 세트; 및

서열번호 29 및 30으로 이루어진 루프 프라이머 세트;를 포함하는, 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

(서열번호 25) 5'-GCGGGTTTCATTGAAAATGG-3'

(서열번호 26) 5'-CTACCTCATTGAATTCATTGTCT-3'

(서열번호 27) 5'-TCCCTCTCCCTGTGCATTCT-ATGGGAAGGCCTAATTGATG-3'

(서열번호 28) 5'-ACTGCTGCAGATTACAAAAGCAC-TGGTTGGTTTTTTCTATAAGCC-3'

(서열번호 29) 5'-TCTGAAACCATACCAAC-3'

(서열번호 30) 5'-TCAATCGGCAATTGATCAAATA-3'를 제공한다.

본 발명에 의한 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트는 특정 인플루엔자 아형의 바이러스 RNA를 표적으로 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA, RNA 표적의 복합도뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 조건에 의존한다.

본 발명에서 "검출"은 화학 분석에서, 시료 속에 화학종이나 미생물 따위의 존재 유무를 알아내는 것으로, 본 발명에서는 인플루엔자 바이러스를 검출하는 것을 의미한다.

본 발명에 의한 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트는 외부 프라이머, 내부 프라이머 및 루프 프라이머의 3쌍으로 이루어져 있다.

본 발명에 의한 인플루엔자 바이러스 검출용 반응용액 조성물에는 내부 프라이머 세트, 외부 프라이머 세트 및 루프 프라이머 세트의 농도가 인플루엔자 바이러스 B, H1, H3 아형 검출의 경우 3 내지 7 uM, 35 내지 45 uM, 8 내지 12 uM의 농도로 각각 함유될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 내부 프라이머 세트, 외부 프라이머 세트 및 루프 프라이머 세트는 5 uM, 40 uM, 및 10 uM의 농도로 각각 함유될 수 있다. 한편, 인플루엔자 바이러스 H5, H7 아형 검출의 경우 3 내지 7 uM, 75 내지 85 uM 및 3 내지 7 uM의 농도로 각각 함유될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 내부 프라이머 세트, 외부 프라이머 세트 및 루프 프라이머 세트는 5 uM, 80 uM, 및 5 uM의 농도로 각각 함유되는 것이 인플루엔자 바이러스의 효율적인 검출을 위해 바람직하다.

본 발명의 각 프라이머에는 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지를 추가 구성할 수 있다. 검출용 표지는 프라이머에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등일 수 있으며, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 및 NED 등이 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

또한, 본 발명에 의한 프라이머 세트는 역전사고리매개등온증폭법 (Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP)에 이용하기 위한 것이며, RNA를 대상으로 역전사(reverse transcription, RT) 과정을 먼저 수행하여 만들어진 cDNA를 이용하여 2차적으로 LAMP법을 수행할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

역전사고리매개 등온증폭법(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP)은 기존의 PCR과는 달리 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사 시간이 단축될 뿐만 아니라 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서, 전문 진단은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단이나 현장 진단용 등으로 이용 가능하다.

본 발명에 있어서, "RT-LAMP"는 박테리아 또는 바이러스로 야기된 질병을 진단하고, PCR의 단점을 보완한 진단법으로, PCR과는 달리 일정한 온도에서 어닐링(annealing) 및 신장(extention)이 가능하여 온도 변환이 필요하지 않으며, 일정한 온도조건에서 증폭시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 인플루엔자 B형 바이러스 검출용 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 RT-LAMP 프라이머가 인플루엔자 바이러스 RNA의 NA 분절 서열 856 내지 1069에 결합하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 인플루엔자 A H1형 바이러스 검출용 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 RT-LAMP 프라이머가 인플루엔자 바이러스 RNA의 HA 분절 서열 619 내지 804에 결합하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명에 의한 인플루엔자 A H3형 바이러스 검출용 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 RT-LAMP 프라이머가 인플루엔자 바이러스 RNA의 HA 분절 서열 841 내지 1030에 결합하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명에 의한 인플루엔자 A H5형 바이러스 검출용 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 RT-LAMP 프라이머가 인플루엔자 바이러스 RNA의 HA 분절 서열 1048 내지 1229에 결합하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명에 의한 인플루엔자 A H7형 바이러스 검출용 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 RT-LAMP 프라이머가 인플루엔자 바이러스 RNA의 HA 분절 서열 1036 내지 1237에 결합하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 조성물에는 역전사고리매개등온증폭을 위한 중합효소(polymerase), dNTP혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 또는 반응완충액(buffer)이 더 함유될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 RNA 바이러스이기 때문에 증폭을 위해서는 역전사(reverse transcription)과정이 추가된 역전사고리매개등온증폭법(RT-LAMP)이 이용되어야 한다. 따라서 기존의 고리매개등온증폭법(LAMP)에서 주로 사용되는 Bst polymerase 대신 보다 빠른 증폭 능력과 강력한 역전사효소능을 가지고 있는 GspSSD DNA polymerase를 함유하는 것이 바람직하다.

검출의 편의성을 높이기 위해 프라이머에 검출용 표지를 추가하거나 별도의 검출용 표지 화합물을 사용할 수 있다. 이들 중에서도 본 발명에서는 작업의 용이성, 검출 민감도 등을 고려하여 EvaGreen과 같은 fluorescent DNA binding dye, 지시약을 사용하는 것이 바람직하다.

이 경우 반응액 중 형광염색제를 실시간으로 검출할 수 있는 장비를 이용하여 별도의 전기영동(electrophoresis)이나 SYBR Green I 등의 추가 없이 실시간으로 증폭을 확인하고, anneal peak를 통해서 표적서열의 증폭 여부를 확인할 수 있다. 형광염색제를 검출할 수 있는 장비 중에는 현재 휴대가 용이하도록 가볍고 작은 크기로 이루어진 장비들이 있어 이러한 장비를 이용하여 본 발명의 검출방법을 수행하면 야외에서도 즉시 인플루엔자 바이러스 검출이 가능하다.

본 발명에 의한 상기의 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물에는 반응용액 조성물에 역전사고리매개등온증폭을 위한 중합효소(polymerase), dNTP 또는 반응완충용액이 함유되어 있지 않을 경우, 이들이 별도로 포함될 수 있으며, 이외에도 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하는데 부수적으로 필요한 도구나 시약 등이 더 포함될 수 있다.

구체적으로 본 발명에 의한 상기의 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물에는 pH의 변화에 따라 색상이 변화하는 지시약을 더 포함하는 것이 가능하고, 상기 지시약은 페놀레드일 수 있다.

또한, 본 발명은

시료의 RNA를 추출하는 단계;

상기 RNA를 주형으로 역전사반응을 수행하여 전체 cDNA(total cDNA)를 합성하는 단계;

상기 cDNA를 주형으로 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및

상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에 의한 인플루엔자 바이러스 검출 방법에서 상기 등온증폭반응은 60℃ 내지 65℃에서 40분 내지 60분동안 수행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 인플루엔자 바이러스 검출 방법에서 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 육안으로 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 인플루엔자 바이러스 검출 방법에서 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 지시약의 색상 변화에 의해 증폭 산물을 검출하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 지시약으로 페놀 레드를 사용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 의한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는 1개의 아형 검출을 위한 프라이머 세트뿐만 아니라, 본 발명에 의한 5개의 아형 중 필요에 따라 2개 이상의 복수개의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트가 모두 포함되는 것이 가능하다.

본 발명에 의한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하는데 부수적으로 필요한 도구나 시약 등이 더 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는 온도 조절이 가능한 휴대용 장치를 포함할 수 있다. 구체적으로 60℃ 내지 65℃의 온도를 유지할 수 있는 휴대용 텀블러, 휴대용 1회용 발열 장치, 휴대용 전기 발열장치 등을 더 포함하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명에 의한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는 밀폐된 공간에 철을 수용하고, 철의 산화 반응에 의해 발열하는 휴대용 열원을 더 포함하는 것이 가능하다. 구체적으로 등온증폭반응이 수행되는 60℃ 내지 65℃의 온도를 유지할 수 있는 시중에서 판매되는 핫팩, 손난로 등을 더 포함하는 것이 가능하다.

본 발명에 의한 인플루엔자 아형 검출을 위한 역전사 고리 매개 등온 증폭법은 타켓 유전자 부위의 뉴클레오타이드 서열에 대한 특이적인 프라이머 세트를 통해 현장에서의 빠른 진단을 가능하게 한다.

기존의 역전사 고리 매개 등온 증폭법은 반응이 끝난 후 염색 시료를 추가해주거나 다른 장비를 통해 증폭을 확인하는데, 본 발명은 반응이 끝나는 즉시 육안으로 색 변화를 통해 결과를 확인할 수 있다.

또한 본 발명에 의한 역전사 고리 매개 등온 증폭법은 등온에서 일어나는 반응으로 열 순환기기와 같은 고가의 장비 없이 등온을 유지할 수 있는 장비를 사용할 수 있으므로 경제적으로 인플루엔자 아형을 검출할 수 있다.

이러한 인플루엔자 바이러스의 빠른 검출은 빠른 치료를 가능하게 하고 이는 공동체에서 인플루엔자의 확산을 방지할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의하여 역전사고리매개 등온증폭법을 이용한 인플루엔자 바이러스 아형 검출 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의하여 역전사고리매개 등온증폭법을 이용한 인플루엔자 바이러스 아형 검출 반응 결과를 2% 아가로오스 겔 전기영동 결과와 대비한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의하여 인플루엔자 바이러스 다른 아형과 인간 호흡기 질병 바이러스에 대한 역전사 고리 매개 등온 증폭법과 바이러스 존재 유무 확인을 위한 one-step 역전사 중합효소 연쇄반응법을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의하여 RT-LAMP(a), one-step 역전사중합효소연쇄반응법(b), real time 역전사중합효소연쇄반응법(c)의 민감도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의하여 RT-LAMP(a), one-step 역전사중합효소연쇄반응법(b), real time 역전사중합효소연쇄반응법(c)의 민감도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 의하여 전기의 인가없이 RT-LAMP에 요구되는 온도 조건을 만족시킬 수 있는 휴대용 텀블러를 이용한 RNA증폭 단계를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> Influenza virus 검출을 위한 표적 부위 선정

인플루엔자 B virus와 A virus의 H1, H3, H5, H7 subtype의 검출을 위한 프라이머를 제작하기 위하여 Influenza Virus Database (https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU)에서 B virus의 NA 유전자, A virus의 H1N1, H3N2, H5N1, H5N6, H7N9의 HA유전자의 서열을 각각 200개씩 분석하여 동일한 아형 내에서는 보존된 영역을 선별하였다.

<실시예 2> Influenza virus 특이적 프라이머 디자인

동일한 아형 내에서는 보존된 영역이되 다른 아형과는 다른 부위를 선별하여 RT-LAMP를 위한 프라이머를 제작하였다.

5종류의 프라이머 세트는 각각 2개의 외부 프라이머(F3, B3), 2개의 내부 프라이머(FIP, BIP), 2개의 루프 프라이머(LB, LF)를 포함한다.

<실시예 3> 역전사고리매개 등온증폭법의 특이도 측정

인플루엔자 바이러스 아형 검출을 위한 역전사 고리 매개 등온 증폭법에 사용할 계절성 인플루엔자 바이러스인 B, H1N1, H3N2 아형과 최근 사람에게서 순환하고 있는 H5N1, H5N6, H7N9 아형의 RNA를 추출하였다.

사용한 해당 스트레인은 다음과 같다:

B/Brisbane/60/2008 (Victoria lineage), B/Phuket/3073/2013 (Yamagata lineage), A/California/04/2009 (H1N1pdm), A/Perth/16/2009 (H3N2), A/Em/Korea/W149/2006 (H5N1), A/Em/Korea/w468/2014 (H5N8), A/Sichuan/26221/2014 (H5N6) and A/gyrfalcon/Washington/ 41088-6/2014 (H5N8), A/Anhui/1/2013 (H7N9)

역전사고리매개 등온증폭법 반응을 위해서 2ul의 RNA, 1ul의 외부 프라이머(F3, B3), 1ul의 내부 프라이머(FIP, BIP), 1ul의 루프 프라이머 및 5ul의 LAMP 2X Master Mix (WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix)를 혼합시켰다. 이 혼합물을 65℃에서 60분간 반응시킨 후, 반응의 종결을 위해서 80℃에서 10분간 가열하였다.

도 1에서 보는 바와 같이 튜브 내 증폭 생성물의 양성 반응은 지시약 색 변화에 의해 직접적으로 검출 가능했다. 지시약으로는 페놀레드(phenol-red)를 사용하였다. 페놀레드 용액은 pH 6.4 이하에서는 노란색, pH 7.0에서는 분홍색, pH 7.4 이상에서는 적색을 나타낸다. 음성 튜브는 분홍색을 유지하는 반면, 양성 튜브는 노란색으로 나타나므로 육안으로 결과를 확인할 수 있다.

본 발명에 의한 프라이머 세트는 각 아형에서는 보존된 영역이지만, 다른 아형과는 다른 부위를 선택하여 프라이머를 설계하였기 때문에 해당 아형에 해당하는 프라이머를 이용한 증폭에서는 교차반응이 일어나지 않고, 해당하는 아형만 양성 반응으로 검출한 것을 확인하였다(도 1).

따라서, 본 발명에 의한 계절성 인플루엔자 바이러스인 B, H1N1, H3N2 아형과 최근 사람에게서 순환하고 있는 H5N1, H5N6, H7N9 아형의 프라이머 세트를 사용할 경우 인플루엔자의 아형 별로 분석할 수 있음을 알 수 있다.

도 2에서 본 발명에 의한 역전사고리매개 등온증폭법 반응 결과를 2% 아가로오스 겔 전기영동을 이용하여 검증하였다.

<실험예 1> 인플루엔자 바이러스의 다른 아형에 대한 역전사고리매개 등온증폭법의 특이도 측정

인플루엔자 아형 검출을 위한 프라이머는 해당하는 아형만 검출하도록 설계되었으므로 인플루엔자의 다른 아형이나 다른 종류의 바이러스에 대해서는 교차반응을 보이지 않아야 한다.

이를 확인하기 위해 인플루엔자 다른 아형의 바이러스(H2, H4, H6, H8, H9, H10, H11, H12)와 인간 호흡기 질병 바이러스(human coronavirus 229E (229E), human Metapneumovirus (hMPV), human Respiratory Syncytial Virus (hRSV), Echovirus E6 (E6), Coxsackie virus B5 (B5), Echovirus E18 (E18), Enterovirus E71 (EV71), 및 Middle East Respiratory Syndrome coronavirus (MERS-CoV) )의 RNA를 추출하였고, 추출된 RNA를 이용하여 해당 바이러스의 존재유무를 확인하기 위해 one-step 역전사 중합효소 연쇄반응법을 수행하였다.

도 3에서 보는 바와 같이 one-step 역전사 중합효소 연쇄반응법의 결과는 2% 아가로오스 겔 전기영동으로 확인되었다.

one-step 역전사 중합효소 연쇄반응법에서 사용된 RNA를 이용하여 역전사 고리 매개 등온 증폭법을 수행하였다. 각 프라이머 세트는 다른 아형의 인플루엔자 바이러스나 인간 호흡기 질병 바이러스에 대해서는 교차반응을 일으키지 않고, 해당하는 바이러스에 대해서만 특이성을 보이는 것을 확인하였다(도 3).

<실시예 4> 역전사고리매개 등온증폭법의 민감도 측정

인플루엔자 바이러스 아형 검출의 민감도를 확인하기 위해 역전사 고리 매개 등온 증폭법, one-step 역전사중합효소연쇄반응법, 실시간 역전사중합효소연쇄반응법을 수행하였다.

<실시예 4-1> one-step RT-PCR의 민감도 측정

상기 실시예 3에서 추출된 정량된 바이러스의 RNA를 10배씩 희석하였다. 희석된 RNA를 사용하여 역전사 고리 매개 등온 증폭법을 수행하였다.

도 4a, 도 5a에서 역전사 고리 매개 등온 증폭법은 색깔 변화를 통해 육안으로 결과를 확인할 수 있었다(도 4a, 도 5a).

<실시예 4-2> one-step RT-PCR의 민감도 측정

비교예로서 상기 실시예 3에서 추출된 정량된 바이러스의 RNA를 10배씩 희석하고, 희석된 RNA를 사용하여 One-step RT-PCR을 실시한 뒤 전기영동 하였다(도 4b, 도 5b).

바이러스의 RNA 추출 과정은 kit의 매뉴얼을 따랐다. 바이러스는 세포에서 증식 후 CPE(cytopathic effect)를 확인한 뒤 -70℃에서 얼렸다 녹이기를 2회 반복하고 원심을 돌려 수확하였다. 바이러스 상층액으로 RNA/DNA extraction kit(Intron)을 사용하여 각 바이러스의 핵산을 추출하고 -70℃에 보관하였다.

-70℃ 에서 꺼내 녹인 RNA를 TOPscript^TM One-step RT PCR Kit (Enzynomics, Daegeon, KOREA)을 사용하여 역전사반응 55℃/30 분, DNA 변성 95℃/10분 수행 후 DNA 변성 95℃/30초, 프라이머 어닐링 60℃에서 30 초, 신장반응 72℃에서 30초의 과정을 35회 반복 후 72℃ 에서 5분의 신장반응 조건으로 One-step RT-PCR 과정을 진행한 후 그 결과는 2% 아가로오스 겔 전기영동으로 확인하였다(도 4b, 도 5b).

<실시예 4-3> real-time PCR의 민감도 측정

TOPreal^TM One-step RT qPCR Kit (SYBR Green, low Rox) (Enzynomics, Daegeon, KOREA)을 사용하여 역전사반응 55℃/30 분, DNA 변성 95℃/10 분 수행 후 DNA 변성 95℃/30초, 프라이머 어닐링 60℃에서 30초, 신장반응 72℃에서 30초의 과정을 35회 반복 후 72℃에서 5분의 신장반응 조건으로 real-time PCR 실험을 진행하고 그 결과를 도 4c, 도 5c에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이 역전사 고리 매개 등온 증폭법, one-step 역전사중합효소연쇄반응법, 실시간 역전사중합효소연쇄반응법의 민감도 비교 결과 본 발명에 의한 역전사고리매개 등온증폭법이 비교예 1의 one-step 역전사중합효소연쇄반응법과 비교예 2의 실시간 역전사중합효소연쇄반응법보다 H1N1, H3N2, H5N6, H5N8, H7N9 아형에서는 민감도가 높은 경향을 보였다.

<실시예 5> 온도조절이 가능한 휴대용 텀블러를 이용한 RT-LAMP

본 발명에 의한 역전사고리매개 등온증폭법 반응은 전사 및 증폭 cDNA를 역전시키기 위해 60℃ 내지 65℃에서 40분내지 60분 이상 동안 일정한 온도가 필요하다.

본 발명에서는 도 6에서 보는 바와 같이 온도조절이 가능한 휴대용 텀블러를 이용하여 RT-LAMP를 수행하였으며, 도 6에서 보는 바와 같이 휴대용 텀블러의 경우에도 온도가 일정하게 유지될 수 있어, 본 발명에 의한 역전사고리매개 등온증폭법 수행 결과가 아가로스 젤을 이용한 전기 영동 결과와 일치하는 것을 확인할 수 있다.

이로부터 본 발명에 의한 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus) 검출용 프라이머 세트를 이용하여 역전사고리매개 등온증폭법을 고가의 장비 없이도 등온 조건에서 수행할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> primer set and detection method for influenza virus subtype <130> DP-2017-0219-KR-1 <150> KR 10-2017-0161096 <151> 2017-11-28 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-F3 <400> 1 caggaagagt aaaacatact gagga 25 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-B3 <400> 2 gattcgcaag gccctgtt 18 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-FIP <400> 3 ggtctttttg ctgtgtaact gttgcacatg cggatttgcc ag 42 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-BIP <400> 4 gtggagactg atacagcgga atgcttccat catttggtct gg 42 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-LF <400> 5 ctacaggcac attctatggt t 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-LB <400> 6 ataagattga tgtgcaca 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-F3 <400> 7 agcaagaagt tcaagccg 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-B3 <400> 8 cgtgaactgg tgtatctgaa 20 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-FIP <400> 9 ggctctacta gtgtccagta atagtaaata gcaataagac ccaaagtg 48 <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-BIP <400> 10 ataacattcg aagcaactgg aaatctgata ataccagatc cagcatt 47 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-LF <400> 11 tctcccttct tgatccc 17 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-LB <400> 12 tagtggtacc gagatatgca 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3-F3 <400> 13 ggggttactt caaaatacga a 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3-B3 <400> 14 gttgccaatt tcagagtgtt 20 <210> 15 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3-FIP <400> 15 gagtgatgca ttcagaattg cattttggga aaagctcaat aatgaga 47 <210> 16 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3-BIP <400> 16 aatggaagca ttcccaatga cagcttaaca tatctgggac agg 43 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3-LF <400> 17 ccaatgggtg catctga 17 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3-LB <400> 18 aaccattcca aaatgtaaac 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5-F3 <400> 19 gctatagcag gttttataga gg 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5-B3 <400> 20 gcctcaaact gagtgttcat 20 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5-FIP <400> 21 actcccctgc tcattgctat ggatggcagg gaatggta 38 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5-BIP <400> 22 ggtacgctgc agacaaagaa ttgagttgac cttattggtg ac 42 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5-LF <400> 23 ggtacccata ccaaccatc 19 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5-LB <400> 24 ccactcaaaa ggcaatagat gga 23 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7-F3 <400> 25 gcgggtttca ttgaaaatgg 20 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7-B3 <400> 26 ctacctcatt gaattcattg tct 23 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7-FIP <400> 27 tccctctccc tgtgcattct atgggaaggc ctaattgatg 40 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7-BIP <400> 28 actgctgcag attacaaaag cactggttgg ttttttctat aagcc 45 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7-LF <400> 29 tctgaaacca taccaac 17 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7-LB <400> 30 tcaatcggca attgatcaaa ta 22

Claims

서열번호 1, 2, 7, 8, 13, 14, 19, 20, 25 또는 26으로 기재된 염기서열 각각으로 이루어진 외부 프라이머 세트;
서열번호 3, 4, 9, 10, 15, 16, 21, 22, 27 또는 28로 기재된 염기서열 각각으로 이루어진 내부 프라이머 세트; 및
서열번호 5, 6, 11, 12, 17, 18, 23, 24, 29 또는 30으로 기재된 염기서열 각각으로 이루어진 루프 프라이머 세트;를 포함하고,
인플루엔자 바이러스(Influenza Virus) B형, A H1형, A H3형, A H5형 및 A H7형 검출을 위한 역전사고리매개 등온증폭(Reverse Transcription Loop-mediated isothermal Amplificaiton, RT-LAMP)용 조성물로서,
서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열 각각으로 이루어진 프라이머 세트는 인플루엔자 바이러스 B형을 검출하고,
서열번호 7 내지 12로 기재된 염기서열 각각으로 이루어진 프라이머 세트는 인플루엔자 바이러스 A H1형을 검출하며,
서열번호 13 내지 18로 기재된 염기서열 각각으로 이루어진 프라이머 세트는 인플루엔자 바이러스 A H3형을 검출하고,
서열번호 19 내지 24로 기재된 염기서열 각각으로 이루어진 프라이머 세트는 인플루엔자 바이러스 A H5형을 검출하며,
서열번호 25 내지 30으로 기재된 염기서열 각각으로 이루어진 프라이머 세트는 인플루엔자 바이러스 A H7형을 검출하고,
상기 조성물은 인플루엔자 바이러스 B형, A H1형 또는 A H3형의 검출을 위해 3 내지 7 μM의 외부 프라이머 세트, 35 내지 45 μM의 내부 프라이머 세트 및 8 내지 12 μM의 루프 프라이머 세트를 포함하며,
인플루엔자 바이러스 A H5형 또는 A H7형의 검출을 위해 3 내지 7 μM의 외부 프라이머 세트, 75 내지 85 μM의 내부 프라이머 세트 및 3 내지 7 μM의 루프 프라이머 세트를 포함하는 조성물.
제 1 항의 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 B형, A H1형, A H3형, A H5형 및 A H7형 검출용 키트.
제 2 항에 있어서,
상기 검출용 키트는 휴대용 열원을 더 포함하는 것인,
인플루엔자 바이러스 B형, A H1형, A H3형, A H5형 및 A H7형 검출용 키트.
분리된 시료의 RNA를 추출하는 단계;
상기 RNA를 주형으로 역전사반응을 수행하여 전체 cDNA(total cDNA)를 합성하는 단계;
상기 cDNA를 주형으로 제 1 항에 따른 조성물을 이용하여 역전사고리매개 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계;
상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는,
인플루엔자 바이러스 B형, A H1형, A H3형, A H5형 및 A H7형 검출 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 등온증폭반응은 60℃ 내지 65℃에서 40분내지 60분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는,
인플루엔자 바이러스 B형, A H1형, A H3형, A H5형 및 A H7형 검출 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis)을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 하는,
인플루엔자 바이러스 B형, A H1형, A H3형, A H5형 및 A H7형 검출 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 지시약의 색상 변화에 의해 증폭 산물을 검출하는 것을 특징으로 하는,
인플루엔자 바이러스 B형, A H1형, A H3형, A H5형 및 A H7형 검출 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 지시약은 페놀 레드인 것을 특징으로 하는,
인플루엔자 바이러스 B형, A H1형, A H3형, A H5형 및 A H7형 검출 방법.