CN103215385B - 用于检测山羊痘病毒的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于检测山羊痘病毒的试剂盒。本发明的试剂盒中至少包括有SEQ№1、SEQ№2、SEQ№3和SEQ№4四条引物，试剂盒内还有dNTP、Tris-HC、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween20和Bst酶，以及模板DNA。本发明的引物具有特异性，在同等条件下不能扩增绵羊痘病毒的核酸，同时本发明的检测灵敏度较高，同时具有检测操作相对简单的、快速的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种兽医学的检测试剂盒，确切讲是一种用于用于检测山羊痘病毒的试剂盒。
背景技术
羊痘（Capripox，CP）包括绵羊痘、山羊痘和牛的皮肤疙瘩病，其中前两者是由绵羊痘病毒（Sheeppox virus，SPPV）和山羊痘病毒（Goatpox virus，GTPV）分别引起绵羊和山羊发生的接触性传染病。病畜体温升高，全身出现丘疹或结节、水疱、内脏病变甚至死亡，给世界养羊业造成了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其规定为法定必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。绵羊痘和山羊痘的鉴别诊断一直是研究的热点。
绵羊痘和山羊痘的鉴别诊断一直是研究的热点。研究表明，SPPV 和GTPV 基因序列同源性达到96%-97%, 仅在基因组末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差异，见：Tulman, E.R., Afonso, C.L., Lu, Z., Zsak, L., Sur, J.H., Sandybaev, N.T., Kerembekova, U.Z., Zaitsev, V.L., Kutish, G.F.,Rock, D.L., 2002. The genomes of sheeppox and goatpox viruses. J Virol. 76, 6054-6061. 。一般来说, SPPV、GTPV 具有较严格的宿主嗜性, 但有一些研究表明试这两种病毒也可发生宿主嗜性改变, 引起交叉感染，见：M.G. Garner, S.D. Sawarkar, E.K. Brett, J.R. Edwards, V.B. Kulkarni, D.B. Boyle;S.N. the Extent and Impact of Sheep Pox and Goat Pox in the State of Maharashtra, India , Tropical Animal Health and Production.2000,32(4):205-223. ,继而可能导致错误的临床诊断和获得不准确的流行病学信息, 不利于对该病的有效防控。对羊痘病毒分离株进行准确的种属鉴别有助于解决生产中遇到的这个问题, 但SPPV 和GTPV 之间抗原性具有明显交叉, 用血清学方法很难区别开来, 需通过分子生物学方法进行鉴别，见：Sheeppox and goatpox virus. World Organisation for Animal Health (2009). - Terrestrial Animal Health Code. OIE,Paris. 。准确鉴定分离株种属和弄清其来源将有助于羊痘的流行病学分析, 具有重要意义。
目前为止，基于基因序列分析的分子生物学鉴别绵羊痘病毒和山羊痘病毒的方法并不十分成熟，前期发明人的实验室通过克隆结合酶切的方法分析P32基因和GPCR基因建立了PCR-RFLP方法，见：颜新敏,吴国华,李健等.山羊痘病毒感染绵羊的诊断及其基因的分子分析.中国兽医科学,2011,41(01):14.，但是该方法需要专用的PCR仪器和酶切操作，相对来说比较繁琐且费用较多，不利于生产实践中的实际应用。而国内肖雯等建立的绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR方法扩增灵敏度仅为1.71×106 copies/μL 的GTPV基因组模板，且同样需要专门的PCR仪器，因此该方法在生产实践中也存在这局限性，见：肖雯，聂福平，王昱 等.绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR检测方法的建立及应用.中国预防兽医学报.2012, 7(7):551-554. 。康文玉等建立了可检测羊痘病毒属的实时定量PCR方法，该方法以PCR为靶基因设计引物和探针进行绵羊痘病毒和山羊痘病毒的检测，见康文玉,徐自忠,花群义 等.羊痘病毒实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立.中国兽医科学,2006.36(07):529-533.。程振涛、姚俊等也分别基于山羊痘病毒基因组不同的基因片段建立了检测山羊痘病毒的实时定量PCR，见：程振涛,岳筠,李永明 等.山羊痘病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立与应用.生物工程学报, 2009,25; 25(3): 464-47. 姚俊,永军,彭海生 等.山羊痘病毒SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立，动物医学进展，2012, 33(7)：32-39.。但是以上方法均需要专用的价格昂贵的荧光定量PCR仪，而且对操作者要求相对较高，因此在实际生产中还是有一定的局限。
环等温介导技术（loop mediated isothermal amplication, LAMP）由于其具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被广泛应用于各种疾病病原的检测中。尽管国内外均已有人针对羊痘病毒属基因设计并建立了能够检测羊痘病毒属的Lamp方法，如美国科学家Amaresh Das等人建立了灵敏度比较高的Lamp方法，见：Amaresh Das, Shawn Babiuk,and Michael T. McIntosh.Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Capripoxviruses. Journal of Clinical Microbiology.2012, 1613–1620. ，该研究靶向SPPV、GTPV和LDSV三种病原共有的保守的VP39基因；国内重庆出入境检验检疫局李应国等人也建立了检测羊痘病毒属的Lamp诊断试剂盒，见：羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法，专利申请公开号：CN102373302A，该方法也是以SPPV、GTPV和LSDV三种病原共有的基因组1119272bp-120322bp保守序列为靶标基因。可见上述已公布的方法或者试剂盒不能够区别出同属不同种的病毒，也就是说不能够把山羊痘病毒属从羊痘病毒书中区别开来。
发明内容
本发明提供一种用于检测山羊痘病毒的试剂盒。
本发明的用于检测山羊痘病毒的试剂盒中至少包括有四条引物，分别是SEQ ID№1、SEQ ID №2、SEQ ID №3和SEQ ID №4，所涉及的序列见序列表及后叙内容。
为方便使用，在本发明的用于检测山羊痘病毒的试剂盒内还可放置有dNTP 、Tris-HC、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween 20和Bst 酶，以及模板DNA。
本发明是一种用于检测山羊痘病毒的LAMP检测试剂盒，其相应的检测是应用特定的引物进行LAMP扩增, 环等温介导技术（loop mediated isothermal amplication, LAMP）具有快速、简便、无需特殊仪器等优点。采用本发明试剂盒内的引物可以特异性扩增山羊痘病毒核酸，在进行检测时可以对被检样品进行扩增，然后根据扩增产物的核酸电泳检测到是否有特异性条带确定被检样品是否带有山羊痘病毒。本发明的引物具有特异性，在同等条件下不能扩增绵羊痘病毒的核酸，同时本发明的检测灵敏度较高，同时具有检测操作相对简单、快速的优点，可在羊痘病毒流行病学研究中应用及疾病的防控中应用。
本发明中设计选取山羊痘病毒基因组的反向末端重复序列ITR区为靶基因，专门设计了只能匹配山羊痘病毒而不能匹配山绵羊痘病毒的特异性Lamp引物。本发明的试剂盒能够检测山羊痘病毒的试剂盒能够快捷高效灵敏的检测出山羊痘病毒，而不与同属的绵羊痘病毒发生交叉反应。因此，本发明可快速特异性地从病料中或者培养的细胞毒中检测出山羊痘病毒，从而判定是山羊痘病毒而不是绵羊痘病毒或别的病原体感染。而且本发明涉及的试剂盒最低可检测出1.045×106个拷贝的模板，灵敏度高于同类能区分检测出山羊痘病毒的分子生物学方法中的双重PCR方法和PCR-RFLP方法，且不需要使用专门的PCR仪和DNA酶，因此在使用成本和时间上都占有一定的优势。
附图说明
附图1为山羊痘病毒lamp引物扩增温度梯度优化，扩增60min后核酸电泳检测图，其中60℃、62℃和64℃均有扩增条带产生，66℃和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的山羊痘病毒lamp引物扩增温度可选择60℃、62℃和64℃中任意一个温度。
附图2为山羊痘病毒lamp引物扩增在62℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果。其中扩增60min后均有扩增条带产生，扩增30min、45min、和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的通用山羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增时间可在60min之后扩增出特异性条带。
图3为以羊的不同病原体基因组为模板，以山羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增60 min后核酸电泳检测结果。其中M表示100bp DNA Ladder marker；1为山羊痘病毒扩增产物；2为绵羊痘病毒扩增产物；3为羊水泡病毒扩增产物；4为支原体扩增产物；5为衣原体扩增产物；6为螺旋体扩增产物；7为弓形虫扩增产物；8为羊泰勒虫扩增产物；9为羊巴贝斯虫扩增产物；10为阴性对照。由图可见，山羊痘病毒lamp引物特异性扩增出了山羊痘病毒基因片段，而其他病原体均无特异性产物产生，阴性对照组无条带产生，说明山羊痘病毒lamp引物特异性很高。
图4 为山羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果,扩增时间为60min。其中M代表100bp DNA marker；1为107个拷贝，2为106个拷贝；3为105个拷贝，4为104个拷贝；5为103个拷贝，6为102个拷贝，7为101个拷贝，8为100个拷贝，9为10-1个拷贝，10为10-2个拷贝，11为阴性对照。由图可见，107-104个拷贝的模板均有特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。对照组无条带产生，此图可看出本发明所设计的山羊痘病毒lamp引物在62℃下，扩增60min之后最少可检出104个拷贝的模板。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细解说。
1. 序列的制备
本发明的扩增引物应用相关的引物设计软件对羊痘病毒基因组反向重复末端（1-2000bp内）设计，再从获得的数百对引物中选择评分较高的引物，再将设计好的序列发送至南京金斯瑞生物工程有限公司进行5’端修饰合成得到。最终确定的这些序列是：
SEQ №1：ACCAAAACAAATAATCAGAGATG，在本发明中被命名为GTPV F3；
SEQ №2：CCTAATCCATTTAAGACACTACG，在本发明中被命名为GTPV B3；
SEQ №3：AAGATGTCTTCCGGTAACTATGTCT-GCGGTTGTGATATCGTCA，在本发明中被命名为GTPV FIP
SEQ №4：CCGAACTTGTTATTTCTTGTGCTT-CACAATAAGGAACCACCTAGA，在本发明中被命名为GTPV BIP。
2．病毒基因组提取
将Vero细胞接种细胞培养瓶，单层细胞长至80%以上融合后，接种羊痘病毒病毒，37℃孵育1h后弃去毒液。加入细胞维持液含有1%胎牛血清DMEM，37℃5%CO2培养，定期观察细胞病变（CPE），待90%以上细胞出现CPE后收毒。将病毒反复冻融3次，置-20℃冰箱保存备用。使用TaKaRa 公司DNA提取试剂盒提取细胞毒株中的DNA，获得的病毒DNA即可用于检测。
3.Lamp扩增条件优化
以上一步骤提取纯化的病毒DNA 为模板进行扩增，实验体系如下：
F3 0.2μM
B3 0.2μM
FIP 1.6μM
BIP 1.6μM
dNTP 1.4mM(每种)
Tris-HCl 20mM
KCl: 10mM
(NH4)2SO4 10mM
MgSO4 4mM
Tween 20 0.2%
Bst 酶 8U
模板DNA 2μL
3.1反应温度的优化
在进行lamp引物的反应温度的确定时，按照上述体系加入反应物。以山羊痘病毒基因组为模板，反应温度设为 60℃、62℃、64℃的水浴锅或PCR仪中进行，反应时间为60 min，结束后 80℃加热 2 min，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。检测结果见图1.
检测结果显示，山羊痘病毒lamp引物扩增温度梯度优化，扩增60min后核酸电泳检测结果。其中60℃、62℃和64℃均有扩增条带产生，66℃和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的山羊痘病毒lamp引物扩增温度可选择60℃、62℃和64℃中任意一个温度。
3.2 反应时间的优化
在进行lamp引物的反应时间的确定时，按照上述体系加入反应物。以山羊痘病毒基因组为模板，反应温度设为 62℃的水浴锅或PCR仪中进行，反应时间为30~60 min，结束后 80℃加热 2 min，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。其检测结果见图2。
检测结果显示，山羊痘病毒lamp引物扩增在62℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果。其中扩增60min后均有扩增条带产生，扩增30min、45min、和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的通用山羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增时间可在60min之后扩增出特异性条带。
3.3 反应特异性检测
在进行lamp引物的反应特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。模板分别为绵羊痘病毒、山羊痘病毒、羊水泡病毒、支原体、为衣原体、螺旋体、弓形虫、羊泰勒虫、羊巴贝斯虫。反应温度设为 62℃的水浴锅或PCR仪中进行，反应时间按优化结果，绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物设为45min、绵羊痘病毒lamp引物反应60min、山羊痘病毒lamp引物为60 min。反应结束后 80℃加热 2 min，之后取出反应管，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。其检测结果见图3.
检测结果显示以羊的不同病原体基因组为模板，以羊的不同病原体基因组为模板，在62℃下扩增60 min后核酸电泳检测结果。山羊痘病毒lamp引物特异性扩增出了山羊痘病毒基因片段，而其他病原体均无特异性产物产生，阴性对照组无条带产生，说明山羊痘病毒lamp引物非常特异。
3.4 反应灵敏度检测
在进行lamp引物的反应灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。以山羊痘病毒基因组为模板，模板均通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为107~10-2个拷贝共计10个梯度作为模板。反应温度设为 62℃的水浴锅或PCR仪中进行，反应时间为60 min。反应结束后 80℃加热 2 min，之后取出反应管，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。检测结果见图4。
结果显示，山羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果,扩增时间为60min。结果显示，107-104个拷贝的模板均有特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。对照组无条带产生，此图可看出本发明所设计的山羊痘病毒lamp引物在62℃下，扩增60min之后最少可检出104个拷贝的模板。
综上可见，这里设计合成的4个基因序列以及其形成的LAMP方法可以单独在使用快速检测山羊痘病毒。
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 用于检测山羊痘病毒的试剂盒
<160> 4
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（GTPV F3）
<400>
accaaaacaa ataatcagag atg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（GTPV B3）
<400>
cctaatccat ttaagacact acg 23
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（GTPV FIP）
<400>
aagatgtctt ccggtaacta tgtctgcggt tgtgatatcg tca 43
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（GTPV BIP）
<400>
ccgaacttgt tatttcttgt gcttcacaat aaggaaccac ctaga 45
Claims (2)
1.用于检测山羊痘病毒的试剂盒，其特征在于试剂盒中至少包括有四条引物，分别是SEQ №1、SEQ №2、SEQ №3和SEQ №4。
2.根据权利要求1所述的用于检测山羊痘病毒的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有dNTP 、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween 20和Bst 酶，以及模板DNA。
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