CN102312019A - 一种用于快速检测孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的生物芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于快速检测孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的生物芯片。本发明与传统检测技术中的抗体相比，寡核苷酸适配子还具与靶分子结合力更强、稳定性好、精确性高、重复性好、可反复使用、可长期保存、可进行精确的位点修饰、筛选期更短等优势；所得到的生物芯片放入SPR生物传感器检测，能实现(1)实时检测、(2)无需标记样品、(3)样品需要量极少、(4)检测过程方便快捷，灵敏度高、(5)应用范围非常广泛、(6)高通量、(7)大多数情况下、(8)能检测混浊的甚至不透明的样品。

Description

一种用于快速检测孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的生物芯片

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体的说，涉及一种用于快速检测孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的生物芯片。 

背景技术

出生缺陷给家庭、国家和社会带来极大的精神及经济负担。目前，临床对胎儿的先天性缺陷尚无有效的治疗方法。出生缺陷疾病预防的方法中，孕前期的一级预防最为有效。弓形虫与巨细胞病毒是一组孕期感染的病原微生物，能通过胎盘或产道引起宫内感染，导致流产、死胎或胎儿生长迟缓、先天畸形、新生儿期感染及婴、幼儿生长发育障碍。我国每年约有26,000个弓形虫与巨细胞病毒混合感染患儿出生，平均每小时就有3个，因此，弓形虫与巨细胞病毒筛查是孕前感染性疾病检查的重要内容。但是，据统计资料显示，我国目前诊断临床普遍采用ELISA法、金标法等检测孕龄妇女血清TOX-IgG和CMV-IgG的水平，假阳性率较高，不能为临床提供准确的诊断依据。 

SELEX技术，又指数富集配体的系统进化(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)是20世纪90年代发展起来的一项组合化学技术。DNA配体与RNA配体的筛选过程虽然有一点不同，但一般都包括以下几个步骤：(1)通过人工合成，建立dsDNA随机序列库。(2)与靶物质反应，筛选出相互结合的靶物质-核酸复合体。(3)将筛选到的蛋白-核酸复合物分离，得到的核酸进 行PCR扩增，变性成单链以准备进行下一轮筛选，筛选的次数由文库的类型和每次循环所得特异性序列的富集程度决定。(4)经过若干轮筛选得到的、能高度结合靶物质的核酸配体可以进行测序并用于各种研究工作。具有库容量大，靶分子范围广，亲和力强等优点，应用十分广泛。与传统检测技术中的抗体相比，寡核苷酸适配子还具与靶分子结合力更强、稳定性好、精确性高、重复性好、可反复使用、可长期保存、可进行精确的位点修饰、筛选期更短等优势，是一种高效、快速的检测手段。 

近年来，表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)技术因其具有实时监测反应动态过程、灵敏度较高、无需标记、无背景干扰、成本低廉等特点，被认为是生物分子检测的理想检测器件，已经成为临床实验诊断领域研究的热点。基本原理是一种物理光学现象。表面等离子体(SP)是沿着金属和电介质间界面传播的电磁波形成的。当平行表面的偏振光以称之为表面等离子体共振角入射在界面上，发生衰减全反射时，入射光被耦合入表面等离子体内，光能大量被吸收，在这个角度上由于表面等离子体共振引起界面反射光显著减少。由于SPR对金属表面电介质的折射率非常敏感，不同电介质其表面等离子体共振角不同。同种电介质，其附在金属表面的量不同，则SPR的响应强度不同。基于这种原理的生物传感器通常将一种具特异识别属性的分子即配体固定于金属膜表面，监控溶液中的被分析物与该配体的结合过程。在复合物形成或解离过程中，金属膜表面溶液的折射率发生变化，随即被SPR生物传感器检测出来。与传统的ELISA检测法相比，SPR生物传感器具有如下显著特点：(1)实时检测，能动态地监测生物分子相互作用的全过程；(2)无需标记样品，保持了分子活性；(3)样品需要量极少；(4)检测过程方便快捷，灵敏度高；(5)应用范围非常广泛；(6)高通量、高质量 的分析数据；(7)大多数情况下，不需对样品进行预处理；(8)能检测混浊的甚至不透明的样品。现在已广泛用于物理量检测，化学检测与生物监测。 

如果能筛选出孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的适配子，然后将其包被在生物芯片上，再结合SPR生物传感器进行检测，将非常的快捷和精确。 

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种能快速检测、准确的检测孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的生物芯片。 

本发明目的是这样实现的：一种用于快速检测孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的生物芯片，包括玻璃基底(1)，玻璃基底(1)上依次附着有金膜(2)、连接层(3)和表面基质(4)，其关键在于：所述金膜(2)的流池包被有SEQ IDNo.1～SEQ ID No.3与SEQ ID No.4～SEQ ID No.6混合在一起的适配子。 

上述金膜(2)在包被适配子前，先预处理，即在1.0mol/L NaOH中浸泡清洗20min，取出后用去离子水清洗3次，然后放入Piranha溶液中处理15min，取出后立即投入无水乙醇中浸泡5min，氮气吹干。 

上述适配子包被在金膜(2)上之前，先预处理，即先将适配子溶解到PBS缓冲液，95℃变性3min，迅速冰浴2min，随后巯基法进行固定。 

SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的二级构象依次分别为： 

制备方法按下列制备方案进行： 

构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物：构建长度为78个碱基的ssDNA文库，两端为固定序列，中间35个核苷酸为随机序列，其中N代表A，T，C，G中的任意一个，库容量约为10¹⁵-10¹⁶： 

5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。上游引物为5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’，下游引物为 

5’-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。下游引物序列5’端需用生物素标记。随机单链DNA文库和引物可由引物合成公司合成。 

双链DNA(dsDNA)文库的PCR扩增及回收： 

PCR反应体系 

反应参数	加入量(单位：μl)
		10*PCR缓冲液	2.0
MgCl2(25mmol/L)	1.2
		dNTP(2.5mmol/L)	1.6
引物1(10pmol/L)	1.0
		引物2(10pmol/L)	1.0
模板(ssDNA文库)	0.1
		TaqDNA聚合酶	1.0
ddH2O	12.1
		总体积	20.0

PCR反应条件 

温度(℃)	作用	时间(S)
			94	预变性	300
94	变性	30
			65	退火	30
72	延伸	30

一共进行18个循环，最后72℃延伸5min.，得到的产物进行下一步实验(或4℃保存) 

PCR产物纯化及回收：往DNA溶液中加入0.1倍体积的3mol/L pH5.2的乙酸钠和2-2.5倍体积的冰冷无水乙醇，在蜗旋混合振荡器上振荡混匀并置于-20℃冰箱里放置30min，然后12000rpm离心5min，弃上清，加入1ml预冷的70％乙醇，颠倒离心管数次，12000rpm离心5min，弃上清，晾干沉淀后(可置于烘箱10min)溶于20μLTE缓冲液(pH8.0)或ddH2O，4℃保存过夜。 

单链DNA(dsDNA)文库的PCR扩增及回收： 

采用不对称PCR进行扩增， 

PCR反应体系 

反应参数	加入量(单位：μl)
		10*PCR缓冲液	2.0
MgCl2(25mmol/L)	0.2

[0031] 

dNTP(2.5mmol/L)	1.6
		引物1(0.4pmol/L)	0.5
引物2(10pmol/L)	2.0
		模板(dsDNA文库)	0.5
TaqDNA聚合酶	0.4
		ddH2O	12.8
总体积	20.0

PCR反应条件 

温度(℃)	作用	时间(S)
			94	预变性	300
94	变性	30
			65	退火	30
72	延伸	45

一共进行40个循环，最后72℃延伸7min.，得到的产物进行下一步实验(或4℃保存) 

回收方法同双链DNA(dsDNA)文库的回收。 

琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果 

配制2％的琼脂糖凝胶：精确称取2g电泳级琼脂糖，加入100ml 1XTAE电泳缓冲液，在微波炉内加热至溶化，待凝胶冷却至55℃左右时，加入溴化乙锭(终浓度为0.5μg/mL)轻轻旋转摇匀，倒入胶膜，插入合适的梳子，让凝胶溶液凝结后使用。 

PCR产物电泳：将凝胶置于电泳槽，取3μLPCR产物加入1μl 6X loading buffer(0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯氰、30％甘油水溶液)，混合后上样，另取5μLDL Marker，分别加入琼脂糖凝胶孔内，在1XTAE电泳缓冲液中80V电泳15-20min，在凝胶成像仪上观察电泳结果。 

SELEX筛选 

包被抗体：用PH9.6 0.05mol/L的包被液(碳酸盐缓冲液)将弓形虫病毒抗 体(TOX-IgG)与巨细胞病毒抗体(CMV-IgG)稀释至所需浓度，在每个SELEX96孔板中(聚苯乙烯板)的每个孔中加入100μl，同时设空白对照孔，4℃保存过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液PBST洗三次。稀释过程如下：弓形虫病毒抗体(TOX-IgG)：取3μl试剂(抗体来源ABcam公司，单位1mg/ml)，加入300μl包被缓冲液稀释。巨细胞病毒抗体(CMV-IgG)：取1.5μl试剂(抗体来源ABcam公司，单位2mg/ml)，加入300μl包被缓冲液稀释。稀释浓度均如下：1μg/孔、0.5μg/孔、0.25μg/孔X3、0.1μg/孔X3、0.05μg/孔X2、0.025μg/孔X2通过计算：12X2＝24孔，共包被24个孔。再加上10个空白对照孔，共34孔。封闭：浓度为3％的BSA(小牛血清)，300μl/孔，4℃保存过夜。 

ssDNA文库的结合：加入SELEX binding buffer稀释ssDNA文库至100μl，先与空白对照孔37℃孵育30min，空白反筛去除靶蛋白非特异性结合的ssDNA，然后转移到弓形虫病毒抗体(TOX-IgG)与巨细胞病毒抗体(CMV-IgG)包被孔中(含量为1μg的孔)孵育60min。 

简单洗脱：用SELEX washing buffer洗涤5次，每次3min。 

强化洗脱：用SELEX eluting buffer向反应孔中加入100μl，于80℃水浴作用10min，。 

精炼ssDNA：往盛有待纯化的ssDNA溶液的1.5ml EP管中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇的溶液(25∶24∶1)，蜗旋混合振荡器上振荡混匀，室温12000rpm离心15s。用移液枪将含有DNA的上层(水相)小心的移入一只新的EP管中，往ssDNA溶液中加入0.1倍体积的3mol/L pH5.2的乙酸钠和2-2.5倍体积的冰冷无水乙醇，在蜗旋混合振荡器上振荡混匀并置于-20℃冰箱里放置30min，然后12000rpm离心10min，弃上清，加入1ml预冷的70％乙醇，颠倒离心管数次， 12000rpm离心5min，弃上清，晾干沉淀后(可置于37℃烘箱10min)溶于20μlTE缓冲液(pH8.0)或ddH2O，4℃保存过夜。 

通过PCR和不对称PCR得到筛选后的ssDNA文库，然后进行电泳检测。最后一共进行12轮筛选达到饱和，得到特异性最高，亲和力最强的ssDNA文库。 

测定亲和性 

将第12轮得到的ssDNA文库经过不对称PCR扩增获得生物素标记的ssDNA文库，将纯化获得的弓形虫病毒抗体(TOX-IgG)与巨细胞病毒抗体(CMV-IgG)用碳酸盐(PH9.6)缓冲液稀释至10μg/ml包被酶联板，4℃过夜，PBST(PBS+Tween)洗涤3次，3min/次；3％BSA 37℃封闭1小时，PBST洗涤3次，3min/次；用SELEX binding buffer稀释的第12轮生物素标记的ssDNA0.05μg/孔，同时加入不同浓度梯度的弓形虫病毒蛋白(TOX)与巨细胞病毒蛋白(CMV)共100μl 37℃温育60min，PBST洗涤4次，3min/次；1∶2000稀释的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶37℃孵育30min，PBST洗涤4次，3min/次；加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)显色液37℃显色15min；2mol/L浓硫酸终止反应，酶标仪于450nm处测定A值。A值为0.157 

回收产物连接 

12轮后，将筛选产物连接到pMD18-T simple vector(TaKaRa公司)。参考TaKaRa公司pMD18-T simple vector的产品说明，将纯化后的目的基因PCR产物与克隆载体pMD18-T simple vector连接，目的基因片段与载体片段反应体系如下： 

pMD18-T/PCR产物/连接缓冲液：1μl/9μl/10μl 

16℃连接过夜 

连接产物的转化 

A、将目的基因片段与pMD18-T simple vector的连接产物20μl加入含有100μl的E.coli DH5α感受态细胞的EP管中，冰浴30min 

B、放入42℃水浴热休克1min，快速将管取出冰浴2min 

C、每管加SOC培养液600μl，37℃摇床，150rpm，培养60min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素性标记基因。 

D、将适当体积已转化的感受态细胞涂布于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB平板上，将平板置于室温直至液体被吸收。 

E、倒置平板，于37℃恒温培养，12-16小时后出现菌落，随机挑取几个菌落PCR鉴定。 

F、随机挑取110个单克隆加入盛有600μl LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)的1.5ml EP管中，37℃摇床，200rpm，培养过夜。次日加入600μl(等量)80％高压灭菌甘油，密封管口，于-70℃保存菌种。 

重组质粒的提取 

取50μl单克隆菌液接种于5ml含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基，37℃摇床，250rpm，培养过夜。 

小量提取质粒具体操作如下： 

A、取约3.0ml克隆菌液置1.5ml eppendof管中，12000rpm/min离心2min，弃上清 

B、菌体重悬于100μl溶液1中，冰浴10min 

C、加200μl新配置的溶液2，冰浴5min 

D、加150μl溶液3，冰浴10min，4℃，12000rpm/min离心10min 

E、上清移入干净的管中，加等体积酚-氯仿抽提一次 

F、用二倍体积的无水乙醇沉淀双链DNA，12000rpm/min离心10min，弃上清 

G、用1ml 70％乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥 

H、将沉淀溶于20μl的TE中，加入RNA酶，使其终浓度为20μg/ml，37℃水浴30min，消化RNA 

I、取2μl进行2％琼脂糖凝胶电泳 

PCR鉴定 

以提取质粒为模板，加入引物1与引物2进行PCR扩增反应，产物电泳。适体亲和性检测 

将挑取的单个克隆经过不对称PCR扩增后得到ssDNA，将此ssDNA与包被好的1μg/孔抗体结合，酶联法测定其亲和性。 

亲和性如下： 

(参看图3)弓形虫适配子与抗体的亲和性分布 

编号	OD值	编号	OD值
				TP3A4	1.095	TP3A9	1.376
TP3A6	1.891	TP3A15	1.841
				TP3A7	2.129	TP3A20	1.479
TP3A8	1.102	NC	0.117

(参看图4)巨细胞适配子与抗体的亲和性分布 

编号	OD值	编号	OD值
				2F12A2	1.408	2F12A7	1.008
2F12A3	1.043	2F12A8	1.092
				2F12A4	1.255	2F12A10	2.148
2F12A5	1.496	NC	0.086

测序 

挑取单克隆送测序公司测序 

弓形虫抗体适配子的序列： 

TP3A4 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGCATTTCGCAACACAACTTGGCCAAC 

GTTCCTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

TP3A6 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGCATTTCGCAACACGGCTTGGCAACG 

TTCCTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

TP3A7 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGCATTTCGCAACATGACTTCCCAACG 

TTCCTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

TP3A8 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGCATTTCGCAACACGACTTGGCCAGC 

GTTCCTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

TP3A9 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGCATTTCGCAACACGACTTGGCCAAC 

GTTCCTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

TP3A15 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGCATTTCGCAACACGACTTGACAAAC 

GTTCCTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

TP3A20 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGCATTTCGCAGCACGACTCGGCCAAC 

GTTCCTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

亲和性最高的3个弓形虫适配子 

为 

TP3A7 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGCATTTCGCAACATGACTTCCCAACG 

TTCCTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

TP3A6 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGCATTTCGCAACACGGCTTGGCAACG 

TTCCTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

TP3A15 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGCATTTCGCAACACGACTTGACAAAC 

GTTCCTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

巨细胞抗体适配子的序列： 

2F12A2 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGAGGCCCGATCTTCGACATGAGGCCCG 

GATC 

2F12A3 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGCTTCGACATGAGGCCCGGATC 

2F12A4 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGCATTTCGCAACACGACTTGGCCAAC 

GTTCCTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

2F12A5 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGGTCAACTCGTGTATTCGACATGAGG 

CCCGGATC 

2F12A7 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGAGCCCCCTTCGACATGAGGCCCGG 

ATC 

2F12A8 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATAGCAGTTTTCGTCGACTGCATCATTGT 

ATTGATGTTCGACATGAGGCCCGGATC 

2F12A10 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATGGGAGCTGATGTCGCATGGGTTTGGAT 

CACATGATTCGACATGAGGCCTGGATC 

亲和性最高的3个巨细胞适配子为 

2F12A10 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATGGGAGCTGATGTCGCATGGGTTTGGAT 

CACATGATTCGACATGA 

2F12A5 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGGTCAACTCGTGTATTCGACATGAGG 

CCCGGATC 

2F12A2 

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGAGGCCCGATCTTCGACATGAGGCCCG 

GATC 

适配子包被生物芯片 

我们在表面基质上包被亲和性最强的适配子，然后结合SPR生物传感器进行检测，具体方法如下： 

生物芯片表面预处理将表面基质镀有链霉亲和素的金膜电极的生物芯片放入1.0mol/L NaOH中浸泡清洗20min，取出后用去离子水清洗3次，然后将生物芯片放入Piranha溶液中处理15min，取出后立即将其投入无水乙醇中浸泡5min，氮气吹干备用。 

适配子预处理：PBS缓冲液溶解，95℃变性3min，迅速冰浴2min，随后巯基法进行固定。 

巯基法探针固定：经过变性处理的生物素化的适配子覆盖经预处理的芯片表面基质，使适配子牢固的固定在生物芯片上，适配子采用最佳浓度1.0umol/L，2h后PBS缓冲液清洗3次，0.02％BSA封闭约1h，PBS缓冲液清洗。 

有益效果：本发明与传统检测技术中的抗体相比，寡核苷酸适配子还具与靶分子结合力更强、稳定性好、精确性高、重复性好、可反复使用、可长期保存、可进行精确的位点修饰、筛选期更短等优势；所得到的生物芯片放入SPR生物传感器检测，能实现(1)实时检测、(2)无需标记样品、(3)样品需要量极少、(4)检测过程方便快捷，灵敏度高、(5)应用范围非常广泛、(6)高通量、(7)大多数情况下、(8)能检测混浊的甚至不透明的样品。 

说明书附图 

图1为本发明生物芯片的示意图； 

图2为SPR检测数据图； 

图3为弓形虫适配子与抗体的亲和性分布图； 

图4为巨细胞适配子与抗体的亲和性分布图。 

具体实施方式

实施例 

SPR生物传感器为北京金菩嘉医疗科技有限公司提供，具体仪器型号为UMPHO A600/B型，生物芯片为北京金菩嘉医疗科技有限公司提供，具体芯片型号与UMPHO A600/B型SPR生物传感器相匹配，如图1所示，包括玻璃基底1、金膜2、连接层3、表面基质4，玻璃基底1上依次附着有金膜2、连接层3和表面基质4，所述金膜2上有4个或8个导流池，该流池包被有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3与SEQ ID No.4～SEQ ID No.6混合在一起的适配子。在制作芯片过程中，先对金膜2预处理，即在1.0mol/L NaOH中浸泡清洗20min，取出后用去离子水清洗3次，然后放入Piranha溶液中处理15min，取出后立即投入无水乙醇中浸泡5min，氮气吹干备用。再对适配子预处理，即先将适配子溶解到PBS缓冲液，95℃变性3min，迅速冰浴2min，随后巯基法进行固定。生物芯片制作完成后，再将包被好适配子的生物芯片载入SPR传感器中，通入过量的蛋白抗体，使其与芯片上的适配子进行反应，最后记录实验结果，做好分析。 

如图2所示SPR检测数据图 

流池1：阴性对照 

流池2-4：弓形虫适配子检测流池(浓度：1.0umol/L) 

流池5-7：巨细胞病毒适配子检测流池(浓度：1.0umol/L) 

流池8：弓形虫适配子与巨细胞病毒适配子共同检测流池(浓度：2.0umol/L) 

结果分析： 

根据检测结果，我们可以得出流池1(阴性对照)的角度差为-5.7，流池2-8(检测流池)的角度差依次为：143.6、138、76.5、84.2、115.1、98.7、260.6。两者间有显著差异(p＜0.01)。说明通过SPR生物传感器能够对弓形虫和巨细胞病毒进行定性和半定量的分析。 

序列表 

<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 

<120>用于快速检测孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的生物芯片的适配子寡核苷酸序列 

<160>6 

<210>1 

<211>77 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<400>GGGAGCTCAG AATAAACGCT CAACGCATTT CGCAACATGA 

CTTCCCAACG TTCCTGGTTC GACATGAGGC CCGGATC 

<210>2 

<211>77 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<400>GGGAGCTCAG AATAAACGCT CAACGCATTT 

CGCAACACGG CTTGGCAACG TTCCTGGTTC GACATGAGGC 

CCGGATC 

<210>3 

<211>78 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<400>GGGAGCTCAG AATAAACGCT CAACGCATTT 

CGCAACACGA CTTGACAAAC GTTCCTGGTT CGACATGAGG 

CCCGGATC 

<210>4 

<211>68 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<400>GGGAGCTCAG AATAAACGCT CAATGGGAGC TGATGTCGCA 

TGGGTTTGGA TCACATGATT CGACATGA 

<210>5 

<211>68 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<400>GGGAGCTCAG AATAAACGCT CAACGGTCAA 

CTCGTGTATT CGACATGAGG CCCGGATC 

<210>6 

<211>54 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<400>GGGAGCTCAG CAACGCATTT CAAGAGGCCC GATCTTCGAC 

ATGAGGCCCG GATC 

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>用于快速检测孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的生物芯片的适配子寡核苷酸序列

<160>  6

<210>  1

<211>  77

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<400> GGGAGCTCAG  AATAAACGCT  CAACGCATTT  CGCAACATGA

CTTCCCAACG  TTCCTGGTTC  GACATGAGGC  CCGGATC

<210> 2

<211>  77

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<400> GGGAGCTCAG  AATAAACGCT  CAACGCATTT

CGCAACACGG  CTTGGCAACG  TTCCTGGTTC  GACATGAGGC

CCGGATC

 

 

<210> 3

<211>  78

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<400> GGGAGCTCAG  AATAAACGCT  CAACGCATTT  CGCAACACGA  CTTGACAAAC  GTTCCTGGTT  CGACATGAGG   CCCGGATC

<210>  4

<211>  68

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<400> GGGAGCTCAG  AATAAACGCT  CAATGGGAGC  TGATGTCGCA

TGGGTTTGGA  TCACATGATT  CGACATGA

<210> 5

<211>  68

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<400> GGGAGCTCAG  AATAAACGCT  CAACGGTCAA

CTCGTGTATT  CGACATGAGG  CCCGGATC

<210>6

<211>  54

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<400>GGGAGCTCAG CAACGCATTT  CAAGAGGCCC  GATCTTCGAC  ATGAGGCCCG  GATC

Claims (4)

1.一种用于快速检测孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的生物芯片，包括玻璃基底（1），玻璃基底（1）上依次附着有金膜（2）、连接层（3）和表面基质（4），其特征在于：所述金膜（2）的流池包被有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3与SEQ ID No.4～SEQ ID No.6混合在一起的适配子。

2.根据权利要求1所述用于快速检测孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的生物芯片，其特征在于：所述金膜（2）在包被适配子前，先预处理，即在1.0mol／L NaOH中浸泡清洗20 min，取出后用去离子水清洗3次，然后放入Piranha溶液中处理15 min，取出后立即投入无水乙醇中浸泡5 min，氮气吹干。

3.根据权利要求2所述生物芯片，其特征在于：所述适配子包被在金膜（2）上之前，先预处理，即先将适配子溶解到PBS缓冲液，95℃变性3 min，迅速冰浴2 min，随后巯基法进行固定。

4.根据权利要求1或3所述用于快速检测孕前宫内感染弓形虫和巨细胞病毒的生物芯片，其特征在于SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的二级构象依次分别为：

。

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