CN107151672B - 一种重组质粒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组质粒，它是在pGEX‑6P‑1质粒的多克隆位点区引入2个SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列构建而成。本发明还提供了重组质粒的用途及一种检测双链DNA抗体的检测试剂盒。本发明提供的重组质粒，可以作为抗原用来检测dsDNA抗体的水平，进而筛查待检人群患系统性红斑狼疮的风险：若dsDNA抗体的表达水平高，则患系统性红斑狼疮的风险高，若dsDNA抗体的表达水平低，则患系统性红斑狼疮的风险低，可用于临床系统性红斑狼疮的辅助诊断，应用前景良好。

Description

一种重组质粒及其用途

技术领域

本发明属于免疫诊断领域，具体涉及一种重组质粒及其用途。

背景技术

双链DNA(dsDNA)抗体是系统性红斑狼疮(SLE)的高度特异抗体，抗体水平变化与病情活动相关，被称为SLE的“标记抗体”，dsDNA抗体对于SLE的诊断和预后具有重要的指导意义。

目前实验室检测dsDNA抗体的方法主要有放免法、间接免疫荧光法、斑点免疫金渗滤法、免疫印记法和酶联免疫(Elisa)法。其中，Elisa法检测dsDNA抗体具有无放射性同位素污染、操作便捷、灵敏度高、适用于高通量样本测定等优点，在临床上被广泛使用，具有较好的市场价值。

制备dsDNA抗体检测Elisa试剂盒，主要的技术瓶颈是dsDNA抗原，dsDNA抗原选择不当，就无法制备出特异性强、结合良好的抗原包被板，不能保证Elisa试剂盒检测的准确性。目前市场上检测dsDNA抗体使用的Elisa试剂盒，几乎全采用进口原装和分装试剂盒，价格昂贵，检测成本高。因此，临床上仍急需开发dsDNA抗体的抗原及试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组质粒及其用途。

本发明提供了一种重组质粒，它是在pGEX-6P-1质粒的多克隆位点区引入2个SEQID NO：1所示的核苷酸序列构建而成。

其中，它是分别在pGEX-6P-1质粒的多克隆位点区的BamHI酶和EcoRI酶之间、EcoRI酶和XhoI酶之间引入SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列构建而成。

其中，上述重组质粒的构建方法如下：

a、以人cDNA为模板，以SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列为引物，扩增得到PCR产物，纯化后用BamHI酶、EcoRI酶进行双酶切，得到片段1；

b、对载体质粒pGEX-6P-1用BamHI酶、EcoRI酶进行双酶切；并与片段1连接，得到载体1；

c、以人cDNA为模板，以SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列为引物，扩增得到PCR产物2，纯化后用EcoRI酶、XhoI酶进行双酶切，得到片段2；

d、对步骤b得到的载体1用EcoRI酶、XhoI酶进行双酶切；并与片段2连接，即可。

其中，所述质粒为非甲基化状态的质粒。

本发明还提供了上述重组质粒在制备检测双链DNA抗体的抗原中的用途。

本发明还提供了一种重组菌，它包含上述的重组质粒；优选地，所述重组菌为大肠杆菌HST-04菌株。

本发明还提供了一种双链DNA抗原包被板，它包被有权利要求1-4任意一项所述的重组质粒。

本发明还提供了上述抗原包被板的制备方法，步骤如下：

a、酶标板的预处理：取聚丙乙烯板条，用HCl溶液浸泡1h，紫外线照射过夜；

b、每孔加入1g/L鱼精蛋白，4℃过夜；

c、用洗涤液洗三次、拍干，每孔加入上述的重组质粒，4℃过夜；

d、用洗涤液洗三次、拍干，再用125U肝素或含5％BSA的PBS4℃封闭过夜；

e、用洗涤液洗三次、拍干，即可；

优选地，所述洗涤液为含0.005％吐温-20的PBST溶液；

优选地，每孔质粒浓度为20ng。

本发明还提供了一种ELISA检测试剂盒，它是检测待检样品中的双链DNA抗体的ELISA检测试剂盒，以上述的重组质粒为抗原；

其中，它还包括洗涤液、酶标二抗、显色液以及终止液；

优选地，所述洗涤液为含0.05％吐温-20的TRIS缓冲液；所述酶标二抗为辣根过氧化酶标记的人IgG；所述显色液为TMB显色液；所述终止液为浓度为0.25mol/L的HCl溶液。

本发明还提供了上述抗原包被板、ELISA检测试剂盒在制备检测双链DNA抗体的试剂中的用途。

SEQ ID NO：1MPO基因序列：

ATGGGGGTTCCCTTCTTCTCTTCTCTCAGATGCATGGTGGACTTAGGACCTTGCTGGGCTGGGGGTCTCACTGCAGAGATGAAGCTGCTTCTGGCCCTAGCAGGGCTCCTGGCCATTCTGGCCACGCCCCAGCCCTCTGAAGGTGCTGCTCCAGCTGTCCTGGGGGAGGTGGACACCTCGTTGGTGCTGAGCTCCATGGAGGAGGCCAAGCAGCTGGTGGACAAGGCCTACAAGGAGCGGCGGGAAAGCATCAAGCAGCGGCTTCGCAGCGGCTCAGCCAGCCCCATGGAACTCCTATCCTACTTCAAGCAGCCGGTGGCAGCCACCAGGACGGCGGTGAGGGCCGCTGACTACCTGCACGTGGCTCTAGACCTGCTGGAGAGGAAGCTGCGGTCCCTGTGGCGAAGGCCATTCAATGTCACTGATGTGCTGACGCCCGCCCAGCTGAATGTGTTGTCCAAGTCAAGCGGCTGCGCCTACCAGGACG TGGGGGTGACTTGCCCGGAGCAGGACAAATACCGCACCATCACCGGGATGTGCAACAACAGACGCAGCCCCACGCTGGGGGCCTCCAACCGTGCCTTTGTGCGCTGGCTGCCGGCGGAGTATGAGGACGGCTTCTCTCTTCCCTACGGCTGGACGCCCGGGGTCAAGCGCAACGGCTTCCCGGTGGCTCTGGCTCGCGCGGTCTCCAACGAGATCGTGCGCTTCCCCACTGATCAGCTGACTCCGGACCAGGAGCGCTCACTCATGTTCATGCAATGGGGCCAGCTGTTGGACCACGACCTCGACTTCACCCCTGAGCCGGCCGCCCGGGCCTCCTTCGTCACTGGCGTCAACTGCGAGACCAGCTGCGTTCAGCAGCCGCCCTGCTTCCCGCTCAAGATCCCGCCCAATGACCCCCGCATCAAGAACCAAGCCGACTGCATCCCGTTCTTCCGCTCCTGCCCGGCTTGCCCCGGGAGCAACATCACCATCCGCAACCAGATCAACGCGCTCACTTCCTTCGTGGACGCCAGCATGGTGTACGGCAGCGAGGAGCCCCTGGCCAGGAACCTGCGCAACATGTCCAACCAGCTGGGGCTGCTGGCCGTCAACCAGCGCTTCCAAGACAACGGCCGGGCCCTGCTGCCCTTTGACAACCTGCACGATGACCCCTGTCTCCTCACCAACCGCTCAGCGCGCATCCCCTGCTTCCTGGCAGGGGACACCCGTTCCAGTGAGATGCCCGAGCTCACCTCCATGCACACCCTCTTACTTCGGGAGCACAACCGGCTGGCCACAGAGCTCAAGAGCCTGAACCCTAGGTGGGATGGGGAGAGGCTCTACCAGGAAGCCCGGAAGATCGTGGGGGCCATGGTCCAGATCATCACTTACCGGGACTACCTGCCCCTGGTGCTGGGGCCAACGGCCATGAGGAAGTACCTGCCCACGTACCGTTCCTACAATGACTCAGTGGACCCACGCATCGCCAACGTCTTCACCAATGCCTTCCGCTACGGCCACACCCTCATCCAACCCTTCATGTTCCGCCTGGACAATCGGTACCAGCCCATGGAACCCAACCCCCGTGTCCCCCTCAGCAGGGTCTTTTTTGCCTCCTGGAGGGTCGTGCTGGAAGGTGGCATTGACCCCATCCTCCGGGGCCTCATGGCCACCCCTGCCAAGCTGAATCGTCAGAACCAAATTGCAGTGGATGAGATCCGGGAGCGATTGTTTGAGCAGGTCATGAGGATTGGGCTGGACCTGCCTGCTCTGAACATGCAGCGCAGCAGGGACCACGGCCTCCCAGGATACAATGCCTGGAGGCGCTTCTGTGGGCTCCCGCAGCCTGAAACTGTGGGCCAGCTGGGCACGGTGCTGAGGAACCTGAAATTGGCGAGGAAACTGATGGAGCAGTATGGCACGCCCAACAACATCGACATCTGGATGGGCGGCGTGTCCGAGCCTCTGAAGCGCAAAGGCCGCGTGGGCCCACTCCTCGCCTGCATCATCGGTACCCAGTTCAGGAAGCTCCGGGATGGTGATCGGTTTTGGTGGGAGAACGAGGGTGTGTTCAGCATGCAGCAGCGACAGGCCCTGGCCCAGATCTCATTGCCCCGGATCATCTGCGACAACACAGGCATCACCACCGTGTCTAAGAACAACATCTTCATGTCCAACTCATATCCCCGGGACTTTGTCAACTGCAGTACACTTCCTGCATTGAACCTGGCTTCCTGGAGGGAAGCCTCCTAG

本发明提供的重组质粒，生产成本低，可以在较低浓度下作为抗原制备包被效果优良的抗原包被板，以准确、快速的检测dsDNA抗体。

本发明提供的检测试剂盒通过检测dsDNA抗体的水平，可以判断正常人和疑似系统性红斑狼疮患者的dsDNA抗体表达水平差异，进而筛查待检人群患系统性红斑狼疮的风险：若dsDNA抗体的表达水平高，则患系统性红斑狼疮的风险高，若dsDNA抗体的表达水平低，则患系统性红斑狼疮的风险低，可用于临床系统性红斑狼疮的辅助诊断。

本发明试剂盒灵敏度优于市售产品，对系统性红斑狼疮检测效果好，而且本发明试剂盒制备简单，成本低廉，市场前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1GST质粒图谱

图2GST-2MPO质粒图谱

图3重组质粒GST-MPO以及GST-2MPO双酶切验证图1.GST-MPO；2.GST-2MPO；3.Marker

图4甲基化GST质粒与GST-2MPO质粒的对比(n＝5)(**:p<0.01)

图5GST-2MPO甲基化与非甲基化的对比(n＝5)(**:p<0.01)

图6不同浓度鱼精蛋白的影响(n＝5)

1.鱼精蛋白浓度20mg/mL；2.鱼精蛋白浓度10mg/mL；3.鱼精蛋白浓度5mg/mL；4.鱼精蛋白浓度1mg/mL；5.鱼精蛋白浓度0.5mg/mL；6.鱼精蛋白浓度0.1mg/mL。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的实验材料试剂与仪器如下：

1.1材料

(1)E.coli DH5α(DE3)菌株

(2)E.coli HST-04菌株：购自Takara公司。

(3)GST质粒：为市售的pGEX-6P-1质粒，图谱见图1。

(4)人CDNA：购自艾博思生物公司。

1.2主要试剂

(1)多聚-L-赖氨酸

(2)鱼精蛋白

(3)限制性内切酶：BamHI、EcoRI和XhoI(Fermentors公司)

(4)质粒小抽提取试剂盒(道普生物科技有限公司)

(5)胶回收试剂盒(道普生物科技有限公司)

(6)辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG抗体(sigma公司)

(7)TMB-2HCl(sigma公司)

(8)抗dsDNA抗体体外诊断试剂盒(新建康成生物科技有限公司)

1.3试剂配方

(1)TAE电泳缓冲液(50×)

Tris 242g

EDTA.2Na.2H₂O 37.2g

加800mL蒸馏水后充分搅拌溶解，再加入57.1mL乙酸，充分混匀，定容至1000mL，4℃保存。(用时用蒸馏水稀释至1×)

(2)低盐液体LB培养基

蛋白胨(tryptone) 10g

酵母粉(yeast extract) 5g

NaCl 5g

加950mL的蒸馏水，用1mol/L NaOH调pH 7.4，定容至1000mL，分装高压灭菌，4℃保存。

(3)低盐固体LB培养基

在低盐LB培养基加入琼脂粉至终浓度为2％高压灭菌，4℃保存。

(4)0.01mol/L PBS(pH 7.2-7.4，1L)

0.2mmol/L NaH₂PO₄ 9.5mL

0.2mmol/L Na₂HPO₄ 40.5mL

NaCl 8.5g

(5)碱裂解法①号液(pH 8.0，1L)

50mmol/L葡萄糖 9.9085g

25mmol/LTRIS-HCl 3.0285g

EDTA 3.722g

(6)碱裂解法②号液(1L)

200mmol/LNaOH 8g

1％SDS 10g

(7)碱裂解法③号液(pH 5.0，1L)

3mol/L醋酸钾 294.42g

醋酸调pH至5.0

1.4主要仪器

(1)UV1102紫外－可见分光光度计(上海天美科技有限公司)

(2)高速冷冻离心机(Eppendorf公司)

(3)水平电泳系统(Bio-Rad公司)

(4)凝胶成像系统(Gene公司)

(5)pH计(PHS-320，成都试剂方舟科技有限公司)

(6)恒温水浴箱:S.HH.W21-600-II指针式三用电热恒温水温箱(上海跃进医疗器械公司)

(7)核酸蛋白测定仪(nanodorp-1000公司)

(8)纯水仪(MilliPore公司)

(9)超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)

(10)移液枪(0.1-2.5μL,1-10μL,20-200μL,100-1000μL；Eppendorf公司)。

实施例1本发明重组质粒的制备

1、GST-2MPO质粒的构建

1.1 PCR扩增MPO基因

(1)引物设计

根据MPO基因序列设计引物

表1 MPO的引物1序列

表2 MPO的引物2序列

(2)PCR扩增基因：

按下列组成在PCR反应管中调制反应液，按如下反应体系进行，其中，上下引物为表1的引物1组合。

表3 PCR反应体系

表4 PCR反应条件

反应结束后，抽取扩增样品5μL，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断片段大小或冷冻保存，以备以后分析使用。

1.2小抽试剂盒提取载体(GST)质粒

(1)将菌液用涂布棒接种到加入抗生素的固体LB培养基中37℃恒温性培养过夜。

(2)挑取单菌落到液体LB培养基中，220×g 37℃摇床生长12小时。

(3)取5mL菌液，在13,000转下离心1min弃上清。

(4)取250μL①号液使沉淀完全重悬。

(5)取250μL②号液加入悬浮液中，上下翻转6-10次，直至液体变清亮。

(6)加入400μL③号液，立即轻柔混合，室温放置5min后13,000×g离心10min.

(7)将试剂盒中柱子加入500μL④号液13,000×g离心1min后弃滤液。

(8)将步骤6上清加入柱子13,000×g离心1min后弃滤液。

(9)加入500μL⑤号液装柱，13,000×g离心1min后弃滤液。

(10)加入600μL⑥号液13,000×g离心1min后弃滤液。

(11)上步骤重复一次，空柱再离心一次，室温放5min后除去残留乙醇。

(12)将柱装置于新的2mL离心管中，膜中央加入50μL60℃无菌水,13,000×g离心1min洗脱。

(13)将洗脱下来质粒进行琼脂糖电泳，利用核酸蛋白测定仪测量浓度，-20℃保存。

1.3载体(GST)和目的基因(MPO质粒)的双酶切

(1)载体(GST)酶切反应体系，37℃水浴3h后加入EcoR I酶切，30min后取出。

表5双酶切反应体系

(2)目的基因(MPO)酶切反应

表6双酶切反应体系

37℃水浴3h后加入EcoR I酶切，30min后取出。

(3)1％琼脂糖凝胶电泳

用1×TAE缓冲液配制1％的琼脂糖凝胶，混匀后，微波炉加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。待凝胶冷却至70℃左右时加入染料混匀，倒入胶板中，插入适当的梳齿，室温放置30min，待凝胶完全凝固，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。用加样器吸取样品5μL与1μL上样缓冲液混合，将样品缓慢加入加样孔中，100v/20min，电泳完毕后，紫外灯下观察结果，并用凝胶成像系统扫描电泳结果。

(4)胶回收

①电泳完后切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，每100mg凝胶中加入300μL的体积溶胶液，于55℃水浴融胶10min，间断(2～3min)混合，确保胶块完全融化，当胶完全融化后，观察溶液的颜色，如颜色为红色，加入适量3mol/L醋酸钠(pH5.2)，调整颜色和溶胶液颜色相同(黄色)。

②待融化的凝胶溶液降至室温，加入吸附柱中静置1min，12,000×g离心1min，弃流出液。

③加入700μL溶液Wash Buffer，12,000×g离心1min，弃流出液。

④12,000×g离心1～2min，去除残留的Wash Buffer。

⑤将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30μL去离子水，室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20℃保存。

⑥取洗脱溶液1μL测定ds DNA的浓度。

1.4载体(GST)和目的基因(MPO)连接

按如下反应体系进行

表7连接反应体系

22℃1h

1.5CaCl2法制备感受态细胞

(1)划线(无选择性LB-Agar平板)，37℃培养16-20h。

(2)挑单菌落到2mL LB培养液中，37℃,300rpm摇菌过夜。

(3)取1mL过夜菌液到100mL LB培养液中，37℃,300rpm摇菌约3h，检测OD_600nm约0.4。

(4)将菌液转移到50mL BD管中，冰上放置10min。

(5)4℃，4000×g，离心10min，倒出培养液，倒置1min。

(6)用0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂(80mmol/L MgCl₂,20mmol/L CaCl₂)溶液30mL重悬细胞沉淀,冰上30min。

(7)4℃，4000×g，离心5min，到出培养液，倒置1min。

(8)用2mL预冷0.1mmol/L CaCl₂-15％甘油重悬细胞沉淀，将其200μL/管分装到灭菌EP管中，冻存于-80℃保存。

1.6连接产物转化

(1)-80℃取出感受态细胞DH5α(DE3)，冰上融化。

(2)加入1μL(50ng)待转化质粒；冰上放置30min(间隔震荡)。

(3)42℃，90s(勿震荡)，冰浴2min，加LB培养基800μL，37℃,50rpm(温柔摇菌)，50min。

(4)取100μL菌液涂板至液体完全被吸收，倒置平皿，37℃培养16h，观察菌落。

1.7小抽试剂盒提取质粒DNA

(1)挑单菌落到5mL选择性LB培养液中，37℃，220rpm，14-18h。

(2)取5mL在LB培养基中培养过夜的菌液12,000×g离心1min，弃尽上清。

(3)加250μL Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

(4)加250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。

(5)加350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10min。

(6)吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管，12,000×g离心1min，弃滤液。

(7)将制备管置回离心管，加500μL Buffer W1，12,000×g离心1min，弃滤液。

(8)将制备管置回离心管，加700μL Buffer W2，12,000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，弃滤液。

(9)将制备管置回2mL离心管中，12,000×g离心1min。

(10)将制备管移入新的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加60-80μL去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min。

1.8构建GST-2MPO质粒

参照构建GST-MPO的方法构建GST-2MPO，步骤如下：

用引物2组合扩增出MPO片段，用EcoRI,XhoI双酶切MPO片段；同样双酶切GST-MPO质粒；然后连接双酶切后的MPO片段和GST-MPO质粒，即可。

GST-2MPO质粒的图谱见图2。

2、获得甲基化GST-2MPO质粒

挑取单颗菌落利用小抽试剂盒提取质粒，得到甲基化GST-2MPO质粒。

将质粒用上述限制性内切酶进行酶切验证，重组质粒GST-MPO用BamHI、EcoRI，GST-2MPO用EcoRI,XhoI来进行双酶切，酶切后进行1％琼脂糖电泳检测。验证结果见图3。

3、获得非甲基化GST-2MPO质粒

3.1构建非甲基化质粒菌株

(1)-80℃取出感受态细胞(HST-04)，冰上融化。

(2)加入1μL(50ng)待转化质粒；冰上放置30min(间隔震荡)。

(3)42℃，90s(勿震荡)，冰浴2min，加LB培养基800μL，37℃,50rpm(温柔摇菌)，50min。

(4)取100μL菌液涂板至液体完全被吸收，倒置平皿，37℃培养16h，观察菌落。

3.2挑取单克隆菌落，提取非甲基化GST-2MPO质粒，备用。

实施例2本发明dsDNA抗原包被板的制备

步骤如下：

1、酶标板的预处理：用每孔100μL 1mmol/L HCl室温浸泡预处理聚丙乙烯板条1h，紫外照射过夜。

2、每孔加入100μL 1g/L多聚-L-赖氨酸或1g/L鱼精蛋白4℃过夜。

3、用含0.005％吐温-20的PBST洗三次、拍干，每孔100μL 200ng/mL质粒4℃过夜。

4、用含0.005％吐温-20的PBST洗三次、拍干，再用125U肝素或含5％BSA的PBS4℃封闭过夜。

5、用含0.005％吐温-20的PBST洗三次、拍干、保存。

实施例3本发明检测试剂盒的制备

按照实施例2方法，制备dsDNA抗原包被板(96孔板)一块；

取酶标抗体(HRP标记的人IgG)、样品稀释液、洗涤液(0.05％TW-20的TRIS缓冲液)、底物液(0.325mol/L TMB-2HCl)、终止液(0.25mol/L HCl)；与本发明的dsDNA抗原包被板共同组成本发明试剂盒。

实施例4本发明质粒的大规模制备方法

1、质粒GST-2MPO的大规模发酵

(1)将GST-2MPO转化到宿主菌HST-04中。

①-80℃取出感受态细胞HST-04,冰上融化。

②加入1μL(50ng)待转化质粒；冰上，30min(间隔震荡)。

③42℃，60s(勿震荡)，室温2min，加LB培养基800μL，37℃,150rpm(温柔摇菌)，60min。

④取200μL菌液涂板至液体完全被吸收，倒置平皿，37℃培养16h，观察菌落。

(2)在LB琼脂培养基(Amp)上挑取菌落并接种到5mL LB(Amp)液体培养基中，在37℃振荡培养14h。

(3)次日将培养菌接种到1000ml LB(Amp)液体培养基中，在37℃振荡培养3h，使其A₅₄₀为0.8-1.0。

(4)冷冻离心10,000×g收集沉淀。

2、碱裂解法粗提取质粒

(1)按1g菌10mL①号液的比例，将菌体重悬，如10g菌体溶于100mL①号液中。

(2)按1g菌10mL②号液的比例，边摇边加入②号液，动作不要太剧烈。

(3)按1g菌15mL③号液的比例，边摇边加入②号液。

(4)静止10min，四层纱布过滤后，经布氏漏斗抽滤，得上清。

(5)加入RNA酶，37℃1h或4℃过夜。

(6)离心去沉淀，用pH 5.0的柠檬酸缓冲液透析。

3、硅藻土吸附质粒

(1)按100mL液体加2g硅藻土的比例，将硅藻土与上诉粗提纯的质粒混合吸附30min。

(2)用布式漏斗抽滤，去除上清，将硅藻土晾干。

(3)用50ml，55℃纯水洗脱吸附在硅藻土上的质粒，用布式漏斗，抽滤得滤液(即为质粒)。

4、阳离子交换柱提纯质粒

(1)用pH 5.0的柠檬酸缓冲液为平衡液，处理阳离子交换柱。

(2)缓慢上样，注意收集穿透峰。

(3)平衡后，用含1mol/L NaCl的柠檬酸缓冲液(pH 5.0)洗脱，收集洗脱峰。

(4)冲10体积的纯水，清洗柱子，后用20％乙醇保存。

5、PEG浓缩质粒

(1)将得到的穿透峰在PBS缓冲液中透析过夜。

(2)再用PEG8000进行浓缩。

6、乙醇提纯

(1)按照质粒：乙醇＝1:1.5的比例加入预冷的乙醇，-20℃冷冻沉淀40min。(2)冷冻离心10,000×g收集沉淀，晾干保存或直接-20℃保存。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1本发明抗原的筛选

一、实验方法

1、实验材料

1)甲基化GST质粒：即pGEX-6P-1质粒；

2)甲基化GST-2MPO质粒：按照实施例1方法制备得到。

3)非甲基化GST-2MPO质粒：按照实施例1方法制备得到。

2、质粒的固定化(制备抗原包被板)

(1)酶标板的预处理：用每孔100μL 1mmol/L HCl室温浸泡预处理聚丙乙烯板条1h，紫外照射过夜。

(2)每孔加入100μL 1g/L多聚-L-赖氨酸或1g/L鱼精蛋白4℃过夜。

(3)用含0.005％吐温-20的PBST洗三次、拍干，每孔100μL 200ng/mL质粒4℃过夜。

(4)用含0.005％吐温-20的PBST洗三次、拍干，再用125U肝素或含5％BSA的PBS4℃封闭过夜。

(5)用含0.005％吐温-20的PBST洗三次、拍干、保存。

3、酶联免疫吸附剂测定

(1)用样本稀释液(为Tris缓冲液)将SLE患者血清和正常人血清按100倍稀释，如：10μL样本+990μL样本稀释液。

(2)加样本：在对应的微孔内(指包被板微孔)加入稀释后的正常人血清，病人血清，蒸馏水等各100μL。

(3)温育：盖上盖子，室温(20℃-28℃)孵育1h。

(4)洗涤：弃去孔内液体，每孔加入含0.05％吐温-20的TRIS缓冲液洗涤三次。

(5)加酶标液：每孔各加100μL酶标液(HRP标记的人IgG),室温(20℃-28℃)孵育30min。

(6)洗涤：弃去孔内液体，每孔加入含0.05％吐温-20的TRIS缓冲液洗涤三次。

(7)加底物液：每孔各加100μL底物液(0.325mol/L TMB-2HCl)，避光室温(20℃-28℃)孵育15min.

(8)终止：每孔加入100μL终止液(0.25mol/L HCl)

(9)比色：在反应终止30min内，在450nm/620nm处(双波长450nm和620nm)读取吸光度值。

二、实验结果

将甲基化GST质粒与甲基化GST-2MPO质粒分别耦联固定在酶标板上，对SLE患者血清进行酶联免疫吸附测定，结果见表8和图4。

表8 GST质粒与GST-2MPO的对比(n＝5)

^#:P<0.01

由表8和图4可见，在质粒总量相同的情况下，GST-2MPO质粒的灵敏度优于GST质粒。

将甲基化的GST-2MPO和非甲基化的GST-2MPO质粒分别耦联固定在酶标板上，对SLE患者血清进行酶联免疫吸附测定，结果见表9和图5。

表9 GST-2MPO甲基化与非甲基化的对比(n＝5)

^#:P<0.01

由表9和图5可见，甲基化GST-2MPO质粒的灵敏度优于非甲基化状态的GST-2MPO质粒。

因此，本发明GST-2MPO重组质粒的灵敏度优于GST质粒，适于作为抗原使用，其中，尤其以非甲基化GST-2MPO质粒的灵敏度最优。而其它质粒作为抗原时，用量大，且有可能出现非特异性结合，产生假阳性，作为抗原效果不佳。

试验例2本发明dsDNA抗原包被板的制备方法筛选

考察不同浓度鱼精蛋白包被对抗原包被板的制备方法影响：

每个微孔内用非甲基化的GST-2MPO质粒总量为10ng，在制备抗原包被板时，选择不同浓度的鱼精蛋白包被，按试验例1的方法进行检测，结果见表10和图6。

表10不同浓度鱼精蛋白的影响(n＝5)

^#:P<0.01

可见，其它条件相同的情况下，鱼精蛋白的用量对检测结果影响较大，仅在鱼精蛋白浓度为1mg/mL能准确鉴别SLE患者与正常人血清，其它浓度均无法鉴别。因此选择鱼精蛋白浓度为1mg/mL。

试验例3本发明检测试剂盒与市售试剂盒的效果对比

1、实验试剂

本发明检测试剂盒：按照实施例3方法制备的试剂盒，

市售试剂盒：抗dsDNA抗体体外诊断试剂盒(新建康成生物科技有限公司)。

2、实验方法

分别取SLE患者血清和正常人血清；

本发明检测试剂盒：按试验例1的方法进行酶联免疫吸附剂测定。

市售试剂盒：按照试剂盒操作说明进行。

3、实验结果

表11两种试剂盒的使用效果对比

	本发明试剂盒	市售试剂盒
			正常人	0.129	0.198
SLE患者	0.841	0.424

可见，对同样的样本，使用本发明试剂盒检测对患者和正常人的差异更明显，说明本发明试剂盒的灵敏度更高，可更加直观的判断是否为系统性红斑狼疮患者，鉴定效果更准确。

综上，本发明提供的重组质粒，可以作为抗原用来检测dsDNA抗体的水平，进而筛查待检人群患系统性红斑狼疮的风险：若dsDNA抗体的表达水平高，则患系统性红斑狼疮的风险高，若dsDNA抗体的表达水平低，则患系统性红斑狼疮的风险低，可用于临床系统性红斑狼疮的辅助诊断，应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都医学院

<120> 一种重组质粒及其用途

<130> GY044-17P1177

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2238

<212> DNA

<213> MPO基因序列

<400> 1

atgggggttc ccttcttctc ttctctcaga tgcatggtgg acttaggacc ttgctgggct 60

gggggtctca ctgcagagat gaagctgctt ctggccctag cagggctcct ggccattctg 120

gccacgcccc agccctctga aggtgctgct ccagctgtcc tgggggaggt ggacacctcg 180

ttggtgctga gctccatgga ggaggccaag cagctggtgg acaaggccta caaggagcgg 240

cgggaaagca tcaagcagcg gcttcgcagc ggctcagcca gccccatgga actcctatcc 300

tacttcaagc agccggtggc agccaccagg acggcggtga gggccgctga ctacctgcac 360

gtggctctag acctgctgga gaggaagctg cggtccctgt ggcgaaggcc attcaatgtc 420

actgatgtgc tgacgcccgc ccagctgaat gtgttgtcca agtcaagcgg ctgcgcctac 480

caggacgtgg gggtgacttg cccggagcag gacaaatacc gcaccatcac cgggatgtgc 540

aacaacagac gcagccccac gctgggggcc tccaaccgtg cctttgtgcg ctggctgccg 600

gcggagtatg aggacggctt ctctcttccc tacggctgga cgcccggggt caagcgcaac 660

ggcttcccgg tggctctggc tcgcgcggtc tccaacgaga tcgtgcgctt ccccactgat 720

cagctgactc cggaccagga gcgctcactc atgttcatgc aatggggcca gctgttggac 780

cacgacctcg acttcacccc tgagccggcc gcccgggcct ccttcgtcac tggcgtcaac 840

tgcgagacca gctgcgttca gcagccgccc tgcttcccgc tcaagatccc gcccaatgac 900

ccccgcatca agaaccaagc cgactgcatc ccgttcttcc gctcctgccc ggcttgcccc 960

gggagcaaca tcaccatccg caaccagatc aacgcgctca cttccttcgt ggacgccagc 1020

atggtgtacg gcagcgagga gcccctggcc aggaacctgc gcaacatgtc caaccagctg 1080

gggctgctgg ccgtcaacca gcgcttccaa gacaacggcc gggccctgct gccctttgac 1140

aacctgcacg atgacccctg tctcctcacc aaccgctcag cgcgcatccc ctgcttcctg 1200

gcaggggaca cccgttccag tgagatgccc gagctcacct ccatgcacac cctcttactt 1260

cgggagcaca accggctggc cacagagctc aagagcctga accctaggtg ggatggggag 1320

aggctctacc aggaagcccg gaagatcgtg ggggccatgg tccagatcat cacttaccgg 1380

gactacctgc ccctggtgct ggggccaacg gccatgagga agtacctgcc cacgtaccgt 1440

tcctacaatg actcagtgga cccacgcatc gccaacgtct tcaccaatgc cttccgctac 1500

ggccacaccc tcatccaacc cttcatgttc cgcctggaca atcggtacca gcccatggaa 1560

cccaaccccc gtgtccccct cagcagggtc ttttttgcct cctggagggt cgtgctggaa 1620

ggtggcattg accccatcct ccggggcctc atggccaccc ctgccaagct gaatcgtcag 1680

aaccaaattg cagtggatga gatccgggag cgattgtttg agcaggtcat gaggattggg 1740

ctggacctgc ctgctctgaa catgcagcgc agcagggacc acggcctccc aggatacaat 1800

gcctggaggc gcttctgtgg gctcccgcag cctgaaactg tgggccagct gggcacggtg 1860

ctgaggaacc tgaaattggc gaggaaactg atggagcagt atggcacgcc caacaacatc 1920

gacatctgga tgggcggcgt gtccgagcct ctgaagcgca aaggccgcgt gggcccactc 1980

ctcgcctgca tcatcggtac ccagttcagg aagctccggg atggtgatcg gttttggtgg 2040

gagaacgagg gtgtgttcag catgcagcag cgacaggccc tggcccagat ctcattgccc 2100

cggatcatct gcgacaacac aggcatcacc accgtgtcta agaacaacat cttcatgtcc 2160

aactcatatc cccgggactt tgtcaactgc agtacacttc ctgcattgaa cctggcttcc 2220

tggagggaag cctcctag 2238

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> MPO的引物1，上游序列

<400> 2

taggatccat gctgcctgcc aggt 24

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> MPO的引物1下游序列

<400> 3

ttgaattcct aggaggcttc cctccag 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> MPO的引物2上游序列

<400> 4

tagaattcat gctgcctgcc aggtctct 28

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> MPO的引物2下游序列

<400> 5

atctcgagct aggaggcttc cctcc 25

Claims (10)

1.一种重组质粒在制备检测双链DNA抗体的试剂中的用途，其特征在于：所述质粒是在pGEX-6P-1质粒的多克隆位点区引入2个SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列构建而成；

它是分别在pGEX-6P-1质粒的多克隆位点区的BamHI酶和EcoRI酶之间、EcoRI酶和XhoI酶之间引入SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列构建而成。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述构建的方法如下：

a、以人cDNA为模板，以SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列为引物，扩增得到PCR产物，纯化后用BamHI酶、EcoRI酶进行双酶切，得到片段1；

b、对载体质粒pGEX-6P-1用BamHI酶、EcoRI酶进行双酶切；并与片段1连接，得到载体1；

c、以人cDNA为模板，以SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列为引物，扩增得到PCR产物2，纯化后用EcoRI酶、XhoI酶进行双酶切，得到片段2；

d、对步骤b得到的载体1用EcoRI酶、XhoI酶进行双酶切；并与片段2连接，即可。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述质粒为非甲基化状态的质粒。

4.一种双链DNA抗原包被板，其特征在于：它包被有权利要求1-3任意一项中的重组质粒。

5.权利要求4所述抗原包被板的制备方法，其特征在于：步骤如下：

a、酶标板的预处理：取聚丙乙烯板条，用HCl溶液浸泡1h，紫外线照射过夜；

b、每孔加入1g/L鱼精蛋白，4℃过夜；

c、用洗涤液洗三次、拍干，每孔加入权利要求1-3任意一项中 所述的重组质粒，4℃过夜；

d、用洗涤液洗三次、拍干，再用125U肝素或含5％BSA的PBS4℃封闭过夜；

e、用洗涤液洗三次、拍干，即可。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：

所述洗涤液为含0.005％吐温-20的PBST溶液。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：

每孔质粒浓度为20ng。

8.一种ELISA检测试剂盒，其特征在于：它是检测待检样品中的双链DNA抗体的ELISA检测试剂盒，以权利要求1-3任意一项中的重组质粒为抗原；

其中，它还包括洗涤液、酶标二抗、显色液以及终止液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：

所述洗涤液为含0.05％吐温-20的TRIS缓冲液；所述酶标二抗为辣根过氧化酶标记的人IgG；所述显色液为TMB显色液；所述终止液为浓度为0.25mol/L的HCl溶液。

10.权利要求4所述的抗原包被板、权利要求8所述的ELISA检测试剂盒在制备检测双链DNA抗体的试剂中的用途。

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