CN103882131A - 确定样品中是否存在目标物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种确定样品中是否存在目标物的方法，该方法包括：（1）提供基板，所述基板由疏水材料形成，并且在所述基板的表面形成有捕获探针，其中，所述捕获探针能够与所述目标物结合，并且所述捕获探针与所述目标物的结合能够提高所述基板表面的亲水性；（2）在捕获探针能够与所述目标物结合的条件下，使所述样品与所述基板接触；（3）提高所述基板表面的潮湿度；以及（4）确定所述基板表面是否形成水斑，其中，所述水斑的形成是所述样品中存在所述目标物的指示。利用本发明的方法能够有效地实现对样片中目标物的检测，并且，该方法无需任何检测仪器，成本低、使用简便、可实现高通量、快速裸眼可视化检测基因、基因突变和蛋白。

Description

确定样品中是否存在目标物的方法
技术领域
本发明涉及一种确定样品中是否存在目标物的方法。
背景技术
基因和蛋白检测已成为疾病早期诊断、有害细菌或病毒检测、以及法医学应用的关键技术。特别在癌症、心血管疾病以及传染性疾病中的早期预警与合理化治疗中发挥着重要作用。
目前，已经开发出多种用于筛选基因突变的方法，包括等位基因杂交法，核苷酸掺入的引物延伸法，电泳法，质谱法，核酸测序以及实时扩增阻滞突变系统定量聚合酶链反应检测等。但是，这些方法都需要贵重的检测仪器。目前，开发出一种成本低、使用简便、无需检测仪器、可实现高通量、快速检测基因和蛋白突变的方法迫在眉睫，且对资源匮乏地区尤为重要。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种无需任何检测仪器，成本低、使用简便、可实现高通量、快速裸眼可视化检测基因、基因突变和蛋白的方法。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种确定样品中是否存在目标物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（1）提供基板，所述基板由疏水材料形成，并且在所述基板的表面形成有捕获探针，其中，所述捕获探针能够与所述目标物结合，并且所述捕获探针与所述目标物的结合能够提高所述基板表面的亲水性；（2）在捕获探针能够与所述目标物结合的条件下，使所述样品与所述基板接触；（3）提高所述基板表面的潮湿度；以及（4）确定所述基板表面是否形成水斑，其中，所述水斑的形成是所述样品中存在所述目标物的指示。
发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够有效地实现对样片中目标物的检测，并且，该方法无需任何检测仪器，成本低、使用简便、可实现高通量、快速裸眼可视化检测基因、基因突变和蛋白。需要说明的是，本发明的方法的原理是，当捕获探针与样品混合后，当样品中存在目标物时，捕获探针能够与目标物结合，从而使疏水性基板结合样品处的亲水性增强，进而在提高基板表面的潮湿度时，疏水性基板结合样品处形成水膜，而其他位置形成小水珠，这些小水珠对光起到散射作用，因而裸眼无法观测到小水珠的形成，而仅能在疏水性基板结合样品处观察到水斑的形成（即水膜）；反之，当样品中不存在目标物时，捕获探针的状态不会变化，而基板仍为疏水性，从而在提高基板表面的潮湿度时，基板表面不会产生水膜，即裸眼观测为没有水斑形成。
另外，根据本发明上述实施例的确定样品中是否存在目标物的方法还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述目标物为选自核酸和蛋白质的至少一种。根据本发明一些具体示例，所述目标物为DNA。
根据本发明的实施例，所述基板为硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片。由此，所述基板为疏水性，从而能够有效基于基板表面的亲疏水性，而实施本发明的方法。
根据本发明的一些实施例，所述捕获探针为核酸分子。由此，利用本发明的方法能够实现对样品中DNA目标物的检测。根据本发明的另一些实施例，所述捕获探针与所述目标物形成抗体-抗原复合物。由此，能够实现对样品中蛋白质抗原的检测。
根据本发明的实施例，所述目标物为DNA片段，所述捕获探针为核酸分子，所述捕获探针的5’端与所述基板的表面结合，所述捕获探针的3’末端形成有游离羟基基团，步骤（2）进一步包括：（2-1）在存在报告探针时，使所述样品与所述基板接触，其中，所述报告探针的5’末端具有游离磷酸基团，并且所述报告探针的包含5’末端碱基的连续序列和所述捕获探针的包含3’末端碱基的连续序列分别与所述目标物的一段连续碱基序列的一部分匹配，以便形成不存在错配的双链结构；以及（2-2）在连接酶的作用下，使所述报告探针的5’末端游离磷酸基团与所述捕获探针的3’末端游离羟基基团连接，以便使所述报告探针与所述捕获探针形成磷酸二酯键。由此，疏水性基板表面捕获探针陈列区域的亲水性增强，进而通过提高基板表面的潮湿度，即可基于基板表面形成水斑确定所述样品中存在目标物。
根据本发明的实施例，步骤（2）进一步包括：（2-3）破坏所述双链结构，以便使所述目标物成为游离状态，并在所述基板表面形成由所述捕获探针和所述报告探针形成的单链连接体。由此，有利于后续将单链连接体进行滚环扩增，使基板表面结合的核酸分子量显著提高，从而使疏水性基板表面捕获探针陈列区域的亲水性也相应地显著增强，进而通过提高基板表面的潮湿度，即可基于基板表面形成水斑确定样品中存在目标物。
根据本发明的实施例，在步骤（2-3）通过对所述基板进行清洗，破坏所述双链结构。根据本发明的一些具体示例，所述清洗包括：将所述基板依次进行氢氧化钠浸泡处理和去离子水洗涤。由此，处理效果好，且不会破坏单链连接体的结构，有利于后续进行滚环扩增，提高基板表面结合的核酸分子量，进而显著提高疏水性基板表面捕获探针陈列区域的亲水性，有利于后续通过提高基板表面的潮湿度而容易地实现裸眼观测样品中目标物的存在。
根据本发明的实施例，步骤（2）进一步包括：（2-4）对所述单链连接体进行滚环扩增。由此，能够显著提高基板表面结合的核酸分子量，进而显著提高疏水性基板表面捕获探针陈列区域的亲水性，有利于后续通过提高基板表面的潮湿度而容易地实现裸眼观测样品中目标物的存在。根据本发明的实施例，所述滚环扩增为选自线性滚环扩增、指数滚环扩增和超分支滚环扩增的至少一种。根据本发明的实施例，所述滚环扩增采用环状DNA模板进行，其中所述环状DNA模板的部分序列与所述报告探针的部分序列互补。由此，能够有效实现报告探针的扩增，从而能够显著提高基板表面结合的核酸分子量。
根据本发明的实施例，进行所述滚环扩增30分钟-12小时，优选4小时。由此，滚换扩增的效果好，从而能够显著提高基板表面结合的核酸分子量，以及疏水性基板表面捕获探针陈列区域的亲水性。
根据本发明的实施例，所述连接酶为Taq DNA连接酶。由此，能够有效实现报告探针5’末端游离磷酸基团与所述捕获探针的3’末端游离羟基基团的连接，从而能够使所述报告探针与所述捕获探针形成磷酸二酯键。
根据本发明的实施例，所述捕获探针的长度为10-40nt。由此，捕获探针对目标物的结合能够显著提高疏水基板表面的亲水性，目标物是否存在与提高基板表面的潮湿度时基板表面的水斑是否形成显著相关，从而能够容易地实现裸眼观测样品中目标物的存在。
根据本发明的实施例，所述目标物具有SEQ ID NO：1-3所示的核苷酸序列，所述捕获探针具有SEQ ID NO：4-6所示的核苷酸序列，所述报告探针具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，其中，具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的捕获探针能够与具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的目标物结合，具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的捕获探针能够与具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的目标物结合，具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的捕获探针能够与具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的目标物结合。由此，能够通过上述报告探针和捕获探针能够有效地检测样品中的相应目标物。
根据本发明的实施例，在步骤（3）中，通过哈气提高所述基板表面的潮湿度。由此，本发明的方法操作更加方便、快捷。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的确定样品中是否存在目标物的方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明另一个实施例的确定样品中是否存在目标物的方法的流程及原理示意图；
图3显示了实施例3中基因突变检测的结果；
图4显示了实施例4中进行滚环扩增4小时的基因检测的结果；
图5分别显示了实施例4中进行滚环扩增30min、60min、120min和150min的基因检测的结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种确定样品中是否存在目标物的方法。发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够有效地实现对样片中目标物的检测，并且，该方法无需任何检测仪器，成本低、使用简便、可实现高通量、快速裸眼可视化检测基因和蛋白突变。需要说明的是，本发明的方法的原理是，当捕获探针与样品混合后，当样品中存在目标物时，捕获探针能够与目标物结合，从而使疏水性基板的亲水性增强，进而在提高基板表面的潮湿度时，裸眼即可观测到水斑的形成；反之，当样品中不存在目标物时，捕获探针的状态不会变化，而基板仍为疏水性，从而在提高基板表面的潮湿度时，基板表面不会产生水斑。
根据本发明的实施例，参照图1，本发明的确定样品中是否存在目标物的方法包括以下步骤：
（1）提供疏水性基板
具体地，提供基板，所述基板由疏水材料形成，并且在所述基板的表面形成有捕获探针，其中，所述捕获探针能够与所述目标物结合，并且所述捕获探针与所述目标物的结合能够提高所述基板表面的亲水性。
根据本发明的实施例，所述基板为硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片。由此，所述基板为疏水性，从而能够有效基于基板表面的亲疏水性，而实施本发明的方法。
根据本发明的实施例，所述目标物为选自核酸和蛋白质的至少一种。根据本发明一些具体示例，所述目标物为DNA。即，本发明的方法能够对样品中的目标核酸或蛋白质进行检测。
根据本发明的一些实施例，所述捕获探针为核酸分子。由此，利用本发明的方法能够实现对样品中目标核酸的检测。根据本发明的另一些实施例，所述捕获探针与所述目标物形成抗体-抗原复合物。由此，能够实现对样品中蛋白质抗原的检测。
（2）使样品与所述基板接触
具体地，在捕获探针能够与所述目标物结合的条件下，使所述样品与所述基板接触。
根据本发明的实施例，所述目标物为DNA片段，所述捕获探针为核酸分子，所述捕获探针的5’端与所述基板的表面结合，所述捕获探针的3’末端形成有游离羟基基团，步骤（2）进一步包括：（2-1）在存在报告探针时，使所述样品与所述基板接触，其中，所述报告探针的5’末端具有游离磷酸基团，并且所述报告探针的包含5’末端碱基的连续序列和所述捕获探针的包含3’末端碱基的连续序列分别与所述目标物的一段连续碱基序列的一部分匹配，以便形成不存在错配的双链结构；以及（2-2）在连接酶的作用下，使所述报告探针的5’末端游离磷酸基团与所述捕获探针的3’末端游离羟基基团连接，以便使所述报告探针与所述捕获探针形成磷酸二酯键。由此，疏水性基板表面捕获探针陈列区域的亲水性增强，进而通过提高基板表面的潮湿度，即可基于基板表面形成水斑确定所述样品中存在目标物。
根据本发明的实施例，步骤（2）进一步包括：（2-3）破坏所述双链结构，以便使所述目标物成为游离状态，并在所述基板表面形成由所述捕获探针和所述报告探针形成的单链连接体。由此，有利于后续将单链连接体进行滚环扩增，使基板表面结合的核酸分子量显著提高，从而使疏水性基板表面捕获探针陈列区域的亲水性也相应地显著增强，进而通过提高基板表面的潮湿度，即可基于基板表面形成水斑确定样品中存在目标物。
根据本发明的实施例，在步骤（2-3）通过对所述基板进行清洗，破坏所述双链结构。根据本发明的一些具体示例，所述清洗包括：将所述基板依次进行氢氧化钠浸泡处理和去离子水洗涤。由此，处理效果好，且不会破坏单链连接体的结构，有利于后续进行滚环扩增，提高基板表面结合的核酸分子量，进而显著提高疏水性基板表面捕获探针陈列区域的亲水性，有利于后续通过提高基板表面的潮湿度而容易地实现裸眼观测样品中目标物的存在。根据本发明的另一些实施例，所述氢氧化钠浸泡处理包括：将所述基板置于质量浓度为0.01M的氢氧化钠溶液中3分钟，以便去除未连接的序列。
根据本发明的实施例，步骤（2）进一步包括：（2-4）对所述单链连接体进行滚环扩增。由此，能够显著提高基板表面结合的核酸分子量，进而显著提高疏水性基板表面捕获探针陈列区域的亲水性，有利于后续通过提高基板表面的潮湿度而容易地实现裸眼观测样品中目标物的存在。其中，可以采用的滚环扩增方法不受特别限制，根据本发明的实施例，所述滚环扩增为选自线性滚环扩增、指数滚环扩增和超分支滚环扩增的至少一种。由此，滚换扩增效果好，有利于后续步骤的进行。根据本发明的实施例，所述滚环扩增采用环状DNA模板进行，其中所述环状DNA模板的部分序列与所述报告探针的部分序列互补。由此，能够有效实现报告探针的扩增，从而能够显著提高基板表面结合的核酸分子量。其中，所述环状DNA模板的成环方式不受特别限制，根据本发明的实施例，可以在T4DNA连接酶和外切酶的作用下，利用与所述环状DNA模板相适应的链条DNA使所述环状DNA模板首尾连接形成环状。
根据本发明的实施例，进行滚环扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，进行所述滚环扩增30分钟-12小时，优选4小时。由此，滚换扩增的效果好，从而能够显著提高基板表面结合的核酸分子量，以及疏水性基板表面捕获探针陈列区域的亲水性。此外，根据本发明的一些实施例，可以利用Phi29聚合酶进行所述滚环扩增。
根据本发明的实施例，所述连接酶的种类不受特别限制，只要能够有效实现所述报告探针的5’末端游离磷酸基团与所述捕获探针的3’末端游离羟基基团连接即可。根据本发明的一些具体示例，所述连接酶为Taq DNA连接酶。由此，报告探针5’末端游离磷酸基团与所述捕获探针的3’末端游离羟基基团的连接效果好，从而能够使所述报告探针与所述捕获探针形成磷酸二酯键。
根据本发明的实施例，所述捕获探针的长度不受特别限制，只要能够有效实现对目标物的捕获检测，并且不影响基板的疏水性即可。根据本发明的一些具体示例，所述捕获探针的长度为10-40nt。由此，捕获探针对目标物的结合能够显著提高疏水基板表面的亲水性，目标物是否存在与提高基板表面的潮湿度时基板表面的水斑是否形成显著相关，从而能够容易地实现裸眼观测样品中目标物的存在。
根据本发明的实施例，所述目标物具有SEQ ID NO：1-3所示的核苷酸序列，所述捕获探针具有SEQ ID NO：4-6所示的核苷酸序列，所述报告探针具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，其中，具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的捕获探针能够与具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的目标物结合，具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的捕获探针能够与具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的目标物结合，具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的捕获探针能够与具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的目标物结合。由此，能够通过上述报告探针和捕获探针能够有效地检测样品中的相应目标物。
（3）提高所述基板表面的潮湿度
根据本发明的实施例，提高基板表面的方法不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，在步骤（3）中，通过哈气提高所述基板表面的潮湿度。由此，无需借助任何实验仪器，仅通过人工哈气即可实现本发明，从而使得本发明的方法操作更加方便、快捷。
（4）确定所述基板表面是否形成水斑
其中，所述水斑的形成是所述样品中存在所述目标物的指示。具体地，当样品中存在目标物时，捕获探针能够与目标物结合，从而使疏水性基板的亲水性增强，进而在提高基板表面的潮湿度时，裸眼即可观测到水斑的形成；反之，当样品中不存在目标物时，捕获探针的状态不会变化，而基板仍为疏水性，从而在提高基板表面的潮湿度时，基板表面不会产生水斑。
此外，根据本发明的一些实施例，本发明的确定样品中是否存在目标物的方法还可以包括以下步骤：针对携带突变多态性位点的DNA片段目标物，根据目标基因片段，设计与之部分匹配的长度为10-40nt的捕获探针，其中在捕获探针3’端设置针对检测突变多态性的位点，并在捕获探针5’端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；将捕获探针呈矩阵分布的固定在疏水性基板上，以便获得固定有捕获探针的检测阵列；将包含目标物的样品与前述的报告探针一起加载在检测阵列，通过Taq DNA连接酶来识别并连接与目标物完全匹配的捕获探针与报告探针；固相核酸连接完成后，取出检测阵列放入高盐或高碱溶液中，去除未连接到基板上检测阵列的非特异性序列；向检测阵列表面加入连接好的环状模板序列、phi29聚合酶、dNTP，以便进行滚环扩增反应；采用哈气方式，提高所述基板表面的潮湿度，然后观测基板表面的检测阵列，并利用手机拍照记录基板表面的显影情况，其中显示水斑的区域相对应的捕获探针上的检测位点与目的基因（即目标物）的待测区域相匹配，未显示水斑的区域相对应的捕获探针上的检测位点与目的基因（即目标物）的待测区域不相匹配，进而基于捕获探针序列及其阵列上的检测位点设计情况，对目的基因待测区域的突变多态性进行判读。
根据本发明的实施例，前述的捕获探针可以包括多个针对检测突变多态性的位点，同一阵列上分布的探针的Tm值相差不超过2℃。根据本发明的一些实施例，所述的进行减少空间位阻的序列延长修饰是在检测探针5’端进行polyT、polyC、polyT+polyC或SpaCer6～15C序列的延长修饰。根据本发明的一些具体示例，所述捕获探针5’端的辅助固定修饰为在所述捕获探针5’最末端添加氨基、巯基、羟基或醛基或不加任何修饰。
根据本发明的实施例，其中，与报告探针的部分序列互补的环状DNA模板的部分序列，可以通过以下步骤获得：设计并合成长度为55～100nt的模板ssDNA以及链条ssDNA，其中将模板ssDNA的5’端磷酸化处理，将链条ssDNA固定于基板上，并将该链条ssDNA5’端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰，其中模板ssDNA的两端与链条ssDNA可以部分杂交互补；将包含目标物的样品与模板ssDNA混合，如果目标物与模板ssDNA部分基因完全匹配，在所述链条ssDNA和连接酶（如T4DNA连接酶）的作用下模板ssDNA可以连接成环，以便形成所述环状DNA模板。
根据本发明的另一些实施例，当目标物为蛋白质时，设所述目标物为极少量抗原，并将待测样品固定于疏水性基板上，且不改变所述基板的亲疏水性；基于目标物的氨基酸序列，制备与目标物相应的抗体；使制备获得的与目标物相应的抗体与固定有待测样品的基板接触，从而，当待测样品中包含目标物时，抗体与抗原结合，即与目标物相应的抗体与所述目标物形成抗体-抗原复合物，此时与目标物相应的抗体即为本发明所述的捕获探针。需要说明的是，上述与目标物相应的抗体连接有报告探针，进而在待测样品中存在目标物时，可以在环的存在下，通过酶的作用基于报告探针进行核酸片段扩增，从而显著增加疏水性基板上与待测样品结合处的亲水性物质的分子量，使该处的亲疏水性显著改变，进而，当提高基板的潮湿度时，能够在该处形成裸眼可视的水斑。反之，当待测样品中不存在蛋白质目标物时，疏水性基板的亲疏水性不变，则不会有裸眼可视的水斑形成。由此，同样能够利用本发明的方法，实现对样品中蛋白质抗原的检测。
根据本发明的实施例，需要说明的是，与现有技术相比，本发明的方法具有以下有益的技术效果：
本发明的方法检测基因或蛋白质，是通过固定在载体上的捕获探针与分析物完全匹配或分析物可以将模板ssDNA连接成环形成环状DNA，模板从而引起的核酸扩增，改变了疏水性基板上陈列区域的亲疏水性（而与探针识别的序列不完全匹配时，就不能进行序列的延长，进而被洗脱掉，载体芯片表面的亲疏水性不变），进而通过提高基板表面的潮湿度尤其是人体呼气凝结，基于水斑形成与否，结合捕获探针的序列及在基板上的矩阵式分布情况，即可容易地实现裸眼检测基因或蛋白质。
本发明的方法是以基因芯片为基础，可实现高通量、高特异性、快速、并且易于推广的检测方法。该方法通过在以硅片为代表的固相介质上进行特异性探针引发的核酸扩增反应，改变载体芯片表面亲疏水性来实现裸眼检测基因突变，无需任何检测仪器，只需哈一口气实现芯片的显影（本文中所述的“芯片显影”，是指基板表面水斑的形成），即可确定样品中是否存在目标物。
本发明的方法检测准确性高，具体表现为：通过特异性的探针设计，以及利用Taq连接酶实现单碱基突变的识别连接，通过核酸的等温扩增（即滚环扩增），能够有效地扩大输出信号，显著改变基板的亲疏水性。
本发明的方法具有良好的分辨力，能够有效保障检测的准确性，操作简单，无需任何检测仪器，仅通过哈气即可使芯片显影从而有效实现检测基因或蛋白质。同时解决了现有方法的检测需要配套仪器昂贵、检测过程复杂等技术问题。
本发明的方法适用于基因分型、耐药突变检测、SNP位点筛查等基于核酸突变的领域，尤其是对各种耐药病毒、细菌以及基因分型或感染初期检查具有重要的检测意义，进而能够为临床早期诊断，早期治疗及指导用药提供参考依据。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
其中，表1示出了下面实施例中所用到的部分试剂：
表1
需要说明的是，上表1中各试剂均由发明人设计，并由生物公司合成，其中所述的“目标物”即待测基因片段249wtAGG或待测基因突变片段249muAGC、249muAGT均是依据其来源基因——人肿瘤抑癌基因P53的核苷酸序列合成获得的。
实施例1：基因芯片的制备
基底载体为表面生长了一层600nm的氧化硅涂层的单晶硅片。这种纳米二氧化硅的表面涂层表现出由弱相干干涉形成的表面颜色。这种基底载体是热氧化p++型、硼掺杂、晶体方向为100的单晶硅。二氧化硅层是通过在一个大气压下，H2与O2的气氛下，1000℃热氧化而成。热氧化以后通过切割机(DAD-321，DISCO Corp.，日本)切成需要的大小。制备好的硅片基底，放入1M NaOH溶液中10min，然后用去离子水清洗干净，氮气吹干。之后硅片表面做氨基化修饰。将清洗干净的硅片浸泡在10%的APTES中，反应15min，用去离子水充分清洗干净，放入120℃中，反应3h。至此，氨基化的玻璃片修饰完毕。之后送入北京博奥公司，采用点样仪，按照设计的DNA阵列，固定上5μM ssDNA，4℃存储，以备后用。
实施例2：环的制备
10μl模板ssDNA（Template）、10μl链条ssDNA（splint）以及2.5μl的10×T4缓冲液（660mM Tris-HCl（pH8.0），66mM MgCl2，100mM DTT，1mM ATP）均匀混合，经过90℃5min退火，在25℃放置25min。之后加入0.5μl的T4DNA连接酶（TaKaRa），在16℃孵育12h，之后加入外切酶I（TaKaRa）0.5μl、外切酶III（TaKaRa）0.2μl以及外切酶III的缓冲液（500mM Tris-HCl（pH8.0），50mM MgCl2，10mM DTT）2.5μl，在37℃孵育1h，之后采用85℃15min灭活酶。所得即为环序列溶液，20℃存储，以备后用。
实施例3：基因突变的检测
取固定了捕获探针（见表1）的基因芯片，采用0.1%PBST清洗两次，每次5min，之后采用去离子水清洗2次，每次5min，备用。
然后，参照图2，根据本发明的确定样品中是否存在目标物的方法，按照以下步骤进行基因突变的检测：将20nM待检测的基因突变片段（表1中，249wtAGG、249muAGC、249muAGT）、5μM报告探针以及0.8U/μl Taq DNA连接酶组成的混合液5μl，加入到芯片表面，60℃下反应1h。之后浸泡在0.01M NaOH溶液中5min，去离子水清洗两次，每次5min。加入连接好的环溶液5μl，在60℃下15min，之后室温下放置15min。配置由RCA反应液（phi29反应缓冲液，DTT，dNTP，Phi29聚合酶），取5μl加入到芯片表面，反应4h。最后采用PBST清洗两次芯片，每次5min，并用去离子水清洗两次，每次5min。采用哈气方式观察检测结果，并通过手机成像记录检测结果，见图3。由图3可知，利用本发明的方法进行检测的结果与实际相符。
实施例4：基因的检测
取固定了捕获探针（见表1）的基因芯片，采用0.1%PBST清洗两次,每次5min，之后采用去离子水清洗2次，每次5min，备用。
然后，参照图2，根据本发明的确定样品中是否存在目标物的方法，按照以下步骤进行基因的检测：将20nM待检测的基因片段（表1中，249wtAGG）、5μM报告探针以及0.8U/μlTaq DNA连接酶组成的混合液5μl，加入到芯片表面，60℃下反应1h。之后浸泡在0.01MNaOH溶液中5min，去离子水清洗两次，每次5min。加入连接好的环溶液5ul，在60℃下15min，之后室温下放置15min。配置由RCA反应液（40mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM KCl，10mM MgCl2，5mM(NH4)2SO4，和4mM DTT用于phi29反应缓冲液，DTT，dNTP，Phi29聚合酶），取5μl加入到芯片表面，反应预定时间（同时设5个处理：即分别反应30min、60min、120min、150min和4h）。最后采用PBST清洗两次芯片，每次5min，并用去离子水清洗两次，每次5min。采用哈气方式观察检测结果，并通过手机成像记录检测结果，见图4和图5。由图4和图5可知，利用本发明的方法进行检测的结果与实际相符。并且，比较图4和图5可以看出，滚环扩增反应时间不会影响检测结果，但反应时间越长，扩增产物越多，从而能够更显著地提高基板表面结合的核酸分子量以及疏水性基板表面捕获探针陈列区域的亲水性，即该处的吸水性越好，表现为形成的水斑越清晰，肉眼观测的结果越准确。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Figure IDA0000481688130000011
Figure IDA0000481688130000021

Claims (10)

1.一种确定样品中是否存在目标物的方法，其特征在于，包括：
（1）提供基板，所述基板由疏水材料形成，并且在所述基板的表面形成有捕获探针，其中，所述捕获探针能够与所述目标物结合，并且所述捕获探针与所述目标物的结合能够提高所述基板表面的亲水性；
（2）在捕获探针能够与所述目标物结合的条件下，使所述样品与所述基板接触；
（3）提高所述基板表面的潮湿度；以及
（4）确定所述基板表面是否形成水斑，其中，所述水斑的形成是所述样品中存在所述目标物的指示，
任选地，所述目标物为选自核酸和蛋白质的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标物为DNA，
任选地，所述基板为硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，
任选地，所述捕获探针为核酸分子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获探针与所述目标物形成抗体-抗原复合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标物为DNA片段，所述捕获探针为核酸分子，所述捕获探针的5’端与所述基板的表面结合，所述捕获探针的3’末端形成有游离羟基基团，
步骤（2）进一步包括：
（2-1）在存在报告探针时，使所述样品与所述基板接触，其中，所述报告探针的5’末端具有游离磷酸基团，并且所述报告探针的包含5’末端碱基的连续序列和所述捕获探针的包含3’末端碱基的连续序列分别与所述目标物的一段连续碱基序列的一部分匹配，以便形成不存在错配的双链结构；以及
（2-2）在连接酶的作用下，使所述报告探针的5’末端游离磷酸基团与所述捕获探针的3’末端游离羟基基团连接，以便使所述报告探针与所述捕获探针形成磷酸二酯键。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）进一步包括：
（2-3）破坏所述双链结构，以便使所述目标物成为游离状态，并在所述基板表面形成由所述捕获探针和所述报告探针形成的单链连接体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤（2-3）通过对所述基板进行清洗，破坏所述双链结构，
任选地，所述清洗包括：
将所述基板依次进行氢氧化钠浸泡处理和去离子水洗涤。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）进一步包括：
（2-4）对所述单链连接体进行滚环扩增。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述滚环扩增为选自线性滚环扩增、指数滚环扩增和超分支滚环扩增的至少一种，
任选地，所述滚环扩增采用环状DNA模板进行，其中所述环状DNA模板的部分序列与所述报告探针的部分序列互补，
任选地，进行所述滚环扩增30分钟-12小时，优选4小时，
任选地，所述连接酶为Taq DNA连接酶，
任选地，所述捕获探针的长度为10-40nt。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述目标物具有SEQ ID NO：1-3所示的核苷酸序列，所述捕获探针具有SEQ ID NO：4-6所示的核苷酸序列，所述报告探针具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，
其中，
具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的捕获探针能够与具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的目标物结合，具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的捕获探针能够与具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的目标物结合，具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的捕获探针能够与具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的目标物结合。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，通过哈气提高所述基板表面的潮湿度。
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