CN111718980A - 一种编辑识别特定核酸链的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其主要操作为根据标志物选取与其能进行碱基互补配对的DNA，将所述DNA经退火过程后形成未封闭环状单链DNA，所述环状单链DNA与标志物识别后，在T4核酸连接酶和Phi29核酸聚合酶的催化下加入脱氧核糖核苷三磷酸(Dntp)溶液，以形成滚环扩增产物，选取PET纳米通道膜，并在所述PET纳米通道膜表面负载纳米金颗粒并接枝PDNA后，将滚环扩增产物产物滴加在PET纳米通道膜表面，以得到待识别产物，通过检测所述待识别产物的跨膜离子电流实现对所述标志物的识别。本发明所述一种编辑识别特定核酸链的检测方法，具有检测灵敏度高、检测体系稳定、检测操作简单和应用范围广等优点。

Description

一种编辑识别特定核酸链的检测方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种编辑识别特定核酸链的检测方法。
背景技术
生命活动离不开微小的孔道，仅仅一个细胞核膜上就有成千上万个大小不同的孔道，它们维持了核内与核外之间的物质、能量以及信息的交换，保持细胞的新鲜活力。细胞与环境的物质能量交换、细胞的新陈代谢活动等也是通过细胞膜上存在的大量孔道来实现的。自然生物界存在形形色色的微小孔道，大小不同，在所有这些孔道中，尤为重要的一类是纳米孔道。天然的生物纳米孔道是膜蛋白质分子或蛋白复合物，其孔道内半径大约在几个纳米以内。组成生物孔道的蛋白质在特定的状态下形成对称或者非对称的空间构型,其中的一些构型允许道通过某些特定的分子或者离子，而另一些则被限制通过，这被称为“门控”效应。细胞膜上离子通道的多样性及其调控机制的复杂性使细胞在应对各种环境变化(水分、pH值、温度、光等)及外场刺激时能够及时做出响应，对维持细胞各项正常生理活动具有重要的意义。
虽然由膜蛋白组成的生物纳米孔道在生命过程中发挥着重要的作用，但这类纳米孔道的功能只能在脂质膜中发挥作用，而纳米器件系统又很难建立在脂质膜环境中，所以膜蛋白类孔道的实用性差。因此，利用纳米技术、分子生物学、界面化学、统计物理等综合方法，开发仿生人工合成纳米孔道具有重要基础研究价值和应用前景。
在人工制备的纳米孔道结构中，科研人员可以通过各种物理化学手段，在纳米尺度上调控孔道界面与所输运物质间的各种相互作用，包括空间位阻、静电相互作用、范德华相互作用以及氢键等，从而实现对纳米孔道的界面功能化修饰。具体来说，高分子材料的纳米孔道可以采取表面化学反应法，等离子体处理法和静电自组装法进行修饰；无机材料的阳极氧化铝纳米孔道，可以采取金属离子溅射法，硅烷耦联法和巯基自组装法进行修饰。
仿生微纳米孔道由于在结构和尺寸上与生物体细胞的相似性，使得纳米孔道技术在基因测序、单分子分析以及药物装载等方面显示出潜在的应用价值。理论与实验研究均已表明，在纳米结构界面上的扩散、对流和反应过程与在宏观界面上存在显著差异。
生命体的繁衍离不开核酸信息，它们调控着生命体的生命活动。其中DNA作为一种稳定的脱氧核糖核苷酸，发挥着重要的储存生命信息作用，miRNA在生命体的生命活动过程中起着重要的调控作用，多种研究结果显示，生命体的个体差异性质均因一个或多个基因位点存在差异。通过对某些特定miRNA的检测，可以实现对某些个体的性状的准确预测，例如某奶牛中优良个体所具备的某些有利于生产的特性对应的相关基因，可采取在其幼年期进行对应基因检测，从而直接筛查出最具经济性的个体进行区别培养，miRNA进行检测具有创伤小、方法简便、可重复性的优势，有着良好的市场前景。
尽管将纳米孔道技术应用于生物分子的检测已经有了一些积极的探索，但是目前的研究大多停留在理想条件下对单一目标分子或者不相关的两种成分进行检测，并未能建立一个稳定的检测体系，存在费时费力等问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种编辑识别特定核酸链的检测方法。
本发明提供一种编辑识别特定核酸链的检测方法，根据标志物选取与其能进行碱基互补配对的DNA，将所述DNA经退火过程后形成未封闭环状DNA，所述未封闭环状DNA与标志物识别后，在T4核酸连接酶和Phi29核酸聚合酶的催化下加入脱氧核糖核苷三磷酸(Dntp)溶液，以形成滚环扩增产物，选取PET纳米通道膜，并在所述PET纳米通道膜表面负载纳米金颗粒并接枝PDNA后，将所述滚环扩增产物滴加在所述PET纳米通道膜的表面，以得到待识别产物，通过检测所述待识别产物的跨膜离子电流实现对所述标志物的识别。
进一步地，其具体包括以下几个步骤：
S1、根据所述标志物选取与其能进行碱基互补配对的所述DNA；
S2、制备通用buffer，并将S1中的所述DNA、所述标志物和所述通用buffer进行混合，以得到混合溶液，将所述混合溶液于95℃处理10min后，自然冷却至室温；
S3、向冷却后的所述混合溶液中加入定量的T4核酸连接酶及所述通用buffer，并在37℃下反应3h，再向所述混合溶液中加入定量的Phi29核酸聚合酶及所述通用buffer，并在37℃下反应12h后，加入定量的Dntp溶液，以得到所述滚环扩增产物；
S4、选择所述PET纳米通道膜，将在所述PET纳米通道膜的外表面上依次喷盖纳米铬颗粒和纳米金颗粒，以得到喷金PET纳米通道膜；
S5、制备单链PDNA溶液，将所述单链PDNA溶液滴加在所述喷金PET纳米通道膜上，反应1h后，再向所述喷金PET纳米通道膜上滴加巯基己醇溶液并反应1h后，将所述滚环扩增产物滴加至所述喷金PET纳米通道膜上并反应3h，以得到所述待识别产物；
S6、对所述待识别产物进行跨膜离子电流检测。
进一步地，S2中所述通用buffer包括0.1M NaCl，5mM MgCl2，10mM Tris-HCl，pH为7.5。
进一步地，S2中所述DNA、所述标志物和所述通用buffer按体积比为1:3:33进行混合。
进一步地，若所述标志物为目标RNA，则S2中所述混合溶液由所述DNA、所述标志物、MDNA链和所述通用buffer按体积比为1:3:3:33进行混合制得。
进一步地，S4中所述PET纳米通道膜的孔径为30nm，密度为5E5/cm2。
进一步地，S5中制备单链PDNA溶液的具体操作为：配置1μM，1mL的单链PDNA，并向所述单链PDNA内加入硫醇类还原剂(TCEP)，以将所述单链PDNA的浓度调至10μM，并反应1h后，得到单链PDNA溶液。
进一步地，所述TCEP为三(2-羧乙基)膦。
进一步地，S6的具体操作为：以0.1M的KCl为电解液，以Ag/AgCl为电极，在-2至2V条件下对待识别产物进行跨膜离子电流检测。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：本发明所述一种编辑识别特定核酸链的检测方法，为识别特定核酸链提供了一套体系的检测方法，具有检测灵敏度高、检测体系稳定、检测操作简单和应用范围广等优点。
附图说明
图1是本发明所述一种编辑识别特定核酸链的检测方法(标志物为目标RNA)的流程图。
图2是待识别产物的LSV曲线；
图3是-2V电压下，不同浓度标志物识别后的电流图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
本发明提供一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其主要原理是通过对不同的DNA分别设计响应性生物标志物，联合采用“N次方循环放大”和“递进二次识别”技术，以提高对DNA检测的灵敏度和特异性，并将DNA修饰在对应尺寸的仿生微纳米孔道中，通过对载有DNA的仿生微纳米孔道的膜进行跨膜离子电流变化，以达到实现对不同DNA的检测的目的。该方法可应用在如对可提高奶牛产奶量的相关基因进行检测，以便直接筛查出最具经济性的个体进行区别培养；再如对肿瘤的不同核酸标志物进行检测，以提高肿瘤的早期检。
请参考图1，一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其主要包括以下步骤：
S1、根据标志物选取与其能进行碱基互补配对的DNA；其中，本发明中所述标志物可以为目标DNA链(Target-DNA)或目标RNA链(Target-RNA)，其对应的碱基序列信息记载在表1中；而所述DNA为含有可编辑识别特定核酸链的LDNA(Linear ssDNA)，其碱基序列信息记载在表1中，其中，所述DNA的可编辑部分是指：滚环扩增(Rolling Circle Amplicon)过程中使用的DNA可根据标志物的不同，编辑更改其首尾两端的信息为标志物的互补链信息，并进行识别-扩增-信号转换，最终实现对其他标志物的识别；
S2、制备通用buffer，并将S1中的所述DNA、所述标志物和所述通用buffer按体积比为1:3:33进行混合，混合均匀后得到混合溶液，将混合溶液加热至95℃，并加热处理10min后自然冷却至室温，以得到所述未封闭环状DNA；其中，本发明中所述通用buffer的组成如下：pH＝7.5，0.1MNaCl，5mM MgCl2，10mM Tris-HCl。
具体的，本发明将1μL所述DNA、3μL所述标志物和33μL所述通用buffer进行混合，以制得所述混合溶液；
此外，若该实施例中所述标志物为目标RNA链时，还需添加可编辑的MDNA链，且所述DNA、所述标志物、所述MDNA链和所述通用buffer按体积比为1:3:3:33进行混合；具体的，本发明将1μL所述DNA、3μL所述目标RNA链、3μL所述MDNA链和33μL所述通用buffer进行混合，以制得所述混合溶液；
S3、向冷却后的混合溶液中加入10μL、0.5U的T4核酸连接酶及10μL所述通用buffer，并在37℃下反应3h，使所述未封闭环状DNA退火后形成的未封闭环在与所述标志物位置进行封闭，以得到封闭环状结构的DNA，向所述混合溶液中加入4μL、0.5UPhi29核酸聚合酶及4μL所述通用buffer，并在37℃下反应12h后，加入40μL、25mM的脱氧核糖核苷三磷酸(Dntp)溶液，所述Dntp溶液中的脱氧核糖核苷三磷酸与环状所述DNA中的标志物聚合，以形成具有重复的所述DNA的互补链信息的滚环扩增产物；本发明所得到的滚环扩增产物，其核酸排列信息为不断重复的所述DNA的互补链，且其分子量远高于所述DNA；其中，若标志物为目标RNA链，MDNA链可使得滚环扩增反应正常进行，且脱氧核糖核苷三磷酸直接与环状所述DNA中的MDNA链聚合；若标志物为目标DNA链，则脱氧核糖核苷三磷酸直接与环状所述DNA中的目标DNA链聚合；
S4、选择孔径为30nm、密度为5E5/cm2的PET纳米通道膜，将所述PET纳米通道膜在喷金镀膜仪中进行plasma处理10min，以在所述PET纳米通道膜的外表面上依次喷盖20nm厚的纳米铬颗粒和2nm厚的纳米金颗粒，进而得到喷金PET纳米通道膜；
S5、制备单链PDNA溶液：配置1μM、1mL的单链PDNA，并向所述单链PDNA内加入硫醇类还原剂(TCEP)，以将所述单链PDNA的浓度调至10μM，并反应1h后，得到单链PDNA溶液；本发明所述单链PDNA的碱基序列信息记载在表1中，所述单链PDNA含有可编辑的核酸信息排列，且在5’端与巯基相连，所述单链PDNA可通过碱基互补配对捕捉滚环扩增产物；具体的，本发明中所述硫醇类还原剂为三(2-羧乙基)膦。
将所述单链PDNA溶液以每100μL/cm2的量滴加在所述喷金PET纳米通道膜上，反应1h后将所述喷金PET纳米通道膜洗净吹干，再向吹干后的所述喷金PET纳米通道膜上以100μL/cm2的量滴加1μM的巯基己醇溶液，反应1h并再次将所述喷金PET纳米通道膜洗净吹干后，将所述滚环扩增产物以100μL/cm2的量滴加到吹干的所述喷金PET纳米通道膜上，反应3h，使单链PDNA溶液中的单链PDNA充分抓取滚环扩增产物；由于单链PDNA溶液中的单链PDNA通过金硫键与外表面喷金PET纳米通道膜结合，单链PDNA可通过碱基互补配对捕捉滚环扩增产物，最终将滚环扩增产物固定在所述喷金PET纳米通道膜的纳米孔表面，以得到待识别产物；
S6、以0.1M的KCl为电解液，Ag/AgCl为电极，电解槽由两个腔室组成，所述喷金PET纳米通道膜被固定在两个腔室中间，腔室横截面上的孔和膜的接触，离子可以穿过孔道进行检测，在-2至2V条件下对待识别产物进行跨膜离子电流检测，其LSV曲线结果如图2所示。测量面积由横截面上孔的直径决定。本发明中的电解槽的直接为3mm，测量面积为7mm2，且腔室上方的两个孔直径也是3mm，用来加入电解液和检测电解槽中的温度。
此外，本发明同时对喷金前的PET纳米通道膜(即图中的PET)和喷金PET纳米通道膜负载单链PDNA过程中(即图中的PDNA)的跨膜离子电流进行检测，由图2可知，PET纳米通道膜在识别前进行的每一步修饰，均会引起跨膜电流变化，且均具有各自的特征电流。当测得待识别产物的电流值在-2.51667E-6±6.50103E-7安培范围内时，则表示标志物识别成功，否则则认为标志物识别失败，且由图2可知，标志物识别成功后，相对于上一步负载PDNA的喷金PET纳米通道膜，电流显著增大，且仍高于识别失败的电流。
本方法对特定核酸序列的识别过程发生在RCA反应中，而最后将滚环扩增产物负载到PET纳米通道膜的过程，则是将是否识别成功这一化学信号转换为跨膜离子电流这一电信号(0.1M/L KCl，-2-2V，LSV)，且因PET纳米通道对于跨膜离子电流变化的高灵敏性，还可以达到对不同浓度的标志物的识别和分辨的目的。为了更简单直观地查看对比不同浓度标志物的识别结果，将跨膜电流曲线在-2V时的电流值定位其特征值，即可得到不同浓度标志物在-2V时电流大小，可在标志物浓度未知时据此判断标志物的浓度范围。
由图3可知，不同浓度下的标志物，在本方法中具有不同的跨膜离子电流，且在100aM-600fM浓度区间内呈现出浓度越高，特征电流越大的趋势，因此本方法在识别特定核酸标志物的应用方面具有可行性(此实验检测所用标志物为目标RNA)。
表1
Figure BDA0002491419300000081
在本文中，所涉及的前、后、上、下等方位词是以附图中零部件位于图中以及零部件相互之间的位置来定义的，只是为了表达技术方案的清楚及方便。应当理解，所述方位词的使用不应限制本申请请求保护的范围。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其特征在于，根据标志物选取与其能进行碱基互补配对的DNA，将所述DNA进行退火处理，形成未封闭环状DNA，所述未封闭环状DNA与标志物识别后，在T4核酸连接酶和Phi29核酸聚合酶的催化下加入脱氧核糖核苷三磷酸溶液，以形成滚环扩增产物；选取PET纳米通道膜，在所述PET纳米通道膜表面负载纳米金颗粒并接枝PDNA，然后将所述滚环扩增产物滴加在所述PET纳米通道膜的表面，以得到待识别产物，通过检测所述待识别产物的跨膜离子电流实现对所述标志物的识别。
2.根据权利要求1所述的一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其特征在于，其具体包括以下几个步骤：
S1、根据所述标志物选取与其能进行碱基互补配对的所述DNA；
S2、制备通用buffer，并将所述通用buffer与S1中的所述DNA、所述标志物进行混合，以得到混合溶液，将所述混合溶液于95℃处理10min后，自然冷却至室温；
S3、向冷却后的所述混合溶液中加入定量的T4核酸连接酶及所述通用buffer，在37℃下反应3h后，再向所述混合溶液中加入定量的Phi29核酸聚合酶及所述通用buffer，并在37℃下反应12h后，加入定量的脱氧核糖核苷三磷酸溶液，以得到所述滚环扩增产物；
S4、选择所述PET纳米通道膜，在所述PET纳米通道膜的外表面上依次喷盖纳米铬颗粒和纳米金颗粒，以得到喷金PET纳米通道膜；
S5、制备单链PDNA溶液，将所述单链PDNA溶液滴加在所述喷金PET纳米通道膜上，反应1h后，再向所述喷金PET纳米通道膜上滴加巯基己醇溶液并反应1h，然后将所述滚环扩增产物滴加至所述喷金PET纳米通道膜上并反应3h，以得到所述待识别产物；
S6、对所述待识别产物进行跨膜离子电流检测。
3.根据权利要求2所述的一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其特征在于，S2中所述通用buffer包括：0.1M NaCl，5mM MgCl2，10mM Tris-HCl，其pH为7.5。
4.根据权利要求2所述的一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其特征在于，S2中所述DNA、所述标志物和所述通用buffer按体积比为1:3:33进行混合。
5.根据权利要求2所述的一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其特征在于，若所述标志物为目标RNA，则S2中所述混合溶液由所述DNA、所述标志物、MDNA链和所述通用buffer按体积比为1:3:3:33进行混合制得。
6.根据权利要求2所述的一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其特征在于，S4中所述PET纳米通道膜的孔径为30nm，密度为5E5/cm2。
7.根据权利要求2所述的一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其特征在于，S5中制备单链PDNA溶液的具体操作为：配置1μM、1mL的单链PDNA，并向所述单链PDNA内加入硫醇类还原剂，以将所述单链PDNA的浓度调至1nM，并反应1h后，得到单链PDNA溶液。
8.根据权利要求7所述的一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其特征在于，所述硫醇类还原剂为三(2-羧乙基)膦。
9.根据权利要求1所述的一种编辑识别特定核酸链的检测方法，其特征在于，S6的具体操作为：以0.1M的KCl为电解液，以Ag/AgCl为电极，在-2至2V条件下对待识别产物进行跨膜离子电流检测。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200929

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