CN112795628A - 基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法、检测探针及试剂盒 - Google Patents
基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法、检测探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法、检测探针及试剂盒。本发明的检测方法包括以金纳米颗粒作为载体，对不同金纳米颗粒进行DNA探针单分子标记。当探针与靶miRNA共存时，DNA探针与miRNA目标靶分子杂交互补，诱导探针形成金纳米颗粒二聚体。当金纳米颗粒单体和二聚体通过纳米孔传感器时产生不同的电流轨迹特征信号，从而识别出miRNA目标靶分子。本发明可同时对多种肺癌标志物miRNA生物靶分子的多元检测。本发明解决了固态纳米孔传感器难以对miRNA小生物分子检测的难题，同时实现了对多种肺癌标志物miRNA靶分子的多元联合检测，扩展了氮化硅固态纳米孔在单分子检测领域的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种固态纳米孔传感器检测方法，特别涉及一种基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法、检测探针及试剂盒。
背景技术
miRNA是非蛋白编码的短RNAs，可在转录或转录后水平调节mRNA的表达。大量研究表明，miRNA在细胞增殖、分化、凋亡和代谢方面发挥着重要作用。在多种人类恶性肿瘤中已经检测到异常表达的miRNA，并且与肿瘤的发生、发展、预测、诊断、治疗和术后有关，因此，miRNA作为癌症诊断、预测和治疗的潜在标记物，具有广阔的临床应用前景。miRNA在非小细胞肺癌中扮演着多重角色，包括在肺癌发生过程中发挥促癌基因或抑癌基因的作用，调控肺癌细胞的增殖和分化，参与肺癌的侵袭和转移，影响肺癌对放、化疗的敏感性等。目前，对肺癌的早期诊断存在困难，其被发现时2/3已为晚期。因此，如何提高肺癌早期诊断率已成为改善患者预后的重要课题。作为一种非侵入性诊断方法，miRNA的出现和应用为早期诊断肺癌提供了准确可靠的支持。同时研究表明，联合多种miRNA靶分子，可以提高在诊断肺癌时的灵敏度和特异度，所以实现对多种miRNA目标分子的高灵敏多元检测尤为重要。
由于miRNAs的核糖核苷酸序列较短，在细胞内含量低，且同源性较高，使得miRNAs的高灵敏检测面临挑战。迄今为止，已报道有多种检测miRNAs的方法和技术，主要有Northern Blotting，微阵列芯片法，核酸扩增等，但难以满足miRNAs的特异性高通量检测需求。纳米孔传感器作为一种单分子检测工具，具有无标记、高特异性和灵敏高效等特征，在DNA和蛋白质等生物分子检测上具有潜在的优势。有关生物纳米孔对DNA以及RNA等生物小分子的检测研究已经取得一定的进展。生物纳米孔具有较小的孔径，一般1-2nm左右，允许单链核酸分子通过，通过miRNAs杂交和双链解链反应，生物纳米孔对其具有较高的分辨率。但miRNAs在固态纳米孔中的检测还面临困难，因加工工艺以及膜厚度等因素，固态纳米孔电信号的背景噪音较大，对短的DNA序列等小分子分辨率较低。同时，短的DNA序列在通过固态纳米孔时，速度过快，信号采集也有较高的要求。对此人们对固态纳米孔芯片进行一系列改进，比如表面修饰等，但修饰后的纳米孔成本高，且检测分子单一，不利于高通量的检测。因此，为了进一步扩大固态纳米孔的应用，利用固态纳米孔传感器良好的单分子高分辨特性，探索一个miRNA等小分子的高效多元检测平台，实现对多种癌症标志物的多元检测，具有十分重要的临床医学研究价值。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法、检测探针及试剂盒。本发明基于DNA探针修饰的金纳米颗粒载体，利用纳米孔传感器进行miRNA检测。
技术方案：本发明一种基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法，包括以下步骤：
(1)使用BSPP修饰金纳米颗粒(将BSPP(二水合双(对-磺酸苯基)磷化二钾盐)加入金纳米颗粒溶液，在室温下振荡过夜，将氯化钠缓慢加入到混合物中，同时搅拌，直至颜色从深酒红变成浅紫色)；
(2)将金纳米颗粒与DNA探针孵育，室温下轻轻摇动，得到检测探针；所述检测探针至少包括第一检测探针以及第二检测探针；所述第一检测探针的DNA探针包括用于识别第一目标分子上游片段的第一捕获链，所述第二检测探针的DNA探针包括用于识别第一目标分子下游片段的第二捕获链；
(3)在混合物中加入磷酸钠缓冲液，该混合物在室温下孵育；
(4)将所得混合物离心除去多余的DNA探针；
(5)将步骤(4)得到的经过DNA探针修饰的金纳米颗粒，与目标分子孵育；
(6)使用固态纳米孔传感器对溶液进行检测，使用膜片钳记录检测到的轨迹电流信号。
本发明的步骤(1)中，选定的金纳米颗粒首先经过BSPP处理，有助于探针的修饰和组装体的形成。
优选地，步骤(1)中，BSPP的用量大于金纳米颗粒的用量。
优选地，步骤(1)中，修饰步骤为：将3-6mg的BSPP加入10ml金纳米颗粒溶液(金纳米颗粒溶液中的金纳米球数目为1013个/mL)，在室温下振荡过夜，将固体氯化钠缓慢加入到混合物中，同时搅拌，直至颜色从深酒红变成浅紫色；由此产生的混合物以8000rpm离心5min，然后去除上清液；然后加入0.5ml BSPP(2.5mM)复溶，直至红色。再加入0.5ml甲醇，将混合物再次离心，除去上清液，再加入BSPP 100uL(2.5mM)得到BSPP修饰的金纳米颗粒。优选地，步骤(2)中，所述BSPP修饰的金纳米颗粒与DNA探针以1:1-1:10的摩尔比孵育。
优选地，步骤(2)中，孵育的时间为16h。
步骤(2)中，所述检测探针还包括第三检测探针以及第四检测探针；所述第三检测探针的DNA探针包括用于识别第二目标分子上游片段的第三捕获链，所述第四检测探针的DNA探针包括用于识别第二目标分子下游片段的第四捕获链；所述第三检测探针以及第四检测探针的金纳米颗粒的直径与第一检测探针以及第二检测探针的金纳米颗粒的直径不同。
步骤(2)中，所述第一检测探针以及第二检测探针连接的金纳米颗粒的粒径为5nm。
所述检测探针还包括第三检测探针以及第四检测探针连接的金纳米颗粒的粒径为10nm。
步骤(3)中，磷酸钠缓冲液的组成为：1M/L NaCl，100mM/L Na2HPO4和100mM/LNaH2PO4，pH＝7.4。
步骤(3)中，混合物中加入磷酸钠缓冲液，每隔30min加一次，总共加入5次，使得溶液中NaCl的浓度为100nM。
优选地，步骤(3)中，混合物在室温下孵育的时间大于24h。
优选地，步骤(4)中，离心的条件为：转速12000rpm，时间：20min。
优选地，步骤(4)中，所述复溶的步骤为：0.1M/L磷酸钠缓冲液(PBS，0.1M/L NaCl，10mM/L Na2HPO4和10mM/L NaH2PO4，pH＝7.4)进行复溶，总共离心2次。
步骤(5)中，孵育的时间不少于10h。
步骤(6)中，所述固态纳米孔传感器为氮化硅纳米孔，纳米孔的孔径为40nm。
所述第一目标分子或第二目标分子选自miR-21、miR-486、miR-375、miR-205、miR-486以及miR-708。
每个捕获链的长度为6-12nt。
本发明所述的一种肺癌标志物miRNA靶分子的检测方法，包括以下步骤：
(S1)使用BSPP修饰金纳米颗粒，将BSPP加入金纳米颗粒溶液，在室温下振荡过夜，将氯化钠缓慢加入到混合物中，同时搅拌，直至颜色从深酒红变成浅紫色；
(S2)将金纳米颗粒与DNA探针孵育，室温下轻轻摇动，得到检测探针；所述检测探针包括第一检测探针、第二检测探针、第三检测探针以及第四检测探针；所述第一检测探针的金纳米颗粒直径为5nm，DNA探针如SEQ ID NO.1所示；所述第二检测探针的金纳米颗粒直径为5nm，DNA探针如SEQ ID NO.2；所述第三检测探针的金纳米颗粒直径为10nm，DNA探针如SEQ ID NO.3所示；所述第四检测探针的金纳米颗粒直径为10nm，DNA探针如SEQ ID NO.4所示；
(S3)在混合物中加入磷酸钠缓冲液，该混合物在室温下孵育；
(S4)将所得混合物离心除去多余的DNA探针；
(S5)将步骤(S4)得到的经过DNA探针修饰的金纳米颗粒，与目标分子miRNA-21以及miRNA-486孵育；
(S6)使用固态纳米孔传感器溶液进行检测，使用膜片钳记录检测到的轨迹电流信号。
优选地，步骤优选地，步骤(S1)中，BSPP的用量大于金纳米颗粒的用量；具体修饰步骤与上文所述的方法相同。
优选地，步骤(S2)中，孵育的时间为16h。优选地，步骤(S3)中，溶液中的NaCl的终浓度为100nM。
本发明所述的一种用于固态纳米孔传感器的检测探针，包括金纳米颗粒以及与所述金纳米颗粒连接的DNA探针，所述DNA探针包括与金纳米颗粒连接的连接链以及用于捕获目标分子的捕获链；所述检测探针包括第一检测探针以及第二检测探针；所述第一检测探针的DNA探针包括用于识别目标分子上游片段的第一捕获链，所述第二检测探针的DNA探针包括用于识别目标分子下游片段的第二捕获链。
所述目标分子为miRNA；所述捕获链长度为6-12nt；所述锚定链为PolyA片段；所述DNA探针在锚定链以及捕获链之间还具有柔性片段，所述柔性片段的长度为5-10nt。
本发明所述的金纳米颗粒载体粒径选择5nm，连接链为PolyA片段的长度为55-65nt。
本发明所述的金纳米颗粒载体粒径选择10nm，连接链为PolyA片段的长度为75-85nt。
本发明所述的柔性链嵌于连接链以及捕获链之间，便于减少空间位阻和便于捕获链对于目标分子的识别。
本发明所述的检测探针用于检测肺癌标志物时，所述的检测探针可以根据不同的目标分子，制备不同目标分子的识别探针。
当用于同时检测两种目标分子时，所述检测探针可以为检测探针体系，包括用于检测第一目标分子以及第二目标分子的检测探针。
用于第一目标分子检测的检测探针包括第一检测探针以及第二检测探针，用于第二目标分子检测的检测探针包括第三检测探针以及第四检测探针；所述第一检测探针以及第二检测探针的金纳米颗粒尺寸大小与第三检测探针以及第四检测探针金纳米颗粒尺寸大小是不同的，保证在用于固态纳米孔传感器检测时产生不同的信号。
当上述的检测体系中，金纳米颗粒载体使用的纳米颗粒尺寸为5nm和10nm，两种大小不同的纳米颗粒组装可以得到5-5nm，10-10nm的两种二聚体组合，在氮化硅纳米孔传感器电信号中能够灵敏区分。
所述的金纳米颗粒上修饰的两段式DNA探针，一端polyA序列中腺嘌呤与金纳米颗粒有较强的吸附能力，数量可控地覆盖在金纳米颗粒上面，同时另一端设计与miRNA互补的捕获链(制备的两种探针的捕获链分别识别目标分子的不同区域)，对miRNA进行高效特异地捕获，形成稳定的二聚体组装结构。
进一步地，本发明提供了用于检测肺癌标志物miRNA的检测探针；所述的标志物选自miR-21、miR-486、miR-375、miR-205、miR-486以及miR-708中的一种或者多种。
当所述的检测探针用于多元检测的miRNA靶分子为miR-21以及miR-486，本发明提供了一种用于检测两种标志物的检测体系，该检测体系包括了第一检测探针、第二检测探针、第三检测探针以及第四检测探针，所述第一检测探针的金纳米颗粒直径为5nm，DNA探针如SEQ ID NO.1所示；所述第二检测探针的金纳米颗粒直径为5nm，DNA探针如SEQ ID NO.2；所述第三检测探针的金纳米颗粒直径为10nm，DNA探针如SEQ ID NO.3所示；所述第四检测探针的金纳米颗粒直径为10nm，DNA探针如SEQ ID NO.4所示。
所述的检测探针进行多元检测的miRNA靶分子为miR-21以及miR-486，能够特异性的与金纳米颗粒结合，形成5-5nm，10-10nm两种不同尺寸的二聚体组装体，从而实现对肺癌早期标志物的多元检测。该方案所使用的氮化硅固态纳米孔尺寸为直径40nm，长度100nm，对金纳米颗粒及其组装体具有良好的区分度。
通过本发明的技术方案，我们可以得到良好DNA探针单分子标记的金纳米颗粒载体，分别捕获2种肺癌标志物miR-21和miR-486，并在纳米孔传感器上进行高灵敏信号检测。
本发明还提供了包含上述检测探针的检测试剂盒。
有益效果：(1)本发明利用不同尺寸的金纳米颗粒为载体，针对多种肺癌标志物miRNA靶分子设计不同的DNA探针，将其修饰在不同尺寸的金纳米颗粒表面，特异性地捕获miRNA靶分子，引起金纳米颗粒组装形成二聚体，单体和组装体通过氮化硅固态纳米孔传感器进行高灵敏电信号检测，从而实现肺癌标志物miRNA靶分子的多元检测，属于固态纳米孔传感器检测领域；(2)本发明结合纳米技术，利用固态纳米孔单分子传感对两种不同的肺癌早期标志物miR-21、miR-486进行检测，有效的提高了疾病的早期诊断和治疗，本发明设计两段式DNA探针，一段利用polyA序列对金纳米颗粒进行单分子标记，另一段为捕获链，与miRNA靶分子杂交互补，针对miR-21、miR-486设计不同的DNA探针修饰在金纳米颗粒表面，当miRNA靶分子出现时可以连接两个金纳米颗粒捕获探针，从而形成二聚体组装结构；组装前后的纳米颗粒在氮化硅纳米孔中进行现高灵敏检测，通过氮化硅纳米孔传感器电流信号上识别出不同的miRNA分子，从而实现了对肺腺癌早期检测目标miRNA靶分子的多元检测；(3)本发明使用的金纳米颗粒大小均一、性质稳定，具有良好的生物相容性，在纳米孔中受到较强的电场驱动力，具有高通量和高信噪比的优势；(4)本发明使用的两段式DNA探针，可控的进行金纳米颗粒的修饰，同时具有高的特异性，有利于金纳米颗粒的组装；(5)本发明使用金纳米颗粒载体捕获miRNA靶分子后形成的二聚体结构，在氮化硅固态纳米孔传感器具有信号放大的优势，便于信号识别；(6)本发明使用的氮化硅纳米孔传感器大小尺寸可控，操作简单，突破了待检测分子与纳米孔尺寸相近的限制，解决了小分子在纳米孔检测中背景噪音和信号采集的问题，提高了纳米孔的检测通量和灵敏性；(7)本发明实现了对肺癌早期检测标志物miR-21和miR-486靶分子高灵敏单分子多元检测。
附图说明
图1为本发明的原理示意图，其中(a)图为金纳米颗粒DNA探针设计和纳米颗粒组装图；(b)图为金纳米颗粒以及组装体在氮化硅固态纳米孔传感器中的检测示意图。
图2为本发明实施例1制备的金纳米颗粒探针捕获目标分子后形成金纳米颗粒二聚体结构的TEM图，其中，(a)图为10nm金纳米颗粒捕获miRNA-486形成的二聚体结构；(b)图5nm金纳米颗粒捕获miRNA-21形成的二聚体结构。
图3为不同尺寸金纳米颗粒探针和靶分子miRNA-21和miRNA-486结合后，通过纳米孔传感器产生的电流信号轨迹图。
图4为5nm金纳米颗粒单体和金纳米颗粒探针捕获miRNA-21后形成二聚体的阻塞信号幅值的高斯统计图。
图5为10nm金纳米颗粒单体和金纳米颗粒探针捕获miRNA-486后形成二聚体的阻塞信号幅值的高斯统计图。
图6为对金纳米颗粒探针捕获miRNA-21和miRNA-486目标分子组装前后的电流信号的阻塞幅值高斯拟合图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例来对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1：金纳米颗粒探针的制备和对miRNA靶分子检测的具体实施包括如下步骤：
步骤1：BSPP(3mg)加入到10ml金纳米溶液(AuNPs的直径为5nm)中，并将混合物在室温下振荡过夜。
步骤2：将氯化钠缓慢加入到该混合物中，同时搅拌，直至颜色从深酒红变成浅紫色。
步骤3：由此产生的混合物离心5min(8000rpm)，然后取出上清液。然后再加入0.5ml BSPP(2.5mM/L)，加入0.5ml甲醇。将混合物再次离心，除去上清液，在加入BSPP100uL(2.5mM/L)。
步骤4：在BSPP-AuNPs加入SEQ ID NO.1所示的DNA片段进行DNA探针单分子标记。
具体为：(1)首先将BSPP-AuNPs与SEQ ID NO.1所示的DNA片段以摩尔比为1:10的比例孵育16小时，室温下轻轻摇动。
(2)然后在BSPP-AuNPs和DNA的混合物中加入1M/L的磷酸钠缓冲液(PBS缓冲液：1M/L NaCl，100mM/L Na2HPO4和100mM/L NaH2PO4，pH＝7.4)，每隔30min加一次，至溶液中NaCl的浓度为100nM/L，总共加入5次，该混合物在室温下孵育40h。
(3)将所得混合物离心20min(12000rpm)以除去多余的DNA。使用0.1M/L磷酸钠缓冲液(PBS，0.1M/L NaCl，10mM/L Na2HPO4和10mM/L NaH2PO4，pH＝7.4)进行复溶，总共离心2次,得到第一探针标记的金纳米颗粒，作为第一检测探针。
通过以上方法，分别制备第二检测探针、第三检测探针以及第四检测探针，区别在于：
第二检测探针：BSPP-AuNPs加入SEQ ID NO.2所示的DNA片段。
第三检测探针：选用的AuNPs的平均粒径为10nm，得到的BSPP-AuNPs加入SEQ IDNO.3所示的DNA片段。
第四检测探针：选用的AuNPs的平均粒径为10nm，得到的BSPP-AuNPs加入SEQ IDNO.4所示的DNA片段。
表1 DNA探针设计和目标分子序列
表1为DNA探针设计和检测目标分子序列，其中DNA-1与DNA-2为miRNA-21的探针，DNA-3和DNA-4为miRNA-486的探针。
本发明通过实施例1制备的检测探针可以同时检测miR-21和miR-486靶分子。本实施例中通过对每个miRNA靶分子设计不同的探针，在探针捕获到miRNA靶分子后可以形成不同构象的二聚体结构，同时二聚体结构还能够与金纳米探针颗粒产生的纳米孔电信号具有明显的区分度，在本实施例中，采用5nm-5nm的金纳米颗粒设计miR-21分子的捕获探针，10nm-10nm及纳米颗粒设计miR-486分子的捕获探针。
图1展示了DNA探针修饰金纳米颗粒和组装过程以及氮化硅固态纳米孔检测二聚体组装结构的示意图。两段式的DNA探针一段通过polyA序列对金纳米颗粒表面覆盖和调控，实现DNA探针单分子标记，同时当溶液中出现miRNA时，探针可以捕获miRNA靶分子，捕获到的miRNA靶分子连接两个DNA探针标记的金纳米颗粒形成二聚体组装结构。在本发明方案中，金纳米颗粒探针在形成二聚体结构和单个的金纳米颗粒探针相比，引起体积和构象发生了很大的变化，在使用氮化硅固态纳米孔传感器检测时可以检测到具有明显差异性的特征信号。
实施例2：miR-21和miR-486的固态纳米孔检测
(1)将miRNA靶分子包括miR-21和miR-486等比例加入到设计的探针溶液中，混合物过夜。
(2)将反应后溶液加入孔径为40nm的氮化硅固态纳米孔传感器，施加0-1000mV的不同偏置电压进行信号检测，驱动金球过孔，观测纳米颗粒的易位过程，使用膜片钳记录轨迹电流信号。其采样频率为100KHz，低通滤波截止频率为10KHz。
图2为DNA探针调控的金纳米颗粒与miRNA靶分子结合后，形成的纳米颗粒二聚体的TEM图，从图2的结果可以看出，本发明设计的检测探针在DNA探针其中一端的腺嘌呤A序列和金纳米颗粒表面有强的吸附能力，可以覆盖在金纳米颗粒表面，既减少了金纳米颗粒的聚集，又可以调控在金纳米颗粒表面的DNA探针数量。DNA探针另一端为捕获链，特异性与miRNA结合，当加入miRNA靶分子后，两种尺寸的金纳米颗粒都经过条件培养形成了良好的二聚体结构。
图3为将金纳米颗粒与miRNA靶分子结合后的产物加入纳米孔传感器得到的电流信号轨迹图。纳米孔的离子电流为KCl电解质溶液中正负离子在纳米孔中的定向运动，当溶液中分子进入纳米孔时，由于体积排阻效应以及分子电荷的变化，会引起电流信号的变化。从图3中可以看出金纳米颗粒与miRNA靶分子结合前后的单体和组装体在纳米孔中易位时呈现明显的不同电流层次，阻塞电流ΔI随着金纳米颗粒直径的增大而增大。根据数据统计分析，水平1的位置代表的是5nm Au-DNA探针的信号，而水平3的位置代表的是10nm Au-DNA的信号，当这两种探针分别遇到他们的检测物时，探针会捕获相应的目标从而形成组装体，那么通过纳米孔时电流就会增大，因此，水平2的位置代表就是miRNA-21与5nm金纳米颗粒组装体的信号，水平4代表的时miRNA-486与10nm金纳米颗粒组装体的信号。
图4为氮化硅固态纳米孔传感器在600mV下对5nm的miRNA-21分子的捕获探针检测信号和提纯捕获miRNA-21分子形成的二聚体结构的检测信号(图4中上图为5nm的miRNA-21分子的捕获探针检测信号，图4下图为miRNA-21分子形成的二聚体结构的检测信号)，从图4中可以看出，在形成二聚体结构后，使用氮化硅固态纳米孔传感器检测的信号其阻塞信号的幅值明显变大，在对两种检测的阻塞信号的幅值进行统计之后，可以看出二聚体形成的阻塞信号幅值约为单体信号的两倍。
图5为氮化硅固态纳米孔传感器在600mV下对10nm的miRNA-486分子的捕获探针检测信号和提纯捕获miRNA-486分子形成的二聚体结构的检测信号(图5中上图为10nm单体金纳米颗粒的miRNA-486分子的捕获探针检测信号；图5中下图为捕获miRNA-486分子形成的二聚体结构的检测信号)，从图5中可以看出，在形成二聚体结构后，纳米孔传感器检测的阻塞信号的幅值明显变大，可以看出形成的二聚体结构其阻塞幅值约为金纳米单体捕获探针的两倍。
图6为对金纳米颗粒捕获探针和二聚体组装结构轨迹电流阻塞信号幅值的统计拟合线分布图，从图6中我们而已明显的看到，检测到的信号具有明显的区分度，基于不同尺寸的金纳米颗粒设计的miRNA靶分子捕获探针可以对不同的miRNA靶分子实现单分子水平上的多元检测。
所有的测试结果表明，我们设计的探针可以实现良好的金纳米球单颗粒标记，同时在捕获到miRNA靶分子形成二聚体结构后，在氮化硅固态纳米孔中实现高灵敏的单分子检测，同时设计的不同尺寸分布探针可以实现对miR-21，miR-486多种miRNA靶分子高灵敏单分子水平的多元检测。本发明不仅扩展了氮化硅固态纳米孔传感器在miRNA小分子检测领域的应用，同时实现了对miRNA的多元检测，具有十分重要的临床医学意义。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法、检测探针及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
tacgacgtat cgaatagtc 79
<210> 2
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
tgcatggttc aacatcagt 79
<210> 3
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tacgacgtag gacatgact 99
<210> 4
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tgcatggtct cggggcagc 99
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uccuguacug agcugccccg ag 22
Claims (10)
1.一种基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用BSPP修饰金纳米颗粒；
(2)将BSPP修饰的金纳米颗粒与DNA探针孵育，室温下轻轻摇动，得到检测探针；所述检测探针至少包括第一检测探针以及第二检测探针；所述第一检测探针的DNA探针包括用于识别第一目标分子上游片段的第一捕获链，所述第二检测探针的DNA探针包括用于识别第一目标分子下游片段的第二捕获链；
(3)在混合物中加入磷酸钠缓冲液，该混合物在室温下孵育；
(4)将所得混合物离心除去多余的DNA探针；使用磷酸钠缓冲液进行复溶，离心2-3次；
(5)将步骤(4)得到的经过DNA探针修饰的金纳米颗粒，与目标分子孵育；
(6)使用固态纳米孔传感器对检测溶液进行检测，使用膜片钳记录检测到的轨迹电流信号。
2.根据权利要求1所述的基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述检测探针还包括第三检测探针以及第四检测探针；所述第三检测探针的DNA探针包括用于识别第二目标分子上游片段的第三捕获链，所述第四检测探针的DNA探针包括用于识别第二目标分子下游片段的第四捕获链；所述第三检测探针以及第四检测探针的金纳米颗粒的直径与第一检测探针以及第二检测探针的金纳米颗粒的直径不同；每个捕获链的长度为6-12nt。
3.根据权利要求1所述的基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第一检测探针以及第二检测探针连接的金纳米颗粒的粒径为5nm。
4.根据权利要求2所述的基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法，其特征在于，所述检测探针还包括第三检测探针以及第四检测探针连接的金纳米颗粒的粒径为10nm。
5.根据权利要求1所述的基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法，其特征在于，步骤(6)中，所述固态纳米孔传感器为氮化硅纳米孔，纳米孔的孔径为40nm。
6.根据权利要求2所述的基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法，其特征在于，所述第一目标分子或第二目标分子选自miR-21、miR-486、miR-375、miR-205、miR-486以及miR-708。
7.一种肺癌标志物miRNA靶分子的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(S1)使用BSPP修饰金纳米颗粒，将BSPP加入金纳米颗粒溶液，在室温下振荡过夜，将氯化钠缓慢加入到混合物中，同时搅拌，直至颜色从深酒红变成浅紫色；
(S2)将金纳米颗粒与DNA探针孵育，室温下轻轻摇动，得到检测探针；所述检测探针包括第一检测探针、第二检测探针、第三检测探针以及第四检测探针；所述第一检测探针的金纳米颗粒直径为5nm，DNA探针如SEQ ID NO.1所示；所述第二检测探针的金纳米颗粒直径为5nm，DNA探针如SEQ ID NO.2；所述第三检测探针的金纳米颗粒直径为10nm，DNA探针如SEQID NO.3所示；所述第四检测探针的金纳米颗粒直径为10nm，DNA探针如SEQ ID NO.4所示；
(S3)在混合物中加入磷酸钠缓冲液，混合物在室温下孵育；
(S4)将所得混合物离心除去多余的DNA探针；
(S5)将步骤(S4)得到的经过DNA探针修饰的金纳米颗粒，与目标分子miRNA-21以及miRNA-486孵育；
(S6)使用固态纳米孔传感器对溶液进行检测，使用膜片钳记录检测到的轨迹电流信号。
8.一种用于固态纳米孔传感器的检测探针，其特征在于，包括金纳米颗粒以及与所述金纳米颗粒连接的DNA探针，所述DNA探针包括与金纳米颗粒连接的锚定链以及用于捕获目标分子的捕获链；所述检测探针包括第一检测探针以及第二检测探针；所述第一检测探针的DNA探针包括用于识别目标分子上游片段的第一捕获链，所述第二检测探针的DNA探针包括用于识别目标分子下游片段的第二捕获链。
9.根据权利要求8所述的用于固态纳米孔传感器的检测探针，其特征在于，所述目标分子为miRNA；所述捕获链长度为6-12nt；所述锚定链为PolyA片段；所述DNA探针在锚定链以及捕获链之间还具有柔性片段，所述柔性片段的长度为5-10nt。
10.一种包含如权利要求8或9所述的检测探针的检测试剂盒。
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