CN112961906B - 金纳米棒检测探针、制备方法、检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金纳米棒检测探针、制备方法、检测方法及其应用。所述检测探针包括金纳米棒以及连接在所述金纳米棒两端的与目标分子互补的核酸探针。本发明通过巯基核酸探针对金纳米棒两端选择性修饰，与目标检测物miRNA分子通过碱基互补配对特异性结合，使得金纳米棒进行线性组装，该组装体通过纳米孔时，引起高信噪比的易位信号，从而实现了氮化硅纳米孔传感器对miRNA小分子的高灵敏检测。本发明克服了生物小分子在氮化硅纳米孔检测中速度快，信号分辨率低的缺点，同时提高了固体纳米孔的分辨率和检测通量，扩展了氮化硅纳米孔在单分子检测领域的应用。
Description
技术领域
本发明属于氮化硅纳米孔传感器检测领域，特别涉及一种金纳米棒检测探针、制备方法、检测方法及其应用。
背景技术
miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，参与各种新陈代谢和信号传导途径，如生长发育、病毒防御、以及细胞增殖和凋亡等，并且与肿瘤的发生、发展、预测、诊断、治疗和术后有关，因此，miRNA作为癌症诊断、预测和治疗的潜在标记物，具有广阔的临床应用前景。miRNA在非小细胞肺癌中扮演着多重角色，包括在肺癌发生过程中发挥促癌基因或抑癌基因的作用，调控肺癌细胞的增殖和分化，参与肺癌的侵袭和转移，影响肺癌对放、化疗的敏感性等。因此miRNA表达谱的差异已成为肺癌早期诊断和临床诊疗重要的生物标志物。但由于miRNAs的核苷酸序列较短，在细胞内含量低，且同源性较高，使得miRNAs的高灵敏检测面临挑战。迄今为止，已报道有多种检测miRNAs的方法和技术，主要有NorthernBlotting，微阵列芯片法，核酸扩增，荧光等，但这些方法需要标记，扩增等技术，过程繁琐，容易引入误差，难以实现miRNAs的特异性高通量检测需求。
纳米孔传感器作为一种单分子检测工具，具有无标记、高特异性和灵敏高效等特征，在DNA和蛋白质等生物分子检测上具有潜在的优势。有关生物纳米孔对DNA以及RNA等生物小分子的检测研究已经取得一定的进展。生物纳米孔具有较小的孔径，一般1-2nm左右，只允许单链核酸分子通过，通过miRNAs杂交和双链解链反应，实现mRNA等小分子片段的识别。固态纳米孔具有大小尺寸可控，性质稳定，适用于各种环境的优势。但miRNAs在固态纳米孔中的检测还面临挑战。因加工工艺以及膜厚度等因素，sub-2nm的纳米孔制备成本较大，耗时长，不利用大规模的制备应用。对较大的固态纳米孔制备简易，但分辨率又受限于纳米孔与检测分子尺寸相近的约束。同时，短的核苷酸序列在通过固态纳米孔时，速度过快，对信号采集也有较高的要求。因此本发明设计了一种金纳米棒检测探针，可特异性捕获miRNA，既保留氮化硅纳米孔传感器在各种极性环境下对多种检测物的通用性，又实现对miRNA等生物小分子的高通量、高灵敏检测，大大扩展了固态纳米孔的应用。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种金纳米棒检测探针，通过置换反应在金纳米棒两端修饰核酸探针，可特异性捕获miRNA；该检测探针作为检测miRNA等小分子的载体，解决了纳米孔信号识别中孔的大小和待检测分子尺寸相近的局限，提高了纳米孔检测信号的分辨率，既保留氮化硅纳米孔传感器在各种极性环境下对多种检测物的通用性，又实现对miRNA等生物小分子的高通量、高灵敏检测。本发明还提供了金纳米棒检测探针的制备方法。本发明另外提供了金纳米棒检测探针在检测miRNA中的方法及其应用。本发明通过金纳米棒的线性组装，通过纳米孔传感器产生的电信号，来检测miRNA的浓度。
技术方案：本发明所述的一种金纳米棒检测探针，包括金纳米棒以及连接在所述金纳米棒两端的与目标分子互补的核酸探针；所述金纳米棒为线性结构。
优选地，所述金纳米棒的长径比大于3。
优选地，所述金纳米棒的长度为64±4nm nm，直径为16±2nm nm，长径比约为4。在纳米孔中具有高的信噪比。
优选地，所述金纳米棒表面依次经过CTAB以及SDS处理，经过处理后的金纳米棒带正电荷。
本发明的金纳米棒检测探针由于金纳米棒的各向异性，在易位的过程中可以通过调控纳米孔的尺寸大小来调节金纳米棒的易位方式，获得高信噪比的纳米孔易位信号，极大地提高检测通量，同时利用金纳米棒的各向异性设计并调控易位分子的易位行为，可以得到更具有符合预期设计的易位信号。
优选地，所述检测探针通过以下方法制备：金纳米棒加入CTAB溶液，混合均匀，加入巯基修饰的核酸探针，震荡均匀，室温反应，离心；将离心所得的加入SDS溶液，震荡均匀，加入巯基修饰的核酸探针，震荡均匀，室温反应，加盐老化，离心得到检测探针。
优选地，所述检测探针通过以下方法制备：
步骤(1)：取金纳米棒加入过量的CTAB溶液，混合均匀，再加入巯基修饰的核酸探针溶液，震荡均匀，放到摇床上室温反应8-12h，金纳米棒与巯基修饰的核酸探针的摩尔比1:50-100；
步骤(2)：将步骤(1)反应后的样品取出，离心，除去上清液，使用超纯水复溶，重复2-3次，加入过量的SDS溶液，震荡均匀，加入巯基修饰的核酸探针溶液，震荡均匀，放到摇床上反应8-10h；
步骤(3)：将步骤(2)制备的样品加入NaCl溶液老化，溶液中盐浓度为50-100mM；
步骤(4)：将步骤(3)制备的样品离心，使用超纯水复溶，重复2-3次，将得到的检测探针样品放置到4℃保存。
步骤(3)中，加盐老化可以提高巯基DNA的连接效率。
本发明将设计的金纳米棒，通过CTAB和SDS两种不同分散剂体系下分步置换：CTAB分散剂体系保证了金纳米棒上少量的CTAB被置换，特别是金纳米棒两端的CTAB被置换，SDS分散剂体系保证了金纳米棒与溶液中的分散性与耐盐性，且二次修饰保证了足够的DNA链修饰在金纳米棒两端作为捕获探针，在金纳米棒的两端特异性修饰核酸探针与miRNA目标分子特异性结合。
事实上，本发明利用金纳米棒两端的CTAB分散比较稀疏，巯基DNA链优先于两端置换CTAB，通过调控巯基DNA与金纳米棒浓度，实现DNA链可控地修饰在金纳米棒的两端。
本发明第二方面提供了一种用于检测miRNA的组合探针，所述组合探针包括第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针包括金纳米棒以及在金纳米棒两端修饰的用于捕获目标分子上游片段的第一核酸探针；所述第二检测探针包括金纳米棒以及在金纳米棒两端修饰的用于捕获目标分子下游片段的第二核酸探针；所述目标分子为miRNA。
本发明在金纳米棒两端修饰的核酸探针，核酸探针一端为巯基通过金-硫键将DNA序列连接在金纳米棒上，另一端与待测的miRNA目标分子序列互补，可以特异性的捕获miRNA小分子；通过第一检测探针以及第二检测探针两端修饰的核酸探针与miRNA的上下游分别结合，引起金纳米棒的线性组装，该组装体通过纳米孔时，产生高信噪比的易位信号，便于识别和分析，满足了氮化硅纳米孔传感器对miRNA小分子高灵敏检测的需求，来实现生物小分子的检测与表征。
优选地，所述第一核酸探针或第二核酸探针的捕获链的长度为8-14nt。
优选地，所述第一核酸探针如SEQ ID NO.1所示；所述第二核酸探针如SEQ IDNO.2所示。
所述miRNA为miRNA-21，序列如SEQ ID NO.3所示。miRNA-21是一种癌症标记物，本发明制备的检测探针可以实现miRNA-21的高灵敏检测，对于肺癌的早期检测具有很重要的临床医学意义。
本发明第三方面提供了上述的组合探针在制备检测miRNA试剂盒中的用途。
本发明第四方面提供了一种金纳米棒检测探针的制备方法，包括以下步骤：金纳米棒加入CTAB溶液，混合均匀，加入巯基修饰的核酸探针，震荡均匀，室温反应，离心；将离心所得的金纳米棒中加入SDS溶液，震荡均匀，加入巯基修饰的核酸探针，震荡均匀，室温反应，加盐老化，离心得到检测探针。
优选地，所述金纳米棒与CTAB的摩尔比为1:300-1:400。
优选地，各项异性的金纳米棒使其表面覆盖的CTAB胶束不均匀，在两端曲率大的部位较稀疏。
优选地，所述金纳米棒与SDS的摩尔比为1:50-100。
优选地，SDS分散剂体系在金棒表面二次修饰，保证了金纳米棒在溶液中的分散性与两端的取代性，保证了DNA探针选择性优先修饰在金纳米棒两端。
优选地，金纳米棒与核酸探针的摩尔比为1:50-100。
本发明第五方面提供了一种用于检测miRNA的组合探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)第一检测探针的制备：金纳米棒加入CTAB溶液，混合均匀，加入巯基修饰的第一核酸探针，震荡均匀，室温反应，离心；将离心所得的金纳米棒中加入SDS溶液，震荡均匀，加入巯基修饰的第一核酸探针，震荡均匀，室温反应，加盐老化，离心得到第一检测探针；
(2)第二检测探针的制备：金纳米棒加入CTAB溶液，混合均匀，加入巯基修饰的第二核酸探针，震荡均匀，室温反应，离心；将离心所得的金纳米棒中加入SDS溶液，震荡均匀，加入巯基修饰的第二核酸探针，震荡均匀，室温反应，加盐老化，离心得到第二检测探针。
本发明第六方面提供了一种检测探针或组合探针在固态纳米孔传感器中的用途。
本发明第七方面提供了一种组合探针检测miRNA的方法，包括以下步骤：
(S1)取等量的第一检测探针以及第二检测探针震荡混合均匀，加入到miRNA溶液中，形成组装结构；
(S2)使用固态纳米孔传感器对组装体进行检测，通过检测的轨迹电流信号的幅值和滞留时间来区分不同的组装体结构，实现miRNA的检测。
步骤(S1)中，在溶液中miRNA通过碱基互补配对原则与金纳米棒两端的核酸探针杂交，实现金纳米棒头对头的线性组装。
步骤(S1)中，固态纳米孔为氮化硅纳米孔，孔径为40nm。氮化硅纳米孔，大小尺寸可控，便于操作。
步骤(S1)中，固态纳米孔使用食人鱼溶液处理，使得固态纳米孔表面荷负电，有助于带正电的分子进入纳米孔通道，所以氮化硅纳米孔对于金纳米棒有较高的捕获率。
本发明通过种子生长法制备的金纳米棒，以CTAB作为模板来调控金纳米棒的生长，因此合成的金纳米棒外层包覆着CTAB分子，金纳米棒表面荷正电，随后使用SDS溶液进行处理，提高核酸探针的连接效率。
本发明利用金纳米棒的各向异性，其两端的曲率较大，覆盖的CTAB双分子层较为稀疏，设计的DNA核酸探针通过Au-S键反应时会优先取代两端的双分子层，从而形成两端连接核酸捕获分子结构的金纳米棒探针捕获待检测的小分子，金纳米棒在探针捕获目标分子后会形成线性组装体，单体和组装体结构差异大，从而引起易位信号的变化。
有益效果：(1)本发明使用的金纳米棒具有良好的分散性和均一性，可以根据不同的检测要求设计所需要的尺寸，所设计的核酸探针可以特异性捕获检测物，金纳米棒两端修饰的核酸探针是与miRNA的序列互补的核酸分子结构，引起金纳米棒自组装，形成良好的线性组装体，纳米孔对金纳米棒和组装体结构具有明显差异性的轨迹电流信号，检测所使用的纳米孔传感器克服了待测物对孔的大小尺寸的依赖，实现了较大孔径的氮化硅纳米孔传感器对生物小分子的检测。(2)本发明所设计的金纳米棒载体，放大了纳米孔传感器对生物小分子检测的电信号，单体和组装体的电流轨迹信号易于识别，提高了氮化硅纳米孔的检测通量和分辨率；(3)本发明实现不同尺寸的氮化硅纳米孔对生物小分子的检测，即通过使用金纳米棒两端修饰分子探针，捕获目标分子之后形成自组装线性结构，进行纳米孔易位行为研究，实现对生物小分子的检测与表征。(4)本发明使用的金纳米棒表面携带正电性，提高了氮化硅纳米孔检测的通量，同时形成的线性组装结构在检测过程中会形成高信噪比的易位信号，提高了检测的灵敏性，解决了固态纳米孔对检测分子进行信号识别时孔的大小和待检测分子尺寸相近的局限，使得纳米孔传感器对小分子的检测不受孔的大小尺寸限制，扩展了固态纳米孔传感器的检测领域。
附图说明
图1为本发明所述的金纳米棒的结构和组装示意图，自定义生长的金纳米棒，通过置换反应在两端定向修饰核酸探针，然捕获miRNA形成纳米组装体；
图2位本发明实施例中所需要的金纳米棒的形貌图,a为SEM电镜，b为金纳米棒直径统计分布柱状图，c为金纳米棒长度统计分布柱状图，该纳米棒具有很好的分散性和均一性；
图3为本发明实施例中在定向修饰的金纳米棒溶液中，加入miRNA后，金纳米棒组装后的TEM图；
图4为本发明实施例中在两端修饰的金纳米棒溶液中，加入不同浓度的miRNA溶液形成组装体，使用纳米孔传感器检测到的电流轨迹信号；
图5为本发明实施例中在修饰核酸探针的金纳米棒溶液中，加入miRNA目标分子溶液前后检测到的信号的滞留时间和阻塞电流大小与基线电流比值的统计分布柱状图；
图6通过纳米孔传感器检测到的金纳米棒组装体(TA)和单体(Ts)的比例与加入miRNA溶液的浓度比之间的关系。
具体实施方式
实施例1：金纳米棒的合成
步骤1：种子合成：取10mL的CTAB(0.1mol/L)溶液和0.01mol/L的HAuCl4 10mL混合，加入磁子，然后加0.6mL的现配的NaBH4(0.01mol/L)溶液，边加边剧烈搅拌2min，30℃水浴2小时。
步骤2：金纳米棒生长(64×16nm)：取100mL CTAB(0.1M)溶液，5mL的HauCl4(0.01mol/L)溶液和875uL AgNO3溶液(10mM)混合，并加入磁子搅拌，加入1.9mL的HCl(1mol/L)溶液调节pH为2左右，加入0.8mL的0.1mol/L的抗坏血酸溶液，搅拌至溶液变为无色，加入250uL步骤(1)制备的金种子溶液，搅拌混匀放置30℃水浴锅内生长8h。
步骤3：将步骤(2)生长8h后的金纳米棒溶液使用50mL离心管以8000rpm进行离心30min，吸取上清液保留沉淀，加入超纯水进行复溶，重复三次，将离心后的金纳米棒溶液集中后使用广口瓶密封保存。
本发明的金纳米棒使用种子生长法制备，尺寸长度约为64nm，直径约为16nm，长径比约为4，合成的金纳米棒具有自定义的尺寸分布，可以良好的匹配纳米孔传感器的检测，产生符合预期的电流检测信号。图1为基于金纳米棒组装用于miRNA的实验原理图。当金纳米棒捕获到miRNA后可以通过碱基互补原则使得金纳米棒之间发生自组装。最终制备的探针保存在4℃冰箱内保存。图2为本实施例中合成的金纳米棒颗粒，通过测试结果中可以看出，制备的金纳米棒长度约为64nm，直径约为16nm，具有良好的均一性和分散性，适用于40nm孔径的氮化硅纳米孔传感器的检测；在金纳米棒的两端修饰核酸探针，捕获miRNA分子，并引起金纳米棒进行线性组装。
实施例2：金纳米棒核酸探针制备
步骤(1)：取上述步骤制备的金纳米棒，测量其紫外吸收值，通过其400nm处的吸收值计算金纳米棒的浓度，将其浓缩为5nM；采用金纳米棒与巯基DNA(如SEQ ID NO.1所示)最优浓度比1:50，取80uL的金纳米棒(5nM)加入2uL的CTAB(0.1M)溶液，混合均匀，再加入2uL分装的10uM的巯基DNA溶液，震荡均匀，放到摇床上室温反应8h。
步骤(2)：将步骤(1)反应后的样品取出，使用9000rpm的转速离心，除去上清液，使用80uL超纯水复溶，重复两次，加入1.6uL 1％的SDS溶液，震荡均匀，加入2uL分装的10uM巯基DNA溶液(如SEQ ID NO.1所示)，震荡均匀，放到摇床上反应8h。
步骤(3)：将步骤(2)制备的样品使用3M NaCl溶液进行三次加盐老化，半小时加一次，最终盐浓度为50mM，提高巯基DNA的连接效率。
步骤(4)：将步骤(3)制备的样品离心，转速9000rpm，离心10min，使用超纯水复溶，重复三次，将得到的探针样品放置到4℃冰箱保存，得到第二检测探针。
通过以上相同的步骤在金纳米棒上连接如SEQ ID NO.2所示的DNA片段，获得第二检测探针。
本发明金纳米棒载体是在CTAB和SDS两种分散剂中分步将巯基修饰的DNA链连接到金纳米棒上。
表1 核酸探针设计和目标分子序列
本实施例提供了一种用于捕获生物小分子的金纳米棒纳米载体，所述的纳米载体两端修饰核酸探针，可以捕获miRNA-21。miRNA-21是一种癌症标记物，对于肺癌的早期检测具有很重要的临床医学意义。
图3为制备金纳米棒探针后加入到miRNA溶液中捕获其中的miRNA分子，并形成自组装线性结构，通过透射电子显微镜对形成的自组装结构进行表征，可以观测到不同个数的金纳米棒线性组装结构的形成，所设计的探针成功的捕获到miRNA分子并自发形成了线性组装结构。
实施例3：纳米孔传感器对miRNA的检测
步骤1：取等量的以上步骤制备两端含有分别与miRNA序列半段互补的DNA链的金纳米棒探针(第一检测探针以及第二检测探针)，震荡混合均匀，取5uL加入到100uL所需要检测的不同浓度的miRNA溶液中，反应3h，形成线性组装结构。
步骤2：使用40nm的纳米孔传感器对修饰核酸探针的金纳米棒和组装体进行检测，通过检测的轨迹电流信号的幅值和滞留时间来区分不同的组装体结构，从而实现miRNA的检测：具体为：安装流体，使用40nm的氮化硅纳米孔传感器，用50mM的NaCl溶液装通后，在trans腔室内加入步骤1制备的溶液样品。使用膜片钳，在纳米孔两侧的腔室加上驱动电压，本实施例中使用600mV，通过软件记录检测到的轨迹电流信号；使用clampfit软件使用阈值法统计轨迹电流中产生的单个检测信号；使用origin软件对统计到的检测信号进行统计分析。
图4为在不同浓度的miRNA溶液加入到金纳米棒载体溶液中，通过纳米孔传感器检测到的电流信号图，图a,b,c,d分别对100pM、500pM、1nM和5nM浓度的microRNA检测溶液分别加入金纳米棒捕获探针后形成的金纳米棒组装体复合物在纳米孔中检测时，产生的电流信号的轨迹图，在基线电流上形成一个个脉冲阻塞信号。随着microRNA的提高，金纳米棒两端的探针捕获目标分子，形成线性结构比例也在增加，因此金纳米棒组装体线性结构过孔的时间增长，形成矩形脉冲信号，从图中可以看出随着miRNA浓度的增加，可以明显的看出矩形脉冲信号的出现，表明纳米孔传感器检测到miRNA后，金纳米棒组装形成线性结构。
图5为检测到的轨迹电流中的阻塞信号的滞留时间和阻塞电流大小与基线电流比值的统计分布柱状图，从图中可以看出，纳米孔传感器检测到的阻塞电流信号幅值相对于基线的比值略有增加，因为线性组装结构在纳米孔内所占据的体积变化增加，在出现miRNA后检测到的阻塞信号的滞留时间分布出现了十分明显的双峰现象，其中第一个峰位与金纳米棒单体所检测到的信号的峰位十分吻合，随着滞留时间增加，后面峰位代表线性组装体结构的出现。
图6为本实施例中检测到的金纳米棒组装体和单体的比例随着miRNA浓度成线性关系。这个对应关系与图5所统计的信号的滞留时间具有一致的对应关系，通过信号来进行观测，检测到的信号在滞留时间的尺度上具有十分明显的区分度，可以用于氮化硅纳米孔传感器对小生物分子的定量检测。
所有的测试结果表明，本发明所设计的金纳米棒载体在氮化硅纳米孔传感器领域可以实现对小生物分子的检测，并对易位信号进行放大，解决了氮化硅纳米孔传感器在生物小分子检测领域的局限性与不足。此研究对于固态纳米孔实现对小生物分子的检测应用有着十分重要的借鉴意义。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 金纳米棒检测探针、制备方法、检测方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacgacgtat cgaatagtc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgactacaac ttggtacgt 19
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uagcuuauca gacugauguu ga 22
Claims (4)
1.一种利用组合探针检测miRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（S1）所述组合探针包括第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针包括金纳米棒以及在金纳米棒两端修饰的用于捕获目标分子上游片段的第一核酸探针；所述第二检测探针包括金纳米棒以及在金纳米棒两端修饰的用于捕获目标分子下游片段的第二核酸探针；所述目标分子为miRNA；取等量的第一检测探针以及第二检测探针震荡混合均匀，加入到miRNA溶液中，形成金纳米棒组装结构；
（S2）使用固态纳米孔传感器对组装体进行检测，通过检测的轨迹电流信号的幅值和滞留时间来区分不同的组装体结构，实现miRNA的检测，所述固态纳米孔传感器的电解质溶液为50mM的氯化钠溶液；驱动电压为600mV。
2.根据权利要求1所述的利用组合探针检测miRNA的方法，其特征在于，所述第一核酸探针或第二核酸探针的捕获链的长度为8-14nt。
3.根据权利要求1所述的利用组合探针检测miRNA的方法，其特征在于，所述第一核酸探针如SEQ ID NO.1所示；所述第二核酸探针如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的利用组合探针检测miRNA的方法，其特征在于，所述第一检测探针和第二检测探针按如下方法制得：
（1）第一检测探针的制备：金纳米棒加入CTAB溶液，混合均匀，加入巯基修饰的第一核酸探针，震荡均匀，室温反应，离心；将离心所得的金纳米棒中加入SDS溶液，震荡均匀，加入巯基修饰的第一核酸探针，震荡均匀，室温反应，加盐老化，离心得到第一检测探针；
（2）第二检测探针的制备：金纳米棒加入CTAB溶液，混合均匀，加入巯基修饰的第二核酸探针，震荡均匀，室温反应，离心；将离心所得的金纳米棒中加入SDS溶液，震荡均匀，加入巯基修饰的第二核酸探针，震荡均匀，室温反应，加盐老化，离心得到第二检测探针。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106947811A (zh) * | 2017-03-17 | 2017-07-14 | 中国科学技术大学 | 一种检测miRNAs‑21的方法、探针组及试剂盒 |
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MicroRNA定量检测方法的研究进展;景花等;《遗传》(第01期);31-40 * |
| λ-DNA在锥形纳米孔中易位的研究;武灵芝等;《南京邮电大学学报(自然科学版)》;第33卷(第04期);115-118 * |
| 基于金纳米颗粒组装的纳米孔检测体系构建及应用;马闪闪;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》;全文 * |
| 核酸分子组装引导的纳米颗粒在纳米孔中的易位研究;吴皓;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;B020-617 * |
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