CN107367611A - 表皮生长因子受体ⅲ型突变体的elisa检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的ELISA检测试剂盒，其关键是应用基因工程技术获取抗EGFRvⅢ的单链抗体并与生物素抗原、亲和素‑HRP和显色液等组成试剂盒的主要组成部分。应用竞争法建立了对细胞、血清或者组织培养物中EGFRvⅢ的检测方法，具有强特异性、高灵敏度、高准确性等优点。该试剂盒可以供一般科研或临床上筛查肿瘤使用。

Description

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种快速检测EGFRvⅢ的方法，适用于血清、细胞培养物或组织培养物中EGFRvⅢ的检测。
背景技术
EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一，是一种分子量为170kD的跨膜糖蛋白。广泛分布在哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面且在大多数肿瘤中过表达且表达程度与肿瘤的分化程度及恶性程度密切相关。研究发现EGFR在恶性肿瘤中存在着许多突变体，其中表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)是最常见的缺失突变体。EGFRvⅢ是EGFR的胞外区框内缺失突变所致，与EGFR的完整分子结构相比较，EGFRvⅢ胞外区的2-7外显子被删除掉，导致801个碱基对的缺失并在缺失位点形成一个新的甘氨酸残基[1]。 EGFRvⅢ由于缺失胞外配体结合区可以在没有与任何配体相结合的情况下激活酪氨酸激酶、产生自体磷酸化、诱发下游信号传导通路、引起级联反应，导致肿瘤的发生[2]。研究发现EGFRvⅢ与肿瘤的发生具有密切的关系，EGFRvⅢ能促进肿瘤细胞分裂和抑制其凋亡，从而提高其致癌性，同时EGFRvⅢ也具有提高细胞活力、促进肿瘤细胞转移和提高其侵袭能力[3]。目前在人体多种肿瘤组织中已检测到EGFRvⅢ，如多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌[4-5]，但在正常组织中未发现其表达[6]，因此EGFRvⅢ有望为临床癌症的筛查奠定坚实基础。
目前临床上主要应用实时荧光定量PCR、直接测序法、dHPLC和PCR-RFLP 等方法对该靶点检测，这些检测方法操作繁琐、成本较高且不易操作，因此开发一种灵敏度高、准确性高且操作简单和便捷的一种检测EGFRvⅢ的方法迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于寻找一种能快速、准度的检测肿瘤是否突变为EGFRvⅢ的ELISA试剂盒，从而指导临床用药。
本发明是这样实现的：
首先，本发明提出了一种抗EGFRvⅢ的单克隆抗体，包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，其中：
重链CDR1-3的氨基酸序列为：
CDR1：如序列列表中SEQ ID NO：1所示；
CDR2：如序列列表中SEQ ID NO：2所示；
CDR3：如序列列表中SEQ ID NO：3所示；
轻链CDR1-3的氨基酸序列为：
CDR1：如序列列表中SEQ ID NO：4所示；
CDR2：如序列列表中SEQ ID NO：5所示；
CDR3：如序列列表中SEQ ID NO：6所示。
进一步的，重链可变区的氨基酸序列如序列列表SEQ ID NO：7所示；轻链可变区的氨基酸序列如序列列表SEQ ID NO：8所示。
进一步的，重链CDR1-3的碱基序列如序列列表中SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11所示；轻链CDR1-3的碱基序列如序列列表中SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14所示。
本发明还提出了含有该抗EGFRvⅢ的单克隆抗体的ELISA检测试剂盒。该 ELISA试剂盒的试剂组成包括：抗EGFRvⅢ的单抗、生物素标记的抗原、亲和素-HRP、显色液、终止液、洗涤液样品稀释液和酶标板。
本发明还提出了该ELISA检测试剂盒在检测EGFRvⅢ含量中的应用。
其中，在应用时，本发明的ELISA检测试剂盒检测EGFRvⅢ含量的方法是这样的，包括如下步骤：
S1，将抗EGFRvⅢ的单抗(1μg/mL)于4℃12h包被于酶标板中，用含0.5％吐温-20PBS洗涤5次；
S2，按照合适的稀释度，用样品稀释液稀释样品和标准品，以每孔100μl加入酶标板中，于37℃孵育1h，用含0.5％吐温-20PBS洗涤5次；
S3，向酶标板中加入生物素标记的抗原，于37℃孵育1h，用含0.5％吐温-20 PBS洗涤5次；
S4，向酶标板中加入亲和素-HRP，于37℃孵育45min，用含0.5％吐温-20PBS 洗涤5次；
S5，向酶标板中加入显色液，于37℃孵育20min，加入终止液于450nm测定其吸光度。通过分析OD值大小，判断EGFRvⅢ的含量。
本发明的优点在于：利用免疫和细胞融合技术获得一株抗EGFRvⅢ的菌株即本法获得的抗EGFRvⅢ的特异性较高，若将其包被于酶标板，可以提供其准确度；同时利用protein L对目的蛋白进行纯化即本法可以获得较纯的抗体，将其包被于酶标板，可以提供其灵敏度。该抗体包被于酶标板，依次加入样品、生物素标记的抗原、亲和素-HRP和显色液和终止液。在450nm处检测样品的浓度具有操作简单，准确快捷的优点。
附图说明
图1是纯化后抗体的还原性SDS-PAGE分析结果；注:M:标准蛋白分子量；1: 纯化的抗体；
图2是四参数Logistic曲线拟合示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的任何限制。
本发明是这样实施的：
本发明的抗EGFRvⅢ的单克隆抗体3D9，包括其的重链和轻链的可变区氨基酸序列如序列列表SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；重链和轻链的的可变区碱基序列如序列列表SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。
本发明的单克隆抗体3D9的制备过程如下：
1免疫动物
取健康的BALB/c雌性小鼠15只，分为实验组(抗原和佐剂的混合物1:1混合)、佐剂组(只含佐剂)和空白对照组(生理盐水)。免疫的时间和部位如表1，每个部位注射50μl，腹腔注射70μl。
表1 BALB/c小鼠免疫接种表
注：CFA:弗氏不完全佐剂
2ELISA检测免疫的结果
在免疫第35天，分别对3组小鼠断尾取血，200μl/只，于离心机中2000rpm/min离心5min。取血清于干净的1.5mL离心管，-20℃保存。按照间接 ELISA方法测定免疫的效果。
⑴包被：用PBS(pH7.2)稀释抗原(EGFRvⅢ)至1μg/mL，以100μl/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
⑵封闭：用PBST以300μl/孔，洗板5次后，每孔加入300μl的1％BSA-PBST 溶液，37℃封闭2h。
⑶加样：用PBST以300μl/孔，洗板5次后，加入用PBS稀释至不同浓度的血清100μl/孔(1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200)和阴性对照(用佐剂免疫的小鼠血清)。于37℃反应1h。
⑷酶标抗体：用PBST以300μl/孔，洗板5次后，以100μl/孔加入HRP标记羊抗鼠多克隆抗体(1:10000)，于37℃反应45min。
⑸显色：用PBST以300μl/孔，洗板5次后，以100μl/孔加入显色液(TMB)，于37℃避光反应45min(血清的效价越高，其反应的颜色越深)。
⑹终止：每孔加入100μl 2mol/L硫酸以终止其反应(溶液颜色由蓝变黄)。
⑺检测：于酶标仪(BIO-RAD，型号Model 680)以450nm为检测波长、630nm 为参比波长检测.若样品的OD值大于阴性组OD值得2.1倍，视为阳性，检测结果如表2。
表2免疫第35天测定免疫效果
同理在免疫第44天，分别对3组小鼠断尾取血，按照上述方法测定免疫的效果，检测结果如表3，根据检测结果选取效价最高的进行下一步实验(3号小鼠)。
表3免疫第44天测定免疫效果
3杂交瘤细胞株的构建
3.1SP2/0骨髓瘤细胞的培养
SP2/0骨髓瘤细胞用含10％胎牛血清(PAN)的1640培养基(Gibco)于37℃、 5％CO2恒温培养箱中培育，24h后更换培养基，每隔2天按1:4比例传代。
3.2脾细胞的制备
选取效价最高的BALB/c小鼠(已被免疫)，采取摘除眼球采血，于离心机中 1500r/min离心4min，取血清至干净的15mL离心管中作为阳性血清，血清保存于-20℃。脱颈处死小鼠后，用75％酒精浸泡小鼠6min，在超净工作台解剖小鼠，取出脾脏(整个过程注意防止杂菌污染)。将脾脏置于已盛有10ml PBS的培养皿中，洗去表面的血渍和去除周围结缔组织。将脾脏转移至含不完全培养中，用1ml注射器内芯挤压脾脏，然后用200目铜网过滤，去除较大的组织，最后用吹管吹打数次，制成单细胞悬液，于离心机中1000r/min离心5min，用不完全培养基离心洗涤1次，用10ml不完全培养基将细胞重悬，混匀备用，取上述细胞悬液少许，加台酚蓝染液作活细胞计数。
3.3细胞融合
将所用的试剂于37℃水浴锅中预热。对脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞分别计数，将SP2/0骨髓瘤细胞和脾细胞按1:8混合，1000r/min离心3min，弃掉细胞液，用1640不完全培养基洗一次，1000r/min离心3min，弃培养基。用手指轻弹离心管底部，使细胞团疏松形成均一的糊状，缓慢的加入1ml 50％的PEG 3350，边加边轻轻摇晃离心管，加完后再轻轻摇晃1min,使细胞混匀，充分融合，然后沿管壁缓慢加入不完全培养基终止融合，前2min以1ml/min缓慢的加入不完全培养基，后6min以3ml/min缓慢的加入不完全培养基，边加边轻轻摇晃离心管。1000r/min离心3min，弃上清，用完全培养基将细胞重悬，以100μl/孔加入96孔板中，外围降入PBS提供合适的环境共4块板，置于37℃，5％CO2培养温箱中培养。
3.4杂交瘤细胞的筛选
细胞融合第3天换成HAT培养基，100μl/孔；细胞融合第10天将培养基换成HT完全培养基，100μl/孔；细胞融合第14天改用完全培养基培养细胞，100μl/ 孔，继续观察细胞。在细胞融合后的第14天取培养基上清，按上述方法进行间接ELISA实验，结果如表4、表5、表6和表7，选取效价较高的孔，进一步筛选。将初次筛选的阳性孔(OD值大于1或者接近1的孔)，细胞消化下来，用完全培养基将细胞稀释至2×104个，以100μl/孔加入96孔板(外围每孔加入PBS 100μl)，筛选条件同上，在培养第14天取培养基上清，按上述方法进行间接ELISA 实验，结果如表8、表9、表10和表11。结果表明3D9和4D10为效价较好的两株杂交瘤细胞。
表4杂交瘤细胞初次筛选结果(板1)
注:G11:阴性组
表5杂交瘤细胞初次筛选结果(板2)
注:G11:阴性组
表6交瘤细胞初次筛选结果(板3)
注:G11:阴性组
表7交瘤细胞初次筛选结果(板4)
注:G11:阴性组
表8杂交瘤细胞初次筛选结果(1F3)
注:G11:阴性组
表9杂交瘤细胞初次筛选结果(2G7)
注:G11:阴性组
表10杂交瘤细胞初次筛选结果(3D9)
注:G11:阴性组
表11杂交瘤细胞初次筛选结果(4D10)
注:G11:阴性组
3.5单克隆抗体的制备
挑选几支健康的BALB/c雌性小鼠，每只注射石蜡(灭菌)500μl，7天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞(3D9)。观察小鼠腹腔变化，腹部出现外凸时，处死小鼠，采集腹腔积液。将腹腔液在4℃以12000r/min离心10min，取上清，加入终浓度20％饱和度硫酸铵溶液，边加入边搅拌，室温静置30min，12000r/min离心5min，取上清，加入终浓度为30％饱和度的硫酸铵溶液，边加入边搅拌，室温静置30min，12000r/min离心5min，取上清，加入终浓度为40％饱和度的硫酸铵溶液，边加入边搅拌，室温静置30min，12000r/min离心5min，取沉淀，加入PBS混匀后备用。根据Protein A亲和柱(GE Healthcare lot:10221586)操作要求进行纯化，利用还原性SDS-PAGE电泳对纯化结果鉴定(图1)，结果表明；SDS-PAGE产生链明显的两条，分别对应着55KD和26KD，是典型的人IgG 的重链和轻链条带，表明应用该方法纯化效果较好。纯化样品保存于-20℃备用。取纯化后的样品用小鼠单抗Ig/亚类/亚型鉴定试剂盒测定抗体亚型(表12)。结果表明：该抗体的重链为IgG2，轻链为k链。取纯化后样品按照上述间接ELISA 方法进行活性分析(表13)，结果表明纯化后3D9的亲和力较好。
表12抗EGFRvⅢ抗体的亚型鉴定
表13纯化后抗体的ELISA活性分析
注:Neg.:佐剂组小鼠的血清。
3.6单克隆抗体(3D9)序列的测定
取筛选后的杂交瘤细胞，按照Super总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA和5’RACE反转录cDNA。
以上游引物5’CAGGTTCAGCTGCAAGAAAGCG 3’和下游引物 5’GCTGCTAACGGTAACCATTGTA3’钓取轻链基因；
以上游引物5’GATATTCAGATGACCCAGAGTC3’和下游引物 5’TTTAATTTCAACTTTGGTGCCA3’钓取轻链基因。利用特异性引物进行RT-PCR反应，将产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。如表14。
表14 3D9抗体的序列
4ELISA试剂盒
4.1ELISA试剂盒检测原理
本试剂盒采用竞争法检测样品中EGFRvⅢ的含量。将3D9抗体包被于酶标板中，加入样品，再加入生物素标记的抗原，在37℃孵育1h，洗版后加入亲和素-HRP，于37℃孵育45min，加入显色液TMB，避光反应20min，加入2mol/L H2SO4终止反应，于450nm检测其吸光度。
4.2ELISA试剂盒组成
本试剂盒主要有以下组成：封口膜、酶标板(包被3D9抗体)、标准品 (EGFRvⅢ)、生物素抗原、亲和素-HRP、显色液(TMB)和终止液(2mol/L H2SO4)
4.3ELISA方法的建立
⑴包被：用PBS(pH7.2)稀释3D9抗体至0.5μg/mL，以100μl/孔加入酶标板， 4℃包被过夜。
⑵封闭：用PBST以300μl/孔，洗板5次后，每孔加入300μl的1％BSA-PBST 溶液，37℃封闭2h。
⑶加样：用PBST以300μl/孔，洗板5次后，加入用1％BSA-PBST稀释的样品、标准品(1μg/L)和空白对照，于37℃反应1h。
⑷生物素抗原(50ng/L)：用PBST以300μl/孔，洗板5次后，以100μl/孔加入生物素抗原，于37℃反应1h。
⑸亲和素-HRP：用PBST以300μl/孔，洗板5次后，以100μl/孔加入亲和素-HRP，于37℃反应45min。
⑹显色：用PBST以300μl/孔，洗板5次后，以100μl/孔加入显色液(TMB)，于37℃避光反应20min。
⑺终止：每孔加入100μl 2mol/L硫酸以终止其反应(溶液颜色由蓝变黄)。
⑻检测：于酶标仪(BIO-RAD，型号Model 680)以450nm为检测波长、630nm 为参比波长检测。用ELISAcalc拟合logistic曲线(四参数)，计算样品浓度。
4.4ELISA试剂盒性能测试
4.4.1ELISA标准曲线的建立
用1％BSA-PBST将标准品稀释至480ng/L、240ng/L、120ng/L、60ng/L、30ng/L 和15ng/L，每个浓度做3个副孔，根据4.3建立的ELISA方法，拟建立ELISA 标准曲线，如图2所示。
图中：
数据个数：7
残差平方和：0.00040。
应用logistic曲线(四参数)拟合曲线，R2＝0.99832表明：线性良好，该方法的检测限为15ng/L-480ng/L。
4.4.2ELISA试剂盒的特异性
按照4.3建立的ELISA方法，分别对阳性血清、阴性血清、EGFR血清、突变体T790M血清、突变体L858R血清和HER2血清各稀释10倍，每个样品做3 个副孔，以验证建立ELISA方法的特异性如表15，结果表明3D9抗体的特异性高。
表15 ELISA试剂盒的特异性
4.4.3ELISA试剂盒批内差异
按照4.3建立的ELISA方法，用同一批纯化的3D9(0.5μg/mL)，包被于酶标板中,随机选取6个孔，测定稀释至70ng/L和20ng/L的标准品的吸光度值，计算其变异系数，结果如表16，结果表明：ELISA试剂盒在检测同一批次的70ng/L 和20ng/L的标准品的变异系数为3.45％和7.35％，均符合2015版中华人民共和国药典要求(低于20％)。
表16 ELISA试剂盒的批内差异
4.4.4ELISA试剂盒批间差异
按照4.3建立的ELISA方法，用不同批次纯化的3D9(0.5μg/mL)，包被于酶标板中,每张板随机选取5个孔，测定稀释至50ng/L的标准品的吸光度值，计算其变异系数，结果如表17，结果表明：ELISA试剂盒在检测3个批次(1、5和 7)的50ng/L的标准品的变异系数为3.15％、5.17％和4.78％，均符合2015版中华人民共和国药典要求(低于20％)。
表17 ELISA试剂盒的批间差异
4.4.5ELISA试剂盒的准确度
按照4.3建立的ELISA方法，用同一批次纯化的3D9(0.5μg/mL)，包被于酶标板中,随机选取5个副孔，测定稀释至100ng/L、50ng/L、25ng/L的标准品的吸光度值，计算其变异系数，结果如表18，结果表明：ELISA试剂盒的在检测100ng/L、50ng/L、25ng/L的标准品的准确度分别为98.74％、98.14％和98.17％，均符合2015版中华人民共和国药典要求(80％-120％)。
表18 ELISA试剂盒的准确度
4.5临床事例
由贵州医科大学附属医院馈赠50份患有非小细胞肺癌的患者血清，按照4.3 建立的ELISA方法，对其检测如表19，结果表明该试剂盒于市售检测EGFRvIII 的ELISA试剂盒的符合率较高达97.5％。
表19自制ELISA试剂盒与上海酶联生物试剂盒的比较
实验材料、试剂及仪器：
1实验材料
SP2/0小鼠骨髓瘤细胞株由本实验室保存；雌性BALB/c小鼠购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司；
2试剂
酶标板(批号475094)购自Thermo Scientific；吐温20(批号822L045)、四甲基联苯胺(TMB)(批号PR1200)、BCA蛋白浓度测试试剂盒(批号20160616)购自北京索莱宝科技有限公司；HA和HAT培养基(21060-017)购自南京生兴生物技术有限公司。
⑴50％PEG：向含10g PEG3350的50Ml离心管中，加入15ml去离子水溶解后，调pH至8.0，定容至20ml。121℃下灭菌30min。灭菌后-20℃保存；
⑵考马斯蓝染液：称取考马斯亮蓝R250，2.0g量取甲醇50ml、乙醇425ml、冰醋酸100ml，加入去离子水425ml，完全溶解后即得1L的考马斯蓝染液。
⑶饱和硫酸铵溶液的配置(SAS)：称取767g(NH4)2SO4，加入1L去离子水中，调pH至7.0，此即饱和度为100％的硫酸铵溶液。
3仪器
酶标仪(BIO-RAD，型号Model 680)；蛋白电泳仪(BIO-RAD，型号Mini Trans-BLotCell)；电热恒温培养箱(泰斯特,型号DH6000BⅡ)；低温台式冷冻离心机(Eppendorf公司,型号5424R)。
参考文献
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当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
序列表
<110> 贵州医科大学
<120> 表达表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的ELISA检测试剂盒
<130> nm:
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
gtgtgcggca tgagc 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
ctgaccggcg gcgtg 15
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
accggcagca gcaccagcat cttcaccgac tgc 33
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
tgcgacatca ccgac 15
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
ggcggcacca ccctgggcag c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
gactgcaccg tgcccctggg c 21
<210> 7
<211> 360
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
caggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgaagc ccggcgagag cggcctgtgc 60
gccaccgagg tgatcggctt caccttcagc gtgtgcggca tgagctgggt gaggcagacc 120
cccgacctga aggacatctg ggtggccacc atcctgaccg gcggcgtgtg cacctgctgc 180
cccgacagcg tgaagggcgg catcagcacc aaggtgccca gcaccacctg caccctgtgc 240
ctgcagatga gcagcctgaa gagcgaggac accgccatgt gctgctgcgc cggcaccggc 300
agcagcacca gcatcttcac cgactgctgg accaccggca ccatggtgac cgtgagcagc 360
<210> 8
<211> 327
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgacctgcc tggccagcga cggcgtgacc 60
atcacctgcc aggccagctg cgacatcacc gacgacatga cctggtgcgc cagcaccacc 120
ctgtgcaccc ccaagctgct gatctgcggc ggcaccaccc tgggcagcgg cgtgcccagc 180
ggcttcagcg gcagcgcctg caccctgacc ttcatcttca ccatcagcag cctgcagccc 240
ggctgcacca tcaccagcgt gggccagcag ctgcaggact gcaccgtgcc cctgggcttc 300
ggcggcggca ccaaggtgga gatcaag 327
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
ggcaccggca ccggctgcgg cggcaccgcc accggcgccg gctgc 45
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 10
tgcaccggcg cctgctgcgg cggcaccggc ggcaccggca ccggc 45
<210> 11
<211> 99
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 11
gcctgcggcg gcggcaccgc cggctgcgcc ggctgcgcct gctgcgccgg ctgcgccacc 60
accaccacca ccgcctgcgg cggcgccacc accggctgc 99
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 12
accggctgcg gcgccaccgc caccaccgcc tgctgcggcg ccacc 45
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 13
ggcggcaccg gcggcaccgc ctgcggcgcc tgcggctgca ccggcggcgg caccgccggc 60
tgc 63
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 14
ggcgccacca ccggctgcgc ctgcggcggc accggctgct gcggctgcac cggcggcggc 60
acc 63

Claims (7)

1.一种抗EGFRvⅢ的单克隆抗体，包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，其特征在于，所述重链CDR1-3的氨基酸序列为：
CDR1：如序列列表中SEQ ID NO：1所示；
CDR2：如序列列表中SEQ ID NO：2所示；
CDR3：如序列列表中SEQ ID NO：3所示；
所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为：
CDR1：如序列列表中SEQ ID NO：4所示；
CDR2：如序列列表中SEQ ID NO：5所示；
CDR3：如序列列表中SEQ ID NO：6所示。
2.如权利要求1所述的抗EGFRvⅢ的单克隆抗体，其特征在于，重链可变区的氨基酸序列如序列列表SEQ ID NO：7所示；轻链可变区的氨基酸序列如序列列表SEQ ID NO：8所示。
3.如权利要求1-2任意一项所述的抗EGFRvⅢ的单克隆抗体，其特征在于，所述重链CDR1-3的碱基序列如序列列表中SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示；所述轻链CDR1-3的碱基序列如序列列表中SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示。
4.一种含权利要求1-3任意一项所述的抗EGFRvⅢ的单克隆抗体的ELISA检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，该ELISA试剂盒的试剂组成包括：抗EGFRvⅢ的单抗、生物素标记的抗原、亲和素-HRP、显色液、终止液、洗涤液样品稀释液和酶标板。
6.权利要求4所述的ELISA检测试剂盒在检测EGFRvⅢ含量中的应用。
7.一种如权利要求4所述的ELISA检测试剂盒检测EGFRvⅢ含量的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
S1，将抗EGFRvⅢ的单抗于4℃12h包被于酶标板中，用含0.5％吐温-20_PBS洗涤5次；
S2，用样品稀释液稀释样品和标准品，以每孔100μl加入酶标板中，于37℃孵育1h，用含0.5％吐温-20PBS洗涤5次；
S3，向酶标板中加入生物素标记的抗原，于37℃孵育1h，用含0.5％吐温-20PBS洗涤5次；
S4，向酶标板中加入亲和素-HRP，于37℃孵育45min，用含0.5％吐温-20PBS洗涤5次；
S5，向酶标板中加入显色液，于37℃孵育20min，加入终止液于450nm测定其吸光度；通过分析OD值大小，判断EGFRvⅢ的含量。
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