CN115232210A

CN115232210A - 靶向人cd40的激动型单克隆抗体

Info

Publication number: CN115232210A
Application number: CN202210403728.3A
Authority: CN
Inventors: 张贵民; 赵丽丽; 刘忠; 曹宇; 李振宇; 朱中松; 张娜; 彭伟
Original assignee: Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2022-04-18
Publication date: 2022-10-25

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种与人CD40特异性结合的激活型抗体及其片段；本发明所提供的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，具有CD40激动剂功能，刺激树突状细胞成熟，能够诱导CD40介导的抗肿瘤免疫应答，抑制肿瘤生长。

Description

靶向人CD40的激动型单克隆抗体

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种与人CD40特异结合的激活型抗体及其片段。

背景技术

CD40又称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5或TNFR5，是一种关键的免疫共刺激通路受体，存在于免疫系统中抗原提呈细胞(APC)的表面，例如B细胞、巨噬细胞和树突细胞上表达，在先天性免疫系统和适应性免疫系统机制的激活中起着关键作用。体细胞的完全激活需要两种不同但具有协同作用的信号。第一信号通过T细胞抗原受体(TCR)，抗原提呈细胞(APC)上的抗原和MHC复合物提供，负责特异性的免疫反应。第二或共刺激信号是通过CD28与B7-1(CD80)/B7-2(CD86)的相互作用，以及CD40与CD40L(CD154)，负责获得性T细胞反应。共刺激信号缺失，抗原刺激后可能导致T细胞出现无反应或程序性细胞死亡(凋亡)。

CD40与一种主要由激活的T淋巴细胞和血小板表达的主要配体CD40L结合，激活抗原提呈细胞，激发多个下游信号通路，包括免疫细胞激活和增殖、以及细胞因子和趋化因子的生产，增强细胞功能和免疫功能(Ara A et al，.(2018)Immunotargets Ther 7：55-61)。

另一方面，CD40也存在于非免疫细胞和肿瘤上(Costello et al.，(1999)ImmunolToday 20(11)：488-493；Tong et al.，(2003)Cancer Gene Ther 10(1)：1-13；Leeetal.，(2014)Curr Cancer Drug Targets 14(7)：610-620；Ara A et al，.(2018)同上)，并报道其与多种免疫疾病(包括自身免疫疾病)、动脉粥样硬化血栓、癌症和呼吸系统疾病有关联。例如，CD40/CD40L表达在动脉粥样化相关细胞中上调。CD40在几乎所有的B细胞恶性肿瘤以及高达70％的实体瘤中表达，且与某些细胞恶性肿瘤中的CD40配体结合会促成多种保护肿瘤细胞免受细胞凋亡的因子的表达增加(Lee et al.，(1999)ProcNatIAcadSciUSA96：9136-9141)。

尽管CD40在肿瘤发生中的作用非常复杂，已经开发出一些CD40抗体用于潜在的肿瘤治疗。CP-870,893，开发的完全人源的IgG2激动型CD40抗体，可以激活树突细胞，并已在多种背景的晚期癌症病患中显示出了临床效用(Vonderheide et al.，(2007)J ClinOncol25(7)：876-883；Gladue et al.，(2011)Cancer Immunol Immunother 60(7)：1009-1017；Beatty et al.，(2013)Expert Rev Anticancer Ther 17(2)：175-186；Vonderheideetal.，(2013)Oncoimmunology 2(1)：e23033；Nowak et al.，Ann Oncol 26(12)：2483-2490；2015U.S.patent no.7,338,660)。

Dacetuzumab，也称作SGN-40，是Seattle Genetics开发的人源化IgG1激动型CD40抗体，每周静脉施用下显示出抗肿瘤活性，特别是在患有弥漫性大B细胞性淋巴瘤的患者中。临床前数据也示出Dacetuzumab与其他药物例如CD20单抗利妥昔单抗的协同效应(Lapalombella et al.，(2009)Br J Haematol 144(6)：848-855；Hussein et al.，(2010)Haematologica 95(5)：845-848；de Vos et al.，(2014)J He-matol Oncol 7：44)。ChiLob 7/4，英国癌症研究中心(Cancer Research UK)开发的嵌合IgG1激动型抗人CD40抗体，正在进行初始的临床测试。21名患者中的11名病情稳定，而没有部分或完全缓解(Chowdhury et al.，(2014)CancerImmunolRes 2(3)：229-240)。

近日，致力于研发新一代用于肿瘤等疾病治疗的抗体药物临床阶段生物制药公司Apexigen宣布，其靶向CD40的单克隆抗体APX005M获得FDA授予的孤儿药资格，用于治疗食道和胃食管连接癌(GEJ)及胰腺癌。APX005M通过激活CD40模拟内源性免疫激活过程，活化内源性免疫系统，扭转癌症患者的免疫抑制作用。将其与免疫监测点抑制剂IO联合用药，有望激活肿瘤微环境中的APC，从而触发对肿瘤更有效和更持久的免疫反应。

然而，依然需要更多更有效的靶向CD40抗体的研发，用于肿瘤的治疗。本发明的目的在于提供两株新的激活性抗人CD40单克隆抗体，通过激活免疫细胞例如树突状细胞(DC)，打破免疫耐受，抑制肿瘤细胞的生长，进而治疗癌症。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离的单克隆抗体，例如，与CD40的嵌合或人源化的单克隆抗体，其可以是激活CD40信号通路的激动型CD40抗体。用于诱导CD40表达阳性的肿瘤细胞生长抑制、凋亡和提高其免疫原性，达到治疗肿瘤的目的。

本发明第一方面是提供一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1，HCDR2和HCDR3序列。

在一些实施方案中，所述HCDR1序列包含SEQ ID NO：1或4或6或9所示的氨基酸序列；在一些实施方式中，所述HCDR2序列包含SEQ ID NO：2或5或7或10所示的氨基酸序列；在一些实施方式中，所述HCDR3序列包含SEQ ID NO：3或8或11所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述重链可变区包含序列如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：2所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR3。

在一些实施方案中，所述重链可变区包含序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：5所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR3。

在一些实施方案中，所述重链可变区包含序列如SEQ ID NO：6所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：8所示的HCDR3。

在一些实施方案中，所述重链可变区包含序列如SEQ ID NO：9所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：10所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：11所示的HCDR3。

在一些实施方案中，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。所述LCDR1序列包含SEQ ID NO：12或15或16或19所示的氨基酸序列；所述LCDR2序列包含SEQ ID NO：13或17或20所示的氨基酸序列；所述LCDR3序列包含SEQ ID NO：14或18或21所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述轻链可变区包含序列如SEQ ID NO：12所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：13所示的LCDR2，序列如SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

在一些实施方案中，所述轻链可变区包含序列如SEQ ID NO：15所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：13所示的LCDR2，序列如SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

在一些实施方案中，所述轻链可变区包含序列如SEQ ID NO：16所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：17所示的LCDR2，序列如SEQ ID NO：18所示的LCDR3。

在一些实施方案中，所述轻链可变区包含序列如SEQ ID NO：19所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：20所示的LCDR2，序列如SEQ ID NO：21所示的LCDR3。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含序列如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，序列如SEQ IDNO：2所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；所述轻链可变区包含序列如SEQ IDNO：12所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：13所示的LCDR2，序列如SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，序列如SEQ IDNO：5所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；所述轻链可变区包含序列如SEQ IDNO：15所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：13所示的LCDR2，序列如SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含序列如SEQ ID NO：6所示的HCDR1，序列如SEQ IDNO：7所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：8所示的HCDR3；所述轻链可变区包含序列如SEQ IDNO：16所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：17所示的LCDR2，序列如SEQ ID NO：18所示的LCDR3。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或其与抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含序列如SEQ ID NO：9所示的HCDR1，序列如SEQ IDNO：10所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：11所示的HCDR3；所述轻链可变区包含序列如SEQ IDNO：19所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：20所示的LCDR2，序列如SEQ ID NO：21所示的LCDR3。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或抗原结合片段，包含重链可变区，其包含SEQ ID NO：22-25、32、33任一项所示的氨基酸序列；或包含与这些序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区，其包含SEQ ID NO：26-29、34、35任一项所示的氨基酸序列；或包含与这些序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：22所示的重链可变区氨基酸序列；所述轻链包含SEQ ID NO：26所示的轻链可变区氨基酸序列。或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：23所示的重链可变区氨基酸序列；所述轻链包含SEQ ID NO：27所示的轻链可变区氨基酸序列。或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：24所示的重链可变区氨基酸序列；所述轻链包含SEQ ID NO：28所示的轻链可变区氨基酸序列。或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：25所示的重链可变区氨基酸序列；所述轻链包含SEQ ID NO：29所示的轻链可变区氨基酸序列。或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段包含轻链，该重链包含SEQ ID NO：32所示的重链可变区氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO：34所示的轻链可变区氨基酸序列；或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段包含轻链，该重链包含SEQ ID NO：33所示的重链可变区氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO：35所示的轻链可变区氨基酸序列；或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方式中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中，重链可变区和轻链可变区含有上述的氨基酸序列，重链恒定区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，轻链恒定区包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列；或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本发明的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4亚型，优选IgG1。

在一些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合部分能够诱导树突状细胞的成熟，在一些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合部分能够诱导T淋巴细胞活化。

优选地，所述的抗体是鼠源抗体、人鼠嵌合抗体或人源化抗体。

本发明的第二方面，提供了核苷酸分子，所述核苷酸分子编码第一方面所述的一种特异性结合CD40抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述核苷酸分子包含如SEQ ID NO：40所示的轻链可变区核苷酸序列和如SEQ ID NO：44所示的重链可变区核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核苷酸分子包含如SEQ ID NO：41所示的轻链可变区核苷酸序列和如SEQ ID NO：45所示的重链可变区核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核苷酸分子包含如SEQ ID NO：42所示的轻链可变区核苷酸序列和如SEQ ID NO：46所示的重链可变区核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核苷酸分子包含如SEQ ID NO：43所示的轻链可变区核苷酸序列和如序列SEQ ID NO：47所示的重链可变区核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核苷酸分子包含如SEQ ID NO：48所示的轻链可变区核苷酸序列和如序列SEQ ID NO：50所示的重链可变区核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核苷酸分子包含如SEQ ID NO：49所示的轻链可变区核苷酸序列和如序列SEQ ID NO：51所示的重链可变区核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核苷酸分子如包含如SEQ ID NO：57所示的轻链恒定区核苷酸序列和序列SEQ ID NO：56所示的重链恒定区核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供了表达载体，所述表达载体含有第二方面所述的核苷酸分子。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的表达载体。

本发明的第五方面，提供第一方面所述的一种特异性结合CD40抗体或抗原结合片段的制备方法。可通过多种技术产生本发明的抗体，包括常规的单克隆抗体法，例如Kohlerand Milstein，Nature 256：495(1975)的标准体细胞杂交技术。优选体细胞杂交法，原则上可采用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如病毒或癌基因转化B淋巴细胞或使用抗体基因文库的噬菌体展示技术均可用于制备本发明所述的抗体。嵌合或人源化抗体也在本领域内熟知，例如美国专利4816567，5225539，5530101，5585089，5693762或6180370等。

用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤生产是非常完善的方法。分离用于融合的经免疫脾细胞的免疫方案和技术是现有技术中已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。

用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的其他优选动物系统是大鼠和兔系统(例如描述于Spieker-Polet et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：9348(1995)，还参见Rossiet al.，Am.J.Clin.Pathol.124：295(2005))。

用于生成单克隆抗体的另一个策略是从所定义策略的产生抗体之淋巴细胞中直接分离编码抗体的基因，例如参见Ba bcock et al.，1996；A novel strategy forgenerating monoclonal antibodies from single，isolated lymphocytes producingantibodies of defined strategy。对于重组抗体工程的细节还参见Welschof andKraus，Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8and BennyK.C.Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1。

本发明第六方面，提供了两种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株名称分别为：Anti-CD40-31A2-2和Anti-CD40-42D11-8。杂交瘤细胞株Anti-CD40-31A2-2以保藏号CGMCCNo.21911保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年03月22日，分类命名为小鼠杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株对应本发明实施例中名称为31A2-2的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株Anti-CD40-42D11-8以保藏号CGMCC No.21912保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年03月22日，分类命名为小鼠杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株对应本发明实施例中名称为42D11-8的杂交瘤细胞株。

本发明的第七方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。

本发明的第八方面，提供一种疫苗，其包含第一方面所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，以及任选的免疫佐剂。

本发明的第九方面，提供第一方面所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗CD40相关疾病药物中的用途，例如肿瘤药物中的用途。

在一些实施方案中，所述肿瘤包括肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、晚期胰腺癌皮肤癌、头或颈癌、鼻咽癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、直肠癌、膀胱癌、肠胃癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多毛细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、多发性骨髓瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、胆道癌、中枢神经系统肿瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经梢瘤、髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺癌、黑素瘤、间皮脂瘤、恶性血液瘤、淋巴瘤、晚期实体瘤、或其转移瘤等。

本发明的有益效果：本发明的抗CD40抗体或抗原结合部分能够特异性与CD40结合，具有以下的一种或多种效应；具有CD40激动剂功能，刺激树突状细胞成熟，诱导CD40介导的抗肿瘤免疫应答抑制肿瘤生长等。

术语

为容易地理解本发明，首先定义本文中使用的某些术语。

“抗体”是指包含四条多肽链，即通过二硫键互连的两条重链(H)及两条轻链(L)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(缩写为VH)以及重链恒定区(缩写为CH)。重链恒定区包含三个域，即CH1、CH2及CH3。各轻链包含轻链可变区(缩写为VL)及轻链恒定区(缩写为CL)。轻链恒定区包含一个域(CL)。VH及VL可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其中穿插有称为构架区(FR)的保守区、在一些实施方案中，从N-末端至C末端，轻链与重链可变结构域包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3与FR4区。

抗体的“抗原结合部分”是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区段。抗原结合域可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或者上述两者。抗体的抗原结合片段或使用任何适合的标准技术从完整抗体分子制备，所示标准技术包括蛋白水解消化或重组遗传工程化技术等。抗原结合部分的非限制性实例包括：Fab片段；F(ab’)2片段；Fd片段；Fv片段；单链Fv(svFv)分子；单域抗体；dAb片段及由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的CDR)。术语“抗原结合部分”也包括其他工程化的分子，如双抗体、三抗体、四抗体及微型抗体等。例如，本文中所述Fd片段是指由VH与CH1结构域组成的抗体片段；Fv片段是由抗体的单臂中VL与VH结构域组成；dAb片段由VH结构域组成。

本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义，例如参见见Kabat etal,“Seq uen ces of Pro teins ofImmunological Interest”，National Institutes of Health,Bethesda，MD.(1991)；Al-Lazikanietal.，JMolBiol273:927-948(1997)；以及Martinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中的CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。在本文中，重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为HCDR1、HCDR2及HCDR3；轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为LCDR1、LCDR2及LCDR3。

“特异性结合”是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体与抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合于两种或更多其序列相关的抗原。例如，本发明的抗体可特异性结合于人类与非人类(例如小鼠或非人类灵长动物)的CD40。

“单克隆抗体”是指基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能retina中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学特性。

“人源化抗体”是指其中所有恒定结构域序列均为人类序列的任何抗体。

“嵌合抗体”是指包含来自两种或多种不同抗体的区段的抗体。在一些实施方案中，一个或多个CDRs衍生自小鼠抗CD40抗体。在另一些实施方案中，所有CDRs均衍生自小鼠抗CD40抗体。在一些实施方案中，在嵌合抗体中组合来自一种以上小鼠抗CD40抗体的CDRs。例如，嵌合抗体可包含来自第一种小鼠抗CD40抗体中轻链的CDR1、来自第二种小鼠抗CD40抗体中轻链的CDR2、与来自第三种小鼠抗CD40抗体中的轻链的CDR3，以及来自重链的CDRs可衍生自一种或多种其他抗CD40抗体。此外，构架区可来自相同抗CD40抗体或来自一个或多个不同的个体。

“激动剂”抗体是指该抗体当加至表达CD40的细胞、组织或生物体中时，可使一种或多种CD40活性提高至少约20％。有些实施方案中，具有激动剂功能的抗体使CD40活性提高至少40％，50％或60％。在一些实施方案中，使用树突状细胞分析法测定IL-12的释放，以测定活化型抗体的活性。本文中，术语“激动剂抗体”、“激动型抗体”和“活化型抗体”可以互换使用。

“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。本文所述的“至少80％同源性”是指同源性为80％至100％的任一值，例如85％、90％、95％、99％等。

“宿主细胞”包括可以是或已经是本发明载体的接受者的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于自然的、偶然的或有意的突变，该后代可以不必与原始亲本细胞(在形态学上或在基因组或总DNA互补性上)完全相同。宿主细胞包括在体内用本发明的载体转染的细胞。“宿主细胞”可以是指原核细胞、真核细胞或作为单细胞实体培养的细胞系，其可以用作或已经用作重组载体或其他转移多核苷酸的接受者，并且包括已经转染的原始细胞的后代。应当理解，由于自然的、偶然的或有意的突变，单细胞的后代可以不必在形态学上或在基因组或总DNA互补性上与原始亲本完全相同。

“载体”是一种核酸分子，优选自我复制性的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。该属于包括主要功能是将DNA或RNA插入细胞中的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，以及功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供超过一种上述功能的载体。“表达载体”指在引入合适的宿主细胞中时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常表示包含能够用来产生所需表达产物的表达载体的合适的宿主细胞。

“治疗”在本文中用来泛指获得所需的药理学和/或生理学效果。该效果就完全或部分防止疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全稳定或治愈疾病和/或归因于该疾病的不良反应而言可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖在哺乳动物中对疾病的任何治疗，该哺乳动物例如是小鼠、大鼠、兔、猪、灵长类动物，包括人类和其他猿类，特别是人，并且该术语包括：(a)防止疾病或症状在可能易患该疾病或症状但尚未发生诊断的受试者中发生；(b)抑制疾病症状；(c)阻止疾病的发展；(d)缓解疾病症状；(e)引起疾病或症状消退；或其任意组合。

术语“癌症”、“肿瘤”和“癌”在本申请中可以互换，是指这样的细胞：它们表现出相对自主的生长，使得它们表现出异常生长表型，其特征在于细胞增殖的显著失控。通常，在本申请中用于监测或治疗的目标细胞包括癌前(例如良性)、恶性、转移前、转移性和非转移性细胞。

“树突状细胞(DC)”是指也称为树突状白细胞的具有很强的抗原呈递功能的一组细胞。

“EC50”是指半数最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC50)指能引起50％最大效应的浓度。

“KD”是指特异性抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。在实施例给出的数值范围内，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。

除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

附图说明

图1：纯化小鼠单克隆抗体激活功能检测曲线图-1；

图2：纯化小鼠单克隆抗体激活功能检测曲线图-2；

图3：纯化小鼠单克隆抗体激活功能检测曲线图-3；

图4：纯化小鼠单克隆抗体激活功能检测曲线图-4；

图5：纯化小鼠单克隆抗体激活功能检测曲线图-5；

图6：小鼠单克隆抗体与人CD40的ELISA检测结果图；

图7：FACS实验检测小鼠CD40单克隆抗体与HEK293T细胞表达人CD40结合曲线图；

图8：FACS实验检测小鼠CD40单克隆抗体与HEK293T细胞表达猴CD40结合曲线图；

图9：单克隆抗体激活功能验证试验图；

图10：FACS实验检测嵌合抗体C42、C31与293T-huCD40的结合曲线图；

图11：DC激活实验检测嵌合抗体C42、C31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-1；

图12：DC激活实验检测嵌合抗体C42、C31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-2；

图13：DC激活实验检测嵌合抗体C42、C31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-3；

图14：DC激活实验检测嵌合抗体C42、C31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-4；

图15：DC激活实验检测嵌合抗体C42、C31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-5；

图16：DC激活实验检测嵌合抗体C42、C31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-6；

图17：DC激活实验检测嵌合抗体C42、C31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-7；

图18：DC激活实验检测嵌合抗体C42、C31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-8；

图19：FACS实验检测人源化抗体42和31与293T-huCD4O的结合曲线图；

图20：DC激活实验检测人源化抗体42、31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-1；

图21：DC激活实验检测人源化抗体42、31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-2；

图22：DC激活实验检测人源化抗体42、31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-3；

图23：DC激活实验检测人源化抗体42、31的促进树突细胞成熟的曲线结果图-4；

图24：CD40人源化抗体31和42在Raji/CIK/DC共接种皮下移植瘤模型中的抑瘤作用；

图25：CD40人源化抗体31和42对Raji/CIK/DC共接种皮下移植瘤模型的治疗作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释与说明，应当理解为以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的保护范围。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术以及相关领域的常规技术。除非另外说明以下述实施例中所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例中所用到的阳性对照抗体为APX005和APX005M，其中APX005具有人IgG1/κ恒定区，按照WO2014070934A1中的氨基酸序列制备，APX005M按照专利WO2018140831A2中的氨基酸序列制备。

实施例1制备分泌人CD40抗体的杂交瘤细胞系

1.1动物免疫

20只6-8周龄雌性BALB/C小鼠通过交叉注射重组人CD40-his蛋白。人CD40(ECD)-his蛋白用等体积的完全Freund佐剂、不完全Freund佐剂或PBS超声乳化。首次免疫剂量为100μg/只，并辅以CFA(完全弗氏佐剂)，之后免疫剂量降至50μg/只，并辅以IFA(弗式不完全佐剂)，均为两周一次交叉免疫。每次加强免疫后1周，从每只小鼠体内取50μl血清，经ELISA检测滴度，具体使用重组人CD40-his进行结合测试。基于最后一次加强之后的ELISA检测和FACS检测结果，血清滴度较高的7只小鼠被选出用于下一步的杂交瘤细胞系制备。

1.2杂交瘤细胞系的制备

最后一次加强的四天后，将小鼠处死后取出脾脏，在PBS中制备成单细胞混悬液。脾细胞用DMEM培养基清洗3次。处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与上述分离的小鼠脾细胞按1∶4的比例混匀后用DMEM清洗2次。细胞融合通过PEG融合的方式进行。融合后的细胞用DMEM清洗3次，并重悬在细胞生长培养基中(RPMI 1640+10％FBS+1×HAT)。将细胞混悬液在96孔培养板上铺板，每孔200μl，5×10⁴细胞每孔，将细胞放于37℃、5％CO₂的潮湿细胞培养箱培养7天。在第7天时，将培养基换成新鲜培养基(DMEM+10％FBS+1×HT)。2-3天以后，吸取细胞培养液上清，经ELISA和FACS筛选杂交瘤。

1.2.1通过ELISA筛选杂交瘤细胞系

通过高通量的ELISA结合检测来筛选与人CD40结合的杂交瘤克隆。对于ELISA检测，用人CD40-his(0.5μg/ml)对96孔ELISA板铺板，100μl每孔，室温过夜。ELISA板用PBST(PBS+0.05％吐温20)溶液清洗3遍，用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2小时，用PBST溶液清洗3遍。杂交瘤细胞培养基上清吸取100μl加入样品检测孔，阴性抗体为小鼠IgG1，阳性对照抗体为APX005。室温孵育1小时后，板用PBST清洗3遍。每孔加入100μl山羊抗鼠Fc-HRP(1∶5000)或人Fc-HRP，室温孵育1小时，PBST清洗3遍，加入80μl TMB显色。5-10分钟后加入80μl的0.16M硫酸终止显色，用酶标仪检测OD450值，取大于阴性对照5倍OD值，筛选出328个候选杂交瘤细胞系。

1.2.2通过FACS检测筛选杂交瘤细胞系

对筛选出的328个杂交瘤细胞系进一步测试其与HEK293T细胞表达的人、猴CD40的结合能力。首先将1×10⁵个HEK293T-人CD40细胞、HEK293T-猴CD40细胞加入96孔板的各检测孔中。杂交瘤培养物上清加入到样品检测孔，100μl每孔，小鼠IgG1作为阴性对照，APX005作为阳性对照抗体。4℃孵育1个小时后，用FACS洗液(PBS+1％BSA+0.01％吐温20)清洗3遍。之后，细胞用FACS洗液重悬，加入500倍稀释的APC山羊抗小鼠IgG二抗或抗人IgG二抗4℃孵育1小时。板用PBS清洗3遍后上FACS检测仪检测细胞荧光。用FlowJo(TreeStar)软件版本10.0.7进行平均荧光强度(MFI)值进行分析和计算，MFI大于等于阴性对照抗体20倍的克隆作为阳性克隆，APX005作为阳性参照抗体。

基于上述FACS筛选，得到176个对HEK293T/人CD40细胞以及HEK293T/猴CD40细胞有高结合力的杂交瘤克隆。

对上述176个杂交瘤克隆进行亚克隆。在亚克隆过程中，选出各克隆的多个亚克隆(n＞3)，并经上述的ELISA/FACS检测进行特征确证。经该步骤得到的亚克隆确定为单克隆杂交瘤细胞系。最终得到176个对人和猴CD40呈现出高结合力的亚克隆，每个亚克隆得自不同的原始母克隆。

1.2.3通过FORTEBIO亲和力筛选杂交瘤细胞系

采用Fortebio Octet RED96仪器，根据Fortebio说明书测定176株杂交瘤单克隆细胞培养上清与人CD40-his的亲和力。

称取1g的BSA，量取500μL的Tween 20，加入到1000mL的1×PBS，混匀。过滤后分装保存。吸取0.1mL 0.1M pH 2.0的甘氨酸溶液加入0.9mL的超纯水，混匀。抗体以KB buffer稀释成10μg/mL，抗原以KB buffer稀释成系列浓度梯度，依次为200、50、12.5、0nM。避光预湿AMC传感器，至少10min后开始测试样品板，测试无误后按预设程序进行。其中，样品板1的第1、10和12列加入200μL/孔的KB buffer，第11列加入0.01M pH2.0的甘氨酸溶液，第2-8列加入制备好的样品溶液(一个样品加4个孔，即一列加2个样品)，第九列按照浓度从高到低依次加入人CD40-his，即第1，5个孔加入200nM的抗原溶液，第2，6个孔加入50nM的抗原溶液，第3，7个孔加入12.5nM的抗原溶液，第4、8个孔加入0nM的抗原溶液。检测后得到25株亲和力KD值≤10^-8的抗体，具体见表1。

表1 25个杂交瘤上清亲和力测定结果

1.3细胞的小量生产、冻存与复苏

1.3.1纯化

首先将25个所选克隆的单克隆小鼠抗体进行纯化。简单而言，各个亚克隆的杂交瘤细胞在T175细胞培养瓶中生长，各个培养瓶含100ml新鲜无血清杂交瘤培养基和1％HT补充液。细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养10天。收集培养物，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。单克隆抗体通过预平衡的蛋白-A亲和柱来富集纯化。后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0-3.5)进行洗脱。抗体保存在PBS(pH7.0)中，并通过NanoDrop检测抗体浓度。

1.3.2冻存

各细胞株活细胞大于90％，经1000rpm离心5min，弃去上清；用冷冻液配制成0.2～1×10⁷/ml细胞悬液，分装冷冻管，放入程序降温盒，-80℃冰箱过夜，放入液氮中。

1.3.3细胞的复苏

从液体氮里取出冷冻管，速放37℃水浴内，不断摇动以加速融化，加适量培养液离心，洗除冷冻液，加入瓶中培养。

1.4纯化抗CD40小鼠抗体激活功能检测

使用本领域常规技术手段构建表达CD40的HT1080细胞，以每孔10⁵个HT1080-CD40细胞铺至96孔板中，每孔150μL 1640完全培养基。CD40抗体以20μg/mL起始，用培养基3.16倍稀释8-10梯度，与HT1080-CD40细胞共混，作用6小时。细胞板于1000rpm离心5min后，收集50μL上清，4℃保存，检测IL-8含量。按照IL-8浓度测定检测试剂盒(Human IL-8Immunoassay Kit)说明书进行。

(1)ELISA板包被：

a.使用PBS稀释Capture Antibody配制成工作浓度。加100μL Capture Antibody工作液至96孔ELISA板中。封板并放置在室温孵育过夜。

b.弃去Capture Antibody工作液，使用Wash Buffer洗涤细胞板3次。每孔使用400μL Wash Buffer，每次洗涤充分移除Wash Buffer，最后一次洗涤在干净的纸上倒置拍板以完全移除Wash Buffer。

c.每孔加入300μL Block Buffer。放置在室温至少孵育1小时。

d.重复步骤b中洗涤过程。

(2)样品检测：

a.每孔加入100μL样品(使用试剂稀释液稀释4倍：25μL细胞培养上清+75μLReagent Dilution Buffer)或者标准品。封板并放置在室温孵育2小时。

b.重复(1)骤b中洗涤过程。

c.每孔加入100μL Detection Antibody。封板并放置在室温孵育2小时。

d.重复(1)骤b中洗涤过程。

e.每孔加入100μL Streptavidin-HRP工作液。封板并放置在室温孵育20分钟。此过程避光。f.重复(1)骤b中洗涤过程。

g.每孔加入100μL Substrate Solution。封板并放置在室温孵育20分钟。此过程避光。

h.每孔加入50μL Stop Solution。轻敲细胞板以确保充分混匀。

i.使用多功能酶标仪测定每孔的OD450。如果波长校准功能可用，设置为540nm或570nm。如果波长校准功能不可用，使用OD450减去OD540或者OD570。此过程在步骤h后30分钟内完成。

测定结果如图1-5所示，抗体激活试验EC50值结果见表2。从图1-5和表2数据可知，抗体30H7-1和35A1-1与阳性对照APX005相当，抗体42D11-8和31A2-2的激活功能优于APX005，因此选择抗体30H7-1、35A1-1、42D11-8和31A2-2作为候选抗体进行后续试验。

表2抗体激活实验EC50结果

1.5鼠源抗体30H7-1、35A1-1、42D11-8和31A2-2可变区序列扩增

将30H7-1、35A1-1、42D11-8和31A2-2的杂交瘤细胞进行培养，分别提取RNA，通过RT-PCR方法扩增cDNA，使用文献中提及的引物(Juste，Muzard，&Billiald，(2006)，AnalBiochem.，1；349(1)：159-61)，应用RACE PCR(GenScript)扩增30H7-1、35A1-1、42D11-8和31A2-2这四个抗体的抗体重链和轻链的可变区核苷酸序列，并且将PCR产物亚克隆到pMD18-T载体系统(TaKaRa)中。使用载体特异性引物验证并测序插入片段。获得编码生成的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸/DNA序列。抗体重链CDR序列、轻链CDR以及抗体重链和轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1～29所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：40～47所示；并列表于表3-1、3-2中，所述CDRs根据Kabat编号确定。

表3-1抗体氨基酸序列

表3-2抗体核苷酸序列

实施例2候选抗体30H7-1、35A1-1、42D11-8和31A2-2功能验证

2.1纯化的小鼠CD40单克隆抗体30H7-1、35A1-1、42D11-8和31A2-2与人CD40结合试验

ELISA检测板用500ng/mL人CD40-his 4℃包被过夜。各孔用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温下封闭2小时，然后加入100μl梯度稀释的CD40抗体(最高浓度40μg/ml)，室温孵育1小时。ELISA检测板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍后加入5000倍稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP，室温孵育1小时。板用新鲜配制的Ultra-TMB室温显色5分钟。之后用SpectraMax^Ri3X在450nm读值。测定结果如图6所示，从图6可知，相比阳性对照抗体APX005，抗体30H7-1、35A1-1、31A2-2和42D11-8抗体与人CD40具有较强的结合力。

2.2小鼠CD40单克隆抗体与HEK293T细胞表达的人和猴CD40结合试验

为进一步确定CD40抗体是否与HEK293T细胞表达的人、猴CD40结合，分别使用稳定过表达人或猴CD40的HEK293T细胞进行FACS细胞结合检测。简单而言，使用本领域常规技术手段分别构建表达人CD40和猴CD40的HEK293T细胞，将10⁵个HEK293T-huCD40或HEK293T-cynoCD40细胞在96孔板上铺板，并加入梯度稀释的CD40抗体(最高浓度40μg/ml)。4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍。加入500倍稀释的APC-山羊抗小鼠IgG。4℃孵育1小时后，细胞用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪监测细胞荧光。测定结果如图7、图8所示，从图7、图8可知，相比对照抗体APX005，抗体30H7-1、35A1-1、42D11-8和31A2-2与人和猴CD40具有更高结合力。

2.3候选抗体30H7-1、35A1-1、42D11-8和31A2-2的激活功能试验

具体实验方法见实施例1.4激活功能实验筛选部分，结果如图9，从图9可知，单克隆抗体42D11-8和31A2-2具有较强的CD40信号通路激动性，且显著优于对照抗体APX005M；30H7-1和35A1-1对CD40信号通路的激动性稍好于对照抗体。

综上对抗体30H7-1、35A1-1、42D11-8和31A2-2的结合和激活功能验证，筛选42D11-8和31A2-2抗体进行人源化和进一步验证。

实施例3嵌合抗CD40抗体表达与纯化

将编码抗体42D11-8和31A2-2的重链和轻链可变区基因(分别如SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：45所示)和各自的人IgG1/κ恒定区(重链恒定区序列如SEQ ID NO：56所示，轻链恒定区的序列如SEQ ID NO：57所示)序列插入到pCDNA3.4的限制性酶切位点XhoI/BamHI来构建鼠人嵌合表达载体。

将上述获得的表达载体转染Expi-293TM细胞。具体而言，Expi-293TM细胞在Expi-293TM表达培养基中培养，并用使用Expi-293TM转染试剂盒将各表达载体转染至细胞，DNA与Expi-Fectamine的比例是1：3，每毫升细胞培养液中加入DNA的量是1.5μg。转染后的Expi-293TM细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中以100RPM转速培养。5-7天后，收集细胞培养上清，按照实施例1.3的方法步骤纯化所述单克隆抗体。

实施例4 CD40嵌合单克隆抗体与HEK293T细胞表达的人CD40结合试验

抗体42D11-8的嵌合抗体命名为抗体C42，其重链和轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO：22和26所示；抗体31A2-2的鼠人嵌合抗体命名为抗体C31，其重链和轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：23和27所示；人重链和轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：30和31所示。

为确定已鉴定到准确的VH和VL序列，在表达CD40的293T细胞上利用FACS实验进一步验证嵌合抗体C42和C31与表达于293T细胞上的人CD40的结合活性，具体实验操作见实施例2.2。测定结果如图10所示，嵌合抗体C42和C31与293T-人CD40具有高亲和力，结合活性优于阳性对照抗体APX005M。

实施例5应用DC激活实验检测嵌合抗体C42和C31的促进树突细胞成熟试验

分别从8名献血者采取人外周血液，放置于抗凝管中，无菌转移并集中后，与等体积的无菌PBS混匀。在50ml无菌离心管按照比例沿管壁缓慢加入15ml的PBMC分离试剂，继而沿管壁加入30ml血液与PBS等体积混合液。离心，800g，20min，升速设置为1，降速设置为0，离心后收集中间层即为富集的PBMC。应用单核细胞分离试剂盒从PBMC中富集单核细胞。将单核细胞离心，计数后用1640+10％非灭活FBS培养基重悬细胞并调整细胞密度为1×10⁶/ml，并加入终浓度为1％的P/S，100ng/ml的GM-CSF，10ng/ml的IL-4，转移至合适的细胞培养瓶中。将培养瓶放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养3天后，换成上述步骤中的新鲜培养基，继续培养4天，备用。

分别处理8个人的DC细胞，收集，离心，用1640+10％灭活FBS培养基重悬细胞，并调整细胞密度为4×10⁵/ml，每孔150ul接种到96孔实验板中。配制待测抗体，起始配制浓度为30ug/ml，依次进行4倍稀释，12个浓度点(包含0浓度点)，每孔50μl接种到实验板中。将实验板静置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h后，应用Human IL-12/IL-23 p40 Valukine^TMELISA kit检测上清中细胞因子IL-12的释放量。数据处理及统计作图，以浓度的对数值为横坐标，以IL-12的释放量为纵坐标做非线性拟合曲线。结果如图11～18所示，从图11～18可知，8名健康志愿者捐献的外周血分化而成的DC细胞用于激活实验，均显示嵌合抗体C42、C31、APX005M具有较强的激活DC细胞的能力，即刺激DC细胞激活并释放IL-12，且具有浓度依赖性；8名健康志愿者的数据均显示鼠人嵌合抗体C42、C31对DC细胞的激活能力强于阳性对照抗体APX005M。

实施例6 CD40抗体的人源化

6.1 CD40抗体人源化

小鼠源抗体的人源化改造通过互补决定区(CDR)移植法，参见美国专利4816567；5225539；5530101；5585089；5693762和6180370进行，具体按照如下的方法进行人源化。

将42D11-8和31A2-2的轻链和重链可变区序列与NCBI网站的人免疫球蛋白基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对。选择与42D11-8和31A2-2同源度最高、表达量也比较高的同时也被其它已成药药物使用过的人种系IGVH和IGVK作为人源化改造的框架。所选择的轻链种系受体序列是人IGKV2D-30*01，所选择的重链种系受体序列是人IGHV4*01。

对42D11-8和31A2-2的可变结构域用PDB BLAST调取序列最接近的抗体晶体结构模型(结构分辨率高于2.5埃)，进行三维结构模拟，以确定可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。简单来说，所选结构模板分别与42D11-8和31A2-2具有相同类型的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、H-CDR1、H-CDR2、和H-CDR3环状结构。利用所选择的结构模板，通过用人种系重链和轻链框架序列代替小鼠框架而构建人源化42D11-8和31A2-2的结构模型。随后进行三维结构建模，以鉴定出可能对维持CDR环状结构或重链和轻链连接起重要作用的关键框架氨基酸残基。当鼠源抗体框架与人种系受体框架在某一位点上拥有相同的氨基酸残基时，保留人种系氨基酸残基。另一方面，当鼠源框架与人种系受体框架在某一位点上拥有不同的氨基酸残基时，通过结构模拟来评价该残基的重要性。如果发现人种系受体框架内的某一氨基酸残基与CDR区残基相互作用并对CDR残基产生影响，那么该残基就会回复突变为鼠源残基。

抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK值(Marshall etal(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)JImmunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol 37：697-706)。糖基化已知发生在含有N-X-S/T序列的基序中。31A2-2-VH的CDR1-NYSVH中，N为糖基化位点，突变为S。

6.2人源化抗体表达与纯化

人源化CD40抗体42D11-8(42D11-8-humanized)和31A2-2(31A2-2-humanized)分别命名为42和31，42人源化重链和轻链可变区核苷酸序列如SEQ NO:48和50所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:32和34所示；合成编码31人源化重链和轻链可变区核苷酸序列如SEQ NO:49和51所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:33和35所示。人IgG1恒定区的核苷酸序列如SEQ NO:56所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；人源化轻链可变区人K恒定区的核苷酸序列如SEQ NO:57所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示。

经过同源建模计算，最后得到最优的Fab结构，将合成编码42和31人源化重链和轻链可变区序列加上人IgG1恒定区以及编码人源化轻链可变区人K恒定区的核苷酸序列，利用BamH I和Xho I限制性酶切位点克隆到pCDNA3.4(+)表达载体中。所有表达构建均经测序证实：抗体42的重链和轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:36和38所示，核苷酸序列如SEQ IDNO:52和54所示，抗体31的重链和轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:37和39所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:53和55所示。用重链表达载体和轻链表达载体转染Expi-293F表达系统，并瞬时表达人源化CD40抗体42和31，方法步骤如实施例3所述。人源化抗体按照实施例1.3所述方法进行纯化。

实施例7人源化CD40抗体的活性检测

7.1 FACS实验检测人源化抗体的结合力

利用FACS实验进一步验证人源化抗体42和31与293T-huCD40的结合力，具体实验操作见实施例2.2。结果如图19所示，从图19可知，抗体31的EC50值(0.2967μg/ml)，42抗体EC50值(0.2505μg/ml)，均低于对照抗体APX005M的EC50值(0.4875μg/ml)，人源化抗体42和31结合293T-huCD40的强度优于对照抗体。

7.2人源化CD40抗体与人CD40的亲和力

嵌合或人源化CD40抗体对人CD40的亲和力测定是利用Blitz法根据仪器Fortebio的说明书进行操作。选用AMC生物传感器，抗-CD40抗体以10μg/ml结合120秒，在动力学缓冲液中进行120秒抗CD40抗体的解离；流动相为抗原huCD40-his，分别稀释200nM，100nM，50nM，25nM，12.5nM，6.25nM 6个梯度。使用Blitz pro 1.2软件进行数据分析，分别得到结合常数(Ka)、解离常数(Kd)，最后得出单克隆抗体的亲和力常数KD(Kd/Ka)，结果见表4。从表4看出嵌合抗体和人源化抗体的结合亲和力数据优于阳性对照APX005M抗体。

表4 CD40抗体对人CD40的结合亲和力

sample	antigen	KD(M)	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)
					APX005M	CD40His	3.82E-08	1.40E+05	5.33E-03
31Chimeric	CD40His	4.52E-09	8.75E+04	3.95E-04
					31Humanized	CD40His	1.65E-08	1.35E+05	2.23E-03
42Chimeric	CD40His	1.35E-08	3.89E+05	5.24E-03
					42Humanized	CD40His	3.32E-08	9.40E+04	3.12E-03

实施例8应用DC激活实验检测人源化抗体42和31的促进树突细胞成熟

按照实施例5中的实验操作，应用DC激活实验检测人源化抗体42和31的促进树突细胞成熟。结果如图20-23所示，4名健康志愿者捐献的外周血分化而成的DC细胞用于激活实验，显示人源化抗体42、31以及APX005M均具有较强的激活DC细胞的能力，即刺激DC细胞激活并释放IL-12，且具有浓度依赖性；4名健康志愿者的数据显示人源化抗体42和31对DC细胞的激活能力均强于阳性对照抗体APX005M。

实施例9人源化抗体的体内药效学研究

9.1人源化抗体31、42对NPG小鼠人Burkitt’s淋巴瘤Raji细胞、CIK细胞、DC细胞共接种皮下移植瘤模型的药效学研究

选取7～8周龄的雌性NPG小鼠(购自北京维通达生物技术有限公司)，收集处于对数生长期的Raji细胞(购自中科院细胞库)，将Raji细胞与CIK细胞、DC细胞以20:10:2的比例混合，0.2ml/只体积接种于NPG小鼠的右侧胁肋部皮下。每只小鼠接种的Raji细胞量为5×10⁶个。接种肿瘤第3天，将小鼠按照体重随机分为七组G1-G7(溶媒对照组、31低、高剂量组、42低、高剂量组、APX005M低、高剂量组)，分组后开始给药。溶媒对照组腹腔注射10ml/kgPBS，抗体31低、高剂量组腹腔注射1、10mpk的31，抗体42低、高剂量组腹腔注射1、10mpk的42，APX005M低、高剂量组腹腔注射1、10mpk的APX005M。所有组别给药频率均为一周两次，连续给药三周。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm³)＝[D×d²]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)＝(1-给药组体积/对照组体积)×100％。

结果如图24所示，在给药后第19天，抗体31低、高剂量组的TGI分别为60.05％、86.83％；抗体42低、高剂量组的TGI分别为66.96％、87.95％；APX005M低、高剂量组的TGI分别为58.09％、85.27％；与溶媒对照组相比，抗体31和42的高、低剂量组均具有非常显著的抗肿瘤作用(P<0.01)。以上结果表明，抗CD40人源化抗体31和42均显示出良好的抗肿瘤效果，抑瘤效果优于对照抗体APX005M。

9.2抗体31、42对NPG小鼠人Burkitt’s淋巴瘤Raji细胞、CIK细胞、DC细胞共接种皮下移植瘤模型的治疗作用研究

选取7～8周龄的雌性NPG小鼠(购自北京维通达生物技术有限公司)，收集处于对数生长期的Raji细胞(购自中科院细胞库)，将Raji细胞与CIK细胞、DC细胞以20:10:2的比例混合，0.2ml/只体积接种于NPG小鼠的右侧胁肋部皮下。每只小鼠接种的Raji细胞量为5×10⁶个。待小鼠的平均肿瘤体积达到100mm³左右时，将小鼠按照肿瘤体积和体重随机分为七组(溶媒对照组、抗体31低、高剂量组、抗体42低、高剂量组、APX005M低、高剂量组)，分组后开始给药。溶媒对照组腹腔注射10ml/kg PBS，抗体31低、高剂量组腹腔注射3、10mpk的31，抗体42低、高剂量组腹腔注射3、10mpk的42，APX005M低、高剂量组腹腔注射3、10mpk的APX005M。所有组别给药频率均为一周两次，连续给药四周。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm³)＝[D×d²]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)＝(1-给药组体积/对照组体积)×100％。

结果如图25所示，在给药后第31天，抗体31低、高剂量组的TGI分别为68.80％、74.52％；抗体42低、高剂量组的TGI分别为70.05％、84.95％；APX005M低、高剂量组的TGI分别为66.69％、67.27％；与溶媒对照组相比，抗体31和42以及APX005M的低剂量和高剂量组均具有非常显著的抗肿瘤作用(P<0.01)。以上结果表明，抗CD40人源化抗体31和42对Raji/CIK/DC共接种皮下移植瘤模型具有显著的治疗作用，且其治疗作用优于对照抗体APX005M。

序列表

<110> 鲁南制药集团股份有限公司

<120> 靶向人CD40的激动型单克隆抗体

<130> 2020

<160> 57

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Tyr Gly Val His

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Ile Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Val Gly Gly Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asn Tyr Ser Val His

1 5

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser

1 5 10 15

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Tyr Gly Val Ser

1 5

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Ile Gly

1 5 10 15

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Val Gly Met Asp Tyr

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Tyr Gly Val Tyr

1 5

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Gly

1 5 10 15

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Val Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Phe Gln Thr Thr His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Leu Ala Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Phe Gln Thr Thr His Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Lys Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Trp Thr Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Phe Gln Gln Thr His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 22

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Phe Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 23

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Phe Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 24

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Ile

50 55 60

Gly Arg Leu Ser Ile Ser Lys Arg Leu Phe Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 25

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val Tyr Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Gly Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Phe Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 26

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 27

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 28

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Leu Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Ile Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 29

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Glu Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Ala Leu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gln

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 30

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 32

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 33

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 34

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 36

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

115 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

180 185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

340 345 350

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 37

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

115 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

180 185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

340 345 350

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 38

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 39

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 40

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60

acctgcacag tctctggttt ctcattaact agctatggtg tacactgggt tcgccagtct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggagtg gtggaagcac agactataat 180

tcagctttca tatccagact gagcatcagc aaggacaact tcaagagcca agtcttcttt 240

aaaatgaaca gtctgcaagc tgatgacaca gccatatact attgtgccag agttgggggg 300

gactactggg gccaaggcac cactgtcaca gtctcctca 339

<210> 41

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60

acctgcacag tctctggttt ctcattaact aactatagtg tacactgggt tcgccagtct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggagtg gtggaagcac agactataat 180

gcagctttca tatccagact gagcatcagc aaggacaact tcaagagcca agtcttcttt 240

aaaatgaaca gtctgcaagc tgatgacaca gccatatact attgtgccag agttgggggg 300

gactactggg gccaaggcac cactgtcaca gtctcctca 339

<210> 42

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gaggttcagc tgcaacagag tggcgcagag ttggtgcagc cctcacaatc cctgtcaatt 60

acatgcactg tatccggctt ttcattgacc tcttatgggg tctcatgggt cagacagagc 120

cccggcaaag ggttggagtg gcttggaatg atatggtcag gaggatcaac tgactataat 180

tccgcagtca ttggtcgctt gagtattagt aagaggttgt ttaagtctca agtcttcttc 240

aagatgaact cactccaagc agacgacacc gctatgtact attgtgctcg cgtcgggatg 300

gactactggg gtcaggggac tagcgtcact gtgtctagc 339

<210> 43

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gaagtccaac tccaacagtc aggggcagag cttgttcaac ctagtcagtc cctgagcatt 60

acttgtaccg tctccggctt cagtctcacc tcttatggtg tatactgggt tagacaaagt 120

ccaggcaaag ggttggaatg gttgggtatg atatggagcg gcggtagcac cgactacaat 180

agcgccttca aaggtagatt gagcatatct aaagacaact tcaaaagtca ggtctttttt 240

aagatgaata gtctccaagc tgatgatacc gcagtgtact tctgtgctcg cgttggtttc 300

gattattggg gacaagggac aagtgtcacc gttagttct 339

<210> 44

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gatattgtga taacccagac tcctctctcc ctgcctgtca gtcttggaga tccagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtcgtg gaaacaccta tttacattgg 120

ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccggttt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaggatc 240

agcagattgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ttcaaactac acatgttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

<210> 45

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gatgttttga tgacccaaac gcctctctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcctgcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttcta cacagtcgtg gaaacaccta tttacattgg 120

ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaggatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ttcaaactac acatgttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

<210> 46

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gacatagtgc tcacccaaag tcctacatcc ctcccagtga gtctgggaga tccagcttcc 60

atttcatgcc gagcatctca aagcctggta catagcaggg gaaatacata tcttcactgg 120

ttccttcaaa agctcggtca aagcccaaag ctccttatat atctggcctc aaaccgcttt 180

agtggggtgc ccgacaggtt tagtggctct ggaagcggta ctgacttcac cctgcgcata 240

tcacgactcg aaattgaaga cttgggagtt tattattgct ttcagacaac tcacgttcct 300

ctcacctttg gagcaggcac caagctcgaa ataaaa 336

<210> 47

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

gatatcgtgc ttactcagag tccaacatct ctccccgtga gtcttggcga tccagcctct 60

atatcttgca aagcaagtca atcattggtg cattccaggg gtaatacata ccttcactgg 120

tttcttcaaa agcctggaca gagccctaaa cttctcatct actggacaag caatagattc 180

tcaggtgtcc ccgacagatt ctccggtagc gggagcggta cagacgaaac acttcggatt 240

tcccggcttg aagccctgga ccttggtgtt tatttttgtt ttcaacaaac acacgtccct 300

tacaccttcg gtgccggtac aaaactcgaa ataaag 336

<210> 48

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

caagtgcagc tgcaagagag cggccctggc ctggtgaagc cttctcagac cctgagcctg 60

acctgcaccg tgagcggctt cagcctgaca agctacggcg tgcactgggt gagacagcac 120

cctggcaagg gcctggagtg gctgggcatg atctggagcg gcggcagcac cgactacaac 180

agcgccttca tcagcagact gacgattagc aaggacaaca gcaagagcca agtgtccctg 240

aagctgagct cggtcaccgc cgccgacacc gccgtgtact actgcgcaag agtaggcggc 300

gattactggg gccaaggcac caccgtgact gtgagcagc 339

<210> 49

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc cttccgaaac actgtctctg 60

acctgcaccg tgtccggctt ctccctgacc tcttactccg tgcactgggt ccgacagcct 120

ccaggcaaag gattggagtg gctgggcatg atttggagcg gcggctctac cgattacaac 180

gccgccttca tctcccggct gaccatctcc aaggacaact ccaagagcca ggtgtccctg 240

aagctgtcct ctgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgtgctag agtcggcggc 300

gattattggg gccagggcac aacagtgacc gtgtcctct 339

<210> 50

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gacatcgtga tcacacagag ccctctgagc ctgcctgtga ccctgggaca gcctgctagc 60

atcacctgca gaagctctca gagcctggtg cacagcagag gcaacaccta cctgcactgg 120

tttcagcaga gacctggaca gagccctaga ctgctgatct acaaggtgag caataggttc 180

agtggagtgc ccgacagatt cagtggttcc ggtagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240

agcagagtgg aggccgagga cgtgggcgtg tacttctgct ttcagaccac ccacgtgcct 300

tggaccttcg gccaaggcac aagactggag atcaag 336

<210> 51

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gacgtggtca tgacacagag ccctctgagc ctgcctgtga cattgggaca gcctgcctct 60

atcacctgtc ggtcctctca gtccctgctg cactccagag gcaacaccta cctgcactgg 120

ttccagcaga ggcctggcca gtctcctaga ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 180

tctggcgtgc ccgacagatt ttccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240

tccagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tacttctgct tccaaaccac acacgtgccc 300

tggacctttg gccagggcac cagactggaa atcaag 336

<210> 52

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

caagtgcagc tgcaagagag cggccctggc ctggtgaagc cttctcagac cctgagcctg 60

acctgcaccg tgagcggctt cagcctgaca agctacggcg tgcactgggt gagacagcac 120

cctggcaagg gcctggagtg gctgggcatg atctggagcg gcggcagcac cgactacaac 180

agcgccttca tcagcagact gacgattagc aaggacaaca gcaagagcca agtgtccctg 240

aagctgagct cggtcaccgc cgccgacacc gccgtgtact actgcgcaag agtaggcggc 300

gattactggg gccaaggcac caccgtgact gtgagcagcg ctagcaccaa gggtcctagc 360

gtgttccctt tagcccctag cagcaagagc acaagcggcg gcaccgccgc cctgggctgc 420

ttggtaaagg attacttccc tgagcctgtg accgtatcct ggaacagcgg cgccctgaca 480

agcggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc 540

gtagtgaccg tgcctagcag cagcctgggc acacagacct acatctgcaa cgtgaaccac 600

aagcctagca acaccaaggt ggacaagaag gtggagccta agagctgcga caagacccac 660

acctgccctc cttgccctgc ccctgagctg ctgggcggcc ctagcgtgtt tctgtttcct 720

cctaagccta aggacaccct gatgatcagc agaacccctg aggtgacctg cgtggtggtg 780

gacgtggagc acgaggaccc tgaggtgaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 840

cacaacgcca agaccaagcc tagagaggag cagtacaaca gcacctacag agtggtgagc 900

gtgctgaccg tgctgcacca agactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 960

aacaaggccc tgcctgcccc tatcgagaag acaataagca aggccaaagg acagcctaga 1020

gagcctcaag tgtacaccct gcctcctagc agagacgagc tgaccaagaa ccaagtgagc 1080

ctgacatgtc ttgtgaaagg gttctaccct agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 1140

ggacagcctg agaacaacta caagaccacc cctcctgtgc tggacagcga cggcagcttc 1200

ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag agcagatggc agcaaggcaa cgtgttcagc 1260

tgctctgtta tgcacgaggc cctgcacaac cactacacac agaagagcct gagcctgagc 1320

cctggcaag 1329

<210> 53

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc cttccgaaac actgtctctg 60

acctgcaccg tgtccggctt ctccctgacc tcttactccg tgcactgggt ccgacagcct 120

ccaggcaaag gattggagtg gctgggcatg atttggagcg gcggctctac cgattacaac 180

gccgccttca tctcccggct gaccatctcc aaggacaact ccaagagcca ggtgtccctg 240

aagctgtcct ctgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgtgctag agtcggcggc 300

gattattggg gccagggcac aacagtgacc gtgtcctctg cttccaccaa gggaccctct 360

gtgttccctc tggctccttc cagcaagtct acctctggcg gaacagctgc tctgggctgt 420

ctggtcaagg actacttccc tgagcctgtg acagtgtcct ggaactctgg cgctctgaca 480

tccggcgtgc acacctttcc agctgtgctg caatcctccg gcctgtactc tctgtcctcc 540

gtcgtgaccg tgccttctag ctctctgggc acccagacct acatctgcaa tgtgaaccac 600

aagcctagca acaccaaggt ggacaagaag gtggaaccca agtcctgcga caagacccac 660

acctgtcctc catgtcctgc tccagaactg ctcggcggac cttccgtgtt tctgttccct 720

ccaaagccta aggacaccct gatgatctct cggacccctg aagtgacctg cgtggtggtg 780

gatgtggaac acgaggatcc cgaagtgaag ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg 840

cacaacgcca agaccaagcc tagagaggaa cagtacaact ccacctacag agtggtgtcc 900

gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc 960

aacaaggccc tgcctgctcc tatcgaaaag accatcagca aggctaaggg ccagcctcgg 1020

gaaccccagg tttacacatt gcctccatct cgggacgagc tgaccaagaa tcaggtttcc 1080

ctgacatgcc tcgtgaaggg cttctacccc tccgatatcg ccgtggaatg ggagtccaat 1140

ggccagcctg agaacaacta caagacaacc cctcctgtgc tggactccga cggctcattc 1200

ttcctgtact ccaagctgac agtggacaag tccagatggc agcagggcaa cgtgttctcc 1260

tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaat cactacaccc agaagtccct gtctctgtcc 1320

cctggcaaa 1329

<210> 54

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gacatcgtga tcacacagag ccctctgagc ctgcctgtga ccctgggaca gcctgctagc 60

atcacctgca gaagctctca gagcctggtg cacagcagag gcaacaccta cctgcactgg 120

tttcagcaga gacctggaca gagccctaga ctgctgatct acaaggtgag caataggttc 180

agtggagtgc ccgacagatt cagtggttcc ggtagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240

agcagagtgg aggccgagga cgtgggcgtg tacttctgct ttcagaccac ccacgtgcct 300

tggaccttcg gccaaggcac aagactggag atcaagagaa ccgtggccgc ccctagcgtg 360

ttcatcttcc ctcctagcga cgagcagctg aagagcggca ccgctagcgt ggtgtgcctg 420

ctgaacaact tctaccctag agaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480

agcggcaaca gccaagagag cgtgaccgag caagacagca aggacagcac ctacagcctg 540

agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaagtgta cgcctgcgag 600

gtgacccacc aaggcctgag cagccctgtg accaagagct tcaacagagg cgagtgc 657

<210> 55

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

gacgtggtca tgacacagag ccctctgagc ctgcctgtga cattgggaca gcctgcctct 60

atcacctgtc ggtcctctca gtccctgctg cactccagag gcaacaccta cctgcactgg 120

ttccagcaga ggcctggcca gtctcctaga ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 180

tctggcgtgc ccgacagatt ttccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240

tccagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tacttctgct tccaaaccac acacgtgccc 300

tggacctttg gccagggcac cagactggaa atcaagcgga cagtggccgc tccttccgtg 360

ttcatcttcc caccttccga cgagcagctg aagtccggca cagcttctgt cgtgtgcctg 420

ctgaacaact tctaccctcg ggaagccaag gtgcagtgga aggtggacaa tgccctgcag 480

tccggcaact cccaagagtc tgtgaccgag caggactcca aggacagcac ctacagcctg 540

tcctccacac tgaccctgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa 600

gtgacccatc agggcctgtc tagccctgtg accaagtctt tcaaccgggg cgagtgt 657

<210> 56

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

gctagcacca agggtcctag cgtgttccct ttagccccta gcagcaagag cacaagcggc 60

ggcaccgccg ccctgggctg cttggtaaag gattacttcc ctgagcctgt gaccgtatcc 120

tggaacagcg gcgccctgac aagcggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagagcagc 180

ggcctgtaca gcctgagcag cgtagtgacc gtgcctagca gcagcctggg cacacagacc 240

tacatctgca acgtgaacca caagcctagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagcct 300

aagagctgcg acaagaccca cacctgccct ccttgccctg cccctgagct gctgggcggc 360

cctagcgtgt ttctgtttcc tcctaagcct aaggacaccc tgatgatcag cagaacccct 420

gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtggag cacgaggacc ctgaggtgaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga gcagtacaac 540

agcacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aagactggct gaacggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcctgccc ctatcgagaa gacaataagc 660

aaggccaaag gacagcctag agagcctcaa gtgtacaccc tgcctcctag cagagacgag 720

ctgaccaaga accaagtgag cctgacatgt cttgtgaaag ggttctaccc tagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa cggacagcct gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg 840

ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcagatgg 900

cagcaaggca acgtgttcag ctgctctgtt atgcacgagg ccctgcacaa ccactacaca 960

cagaagagcc tgagcctgag ccctggcaag 990

<210> 57

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

agaaccgtgg ccgcccctag cgtgttcatc ttccctccta gcgacgagca gctgaagagc 60

ggcaccgcta gcgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc ctagagaggc caaggtgcag 120

tggaaggtgg acaacgccct gcagagcggc aacagccaag agagcgtgac cgagcaagac 180

agcaaggaca gcacctacag cctgagcagc accctgaccc tgagcaaggc cgactacgag 240

aagcacaaag tgtacgcctg cgaggtgacc caccaaggcc tgagcagccc tgtgaccaag 300

agcttcaaca gaggcgagtg c 321

Claims

1.一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；所述HCDR1序列包含SEQ ID NO：1或4或6或9所示的氨基酸序列；所述HCDR2序列包含SEQ ID NO：2或5或7或10所示的氨基酸序列；所述HCDR3序列包含SEQ ID NO：3或8或11所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列包含以下任意一组：

序列如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：2所示的HCDR2，序列如SEQ IDNO：3所示的HCDR3；

序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：5所示的HCDR2，序列如SEQ IDNO：3所示的HCDR3；

序列如SEQ ID NO：6所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR2，序列如SEQ IDNO：8所示的HCDR3；

序列如SEQ ID NO：9所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：10所示的HCDR2，序列如SEQ IDNO：11所示的HCDR3。

3.根据权利要求1所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；所述LCDR1序列包含SEQ ID NO：12或15或16或19所示的氨基酸序列；所述LCDR2序列包含SEQ ID NO：13或17或20所示的氨基酸序列；所述LCDR3序列包含SEQ ID NO：14或18或21所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列包含以下任意一组：

序列如SEQ ID NO：12所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：13所示的LCDR2，序列如SEQ IDNO：14所示的LCDR3；

序列如SEQ ID NO：15所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：13所示的LCDR2，序列如SEQ IDNO：14所示的LCDR3；

序列如SEQ ID NO：16所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：17所示的LCDR2，序列如SEQ IDNO：18所示的LCDR3；

序列如SEQ ID NO：19所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：20所示的LCDR2，序列如SEQ IDNO：21所示的LCDR3。

5.根据权利要求1-4任一所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，其选自以下任意一组：

序列如SEQ ID NO：12所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：13所示的LCDR2，序列如SEQ IDNO：14所示的LCDR3，序列如SEQ ID NO：1所示HCDR1，序列如SEQ ID NO：2所示HCDR2，序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；

序列如SEQ ID NO：15所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：13所示的LCDR2，序列如SEQ IDNO：14所示的LCDR3，序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：5所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；

序列如SEQ ID NO：16所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：17所示的LCDR2，序列如SEQ IDNO：18所示的LCDR3，序列如SEQ ID NO：6所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：8所示的HCDR3；

序列如SEQ ID NO：19所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：20所示的LCDR2，序列如SEQ IDNO：21所示的LCDR3，序列如SEQ ID NO：9所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：10所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：11所示的HCDR3。

6.根据权利要求5所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包含SEQ ID NO：22-25、32、33任一项所示的氨基酸序列，或包含与这些序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

7.根据权利要求5所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：26-29、34、35任一项所示的氨基酸序列，或包含与这些序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

8.根据权利要求5所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其具有以下任意一组的重链可变区和轻链可变区：

SEQ ID NO：22所示的重链可变区，SEQ ID NO：26所示的轻链可变区；

SEQ ID NO：23所示的重链可变区，SEQ ID NO：27所示的轻链可变区；

SEQ ID NO：24所示的重链可变区，SEQ ID NO：28所示的轻链可变区；

SEQ ID NO：25所示的重链可变区，SEQ ID NO：29所示的轻链可变区；

SEQ ID NO：32所示的重链可变区，SEQ ID NO：34所示的轻链可变区；

SEQ ID NO：33所示的重链可变区，SEQ ID NO：35所示的轻链可变区；

包含与这些序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

9.根据权利要求5所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体是鼠源抗体、人鼠嵌合抗体或人源化抗体。

10.一种核苷酸分子，编码权利要求5所述的一种特异性结合CD40抗体或抗原结合片段。

11.一种核苷酸分子，编码权利要求1-4，6-9任一项所述的一种特异性结合CD40抗体或抗原结合片段。

12.一种表达载体，其含有权利要求10所述的多核苷酸。

13.一种表达载体，其含有权利要求11所述的多核苷酸。

14.一种宿主细胞，其含有权利要求12所述的表达载体。

15.一种宿主细胞，其含有权利要求13所述的表达载体。

16.一种组合物，包含权利要求5所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。

17.一种疫苗，包括权利要求5所述的一种特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段以及任选的免疫佐剂。

18.一种权利要求5所述的特异性结合CD40抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗CD40相关疾病药物中的用途。

19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病包括肿瘤，所述肿瘤选自肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、晚期胰腺癌皮肤癌、头或颈癌、鼻咽癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、直肠癌、膀胱癌、肠胃癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多毛细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、多发性骨髓瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、胆道癌、中枢神经系统肿瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经梢瘤、髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺癌、黑素瘤、间皮脂瘤、恶性血液瘤、淋巴瘤、晚期实体瘤、或其转移瘤。