JP6466397B2 - 抗原特異的ｂ細胞の同定及び単離ならびに所望の抗原に対する抗体作製のプロトコール - Google Patents

Description

関連出願の開示

本出願は、２０１３年３月１５日に出願された、「ＰＲＯＴＯＣＯＬ ＦＯＲ ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ ＡＮＤ ＩＳＯＬＡＴＩＮＧ ＡＮＴＩＧＥＮ−ＳＰＥＣＩＦＩＣ Ｂ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＴＯ ＤＥＳＩＲＥＤ ＡＮＴＩＧＥＮＳ」と題する米国仮出願第６１／７９１，４７１号の利益を主張する。当該出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本出願は、その開示の一部として、「４３２５７ｏ３８１３．ｔｘｔ」という名称で２０１４年２月２８日に作成された３，６４７バイトのサイズを有するファイルに記載された生物学的配列表を含む。当該表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、抗体分泌細胞及び抗体産生細胞、特にウサギ抗原特異的Ｂ細胞の同定方法、ならびにこれらの細胞によって産生される抗体の抗原特異的配列のクローニング方法、ならびにこれらの抗体配列の変異体、特にこれらの抗体配列のヒト化型及びキメラ型の発現方法に関する。当該方法は、たとえば、ヒトポリペプチド、ウイルスポリペプチド及び小ペプチドなどの種々の抗原、ならびに比較的非免疫原性であり、かつ／または他のＢ細胞選択法では高品質の抗体を作製するのが難しい他の抗原に対する高品質の抗体を得るために使用することができる。

モノクローナル抗体を作製する方法には、特定の抗原を標的にする抗体を産生するＢリンパ球を単離することに基づくものが知られている。これらの方法は、一般に、精製した抗原または抗原の混合物を用いて、その抗原に結合するＢリンパ球を同定し、単離することに依存している。抗原または抗原の混合物を使用して、抗原に特異的な表面受容体を発現する抗体産生細胞（ＡＦＣ）またはＢリンパ球を選択することに依存する方法には、抗原で被覆した磁気ビーズ（Ｌａｇｅｒｋｖｉｓｔら、１９９５）または蛍光色素標識抗原及び蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）（Ｗｅｉｔｋａｍｐら、２００３）を用いて、細胞を単離することが挙げられ、その後、通常、クローンへと展開されている。モノクローナル抗体は、たとえば、融合によるハイブリドーマの作製（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９３）、または抗体可変領域をコードする遺伝子のクローニング（たとえば、ＲＴ−ＰＣＲの使用）（Ｌａｇｅｒｋｖｉｓｔら、１９９５；Ｗａｎｇ＆Ｓｔｏｌｌａｒ、２０００；Ｗｅｉｔｋａｍｐら、２００３）によって、これらのクローンから産生される。

あるいは、特定の抗原に特異的な抗体を分泌する個々の細胞を同定する方法も記載されている。抗原を結合させた赤血球を用いる溶血プラークアッセイを行った後に、ＲＴ−ＰＣＲなどの技術を用いて、抗体可変領域をコードする遺伝子をクローニングすることができる（Ｂａｂｃｏｏｋら、１９９６：米国特許第５，６２７，０５２号（１９９７）Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．）。

本発明は、所望の抗原に特異的な抗体を分泌する可能性の高い抗体分泌細胞（ＡＳＣ）（たとえば、抗原特異的Ｂ細胞）の同定方法、抗体産生細胞からのＡＳＣまたはＡＳＣのクローンの作製方法、ならびに抗原特異的な抗体の可変配列であって、これらのＡＳＣによって分泌される、所望の抗原に特異的な抗体の軽鎖可変領域及び／または重鎖可変領域をコードする配列のクローニング方法を提供する。特に、当該方法は、抗原特異的ＡＳＣの濃縮、抗原認識のための１次スクリーニング工程、ならびにＡＳＣ、好ましくは抗原特異的Ｂ細胞の収率を向上させるためのＡＳＣ染色及び分取を組み合わせた機能特性のための任意のスクリーニングを含む。当該方法は、抗体を産生するあらゆる種からのモノクローナル抗体の作製に適用することができる。好ましい実施形態において、当該方法は、ウサギまたはヒトのＢ細胞を用いて行われる。

本発明は、（ｉ）目的の抗原で免疫にした宿主または自然感染した宿主からＢ細胞を取得すること、（ｉｉ）抗原特異的Ｂ細胞の濃縮集団、すなわち、目的の抗原に結合する抗体を産生するＢ細胞を、濃縮前のＢ細胞画分に比べてより高い割合で含有するものを得るために、当該Ｂ細胞の画分を濃縮すること、（ｉｉｉ）当該濃縮抗原特異的Ｂ細胞集団から得た１つ以上の画分を、目的の抗原に結合する単一の抗体を産生するクローン性Ｂ細胞集団の形成に有利な培養条件下で個別に培養すること、（ｉｖ）目的の抗原に結合する単一の抗体を産生するクローン性Ｂ細胞集団を検出し、これにより１つ以上の抗原特異的Ｂ細胞を同定すること、（ｖ）任意で、少なくとも１つの所望の機能特性を有する抗原特異的抗体を産生するＢ細胞を同定するために、工程（ｉｖ）にて同定されたクローン性抗原特異的Ｂ細胞集団をスクリーニングすること、（ｖｉ）任意で、異なるクローン性Ｂ細胞培養物から得た抗原特異的Ｂ細胞（たとえば、異なる培養ウェルに含まれるもの）をプールすること、（ｖｉｉ）上記工程（ｉｖ）または任意の工程（ｖ）もしくは任意の工程（ｖｉ）を経て得た抗原特異的Ｂ細胞を、染色後のＢ細胞の陽性または陰性の選択を容易にする標識で染色すること、及び（ｖｉｉｉ）染色した抗原特異的Ｂ細胞を分取して、単一の抗原特異的Ｂ細胞を単離することを含む、抗原特異的抗体を発現するＢ細胞（すなわち、抗原特異的Ｂ細胞）の同定方法を提供する。以下に開示するように、いくつかの実施形態において、濃縮の手順を２回または３回行ってもよい。

本発明はまた、抗原特異的な抗体の可変配列であって、上記で概略した方法を用いて同定した抗原特異的Ｂ細胞によって発現される抗体の軽鎖可変領域及び／または重鎖可変領域をコードする配列のクローニング方法を提供する。一実施形態において、クローニング方法は、上記の工程（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）に加えて、（ｉｘ）分取したＢ細胞によって発現される抗原特異的抗体の可変配列の増幅を容易にする、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の反応媒体に、分取したＢ細胞を入れること、（ｘ）増幅させた抗原特異的抗体の可変配列をコードする核酸の配列を決定すること、（ｘｉ）増幅させた抗原特異的抗体の可変配列をコードする核酸またはその変異体を発現させ、抗体ポリペプチドを作製すること、及び（ｘｉｉ）発現させた抗体ポリペプチドのうち目的の抗原に結合する抗体ポリペプチドを決定することを含む。

一実施形態において、宿主は、モルモット、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類またはヒトである。好ましくは、宿主はウサギである。Ｂ細胞は、免疫付与から約２０〜約９０日後に宿主から取得することができ、好ましくは、免疫付与から約５０〜約６０日後に宿主から取得することができる。

別の実施形態において、工程（ｉ）は、脾臓、リンパ節、骨髄及び血液からの末梢血単核細胞から選択される少なくとも１つの供給源からＢ細胞を採取することを含む。別の実施形態において、工程（ｉ）は、脾臓、リンパ節、骨髄、末梢血単核細胞及び血液から選択される２つ以上の供給源からＢ細胞を採取し、２つ以上の供給源からの当該Ｂ細胞をプールすることを含む。

一実施形態において、当該方法は、宿主から得た血清中に存在する抗原特異的抗体（すなわち、抗原に特異的に結合する抗体）及び／または中和抗体（すなわち、抗原がレセプターもしくはリガンドなどの結合相手と結合するのを中和もしくは阻害する抗体及び／または抗原の少なくとも１つの生物学的活性を中和もしくは阻害する抗体）の力価を確定することをさらに含む。

一実施形態において、濃縮工程（ｉｉ）は、固体マトリックス（好ましくは磁気ビーズ）または担体（好ましくはカラム）に直接的または間接的に付着させた抗原を用いる、抗原特異的Ｂ細胞のアフィニティー精製を含む。別の実施形態において、固体マトリックスまたは担体に直接的または間接的に付着している抗原は、ビオチン化してからストレプトアビジン、アビジンまたはニュートロアビジンを介してマトリックスまたは担体に付着させる。

特定の実施形態において、濃縮工程（ｉｉ）は、（１）Ｂ細胞とビオチン標識抗原を合わせること、（２）任意で、Ｂ細胞／ビオチン標識抗原の構成物を洗浄すること、（３）（１）または（２）のＢ細胞／ビオチン標識抗原の構成物にストレプトアビジンビーズを導入すること、（４）ストレプトアビジンビーズ／Ｂ細胞／ビオチン標識抗原の構成物をカラムに通すこと、及び（５）カラムを洗浄して、結合したＢ細胞をカラムから溶出させ、これにより、濃縮された抗原特異的Ｂ細胞集団を得ることを含む。あるいは、濃縮工程（ｉｉ）は、（１）ビオチン標識抗原とストレプトアビジンビーズを合わせること、（２）ビオチン標識抗原／ストレプトアビジンビーズの構成物をカラムに通すこと、（３）カラムを洗浄して、ビオチン標識抗原で被覆したビーズをカラムから溶出させること、（４）Ｂ細胞と被覆ビーズを合わせること、（５）Ｂ細胞と被覆ビーズの混合物をカラムに通すこと、及び（６）カラムを洗浄して、結合したＢ細胞をカラムから溶出させ、これにより、濃縮された抗原特異的Ｂ細胞集団を得ることを含み得る。いずれかの濃縮方法または両方法を組み合わせた方法を少なくとも１回繰り返すことで、さらに濃縮した抗原特異的Ｂ細胞集団を得ることができる。

一実施形態において、濃縮工程（ｉｉ）により、抗原特異的Ｂ細胞の割合が少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍に高まる。別の実施形態において、濃縮したＢ細胞集団中の抗原特異的Ｂ細胞の割合は、少なくとも１％、５％または１０％である。

一実施形態において、濃縮した抗原特異的Ｂ細胞を、フィーダー細胞、好ましくは照射済みＥＬ４細胞を含む培地にて培養する。培地は、活性化Ｔ細胞の馴化培地を含み得る。好ましくは、濃縮したＢ細胞を、約１％〜約５％の活性化ウサギＴ細胞の馴化培地（ＴＳＮ）を含む培地にて培養する。例示的実施形態において、ＴＳＮは、Ｓｅｅｂｅｒら、「Ａ Ｒｏｂｕｓｔ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｏ Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｂｂｉｔ Ｂ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ」、ＰＬｏＳ ＯＮＥ９（２）：ｅ８６１８４、及び公報ＥＰ０４８８４７０Ａ１（特に、段落００４６）に記載されるもののような当該技術分野において知られている方法によって作製することができる。これらの各文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

培養は、少なくとも約１〜９日、２〜８日、３〜７日、４〜６日、または５〜７日間行うことができる。好ましくは、約５〜７日間で培養を行う。

一実施形態において、濃縮したＢ細胞をマルチウェルプレートで培養する。各ウェルは、少なくとも１、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも２００個の濃縮Ｂ細胞を含有する。別の実施形態において、各ウェルは、約５０〜約１００個の濃縮Ｂ細胞、約２５〜約５０個の濃縮Ｂ細胞、または約１０〜約２５個の濃縮Ｂ細胞を含有する。好ましい実施形態において、約１〜約２００個の濃縮抗原特異的Ｂ細胞と照射済みＥＬ４細胞及びＴ細胞上清（ＴＳＮ）とをマルチウェルプレートの各ウェル中で混合する。

一実施形態において、抗原認識検出工程（ｉｖ）は、抗原反応性上清を含むマルチウェルプレートの個々のウェルを特定するために、培養した濃縮Ｂ細胞から上清を取り、当該上清を評価することにより、抗原特異的Ｂ細胞を含むウェルを検出することを含む。好ましくは、上清をＥＬＩＳＡによって評価する。一実施形態において、ＥＬＩＳＡのスクリーニングによる抗原反応性上清を別のプレートに移し、元の培養プレートに凍結媒体を添加する。特定の実施形態において、濃縮Ｂ細胞を約２〜約７日間培養した後の抗原特異的ＩｇＧの産生及び総ＩｇＧ産生量について上清を評価する。総ＩｇＧ産生量のアッセイは、（１）抗種Ｆａｂ、好ましくは抗ウサギＦａｂでプレートをコーティングすること、（２）培養したＢ細胞から得た上清をプレートに添加すること、及び（３）抗種ＩｇＧ、好ましくは抗ウサギＩｇＧを用いて、上清中の総ＩｇＧを検出することによって行うことができる。さらに、抗原特異的ＩｇＧ産生のアッセイは、（１）非標識抗原でプレートをコーティングすること、またはビオチン標識抗原でストレプトアビジンプレートをコーティングすること、（２）培養したＢ細胞から得た上清をプレートに添加すること、及び（３）抗種ＩｇＧ、好ましくは抗ウサギＩｇＧを用いて、上清中の抗原特異的ＩｇＧを検出することによって行うことができる。マルチウェルプレート中の抗原特異的ウェルと総ＩｇＧウェルの比は、Ｂ細胞濃縮と抗体分泌細胞のクローン性とに相関し得る。

一実施形態において、任意の機能活性スクリーニング工程（ｖ）は、少なくとも１つの所望の機能特性を有する抗原特異的抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞を含有するウェルを特定するために、抗原特異的機能性アッセイを使用して抗原反応性上清を評価することを含む。特に、任意の機能活性スクリーニング工程（ｖ）は、結合相手への抗原結合に対するアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用、特定の標的細胞型の増殖の誘発または阻害、標的細胞の溶解の誘発もしくは阻害、または抗原に関与する生物学的経路の誘発もしくは阻害を呈する抗原特異的抗体を産生するＢ細胞を同定するために、工程（ｉｖ）で同定した抗原特異的Ｂ細胞をスクリーニングすることを含み得る。例示的な機能活性スクリーニング工程は、Ｔ１１６５細胞の増殖の誘発もしくは阻害、ＴＦ１細胞の増殖の誘発もしくは阻害、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞におけるｃＡＭＰ産生の誘発もしくは阻害、またはＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ相互作用の阻害に関して、抗原特異的抗体をスクリーニングすることを含む。

一般に、１つ以上の凍結工程及び保存工程が当該方法の工程の１つ以上の間に存在してもよい。

一実施形態において、染色工程（ｖｉｉ）は、陰性抗原特異的Ｂ選択方法を容易にする。陰性抗原特異的Ｂ選択は、照射済みＥＬ４細胞を染色する第１の標識（第１の標識は好ましくはＴｈｙ１．２である）と、死細胞を染色する第２の標識（第２の標識は好ましくはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）である）とでＢ細胞を染色することにより行われる。当該方法は、陰性選択の染色後、フローサイトメトリーを使用して、すべての生存可能な非ＥＬ４細胞を分取することをさらに含み、好ましくは、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）または免疫磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を使用して実施する。

別の実施形態において、染色工程（ｖｉｉ）は、陽性抗原特異的Ｂ選択方法を容易にする。陽性抗原特異的Ｂ選択は、種特異的Ｂ細胞を染色する第１の標識（第１の標識は好ましくは抗ウサギＩｇＧである）と、死細胞を染色する第２の標識（第２の標識は好ましくはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）である）とで染色することにより行われる。当該方法は、陽性選択の染色後、フローサイトメトリーを使用して、すべての生存可能な種特異的Ｂ細胞を分取することをさらに含み、好ましくは、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して実施する。分取工程（ｖｉｉｉ）は、たとえば、ＦＡＣＳを使用して、細胞をＲＴ−ＰＣＲ反応媒体に（後続の任意の増幅及びクローニングのために）直接分取することを含み得る。

加えて、分取工程（ｖｉｉｉ）は、染色分取したＢ細胞を必要に応じてゲーティングすることをさらに含み得る。好ましい実施形態において、任意のゲーティング工程は、別個の物理学的性質（ＦＳＣ／ＳＳＣ集団）を有する、生存可能な非ＥＬ４細胞を選択することを含む。別の好ましい実施形態において、任意のゲーティング工程は、たとえば、自家蛍光レベルと関係しないＦＳＣ／ＳＳＣ物理的ゲートを描くことによって、別個の物理学的性質（ＦＳＣ／ＳＳＣ集団）を有する、分取した生存可能な種特異的Ｂ細胞を選択することを含む。任意のゲーティング工程は、細胞染色に基づいて分取することをさらに含み得る。この場合、染色サンプルのベースラインとして、未染色細胞の自家蛍光に基づいてゲートを設けることを含み得る。

分取工程は、単一ウェル分取法またはプール分取法を使用して実施することができる。プール分取法では、抗原特異的抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞を含有する異なる個々のウェルを染色及び細胞分取の前に合わせる。一実施形態において、類似の親和性及び／または所望の機能特性を有する抗原特異的抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞を含有する異なる個々のウェルを染色及び分取の前に合わせる。マルチウェルプレートの異なる１００個以上の「陽性」ウェル（すなわち、所望の抗原に結合する単一抗体を産生する抗原特異的Ｂ細胞の含有が特定されたウェル）をプール分取のために合わせることができる。好ましくは、約２〜約１０個の異なる個々のウェル、約１０〜約５０個の異なる個々のウェル、または約５０〜約１５０個の異なる個々のウェルの抗原特異的Ｂ細胞をプール分取のために合わせることができる。

一実施形態において、当該方法は、増幅させ、配列決定した、抗体の抗原特異的可変領域をコードする核酸を、酵母、細菌、植物、昆虫、両生類または哺乳類の細胞などの組換え細胞中で発現させることを含む、発現工程（ｘｉ）をさらに含む。組換え細胞は、好ましくは、ピキアなどの二倍体酵母である。

別の実施形態において、当該方法は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、蛍光免疫測定法、ウェスタンブロット、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））分析、または他の抗原認識法を使用して、発現させた抗体ポリペプチド（たとえば、抗原特異的Ｂ細胞から単離した抗体の抗原特異的可変配列をコードする核酸を、増幅させ、配列決定し、組換え発現させたもの）のうち目的の抗原に結合する抗体ポリペプチドを決定することを含む決定工程（ｘｉｉ）をさらに含む。好ましくは、組換え抗体ポリペプチドの抗原結合特異性は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定する。

別の実施形態において、本発明は、記載のＢ細胞選択方法に従って作製された、生存可能な非ＥＬ４細胞を主とする分取集団をさらに含むものであり、当該分取細胞集団は別個の物理的性質（ＦＳＣ／ＳＳＣ集団）を有する。この場合、好ましくは、フローサイトメトリーによって細胞集団を得る。好ましくは、照射済みＥＬ４細胞を染色する第１の標識と、死細胞を染色する第２の標識とでＢ細胞を染色することによって行う、陰性抗原特異的Ｂ選択を使用する。第１の標識は、好ましくはＴｈｙ１．２であり、第２の標識は、好ましくはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）である。これらの分取細胞は、好ましくは、所望の抗原（特に、その抗原に特異的な抗体がヒトの治療における使用に潜在的に適しているもの）に対して親和性の高い抗体を分泌するＢ細胞を含有する。

別の実施形態において、本発明は、記載のＢ細胞選択法に従って作製された、生存可能な種特異的Ｂ細胞の分取集団をさらに含むものであり、当該細胞集団は別個の物理的性質（ＦＳＣ／ＳＳＣ集団）を有する。この場合、細胞の分取集団は、好ましくは、フローサイトメトリーによって得る。種特異的Ｂ細胞を染色する第１の標識と、死細胞を染色する第２の標識とで染色することによって行う、陽性抗原特異的Ｂ選択を使用する。第１の標識は、好ましくは抗ウサギＩｇＧであり、第２の標識は、好ましくはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）である。これらの分取細胞も、好ましくは、所望の抗原（特に、その抗原に特異的な抗体がヒトの治療における使用に潜在的に適しているもの）に対して親和性の高い抗体を分泌するＢ細胞を含有する。

採取したＢ細胞の濃縮により抗原特異的Ｂ細胞の同定が改善することを示す。非クローン性Ｂ細胞培養物から得たＩｇＧ産生ウェルでは３０個のうち３個が抗原特異性を示したのに対し、濃縮したＢ細胞培養物から得たＩｇＧ産生ウェルでは６個のうち５個が抗原特異性を示した。 Ｂ細胞を分取する際に、最後のＦＳＣ／ＳＳＣゲートを用いて収集した、より大きく、顆粒状でない表現型（主な細胞集団と比較して）の抗原特異的Ｂ細胞のサブ集団を示す。 非抗原特異的Ｂ細胞を除いた細胞分取によって取得した抗原特異的Ｂ細胞を示す。染色細胞の大部分が生存不能及び／または照射済みフィーダー細胞であった（Ｔｈｙ１．２＋及び／またはＰＩ＋）。生存可能な非照射Ｂ細胞（ＰＩ−及び／またはＴｈｙ１．２−）を選択し、最後のＦＳＣ／ＳＳＣゲートにかけて、所望の物理的表現型を有する細胞のサブ集団を得た。これをＲＴ−ＰＣＲマスターミックス中に分取した。 細胞分取における陽性抗原特異的Ｂ細胞の選択を示す。総Ｂ細胞集団のうちの小さな分画がＩｇＧ陽性である。生存可能なＩｇＧ陽性Ｂ細胞（ＰＩ−及びウサギＩｇＧ＋）を選択し、最後のＦＳＣ／ＳＳＣゲートにかけて、所望の物理的表現型を有する細胞のサブ集団を得た。これをＲＴ−ＰＣＲマスターミックス中に分取した。 陰性選択した抗原特異的Ｂ細胞をＦＳＣ／ＳＳＣでゲートしたサブ集団では、増幅の成功率が平均よりも良いことを示す。所望のアンプリコンサイズを有する細胞は、Ｔｈｙ１．２−／ＰＩ−Ｂ細胞（最後のＦＳＣ／ＳＳＣゲートなし）では８８個のうち１個であったのに対して、ＦＳＣ／ＳＳＣでゲートしたＴｈｙ１．２−／ＰＩ−Ｂ細胞では８８個のうち２６個であった。 ２つの抗ＰＣＳＫ９抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）の結合親和性を示す。 ＬＤＬ取込みアッセイにおける２つの抗ＰＣＳＫ９抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）の機能性を示す。 ２つの抗ＣＧＲＰ抗体（Ａｂ３及びＡｂ４）の結合親和性を示す。 ２つの抗標的１抗体（Ａｂ５及びＡｂ６）の結合親和性を示す。 ２つの抗ＮＧＦ抗体（Ａｂ７及びＡｂ８）の結合親和性を示す。 ＴＦ１増幅アッセイにおける２つの抗ＮＧＦ抗体（Ａｂ７及びＡｂ７）の機能性を示す。 ２つの抗標的２抗体（Ａｂ９及びＡｂ１０）の結合親和性を示す。 ＨＴＲＦアッセイにおける２つの抗標的２抗体（Ａｂ９及びＡｂ１０）の結合親和性の機能性を示す。 ＥＬＩＳＡによって決定した２つの抗標的３抗体（Ａｂ１１及びＡｂ１２）の結合親和性を示す。 本発明の抗体選択法を実施するための２つの例示的手段を示すフローチャートである。 本発明の抗体選択法を実施するための２つの例示的手段を示すフローチャートである。 本発明の抗体選択法を実施するための２つの例示的手段を示すフローチャートである。

本発明は、抗体分泌細胞及び抗体産生細胞、特にウサギ抗原特異的Ｂ細胞の同定方法、ならびにこれらの細胞によって産生される抗体の抗原特異的配列、たとえば、Ｖ_Ｈ及び／またはＶ_Ｌ領域のクローニング方法を提供する。以下に記載し、例を示すように、これらの方法は、濃縮、培養、検出、スクリーニング、単離、染色、分取、増幅、配列決定、発現及び決定の一連の工程を含み、各工程を組み合わせて、連続して、繰り返してまたは一定の期間を空けて用いることができる。好ましくは、所望の抗原に対して特異的なモノクローナル抗体、または当該抗体もしくはその変異体に対応する核酸配列の作製に使用できる、少なくとも１つの抗原特異的Ｂ細胞を同定するためにこれらの方法が用いられる。

本発明の方法において、抗体は、濃縮工程、抗原特異的Ｂ細胞のクローン性集団をもたらす培養工程、抗原認識アッセイを用いて抗原特異的Ｂ細胞を同定するための検出工程、所望の機能特性を有する抗原特異的抗体を産生する抗原特異的Ｂ細胞を同定するための任意のスクリーニング試験、染色細胞の陽性または陰性選択のための染色工程、及び単一の抗原特異的Ｂ細胞を得るための分取工程を経て、選択される。

当該方法は、１つ以上の単離抗原特異的細胞から選択した抗体またはその一部の配列決定工程をさらに含み得る。配列決定には当該技術分野において知られている任意の方法を採用することができ、重鎖、軽鎖、可変領域及び／または相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列決定を含み得る。好ましくは、当該方法は、濃縮工程、培養工程及び配列決定工程を含む。

一実施形態において、本発明は、
（ｉ）目的の抗原で免疫にした宿主または自然感染した宿主からＢ細胞を取得すること、
（ｉｉ）目的の抗原に結合する抗体を産生するＢ細胞を、濃縮前のＢ細胞画分に比べてより高い割合で含有する抗原特異的Ｂ細胞の濃縮集団を得るために、当該Ｂ細胞の画分を濃縮すること、
（ｉｉｉ）当該濃縮抗原特異的Ｂ細胞集団から得た１つ以上の画分を、目的の抗原に結合する単一の抗体を産生するクローン性Ｂ細胞集団の形成に有利な培養条件下で個別に培養すること、
（ｉｖ）目的の抗原に結合する単一の抗体を産生するクローン性Ｂ細胞集団を検出し、これにより１つ以上の抗原特異的Ｂ細胞を同定すること、
（ｖ）任意で、少なくとも１つの所望の機能特性を有する抗原特異的抗体を産生するＢ細胞を同定するために、工程（ｉｖ）にて同定されたクローン性抗原特異的Ｂ細胞集団をスクリーニングすること、
（ｖｉ）任意で、異なるクローン性Ｂ細胞培養物から得た抗原特異的Ｂ細胞をプールすること、
（ｖｉｉ）上記工程（ｉｖ）または任意の工程（ｖ）もしくは任意の工程（ｖｉ）を経て得た抗原特異的Ｂ細胞を、染色後のＢ細胞の陽性または陰性の選択を容易にする標識で染色すること、及び
（ｖｉｉｉ）染色した抗原特異的Ｂ細胞を分取し、任意で、分取した染色Ｂ細胞をゲーティングして、単一の抗原特異的Ｂ細胞を単離することを含む、抗原特異的Ｂ細胞（すなわち、抗原特異的抗体を発現するもの）の同定方法を提供する。

さらに、当該方法は、
（ｉｘ）分取したＢ細胞によって発現される抗原特異的抗体の可変配列の増幅を容易にする、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の反応媒体に、分取したＢ細胞を入れること、
（ｘ）増幅させた抗原特異的抗体の可変配列をコードする核酸の配列を決定すること、
（ｘｉ）増幅させた抗原特異的抗体の可変配列をコードする核酸またはその変異体を発現させ、抗体ポリペプチドを作製すること、及び
（ｘｉｉ）発現させた抗体ポリペプチドのうち目的の抗原に結合する抗体ポリペプチドを決定することによって、抗原特異的な抗体の可変配列であって、可変軽鎖領域及び／または可変重鎖領域をコードする配列をクローニングすることをさらに含む。

本明細書に開示される本発明のＢ細胞選択プロトコールは、所望の標的抗原に特異的な抗体分泌Ｂ細胞及びモノクローナル抗体を取得するための他の方法に対して、固有の利点が数多くある。これらの利点には、限定するものではないが、以下が挙げられる。

第１に、所望の抗原、たとえば、ＰＣＳＫ９、ＣＧＲＰ、標的１、ＮＧＦまたは標的２などにともに、これらの選択手順を使用すると、実質的に包括的な抗体の補体と考えられるもの、すなわち、様々な異なる抗原のエピトープに結合する抗体を作製できる抗原特異的Ｂ細胞が再現性よく得られることが認められた。理論に束縛されるものではないが、この包括的な補体は、最初のＢ細胞回収の前に行われる抗原濃縮工程に起因すると想定される。さらに、この利点により、特定の抗体のエピトープ特異性に応じて変わり得る、異なる特性を有する抗体の単離及び選択が可能になる。

第２に、本発明のＢ細胞選択プロトコールでは、比較的高い結合親和性（すなわち、ピコモルに近い抗原結合親和性）で所望の抗原に概して結合する単一のモノクローナル抗体を分泌する単一Ｂ細胞またはその子孫を含むクローン性Ｂ細胞培養物が再現性よく得られることが認められた。これとは対照的に、従来の抗体選択法では、親和性の高い抗体は比較的わずかしか得られない傾向にあり、そのため、治療可能性を有する抗体を単離するには広範なスクリーニング手順が必要である。理論に束縛されるものではないが、本発明のプロトコールでは、宿主のｉｎ ｖｉｖｏでのＢ細胞免疫付与（一次免疫）、続く２回目のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢ細胞刺激（二次抗原プライミング工程）の両方を行うことで、回収するクローン性Ｂ細胞の、抗原標的に特異的な高親和性の単一のモノクローナル抗体を分泌する能力及び性質が向上し得ると想定される。

第３に、本発明のＢ細胞選択プロトコールでは、平均して品質の高い（すなわち、所望の標的に対して選択性の高い（抗原特異的な））ＩｇＧを産生する、かつ／または所望の機能特性を示す濃縮Ｂ細胞が再現性よく得られることが観察された（本明細書ではＰＳＣＫ９、ＣＧＲＰ、標的１、ＮＧＦ及び標的２に特異的なＢ細胞として示す）。この点に一部基づき、本発明の方法によって回収された抗原濃縮Ｂ細胞は、上述したように、エピトープ特異性を持つ所望の完全な補体をもたらすことができるＢ細胞を含むと考えられる。

第４に、本発明のＢ細胞選択プロトコールは、小さな抗原（すなわち、１００個以下のアミノ酸ペプチド、たとえば５〜５０個のアミノ酸長）とともに用いた場合であっても、当該小さな抗原（たとえばペプチド）に対する親和性の高い単一の抗体を分泌するクローン性Ｂ細胞培養物が再現性よく得られることが観察された。小さなペプチドに対して親和性の高い抗体を作製することは、通例では相当に困難で、多大な労力を要すものであり、場合によっては実現不可能でさえあるため、極めて驚くべきことである。したがって、本発明を用いることで、たとえば、ウイルス、細菌または自己抗原のペプチドなどの所望のペプチド標的に対する治療用抗体を作製することができる。これにより、極めて個別の結合特性を有するモノクローナル抗体の作製、または異なるペプチド標的（たとえば、異なるウイルス株）に対するモノクローナル抗体カクテルの作製さえ可能になる。この利点は、異なるＨＰＶ株に対して防御免疫を誘導するＨＰＶワクチンなどの所望の価数を有する治療または予防ワクチンの製造において、特に有用であり得る。

第５に、本発明のＢ細胞選択プロトコールは、特に、ウサギ由来のＢ細胞とともに使用すると、内在性ヒト免疫グロブリンに極めて類似し（アミノ酸レベルで約９０％類似）、ヒト免疫グロブリンに極めて相似の長さを有するＣＤＲを含む、抗原特異的抗体配列が再現性よく得られる傾向がある。したがって、潜在的な免疫原性の問題を排除するために、配列を改変する必要性がほとんどないか、全く必要ない（概して、親抗体配列中、多くても数個のＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のみが改変され得る）。特に、好ましくは、組換え抗体には、抗体認識に必要な宿主（ウサギ）ＣＤＲ１及びＣＤＲ２残基と、全ＣＤＲ３のみが含まれる。これにより、本発明のＢ細胞及び抗体選択プロトコールに従って作製し、回収した抗体配列の高い抗原結合親和性は、そのまま維持され、ヒト化されたとしても実質的にそのまま維持される。

要するに、本発明の方法を用いることで、従来の既知のプロトコールに比べて、より効率的なプロトコールの使用によって、より多様なエピトープに対して高い結合親和性を呈する抗体を作製することができる。

抗体分泌細胞の取得

本明細書で開示される方法は、免疫宿主から免疫細胞を含有する細胞集団を取得する工程を含む。免疫宿主から免疫細胞を含有する細胞集団を取得する方法は、当該技術分野において知られており、一般に、宿主の免疫応答を誘導し、宿主から細胞を採取して、１つ以上の細胞集団を取得することを含む。免疫応答は、所望の抗原で宿主を免疫にすることによって誘発することができる。あるいは、かかる免疫細胞の供給源として利用する宿主は、所望の抗原に自然感染したものでもよい。たとえば、バクテリアもしくはウイルスなどの特定の病原体に感染した個体、または罹患した癌に対して特定の抗体応答を備える個体などである。

宿主動物は、当該技術分野においてよく知られており、限定するものではないが、モルモット、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒトだけでなく他の哺乳類、齧歯類、ニワトリ、ウシ、ブタ、ヤギ及びヒツジが挙げられる。宿主は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはウサギ、マウス、ラットまたはヒトであり、最も好ましくはウサギである。宿主は、抗原に曝露すると、その抗原に対する生来の免疫応答の一部として、抗体を産生する。上述の通り、免疫応答は、疾病により自然発生し得、抗原による免疫付与によって誘導することもできる。免疫付与は、当該技術分野において知られた任意の方法、たとえば、完全もしくは不完全フロイントアジュバントなどの免疫応答を高める試薬を使用して、または使用せずに、抗原を１回以上注入することなどにより実施することができる。宿主動物をｉｎ ｖｉｖｏで免疫にする代わりに、宿主細胞の培養物をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫にすること、またはＤＮＡ免疫法を当該方法に含めることができる。

免疫応答の時間を置いてから（たとえば、血清抗体検出で測定して）、宿主動物の細胞を採取して、１つ以上の免疫細胞含有細胞集団を取得する。採取する細胞集団は、好ましくは、脾臓、リンパ節、骨髄、血液及び／または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のうち少なくとも１つに由来するものである。細胞は、２つ以上の供給源から採取し、プールすることができる。ある特定の抗原には、ある特定の供給源が好ましい場合がある。たとえば、ＰＣＳＫ９、ＣＧＲＰ、標的１、ＮＧＦ及び標的２には、脾臓、リンパ節及び全血が好ましい。その後、宿主動物の血清中に存在する抗原特異的抗体及び／または中和抗体の力価を決定することができる。

細胞集団は、免疫後、約２０〜約９０日またはこの中の増分で採取し、好ましくは約５０〜約６０日で採取する。採取した細胞集団及び／またはその単一細胞懸濁液は、抗体選択のために、濃縮、スクリーニング及び／または培養することができる。採取した細胞集団中の抗原特異的細胞の頻度は、通常、約１％〜約５％またはこの中の増分である。

本出願全体を通じて、「増分」という用語は、ある数値を、たとえば最近接の１０、１、０．１、０．０１などの様々な精度で定義するために使用される。増分は、いずれかの測定可能な精度に丸めることができ、範囲の両側を同じ精度に丸める必要はない。たとえば、１〜１００の範囲またはこの範囲内の増分は、２０〜８０、５〜５０及び０．４〜９８などの範囲を含む。範囲に制限がない場合、たとえば、１００未満の範囲である場合は、この範囲内の増分は１００と測定可能な限界値との間の増分を意味する。たとえば、１００未満またはこの中の増分は、たとえば、温度などの特徴が０で制限されない場合を除き、０〜１００またはこの中の増分を意味する。

抗体分泌細胞の濃縮

本発明は、単一抗体産生Ｂ細胞を単離する既存の方法に改善をもたらす。特に、当該方法は、宿主から得たＢ細胞の濃縮を行う濃縮工程（ｉｉ）を含むため、濃縮されたＢ細胞集団を得ることができる。濃縮工程により、後続の培養工程で必要な細胞が少なくなる。たとえば、マルチウェル組織培養プレートの個々のウェルに、より低いＢ細胞培養濃度で播種でき、さらに望ましい成功率を達成できる。たとえば、わずか約１０個または約２５個の濃縮Ｂ細胞を、その後、マルチウェルプレートの各ウェルで培養することができ、この場合でもなお抗原特異的抗体が得られる。

抗原特異的細胞の頻度が低い細胞集団から抗体を作製する従来技術とは異なり、本発明は、高頻度の抗原特異的細胞から抗体を選択することができる。濃縮工程が抗体選択の前に用いられるので、抗体の作製に使用される細胞の大多数、好ましくは事実上すべての細胞が抗原特異的である。抗原特異性の頻度が高い細胞集団から抗体を作製することにより、抗体の量及び多様性が向上する。

濃縮したＢ細胞集団は、濃縮前のＢ細胞サンプルに比べて、より高い割合で抗原特異的Ｂ細胞、すなわち、目的の抗原に結合する抗体を産生する細胞を含有している。一実施形態において、濃縮したＢ細胞集団中の抗原特異的Ｂ細胞の割合は、少なくとも１％、５％または１０％である。

濃縮工程は、あらゆる選択工程、たとえば、細胞集団からの特定のＢ細胞の選択及び／または特定の細胞によって産生された抗体の選択よりも先に行われる。その後、濃縮したＢ細胞集団をクローン性Ｂ細胞集団の形成に有利な条件下で培養するので、濃縮により、当該抗原に特異的な単一のモノクローナル抗体を産生するクローン性Ｂ細胞集団を得ることができる。

本出願全体を通して、「クローン性Ｂ細胞集団」とは、所望の抗原に特異的な単一の抗体のみを分泌するＢ細胞の集団を指す。すなわち、これらの細胞は、所望の抗原に特異的な、一つの型のモノクローナル抗体のみを産生するということである。

本出願において、細胞集団の細胞を「濃縮する」とは、混合細胞集団（たとえば、所望の抗原に対して免疫にした宿主に由来するＢ細胞を含有する単離物）に含まれる所望の細胞（典型的には抗原特異的Ｂ細胞）の頻度を上げることを意味する。したがって、濃縮した細胞集団は、濃縮工程の結果、抗原特異的細胞の頻度がより高い細胞集団及び／またはその割合がより大きい細胞集団を包含するが、この細胞集団は、異なる抗体を含んでもよいし、異なる抗体を産生してもよい。

「細胞集団」という一般用語は、濃縮前の細胞集団と濃縮後の細胞集団とを包含するが、複数の濃縮工程が実施される場合は、濃縮前及び濃縮後の両方の細胞集団であり得ることに留意されたい。たとえば、濃縮工程を１回、２回、３回またはそれ以上の工程として実施することができる。一実施形態において、本発明は、
（ａ）目的の抗原で免疫にした宿主または自然感染した宿主からＢ細胞を取得すること、及び採取した細胞集団から少なくとも１つの単一細胞懸濁液を作製すること、
（ｂ）目的の抗原に結合する抗体を産生するＢ細胞を、濃縮前のＢ細胞画分に比べてより高い割合で含有する抗原特異的Ｂ細胞の第１の濃縮集団を得るために、当該Ｂ細胞単一細胞懸濁液の画分を濃縮すること、
（ｃ）第１の抗原特異的Ｂ細胞濃縮集団に比べてより高い割合で抗原特異的Ｂ細胞を含有する第２の抗原特異的Ｂ細胞濃縮集団を形成するために、第１の抗原特異的Ｂ細胞濃縮集団を濃縮すること、
（ｄ）第２の抗原特異的Ｂ細胞濃縮集団に比べてより高い割合で抗原特異的Ｂ細胞を含有する第３の抗原特異的Ｂ細胞濃縮集団を形成するために、第２の抗原特異的Ｂ細胞濃縮集団を濃縮すること、
（ｅ）目的の抗原に結合する単一抗体を産生するクローン性Ｂ細胞集団を作製するために、第３の抗原特異的Ｂ細胞濃縮集団を培養すること、ならびに
（ｆ）第３の細胞濃縮集団から単離した抗原特異的細胞によって産生された抗体を選択することなどの複数の濃縮工程を含む方法を提供する。

各細胞集団は、次の工程で直接使用してもよいし、長期間もしくは短期間の保存のために、または後続工程（たとえば、検出、単離、染色及び分取）のために、一部もしくは全体を（たとえば、−７０℃もしくは−８０℃または液体窒素中で）凍結することもできる。また、細胞集団から得た細胞を個別に懸濁し、単一細胞懸濁液を得ることもできる。単一細胞懸濁液は、濃縮することができ、したがって、濃縮前細胞集団として使用することができる。その後、１つ以上の抗原特異的な単一細胞懸濁液と一緒にして濃縮細胞集団を形成する。すなわち、抗原特異的な単一細胞懸濁液を一緒にすることができ、たとえば、さらなる分析及び／または抗体産生のために再培養してもよい。

上述の通り、本発明のプロセスに使用されるＢ細胞濃縮集団は、本明細書に記載の工程に従った抗体選択のために、さらなる濃縮、スクリーニング及び／または培養がなされてもよい。これらの工程は、繰り返し行ってもよいし、異なる順序で実施されてもよい。好ましい実施形態において、抗体選択のために、好ましくはクローン性である抗原特異的細胞濃縮集団のうちの少なくとも１つの細胞を単離し、培養し、使用する。したがって、一実施形態において、本発明は、
ａ．採取された細胞集団を取得するために、免疫にした宿主から細胞集団を採取すること、
ｂ．採取された細胞集団から少なくとも１つの単一細胞懸濁液を作製すること、
ｃ．第１の濃縮細胞集団を形成するために、少なくとも１つの単一細胞懸濁液を好ましくはクロマトグラフィーによって濃縮すること、
ｄ．好ましくはクローン性である第２の濃縮細胞集団（すなわち、単一の型の抗原特異的Ｂ細胞のみを含有する細胞集団）を形成するために、第１の濃縮細胞集団を好ましくはＥＬＩＳＡアッセイによって濃縮すること、
ｅ．所望の抗原に特異的な抗体を産生する、単一または数個のＢ細胞を含有する第３の濃縮細胞集団を形成するために、第２の濃縮細胞集団を好ましくはＥＬＩＳＡアッセイによって濃縮すること、
ｆ．目的の抗原に結合する単一抗体を産生するクローン性細胞集団を作製するために、第３の濃縮細胞集団を培養すること、及び
ｇ．第３の濃縮細胞集団から単離した抗原特異的細胞によって産生された抗体を選択することを含む方法を提供する。

一実施形態において、濃縮した細胞集団から単一のＢ細胞を単離して、この単一のＢ細胞が抗原特異性及び／または所望の特性を有する抗体を分泌するかどうかを確認する。別の実施形態において、濃縮したＢ細胞はマルチウェルプレートで培養し、各ウェルは約１〜約２００個の濃縮Ｂ細胞を含有する。たとえば、マルチウェルプレートの各ウェルは、少なくとも１、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも２００個の濃縮Ｂ細胞を含有する。好ましくは、約５０〜約１００個の濃縮Ｂ細胞、約２５〜約５０個の濃縮Ｂ細胞、または約１０〜約２５個の濃縮Ｂ細胞を各ウェルに播種する。

一実施形態において、本発明は、抗原特異的細胞の頻度が約５０％〜約１００％またはこの中の増分である濃縮された細胞集団を得るための細胞集団の濃縮方法を提供する。好ましくは、濃縮された細胞集団は、抗原特異的細胞の頻度が約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％以上または１００％である。

別の実施形態において、本発明は、抗原特異的細胞の頻度が少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１，０００倍または１０，０００倍またはこの中の増分だけ増える、細胞集団の濃縮方法を提供する。

抗原特異性は、任意の抗原について測定することができる。抗原は、抗体が結合できる任意の物質であり得、ペプチド、タンパク質またはその断片；炭水化物；有機及び無機の分子；動物細胞、細菌細胞及びウイルスによって産生される受容体；酵素；生物学的経路のアゴニスト及びアンタゴニスト；ホルモン；ならびにサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な抗原としては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、アンギオテンシンＩＩ、ＢＡＦＦ、ＣＧＲＰ、ＣＸＣＬ１３、ＩＰ−１０、ＰＣＳＫ９、ＮＧＦ、Ｎａｖ１．７、ＶＥＧＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ及びＨＲＧが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい抗原は、ＣＧＲＰ、ＰＣＳＫ９、Ｎａｖ１．７、ＮＧＦ、アンギオテンシンＩＩ、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α及びＶＥＧＦ−αである。

２つ以上の濃縮工程を利用する方法において、各濃縮工程で使用される抗原は、別の濃縮工程で使用される抗原と同一であってもよいし、異なっていてもよい。複数の濃縮工程を同一の抗原で行うと、多量の及び／または異なる抗原特異的細胞集団が得られる。一方、複数の濃縮工程を異なる抗原で行うと、異なる抗原に交差特異性を有する濃縮細胞集団が得られる。

細胞集団の濃縮は、当該技術分野において知られている、抗原特異的細胞を単離するための任意の細胞選択手段によって実施することができる。例示的な抗原結合アッセイには、たとえば、蛍光、リン光、化学発光、電気化学発光、蛍光偏光、蛍光共鳴エネルギー移動、表面プラズモン共鳴などの光学的方法に基づいた放射線アッセイ及び非放射線アッセイが挙げられる。一実施形態において、抗原認識検出には、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、蛍光免疫測定法、ウェスタンブロット、表面プラズモン共鳴（ＰｒｏｔｅＯｎまたはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））分析、または他の抗原結合アッセイが含まれる。好ましくは、ＥＬＩＳＡを使用して抗原認識が行われる。

細胞集団は、たとえば、アフィニティー精製などのクロマトグラフィー技術によって、濃縮することができる。たとえば、固体マトリックス（たとえば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ（登録商標）のマイクロビーズのような磁気ビーズ、またはアガロースもしくはポリアクリルアミドビーズなどの非磁性ビーズ）または担体（たとえば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などの磁気カラム、またはスピンカラム及び重力流カラムなどの非磁性カラム）に直接的または間接的に付着させた抗原を用いて、抗原特異的Ｂ細胞を精製することができる。

一実施形態において、採取した細胞集団から得た単一細胞懸濁液を、好ましくはＭｉｌｔｅｎｙｉビーズを用いて濃縮する。たとえば、単一細胞懸濁液中の細胞をＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズで磁気的に標識し、そのサンプルをＭＡＣＳ（登録商標）セパレータに設置したＭＡＣＳ（登録商標）カラムにかける。標識されていない細胞はカラムを通過し、磁気的に標識した細胞はカラム内に保持される。通過画分は、非標識細胞画分として収集することができる。短期間の洗浄工程の後、カラムをセパレータから取り外し、磁気的に標識した細胞をカラムから溶出することができる。

抗原特異的細胞の頻度が約１％〜約５％である採取後の細胞集団から、抗原特異的細胞の頻度が１００％に近い濃縮した細胞集団が得られる。

目的の抗原は、固体マトリックスまたは担体に直接的または間接的に付着させられる。たとえば、抗原をビオチン化し、ストレプトアビジン、アビジンまたはニュートロアビジンを介してマトリックスまたは担体に付着させてよい。一実施形態において、濃縮工程（ｉｉ）は、磁気ビーズまたはカラムなどの固体マトリックスまたは担体に直接的または間接的に付着させた抗原を用いる、抗原特異的Ｂ細胞のアフィニティー精製を含む。好ましくは、抗原をビオチン化し、ストレプトアビジン、アビジンまたはニュートロアビジンを介してマトリックスまたは担体に付着させる。

一実施形態において、濃縮工程は、（１）Ｂ細胞とビオチン標識抗原を合わせること、（２）任意で、Ｂ細胞／ビオチン標識抗原の構成物を洗浄すること、（３）（１）または（２）のＢ細胞／ビオチン標識抗原の構成物にストレプトアビジンビーズを導入すること、（４）ストレプトアビジンビーズ／Ｂ細胞／ビオチン標識抗原の構成物をカラムに通すこと、及び（５）カラムを洗浄して、結合したＢ細胞をカラムから溶出させ、これにより、濃縮された抗原特異的Ｂ細胞集団を得ることを含む。あるいは、別の実施形態において、濃縮工程は、（１）ビオチン標識抗原とストレプトアビジンビーズを合わせること、（２）ビオチン標識抗原／ストレプトアビジンビーズの構成物をカラムに通すこと、（３）カラムを洗浄して、ビオチン標識抗原で被覆したビーズをカラムから溶出させること、（４）Ｂ細胞と被覆ビーズを合わせること、（５）Ｂ細胞と被覆ビーズの混合物をカラムに通すこと、及び（６）カラムを洗浄して、結合したＢ細胞をカラムから溶出させ、これにより、濃縮された抗原特異的Ｂ細胞集団を得ることを含む。これらの濃縮方法またはこれらの組み合わせを用い、必要に応じて少なくとも１回繰り返すことで、さらに濃縮した抗原特異的Ｂ細胞集団を得ることができる。

細胞集団は、当該技術分野において知られている任意の抗原特異性アッセイ法を実施することによっても濃縮することができる。たとえば、細胞と、抗原担持ビーズと、たとえばフルオロフォアで標識した、Ｂ細胞を採取するために使用された宿主に特異的な抗宿主抗体とを接触させることを含む、ハロアッセイを用いてもよい。しかしながら、好ましい実施形態では、フローサイトメトリーを用いて細胞集団を濃縮する。以下で論じるように、抗原特異的Ｂ選択は、染色及び分取によって単離することができる。簡潔に言えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）または免疫磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を使用して、所望の特性、たとえば、生存率、ＩｇＧ発現及び／またはサイズなどに基づいて、抗原特異的Ｂ細胞を選択することができる。

一実施形態において、少なくとも１つの単一細胞懸濁液に対して、少なくとも１つのアッセイ濃縮工程が実施される。別の実施形態において、細胞集団濃縮方法は、少なくとも１つのクロマトグラフィー濃縮工程と、少なくとも１つのアッセイ濃縮工程とを含む。

細胞集団をサイズまたは密度によって「濃縮」する方法は、当該技術分野において知られている。たとえば、米国特許第５，６２７，０５２号を参照されたい。これらの工程は、抗原特異性による細胞集団の濃縮に加えて、本方法にて使用することができる。

本発明の細胞集団は、抗原を認識することができる、少なくとも１つの細胞を含有する。抗原認識細胞には、限定するものではないが、Ｂ細胞、プラズマ細胞及びこれらの子孫が含まれる。一実施形態において、本発明は、単一の型の抗原特異的Ｂ細胞を含有するクローン性細胞集団を提供する。すなわち、このＢ細胞集団は、所望の抗原に特異的に結合する単一のモノクローナル抗体を産生する。

クローン性抗原特異的Ｂ細胞集団は、本明細書に記載する新しい培養選択プロトコールによって得られる、抗原特異的な抗体分泌細胞から主に構成されると考えられる。したがって、本発明はまた、少なくとも１つの抗原特異的な抗体分泌細胞を含有する濃縮細胞集団の取得方法も提供する。一実施形態において、本発明は、約５０％〜約１００％またはこの中の増分、すなわち、約６０％、７０％、８０％、９０％以上または１００％の抗原特異的な抗体分泌細胞を含有する濃縮細胞集団を提供する。好ましくは、濃縮細胞集団は、約１０，０００個以下の抗原特異的な抗体分泌細胞、より好ましくは約５０〜１０，０００個、約５０〜５，０００個、約５０〜１，０００個、約５０〜５００個、約５０〜２５０個、またはこの中の増分の抗原特異的な抗体分泌細胞を含む。

続けて、濃縮後の抗原特異的Ｂ細胞の培養、抗原認識アッセイによる検出、任意の機能活性についてのスクリーニング、単離、染色及び分取を行う。その後、抗原特異的抗体の可変配列（たとえば、Ｖ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖）をコードする核酸の増幅、増幅させた核酸の配列決定、対応する抗体ポリペプチドを作製するための核酸の発現、及び得られる抗体の抗原認識の決定の任意の各工程を行う。

細胞集団の濃縮は、抗原特異的な重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域を発現する抗体配列をクローニングするための抗体の産生及び／または選択を含む方法にて使用される。したがって、本発明は、抗体を選択する前に細胞集団を濃縮することを含む方法を提供する。当該方法は、少なくとも１つの抗原特異的細胞を含む細胞集団を調製すること、濃縮細胞集団を形成するために少なくとも１つの抗原特異的細胞を単離することによって細胞集団を濃縮すること、及び少なくとも１つの抗原特異的細胞から抗体産生を誘導することの各工程を含み得る。好ましい実施形態において、濃縮した細胞集団は、２つ以上の抗原特異的細胞を含有する。

濃縮した抗体分泌細胞集団の培養

本発明はまた培養工程を含み、好適な培地（たとえば、活性化Ｔ細胞の馴化培地、特に、１〜５％の活性化ウサギＴ細胞の馴化培地）を用いて、フィーダー層上で、好ましくは、培養ウェルごとに単一の増殖性抗体分泌細胞の生存に有利な条件下にて、細胞集団を培養することができる。フィーダー層は、通常、照射済み細胞物質（たとえば、ＥＬ４Ｂ細胞）から構成されるが、細胞集団の一部を形成するものではない。細胞は、好適な培地で、好適な条件下にて、抗体産生に十分な時間、たとえば、約１日〜約２週間、約１日〜約１０日、少なくとも約３日、約３日〜約５日、約５日〜約７日、少なくとも約７日、またはその他のこの中の増分で培養される。好ましくは、単一の抗体産生細胞及びその子孫が各ウェル内で生存することにより、抗原特異的Ｂ細胞のクローン性集団が各ウェル内に得られる。

クローン性細胞集団、すなわち、目的の抗原に結合する単一の抗体を産生する細胞集団の形成に有利な条件下にて、工程（ｉｉ）による濃縮細胞集団の１つ以上の画分を個別に培養する。一実施形態において、濃縮細胞集団の２つ以上の画分を、同じ濃縮細胞集団から得た別の画分と同時に個別に培養する。

一実施形態において、クローン性抗原特異的Ｂ細胞集団が得られる条件下にて、工程（ｉｉ）で得られた濃縮Ｂ細胞集団の抗原特異的Ｂ細胞を培養する。その後、抗体産生細胞の単離及び／または当該Ｂ細胞もしくは抗体に対応する核酸配列を用いた抗体の作製を行う。

濃縮集団から得た細胞は、合わせてもよいし、フィーダー細胞とともに培養してもよい。一実施形態において、濃縮細胞は、こうした条件下にて、少なくとも約１〜９日、約２〜８日、約３〜７日、約４〜６日、好ましくは約５〜７日間培養される。一実施形態において、好ましくは照射済みＥＬ４細胞（たとえば、ＥＢ４細胞の亜株ＥＢ４．Ｂ５）であるフィーダー細胞と、活性化Ｔ細胞の馴化培地を含有する培地で、濃縮した抗原特異的Ｂ細胞集団から得たＢ細胞を培養する。好ましい実施形態において、約１％〜約５％の活性化ウサギＴ細胞の馴化培地を含有する培地で、濃縮したＢ細胞を培養する。

一実施形態において、濃縮した細胞集団、たとえば、採取した細胞集団から得た抗原特異的な単一細胞懸濁液などを、様々な細胞密度（たとえば、１ウェル当たり１０、２５、５０、１００、２５０、５００個の細胞、または１〜１０００個の間の他の増分）でマルチウェルプレートに播種し、培養する。たとえば、少なくとも１、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも２００個の濃縮Ｂ細胞を各ウェルに入れたマルチウェルプレートで、濃縮したＢ細胞を培養することができる。好ましくは、各ウェルは、約１０〜約１００個の濃縮Ｂ細胞、約２５〜約５０個の濃縮Ｂ細胞、または約１０〜約２５個の濃縮Ｂ細胞を含有する。濃縮工程により、後続の培養工程で必要な細胞が少なくなる。たとえば、マルチウェル組織培養プレートの個々のウェルにより低いＢ細胞培養濃度で播種でき、さらに望ましい成功率を達成できる。

この段階で、クローン性集団によって産生された免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と抗原特異性は、強い相関関係にある。好ましい実施形態において、ＩｇＧと抗原特異性は、約５０％を上回る相関関係、より好ましくは７０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこの中の増分を上回る相関関係を呈する。相関関係は、Ｂ細胞培養を制限条件下に置き、ウェルごとに単一の抗原特異的抗体産生物を確立することによって表したものである。抗原特異的なＩｇＧと通常のＩｇＧの合成を比較した。単一の形態の抗原（ビオチン化し、直接コーティング）を認識したＩｇＧ、検出可能なＩｇＧ及び免疫化に関係のない抗原認識、ならびにＩｇＧ産生のみの３つの集団を観察した。ＩｇＧ産生と抗原特異性とが強い相関にあった。

抗原認識及び機能活性に関する抗体分泌細胞のスクリーニング

濃縮工程に加えて、抗体選択のための方法は、抗原認識及び任意で抗体機能性に関して細胞集団をスクリーニングする１つ以上の工程も含む。たとえば、所望の抗体は、特定のエピトープもしくは特定の構造の類似体への結合などの特定の構造的特徴、アンタゴニストもしくはアゴニスト活性、または中和活性（たとえば、抗原とリガンドとの間の結合を阻害）を有し得る。一実施形態において、抗体機能性のスクリーニングは、リガンド依存である。

一実施形態において、好ましくはクローン性である抗原特異的Ｂ細胞濃縮集団（当該集団から得た上記の上清は、所望の分泌モノクローナル抗体の存在を検出するために、必要に応じてスクリーニングされる）を使用して、数個のＢ細胞、好ましくは単一のＢ細胞を単離し、その後、クローン性Ｂ細胞集団における単一の抗体産生Ｂ細胞の存在を確認するために、このＢ細胞を適切なアッセイで試験する。一実施形態では、クローン性Ｂ細胞集団から約１〜約２０個の細胞が単離され、好ましくは、約１５、１２、１０、５、もしくは３個未満の細胞またはこの中の増分、最も好ましくは単一の細胞が単離される。スクリーニングは、好ましくは抗原特異性アッセイ、特にＥＬＩＳＡアッセイ（たとえば、上述したようなストレプトアビジンコーティングプレートによるビオチン化抗原の捕捉を用いる選択的抗原固定化）によって行われる。

抗原結合親和性、抗原−リガンド結合のアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用、特定の標的細胞型の増殖の誘発または阻害、標的細胞の溶解の誘発または阻害、及び抗原に関与する生物学的経路の誘発または阻害のうち少なくとも１つについて、抗体を含有する上清をスクリーニングしてもよい。好適なスクリーニング工程には、同定された抗原特異的Ｂ細胞によって産生される抗体が最低限の抗原結合親和性を有する抗体であるかどうか、当該抗体が所望の抗原とリガンドとの結合を誘導するかまたは抑制するか、当該抗体が特定の細胞型の増殖を誘発するかまたは阻害するか、当該抗体が標的細胞に対する細胞溶解反応を誘導または誘発するかどうか、当該抗体が特定のエピトープに結合するかどうか、及び当該抗体が特定の生物学的経路または抗原に関与する経路を調節（抑制または刺激）するかどうかを検出するアッセイ法が挙げられるが、これらに限定されない。

抗体機能性についてのスクリーニングには、抗原リガンドと組換え受容体タンパク質との自然の相互作用を再現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質間相互作用アッセイ、及びリガンド依存性で、かつ容易に監視できる、細胞に基づく応答（たとえば、増殖応答）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、抗体機能性は、Ｔ１１６５細胞増殖、ＴＦ１細胞増殖、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞におけるｃＡＭＰ産生またはＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ阻害を含む。

通常、抗体を含有する上清を回収し、上記の工程に従った抗体選択のために、濃縮、スクリーニング及び／または培養を行うことができる。一実施形態において、上清は、抗体機能性のために、濃縮（好ましくは、抗原特異性アッセイ、特にＥＬＩＳＡアッセイによる濃縮）及び／またはスクリーニングされる。

一実施形態において、抗体選択方法は、抗体機能性に関して、抑制率（％）を測定することによって細胞集団をスクリーニングする工程を含む。抗原特異性を有する濃縮Ｂ細胞から産生された抗体の抗原特異的可変領域をコードする核酸を増幅させ配列決定し、その核酸から発現させた組換え抗体を得れば、抑制濃度（ＩＣ_５０）を求めることができる。一実施形態において、単離された抗原特異的細胞のうち少なくとも１つは、約１００、５０、３０、２５、１０μｇ／ｍＬ未満、またはこの中の増分のＩＣ_５０を有する抗体を産生する。

別の実施形態において、抗体選択方法は、抗体結合強度に関して細胞集団をスクリーニングする工程を含む。抗体結合強度は、当該技術分野において知られている任意の方法（たとえば、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））によって測定することができる。単離された抗原特異的細胞の少なくとも１つは、たとえば、解離定数（Ｋ_Ｄ）が約５×１０^−１０Ｍ^−１未満、好ましくは約１×１０^−１３〜５×１０^−１０、１×１０^−１２〜１×１０^−１０、１×１０^−１２〜７．５×１０^−１１、１×１０^−１１〜２×１０^−１１、約１．５×１０^−１１以下、またはこの中の増分である、抗原親和性の高い抗体を産生し得る。この実施形態において、当該抗体は、親和性成熟であると言える。たとえば、抗体の親和性は、Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標）（エドレコロマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（ゲムツズマブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（アレムツズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（イブリツモマブ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）（セツキシマブ）、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）（ベバシズマブ）、Ｒａｐｔｉｖａ（商標）（エファリズマブ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）、Ｈｕｍｉｒａ（商標）（アダリムマブ）及びＸｏｌａｉｒ（商標）（オマリズマブ）のいずれか１つの親和性と同等か、それ以上である。抗体の親和性は、既知の親和性成熟技術によって高めることもできる。一実施形態において、抗体機能性及び抗体結合強度のうち少なくとも１つ、好ましくは両方に関して、少なくとも１つの細胞集団をスクリーニングする。

濃縮工程に加えて、抗体選択方法は、抗体の配列相同性、特にヒト相同性に関して、細胞集団をスクリーニングする工程を１つ以上含む。一実施形態において、単離した抗原特異的細胞の少なくとも１つは、ヒト抗体との相同性が約５０％〜約１００％またはこの中の増分であるか、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％を超えて相同である抗体を産生する。ＣＤＲグラフト技術または選択的決定残基グラフト技術（ＳＤＲ）などの当該技術分野において知られた技術によって、抗体をヒト化してヒト配列との相同性を上げることができる。

別の実施形態において、本発明はまた、ＩＣ_５０、Ｋ_Ｄ及び／または相同性に関して上述した実施形態のいずれかに従った抗体そのものも提供する。

抗体分泌細胞の単離：染色及び分取

濃縮工程に加えて、抗体選択方法はまた、単一の抗体産生細胞を単離するために、抗体分泌細胞の染色及び分取の工程を１つ以上含む。特に、特定の表現型（たとえば、生存率、表面マーカーの発現など）を有する抗原特異的細胞を同定するために、染色後の細胞の陽性または陰性選択を容易にする標識を１つ以上使用して細胞集団を染色することによって、クローン性集団内の単一の抗原特異的細胞を単離することができる。

一実施形態において、濃縮したクローン性集団から得た抗原特異的Ｂ細胞を、後続の分取のために染色する。抗原特異的Ｂ細胞を染色するための例示的な標識には、表面のγ鎖、κ鎖もしくはλ鎖、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＩｇＧ、ＩｇＤ、Ｉａ、Ｆｃ受容体または所望の抗原に結合する蛍光及び非蛍光試薬、ならびに選択的に死細胞（たとえば、ＰＩもしくは７−ＡＡＤ）または生細胞（たとえば、カルセイン染色）を染色する試薬が挙げられる。分取の特異性を向上させるために、所望の抗原特異的細胞を標的にする複数の標識を用いることができる。複数の蛍光標識を使用する場合、１つまたは２つのレーザーを用いることによって、２、３、４またはそれ以上の色で標識した細胞が分取されるように、異なる励起／発光波長を選択する。

通常、検出試薬は、標識を施すか、検出試薬に結合する第２の検出試薬を介して間接的に標識される。かかる標識化は、特に、蛍光、同位体、磁気及び常磁性であり得る。たとえば、蛍光標識または染色を使用すると、ある特定の物理的特性を有する単一細胞を同定することができる。蛍光標識の例には、６３０、５２５ｎｍ、５７５ｎｍ、６７５ｎｍ、６１０ｎｍ及び６５０ｎｍのバンドパスフィルターで検出可能なＰＩ、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰＣ５（ＰＥ−Ｃｙ５）、ＥＣＤ（ＰＥ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）及びＣｙ−Ｃｈｒｏｍｅ（Ｒ−ＰＥ）が挙げられる。細胞の個々の抗原表面マーカーに基づいて、特定の細胞型を特異的に認識するモノクローナル抗体に蛍光標識をコンジュゲートすることができる。細胞の混合集団では、異なる蛍光標識を用いると個々のサブ集団を識別できる。２つ以上の検出試薬を使用する場合、異なる検出試薬を別々に標識する（たとえば、異なるフルオロフォアを用いる）。

一実施形態において、陽性または陰性の選択を容易にする標識で抗原特異的細胞を染色する。染色工程では、異なる蛍光色素を有する少なくとも２つの標識を使用する。免疫蛍光法を用いて細胞を染色する例示的な方法は、Ｒａｄｂｒｕｃｈ，Ａ．、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２^ｎｄＥｄ．２０１０）の第３章に記載されている。たとえば、目的の抗原に対して特異性を有する抗体を発現する、生存可能なＢ細胞を陽性選択するには、蛍光色素を取り付けた抗ＩｇＧ抗体及び生存率染色でＢ細胞を標識する。好ましくは、濃縮した抗原特異的Ｂ細胞の陽性染色は、ＩｇＧ産生細胞を染色する第１の標識（たとえば、ＦＩＴＣ抗ウサギＦｃ）と、死細胞を染色する第２の標識（たとえば、ＰＩまたは７−ＡＡＤ）とで細胞を染色することを含む。ある特定の実施形態では、ＦＩＴＣ抗ＩｇＧとＰＩとで染色した抗原特異的Ｂ細胞を４８８ｎｍスペクトル線のアルゴンレーザーで励起した。あるいは、生存可能な抗原特異的Ｂ細胞を陰性選択するために、サンプル中に存在し得る他の細胞（たとえば、フィーダー細胞）に結合する蛍光色素を取り付けた抗体と、生存率染色とで細胞を標識する。好ましくは、濃縮した抗原特異的Ｂ細胞の陰性染色は、フィーダー細胞を染色する第１の標識（たとえば、Ｔｈｙ１．２）と、死細胞を染色する第２の標識（たとえば、ＰＩまたは７−ＡＡＤ）とで細胞を染色することを含む。ある特定の実施形態では、ＰＥ抗Ｔｈｙ１．２とＰＩとで染色した抗原特異的Ｂ細胞を４８８ｎｍスペクトル線のアルゴンレーザーで励起した。５２５ｎｍ、５７５ｎｍ及び６３０ｎｍのロングバンドパスフィルターをそれぞれ用いて、緑色（ＦＩＴＣ）と赤色（ＰＥ及びＰＩ）の蛍光を収集した。

さらに、いくつかの実施形態では、抗原特異的細胞を含む複数の個々のウェルを合わせてから、すなわち「プール」してから、染色及び分取を行う（「プール細胞の分取」とも言う）。好ましくは、類似の特性、たとえば、結合親和性または機能性を有する抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞を含有する個々のウェルを、染色及び分取の前に合わせる。クローン性集団の中から陽性を示したウェル、すなわち、抗原特異的細胞を含有するウェルを任意の数、染色分取工程の前に合わせる。一実施形態において、約２〜約２００個、約１０〜約１００個、約２５〜約７５個のウェルを染色及び分取の前に合わせる。好ましくは、約２〜約１０個、約１０〜約５０個のウェルまたは約５０〜約１５０個のウェルを染色及び分取の前に合わせる。プール細胞分取により、処理能力が向上し、ベンチワークが最小限に抑えられる。プール細胞分取によって同定され、任意のクローニングプロセスを経た固有の配列から得られる抗体は、特定のウェル起源ではなく、プールに由来し得る。

あるいは、抗原特異的細胞を含有する個々のウェルを個別に染色し、分取してもよい（「単一ウェル分取」とも言う）。単一ウェル分取は、処理能力が限定されるが、固有の配列をクローニングして得られる抗体と起源のウェルとを直接紐付けすることができる。さらに、単一ウェル分取では、元のスクリーニングによる最初の結果との相関がより直接的になる。

濃縮、培養及び染色の工程に加えて、当該方法はまた、ある特定の所望の表現型を持つ細胞を染色するために用いた標識の有無に基づいて、染色した抗原特異的細胞を集団及びサブ集団に分取する、分取工程を含む。分取によって、さらなる分析のために、目的の細胞を捕捉し、回収することができる。細胞を回収すれば、顕微鏡分析、生化学的分析または機能上の分析を行うことができる。染色細胞は、当業者によく知られている種々のフローサイトメトリー法を使用して分取することができる。フローサイトメトリーは、単一細胞の複数の物理的特性を同時に測定し、分析する。測定される代表的特性には、細胞の大きさ、相対粒度または内部構造の複雑さ、及び相対蛍光強度が挙げられる。各細胞の特徴は、細胞の光散乱及び蛍光特性に基づいており、これを分析することでサンプル内のサブ集団に関する情報が得られる。

一実施形態において、分取した抗原特異的細胞に関する前方散乱光（ＦＳＣ）及び側方散乱光（ＳＳＣ）のデータを収集する。ＦＳＣは、細胞の表面積または大きさに比例する。主な回折光の測定として、ＦＳＣは、蛍光に依存せずに所定の大きさを上回る粒子を検出する好適な方法を提供する。ＳＳＣは、主な屈折光及び反射光の測定に基づくものであり、細胞の粒度または内部構造の複雑さに比例する。ＦＳＣ及びＳＳＣの相関測定値により、不均一細胞集団における細胞種の識別が可能となる。染色パターン（たとえば、蛍光）とＦＳＣ及びＳＳＣのデータを組み合わせて用いると、どのような細胞がサンプル中に存在するかを同定することができ、相対的割合を算出することができる。その後、所望の特性に基づいて細胞をさらに分取することができる。

一実施形態において、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気標識細胞分離（ＭＡＣＳ）またはマイクロ流体などのフローサイトメトリーを使用して染色細胞を分取する。細胞分取は、自動ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣＳｃａｎ（商標）もしくはＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ（商標）、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒのＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ（商標））またはＭＡＣＳ技術（ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標））を使用して実施すると、処理の高速化及び分取の正確性が向上し得る。一実施形態において、染色した抗原特異的細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ反応媒体中に分取された単一細胞である。これにより、分取したＢ細胞によって発現される抗体の抗原特異的可変配列の増幅が容易になる。

好ましくは、標識に基づいて細胞を分取することに加えて、ゲーティングを用いて細胞をさらに分取する。ゲーティングは、数値またはグラフによる境界を設定して、さらなる分析に含める細胞の特徴を定義する。たとえば、目的の集団を取り囲むようにゲートを指定する。ゲートまたは領域は、分析または分取のイベントを分けるためのサブ集団を取り囲む境界である。ＦＳＣまたは細胞の大きさに基づいて、ＦＳＣ対ＳＳＣのプロット上にゲートを設定することができ、所望の大きさの細胞のみを分析できる。一実施形態において、陰性の抗原特異的選択または陽性の抗原特異的選択を用いて分取したＢ細胞をＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングによってさらに分取する。ゲートした抗原特異的Ｂ細胞のサブ集団は、増幅率の改善に相関する表現型がより大きく、顆粒状でないものである。

ゲーティングパラメータは、類似の構造を持つ非染色細胞集団によって定義されるパラメータに基づき得る。特に、陽性選択（Ｂ細胞染色）、陰性選択（ＥＬ４フィーダー細胞染色）及び生存率に関するゲートは、非染色集団の自家蛍光に基づいて設定される。好ましくは、非染色集団に基づくゲートは、設定したゲート内に入る細胞集団の割合がほとんどないものである。さらに、固有の集団、たとえば、集団中の大多数の細胞（ＥＬ４フィーダー細胞と推定される）よりも大きく、顆粒状でないと特定される集団に基づいて、物理的パラメータによるゲートを設定することができる。培養上清の機能性アッセイの対象ではないＢ細胞培養ウェルは、細胞染色試薬を添加せずに、対象のウェルと並行して採取し、処理を行う。

同定した抗原特異的抗体またはその変異体のクローニング

本発明はまた、親和性、結合性、細胞溶解活性などの所望の機能特性を少なくとも１つ任意に有する抗原特異的Ｂ細胞によって発現される抗体に含まれる、抗原特異的な抗体の配列、すなわちＶ_Ｈ及び／またはＶ_Ｌ領域のクローニング方法を提供する。特に、本明細書に記載の方法は、分取したＢ細胞によって発現される抗体の抗原特異的可変配列を増幅させ、核酸の配列を決定し、抗原特異的抗体の可変配列をコードする核酸またはその変異体を発現させ、抗体ポリペプチドを作製することによって、濃縮した細胞集団から得た少なくとも１つの抗原特異的細胞から抗体を作製する工程を任意に含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体を作製する方法は、当該技術分野においてよく知られており、任意の好適な方法を採用することができる。

典型的には、本発明の方法は、所望の抗体をコードするポリペプチド及び核酸の配列の全部または一部を単離し、配列を決定する追加の工程をさらに含む。目的の配列をコードする抗体には、単離した抗原特異的細胞から特定された核酸配列及びアミノ酸配列によってコードされるもの、ならびに特定された核酸とはゲノムコードの縮重によって配列上同一でない核酸及びその変異体によってコードされるものが挙げられる。

変異ポリペプチドは、アミノ酸（ａａ）置換、付加または欠失を含み得る。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または不必要なアミノ酸を取り除く置換、たとえば、グリコシル化部位の変更、機能には必要のない１つ以上のシステイン残基の置換または欠失によって折り畳みの誤りを最小限に抑えることであり得る。変異体は、タンパク質の特定領域（たとえば、機能ドメイン、触媒アミノ酸残基など）の高生物活性を保持または保有するように設計することができる。変異体はまた、本明細書にて開示されるポリペプチド断片、特に生物学的に活性な断片及び／または機能ドメインに相当する断片を含む。クローン遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発に関する技術はよく知られている。また、本主題発明には、タンパク質分解耐性の改善、溶解度特性の最適化、または治療薬としての適性の向上がなされるように、従来の分子生物学的技術を用いて修飾されたポリペプチドも含まれる。

こうして特定された核酸配列もしくは修飾型またはこれらの部分は、所望の抗原に対する組換え抗体を作製するために、所望の宿主細胞において発現させられる。

上述したように、これらの方法はまた、増幅率が向上した抗原特異的細胞を選択するための染色及び分取の工程を含む。たとえば、配列を決定し、結合性及び／または機能特性を確認するために組換えて発現させることができる抗原特異的抗体を、単離した抗原特異的Ｂ細胞の多くが発現する。

先に述べたように、クローン性Ｂ細胞集団は、所望の抗原に対する抗体を産生する抗体分泌Ｂ細胞を主に含むと考えられる。また、複数の抗原及び異なるＢ細胞集団を用いて取得した実験結果に基づくと、本発明に従ってクローン的に作製したＢ細胞及び当該Ｂ細胞から単離した抗原特異的Ｂ細胞は、概して、比較的親和性が高いモノクローナル抗体を分泌し、さらに、培養した抗原特異的Ｂ細胞からモノクローナル抗体を得る他の方法と比較して、エピトープ多様性がより高い種々のモノクローナル抗体の選択を効率的にかつ再現性よく産生できると思われる。例示的な実施形態において、当該Ｂ細胞選択法に使用される免疫細胞集団はウサギ由来である。しかしながら、非ヒト宿主及びヒト宿主を含む、抗体を産生する他の宿主も免疫Ｂ細胞の供給源として代替的に使用できる。Ｂ細胞の供給源としてウサギを使用すると、本方法によって得ることができるモノクローナル抗体の多様性が向上し得ると考えられる。また、本発明に従ったウサギ由来の抗体配列は、概して、ヒト抗体配列に対して高度の配列同一性を持つ配列を有し、抗原性が低いので、ヒトにおける使用に有利である。ヒト化の過程において、最終的なヒト化抗体に含まれる外来性／宿主残基はかなり低くなり、通常は、グラフト化に使用されるヒト標的配列に対する性質に起因して大幅に異なる宿主ＣＤＲ残基のサブセットに限定される。これにより、ヒト化抗体タンパク質における完全な活性回収の確率が高くなる。

同定した抗原特異的細胞を使用して、所望のモノクローナル抗体のコードに対応する核酸配列を得ることができる。（ＲＴ−ＰＣＲ産物のＡｌｕＩ消化または直接配列決定により、ウェルごとに単一のモノクローナル抗体種のみが産生されたことが確認できる。）上述したように、これらの配列は、ヒト用薬剤の使用に適するようにヒト化することなどの突然変異を施してもよい。

好ましくは、当該方法は、選択した抗体のポリペプチド配列または対応する核酸配列の配列決定工程をさらに含む。当該方法はまた、好ましくは、選択した抗体の配列、その断片または遺伝子修飾型を用いた組換え抗体の作製工程を含む。所望の特性を保持するために抗体配列を変異させる方法は、当業者によく知られており、ヒト化、キメラ化、一本鎖抗体の作製が挙げられ、これらの変異方法により、所望のエフェクター機能、免疫原性、安定性、グリコシル化の除去または付加などを有する組換え抗体を得ることができる。組換え抗体は、任意の好適な組換え細胞によって産生させてもよい。好適な組換え細胞には、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ヒト腎臓２９３などの哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び両生類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、一倍体または倍数体の酵母細胞、すなわち、一倍体または二倍体の酵母細胞、特にピキア、最も典型的にはピキア・パストリスで抗体を発現させる。研究、診断及び治療の用途に潜在的に適する機能性抗体を産生させる、費用効果の高いプラットフォームとして、ピキア・パストリス酵母を確立するには、先の研究が役立つ。共有米国特許第７，９３５，３４０号、同７，９２７，８６３号及び同８，２６８，５８２号を参照されたい。これらの各特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、組換えタンパク質発現用のピキア・パストリス発酵の設計方法も文献にて知られており、細胞密度、ブロス容量、基質供給量及び反応の各段階の長さなどのパラメータに関する最適条件について記載されている。Ｚｈａｎｇら、「Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ」Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｄ．，２００７，Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３８９，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．、４３〜６３頁を参照されたい。また、「ＭＵＬＴＩ−ＣＯＰＹ ＳＴＲＡＴＥＧＹ ＦＯＲ ＨＩＧＨ−ＴＩＴＥＲ ＡＮＤ ＨＩＧＨ−ＰＵＲＩＴＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩ−ＳＵＢＵＮＩＴ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＳＵＣＨ ＡＳ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＩＮ ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＤ ＭＩＣＲＯＢＥＳ ＳＵＣＨ ＡＳ ＰＩＣＨＩＡ ＰＡＳＴＯＲＩＳ」と題するＵＳ２０１３００４５８８８、及び「ＨＩＧＨ−ＰＵＲＩＴＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩ−ＳＵＢＵＮＩＴ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＳＵＣＨ ＡＳ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＩＮ ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＤ ＭＩＣＲＯＢＥＳ ＳＵＣＨ ＡＳ ＰＩＣＨＩＡ ＰＡＳＴＯＲＩＳ」と題するＵＳ２０１２０２７７４０８も参照されたい。

ピキア・パストリスの処理に関して使用できる例示的な方法（培養、形質変換及び接合の方法を含む）は、Ｕ．Ｓ．２００８０００３６４３、Ｕ．Ｓ．２００７０２９８５００及びＵ．Ｓ．２００６０２７００４５などの公開出願、ならびにＨｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｄｓ．１９９８．Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．、及びＣｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｄ．，２００７，Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．に開示されている。これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。

ある特定の実施形態において、当該方法は、
ａ．宿主抗体を得るために、抗原で免疫にした動物または自然感染した動物からＢ細胞を取得すること、
ｂ．抗原特異性及び中和について宿主抗体をスクリーニングすること、
ｃ．宿主からＢ細胞を採取すること、
ｄ．抗原特異的細胞の頻度が向上した濃縮細胞集団を作製するために、採取したＢ細胞を濃縮すること、
ｅ．少なくとも１つの培養ウェル中でクローン性集団を作製するために、単一Ｂ細胞の生存に有利な条件下で濃縮細胞集団から得た１つ以上のサブ集団を培養すること、
ｆ．クローン性集団が抗原に特異的な抗体を産生するかどうかを決定すること、
ｇ．クローン性と想定されるＢ細胞培養物からの細胞の一部またはすべてを単離すること、及び任意で、クローン性と想定される異なるＢ細胞培養物からの細胞をプールすること、
ｈ．陽性または陰性の細胞分取を容易にする少なくとも１つの標識で、単離した細胞（任意でクローン性と想定される異なるＢ細胞培養物からプールしたもの）を染色すること、
ｉ．染色したＢ細胞を分取すること、及び任意で、染色分取したＢ細胞をゲーティングしてから、Ｂ細胞によって発現される抗体に含まれる抗原特異的可変配列の増幅を容易にするためのＲＴ−ＰＣＲ反応媒体に、分取したＢ細胞を入れること、
ｊ．単一Ｂ細胞によって産生される抗体の核酸配列の配列を決定すること、
ｋ．増幅させた抗原特異的抗体の可変領域をコードする核酸を発現させ、抗体ポリペプチドを作製すること、ならびに
ｌ．発現させた抗体ポリペプチドのうち目的の抗原に結合する抗体ポリペプチドを決定することを含む。

決定工程（ｆ）は、抗原特異性及び／または抗体機能性に関して、濃縮した抗原特異的細胞の抗原特異的細胞の上清をスクリーニングすることによって実施することができる。同様に、決定工程（ｌ）も、抗原特異性及び／または抗体機能性に関して、組換え抗体をスクリーニングすることによって実施することができる。一実施形態において、濃縮した抗原特異的Ｂ細胞及び／または組換え抗体の上清をＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗原特異性についてスクリーニングする。

発明者らは、本明細書に記載の同定方法及びクローニング方法が、種々の抗原に対する抗体の量及び多様性に改善をもたらすことを証明している。

たとえば、ＰＣＳＫ９抗原特異性を有する濃縮Ｂ細胞から産生された抗体の抗原特異的可変領域をコードする核酸を増幅させ配列決定し、その核酸から組換え発現させた抗ＰＣＳＫ９抗体を産生させた後に、ＥＬＩＳＡアッセイを使用してこの組換え抗体をスクリーニングしてＰＣＳＫ９結合親和性を決定し、ＬＤＬ取込みアッセイでＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの相互作用を調節する能力を有する抗体を検出した。たとえば、Ｌａｇａｃｅら（２００６）Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＰＣＳＫ９ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｉｎ ｌｉｖｅｒｓ ｏｆ ｐａｒａｂｉｏｔｉｃ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．１１６（１１）：２９９５−３００５を参照されたい。ＥＬＩＳＡスクリーニングを用いて特定した陽性ウェルについて、合計で２１個の異なる細胞分取を実施した。これには、単一ウェルとプールした細胞の両方の分取が含まれる。複数の抗体配列を単離し、本明細書に記載の同定方法及びクローニング方法を使用して、その結果として得られる組換え抗体、たとえばＡｂ１及びＡｂ２を作製した（実施例８参照）。

別の例として、ＣＧＲＰ抗原特異性を有する濃縮Ｂ細胞から産生された抗体の抗原特異的可変領域をコードする核酸を増幅させ配列決定し、その核酸から組換え発現させた抗ＣＧＲＰ抗体を産生させた後に、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて組換え抗体をスクリーニングして抗原結合親和性を決定した。また、抗ＣＧＲＰ抗体は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞においてｃＡＭＰ産生を阻害する能力を有する抗体を検出するアッセイを用いてもスクリーニングできる。たとえば、Ｚｅｌｌｅｒら（２００８）ＣＧＲＰ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｈｅａｒｔ ｒａｔｅ ｏｒ ａｒｔｅｒｉａｌ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ ｒａｔｅ．Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ１５５（７）：１０９３−１１０３を参照されたい。ＥＬＩＳＡスクリーニングで、３５個の異なる陽性ウェル（すなわち、著しい抗原認識及び効力を有することが確認された抗体上清を含有するウェル）を特定した。３５個のウェルを一緒にプールし、陽性及び陰性のＢ細胞選択のために染色し、本明細書に記載のＲＴ−ＰＣＴ方法を用いて単離し、プールしたＢ細胞から１９個の異なる抗体配列を作製した。さらに、６個の異なる陽性ウェルのそれぞれについて、単一ウェル分取を行った。６個のウェルのうち５個が抗ＣＧＲＰ特異性抗体を産生することが確認された。本明細書に記載の同定方法及びクローニング方法を用いて同定した例示的な抗ＣＧＲＰ抗体には、Ａｂ３及びＡｂ４が挙げられる（実施例９参照）。

さらに、標的１抗原特異性を有する濃縮Ｂ細胞から産生された抗体の抗原特異的可変領域をコードする核酸を増幅させ配列決定し、その核酸から組換え発現させた抗標的１抗体を産生させた後に、標的１結合親和性に関して、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて組換え抗体をスクリーニングした（実施例１０参照）。

さらに、ＮＧＦ抗原特異性を有する濃縮Ｂ細胞から産生された抗体の抗原特異的可変領域をコードする核酸を増幅させ配列決定し、その核酸から組換え発現させた抗ＮＧＦ抗体を産生させた後に、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて組換え抗体をスクリーニングして抗原結合親和性を決定した。ＴＦ１細胞増殖アッセイを用いて抗体を同じくスクリーニングし、ＴＦ１ヒト赤白血病細胞株においてＮＧＦ誘発増殖を中和する能力を有する抗体を検出した。たとえば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（１９９４）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｋＡ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ／ＮＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ８３：１４７９−１４８５を参照されたい。ＥＬＩＳＡスクリーニングで複数の陽性ウェルを特定し、そのうち５４個の陽性ウェルを分取した。具体的には、３４個のウェルを単一ウェル分取で分取し、２０個のウェルをプール分取で分取した。合計で８個の異なる分取を行い、増殖と配列決定を行った。次に、得られた抗体を機能特性（ｐ７５反応性及び／またはＭｓ ＮＧＦ交差反応性など）についてスクリーニングし、たとえばＡｂ７及びＡｂ８などの１５個の異なる抗体を同定した（実施例１１参照）。

最後に、標的２抗原特異性を有する濃縮Ｂ細胞から産生された抗体の抗原特異的可変領域をコードする核酸を増幅させ配列決定し、その核酸から組換え発現させた抗標的２抗体を産生させた後に、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて組換え抗体をスクリーニングして抗原結合親和性を決定した（実施例１２参照）。

また、ＩＬ−６及びＴＮＦαに対する抗体の同定及び作製の改善については、ＵＳ２００７／０２６９８６８でも示されている。当該特許にて開示された方法は、濃縮方法及び抗原特異的細胞の単離方法、すなわち、本明細に記載の染色方法及び分取方法を含むように容易に変更することができる。

本発明のＢ細胞選択方法の概要を図１５Ａ〜Ｃに示す。これらの図は、ビーズ／抗原／細胞複合体をどのように作製するかという最初の工程が異なる２つの例示的実施形態を示すものである。方法１（図１５Ａ、左上隅から開始）では、免疫細胞（たとえば、抗原で免疫にした動物または別の方法で抗原に曝露させた動物から得た抗原特異的Ｂ細胞など）を収集し、最初にビオチン化抗原と合わせ、得られた抗原被覆細胞を洗浄し、その後、ストレプトアビジンマイクロビーズと接触させて、ビーズ／抗原／細胞複合体を作成する。対照的に、方法２（図１５Ａ、右上隅から開始）では、ストレプトアビジンマイクロビーズをビオチン化抗原と合わせて、得られたビーズ／抗原複合体を磁気カラムにかけ、洗浄し、溶出してから、抗原／ビーズ複合体を免疫細胞（たとえば、抗原で免疫にした動物または別の方法で抗原に曝露させた動物から得た抗原特異的Ｂ細胞など）とともにインキュベートして、ビーズ／抗原／細胞を作成する。これらの方法は以下の点が異なる。方法１では、最初に抗原とビーズを結合させないので、Ｂ細胞の結合により高い自由度があるが、保持力がビーズによって捕捉されるビオチン化抗原に依存するので、一部のＢ細胞を取りこぼす場合がある。対照的に、方法２では、ビーズ抗原複合体を先に作成することで、細胞抗原複合体の捕捉ができないためにＢ細胞を取りこぼすということはないが、抗原はビーズとの結合によって制限されているために、Ｂ細胞に結合することが難しい場合があり、この場合においても一部の抗原特異的Ｂ細胞を取りこぼすことになる。

ビーズ／抗原／細胞複合体は、方法１または方法２のいずれによって作成されたとしても、磁気カラムにかけて、洗浄する。その後、カラムを磁石から取り外して細胞（抗原特異的Ｂ細胞を含む細胞）を溶出する。細胞分取（たとえばＭＡＣＳなど）を利用すると、培養プレート当たりの細胞数を制御することができるが、他の技術も同じく利用可能である。通常、細胞は、１ウェル当たり様々な密度で９６ウェルマイクロタイタープレートに播種される。概して、１０プレートで、１ウェル当たり１０、２５、５０、１００、２５０または５００個の細胞を各密度で播種する。播種密度の範囲は、後続の培養後に抗原特異的Ｂ細胞のクローン性集団がウェル（すなわち、所望の抗原に特異的な単一のモノクローナル抗体を含有するウェル）に含まれるプレートが得られるように選択した。（ＥＬ４フィーダー細胞と）培養すると、約１〜約１００個の抗原特異的クローン性ＩｇＧ産生Ｂ細胞が各ウェルに含まれる。

図１５Ｂは、例示的な培養条件、機能アッセイ及び抗原認識アッセイを概略的に示すものであり、目的の抗原特異的Ｂ細胞を含む細胞培養物が入っているウェルを選択するために用いることができる。これらの培養物は、通常、５〜７日間静置する。この間にＢ細胞集団が増加し、抗体が培地中に分泌される。その後、分泌された抗体を含む上清を収集し、抗原結合親和性及び／または機能効果などの所望の特定について評価する。好ましくは、クローン密度で播種されたプレート（すなわち、多くのウェルが所望の抗原に特異的な単一抗体のみを含むもの）から上清を収集する。所与のウェルの上清を評価することによって得られた結合性及び機能性の結果は、単一抗体の結果と考えられ（抗体の組み合わせとは対照的に）、さらに、クローン性Ｂ細胞集団がウェルに含まれれば、複数の個別の抗体のクローニング及び検査を行うことなく、より効率的に抗体をクローニングできるので、クローン性集団の使用により、スクリーニングの効率と処理量が上がる。

抗原認識抗体を含む上清（たとえば、ＥＬＩＳＡで特定したもの）は、さらなる使用及び任意の凍結のために、個別のプレートに移すことができる。残りの細胞は、任意で、たとえば−８０℃で凍結することができ、培養を行ったのと同じプレートで簡便に行える。抗原認識抗体を含む上清について、所望の活性（たとえば、標的におけるアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性）に関する機能性アッセイ及び／または特異性のさらなる試験（たとえば、類似ポリペプチドのような別の抗原ではなく、所望の抗原への特異的結合）などのさらなる試験を実施してよい。所望の機能特性を有する抗体を産生するウェルを解凍して、抗体コード配列の増幅を行うことができる。

図１５Ｃは、個々の細胞を得て抗体コード配列の増幅及び回収を行うための抗原特異的Ｂ細胞の分取を概略的に示すものである。解凍した細胞を抗ウサギＩｇＧ（陽性染色、すなわち抗体産生Ｂ細胞を染色）または抗Ｔｈｙ−１．２（陰性染色、すなわち非抗体細胞を染色）で染色する。また、ヨウ化プロピジウムを使用して生存率についても細胞を染色する。陽性または陰性の染色法、ＰＩ染色及び物理的ゲーティング基準（本明細書にてさらに記載）を使用して、培養物に含まれるＥＬ−４及び他の細胞からＢ細胞を単離し、個々のウェルに分取する。その後、抗体コード核酸をＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、クローニング、配列決定または他の使用のために回収する。

上述した本発明をさらに明確にするために、以下の非限定的な実施例を提供する。

実施例１：濃縮した抗原特異的Ｂ細胞抗体培養物の作製
目的の標的抗原に対する自然免疫応答を利用するために、従来の抗体宿主動物を免疫にすることによって、抗体パネルを得る。通常、免疫付与に用いる宿主は、類似の成熟プロセスを用いて抗体を産生し、同等の多様性（たとえば、エピトープ多様性）を有する抗体を産生する抗原特異的Ｂ細胞集団を与える、ウサギまたは他の宿主である。最初の抗原免疫付与は完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用いて行い、後続の追加免疫は不完全アジュバントにより行うことができる。免疫付与から約５０〜６０日、好ましくは５５日目に、抗体力価を試験し、適切な力価が確立されている場合は、抗体選択（ＡＢＳ）プロセスを開始する。ＡＢＳの開始にあたって重要な２つの基準は、ポリクローナル血清における強力な抗原認識と、機能修飾活性である。

陽性の抗体力価が確立された時点で、動物を屠殺してＢ細胞の供給源を解離する。これらの供給源には、脾臓、リンパ節、骨髄及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が挙げられる。単一細胞懸濁液を作製し、この細胞懸濁液を低温長期保存ができるように洗浄する。その後、通常は細胞を凍結する。

抗体同定プロセスを開始するために、少量の凍結細胞懸濁液を解凍し、洗浄して、組織培養培地に播種する。その後、動物の免疫応答を引き起こすために使用したビオチン化形態の抗原とこれらの懸濁液とを混合し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気ビーズの細胞選択法を用いて抗原特異的細胞を回収する。ストレプトアビジンビーズを使用して、特異的濃縮を実施する。たとえば、細胞調製物をビオチン化抗原及びストレプトアビジンビーズと合わせて、抗原特異的Ｂ細胞がカラムに結合するようにカラムに通し、その後、結合したＢ細胞を溶出する。濃縮した集団を回収し、次の段階である特異的Ｂ細胞の単離に進む。
実施例２：クローン性抗原特異的Ｂ細胞含有培養物の作製

実施例１に従って作製した濃縮Ｂ細胞を、ウェル当たりの細胞密度を変えて９６ウェルマイクロタイタープレートに播種する。概して、１グループ当たり１０プレートで、１ウェル当たり１０、２５、５０、１００、２５０または５００細胞である。好ましくは、約１〜約１００個の抗原特異的なクローン性ＩｇＧ産生Ｂ細胞をウェルごとに播種する。１〜４％活性化ウサギＴ細胞馴化培地と、約５０Ｋの凍結照射済みＥＬ４（ＥＬ４Ｂ）フィーダー細胞とを、培地に添加する。これらの培養物を５〜７日間静置した後に、分泌された抗体を含有する上清を収集し、別個のアッセイ設定で標的特性について評価する。残りの上清はそのままにして、プレートを−８０℃で凍結する。これらの条件下における培養プロセスにより、通常、抗原特異的Ｂ細胞のクローン性集団を含む混合細胞集団を含有するウェルが得られる。すなわち、個々のウェルには、所望の抗原に特異的な単一のモノクローナル抗体しか含まないことになる。
実施例３：所望の特異性及び／または機能特性を持つモノクローナル抗体についての抗体上清のスクリーニング

実施例２に従って作製したクローン性抗原特異的Ｂ細胞集団を含むウェルから得た抗体含有上清を、ＥＬＩＳＡ法を用いて、最初に抗原認識についてスクリーニングする。これには、選択的抗原固定化（たとえば、ストレプトアビジンコーティングプレートによるビオチン化抗原の捕捉）、非特異的抗原プレートコーティング、またあるいは、抗原堆積法を介すること（たとえば、ヘテロマーのタンパク質−抗原複合体を生成するために、選択的抗原捕捉の後に結合相手を添加する）が含まれる。たとえば、ウサギ（抗原に自然感染したものまたは抗原で免疫にしたもの）から得たＢ細胞に由来する抗体を含む上清を、ビオチン修飾抗原でコーティングしたストレプトアビジンプレートまたは未修飾抗原でコーティングしたプレートに添加し、抗ウサギＩｇＧを用いて抗原特異的ＩｇＧ産生を検出する。同様に、ウサギから得たＢ細胞に由来する抗体を含む上清を、抗ウサギＦａｂでコーティングしたプレートに添加して総ＩｇＧ産生を検出する。たとえば、マウス、ラット、非ヒト霊長類またはヒトなどの別の宿主動物から得たＢ細胞による抗原特異的ＩｇＧ産生の検出は、たとえば、抗マウスＩｇＧ、抗ラットＩｇＧ、抗非ヒト霊長類ＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＧなどの対応する抗種ＩｇＧを用いて実施される。

抗原特異的ウェルと総ＩｇＧ（非特異的）ウェルの比は、濃縮及びクローン性の指標である。特に、濃縮した抗原特異的Ｂ細胞で確立した培養物は、抗原特異的ウェルが多くなるが（図１の上パネル参照）、濃縮が不十分な抗原特異的Ｂ細胞で確立した培養物は、抗原特異的ウェルと非特異的ウェルとの間の相関関係が弱い（図１の下パネル参照）。

その後、濃縮Ｂ細胞の抗原陽性ウェルの上清を、厳密にリガンド依存的である機能修飾アッセイにおいて必要に応じて検査する。かかる例の１つは、抗原リガンドと組換え受容体タンパク質との自然の相互作用を再現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質間相互作用アッセイである。あるいは、リガンド依存性で、かつ容易に監視できる、細胞に基づく応答（たとえば、増殖応答）を利用する。

著しい抗原認識及び効力を呈する上清を陽性ウェルとみなす。元の陽性ウェルから得た細胞を、抗体回収段階へと移行させる。
実施例４：抗原特異的Ｂ細胞の単離

単一抗体配列を分泌する抗原特異的Ｂ細胞のクローン性集団（実施例２及び３に従って作製したもの）を含むウェルから単一抗原特異的Ｂ細胞を回収する。通常、抗原特異的Ｂ細胞の陰性選択または陽性選択のために、ウェル中に存在するＢ細胞を１つ以上のマーカーで染色し、単離したＢ細胞によって発現される抗体の抗原特異的可変重鎖及び／または可変軽鎖の抗体配列の増幅及び続く配列決定のために、染色した細胞をＲＴ−ＰＣＲマスターミックスに直接的または間接的に分取する。

目的のプールウェルまたは単一ウェルと組成が類似するコントロール培養ウェルを用いて、細胞分取ゲーティングを確立した。ゲーティング細胞サンプルを目的ウェルと並行して解凍し、染色した。非染色集団またはブランク集団について最初のゲートを確立する。その後、染色コントロールサンプルをＦＡＣＳ（ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ）にかけ、ＥＬ４除外（ＣＤ９０．２陽性）、Ｂ細胞包含（ＩｇＧ陽性）、生存率（ＰＩ陰性）、及びＢ細胞とマウスＥＬ４細胞とを区別する物理的パラメータ（ＦＳＣ／ＳＳＣ）に関するゲートを確認する。後者のゲートは、培養物中のＥＬ４細胞とは異なる物理的性質（大きさ／粒度）に基づくので、染色がなくても確立することができる。ゲートが確立したら、個々のウェルから得た細胞または複数のウェルのプール細胞からなるサンプルを処理し、ＥＬ４陰性／ＩｇＧ陽性の生存細胞であって、好ましくは一定の物理的（ＦＳＣ／ＳＳＣ）集団を持つ細胞を、ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを予め充填した９６ウェルプレートのウェルに個別に分取する。図８を参照されたい。あるいは、ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）または他のＭＡＣＳ（登録商標）細胞分取技術、たとえば、手動または自動の細胞分取及び分離用の約５０−ｎｍの超常磁性マイクロビーズ、カラム及び分離器を用いてもよい。分取後のプレートを分取器から取り外し、目的のＶＨ領域及び／またはＶＬ領域をＲＴ−ＰＣＲ増幅するために、サーマルサイクラーまたは−８０℃のいずれかに直接移す。

抗原特異的Ｂ細胞の陰性選択では、細胞混合物中に存在するマウスＥＬ４細胞に特異的な蛍光標識抗体（ＣＤ９０．２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５３０１４）を２〜１０μｇ／ｍｌ用いて、細胞を染色した。細胞を室温で約２０分間染色し、続けてインキュベーションを行い、最大２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液１ｍｌ当たり約１×１０Ｅ６（１００万個）の細胞を再懸濁した。再懸濁後、ヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５６４６３）を０．２〜０．５μｇ／ｍｌ添加して、混合物中の死細胞を特定した。Ｔｈｙ１．２及びＰＩが陽性染色ではなかった細胞を選択した（図３の上パネル参照）。任意で、最後のＦＳＣ／ＳＳＣゲートを用いて、表現型がより大きく、顆粒状でないＴｈｙ１．２／ＰＩ陰性細胞集団のサブ集団を選択する（図３の下パネル参照）。

抗原特異的Ｂ細胞の陽性選択では、細胞混合物中に存在するウサギＢ細胞に特異的な蛍光標識抗体（抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＤＭＡＢ４７７９）を２〜１０μｇ／ｍｌ用いて、細胞を染色した。細胞を室温で約２０分間染色し、続けてインキュベーションを行い、最大２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液１ｍｌ当たり約１×１０Ｅ６（１００万個）の細胞を再懸濁した。再懸濁後、ヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５６４６３）を０．２〜０．５μｇ／ｍｌ添加して、混合物中の死細胞を特定した。ウサギＩｇＧが陽性染色で、ＰＩが陰性染色であった細胞を選択した（図４上パネル参照）。任意で、最後のＦＳＣ／ＳＳＣゲートを用いて、主集団よりも表現型がより大きく、顆粒状でないウサギＩｇＧ＋及びＰＩ−の細胞集団のサブ集団を選択する（図４の下パネル参照）。

染色Ｂ細胞を個々のウェルから分取することができる（単一ウェル分取）。通常、１０〜２０個のウェルを個別に染色し、増幅の前に個別に分取する。あるいは、複数のウェルの染色Ｂ細胞を一緒にプールして、分取してもよい（プール細胞分取）。たとえば、少なくとも１００個の別個のウェルの内容物を解凍して、染色のために単一サンプルとして一緒にプールする。その後、プールした染色細胞を分取し、増幅し、配列決定する。

単一ウェル分取では、目的のウェルを含むプレートを−８０℃から取り出し、ウェル当たり２００μｌの培地（１０％ＲＰＭＩ完全、５５μＭ ＢＭＥ）で５回洗浄して各ウェルから細胞を回収した。回収した細胞を遠心分離によりペレット状にし、上清を注意深く除去した。その後、各ウェルから得た細胞をＦＡＣＳチューブ内の２００μｌ培地中に再懸濁した。キャップを緩めに固定して、細胞を３７℃で１２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離によりペレット状にし、最大２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ含有ダルベッコＰＢＳ）で洗浄して、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。

プールセル分取では、目的のウェルを含むプレートを−８０℃から取り出し、ウェル当たり２００μｌの培地（１０％ＲＰＭＩ完全、５５μＭ ＢＭＥ）で５回洗浄して各ウェルから細胞を回収した。回収した細胞を遠心分離によりペレット状にし、上清を注意深く除去した。その後、プール細胞を１ウェル当たり２００μｌの培地中に再懸濁し（Ｘウェル×２００μＬ＝総容量）、適量の組織培養フラスコに移した。細胞を３７℃で１２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離によりペレット状にし、最大２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ含有ダルベッコＰＢＳ）で洗浄して、プールしたウェルにつき１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁した。
実施例５：抗原特異的Ｂ細胞からの抗体配列の単離

組み合わせＲＴ−ＰＣＲに基づく方法を用いて、実施例４に従って作製した単一の単離Ｂ細胞から、抗体配列を回収する。ウサギ免疫グロブリン配列などの標的免疫グロブリン遺伝子（重鎖及び軽鎖）の保存領域及び定常領域でアニールするようにプライマーを設計し、２段階方式のネステッドＰＣＲ法による回収工程を用いて抗体配列を取得する。たとえばＴ７などの発現ベクターから作成した合成コントロールＲＮＡサンプルを陽性コントロールとして用いる。各ウェルのアンプリコンをＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ分析によって回収について分析し、必要に応じてサイズ完全性について（たとえば、電気泳動によって）分析する。ＰＣＲ産物をマルチウェルプレート形式（たとえば、９６ウェルプレート）で直接配列決定し、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎを用いて染色する。あるいは、得られた断片をＡｌｕＩで消化して、配列のクローン性をフィンガープリント法で確認する。同一の配列は、電気泳動分析で共通の断片化パターンを呈する。意義深いことに、細胞のクローン性を証明するこの共通の断片化パターンは、最初に１，０００細胞／ウェルまで播種したウェルにおいてさえ概ね観察される。ゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色を用いて、得られたＡｌｕＩ消化物を分析する。その後、元の重鎖及び軽鎖のアンプリコン断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｉｗＩで消化して、クローニングのために個々のＤＮＡ断片を調製する。その後、得られた消化断片を発現ベクター中に連結し、プラスミドの増殖及び作製のために細菌の中に形質転換する。配列の特徴を決定するためにコロニーを選択する。

通常、最後のＦＳＣ／ＳＳＣゲートで分取した、抗原を発現している特異的Ｂ細胞は、より大きく、顆粒状でない一定の表現型を有しているので、増幅の成功率が平均よりもよい。たとえば、所望の断片パターンを示したのは、Ｔｈｙ１．２／ＰＩ陰性Ｂ細胞では８８個のうち１個（最後のＦＳＣ／ＳＳＣゲートなし）であったのに対して、ＦＳＣ／ＳＳＣでゲートして試験したＴｈｙ１．２／ＰＩ陰性Ｂ細胞では８８個のうち２６個であった。図５を参照されたい。

さらに、陰性選択及び陽性選択で染色したプール分取を評価すると、ＦＳＣ／ＳＳＣでゲートした抗ＣＧＲＰ抗体を産生するＢ細胞では、増幅率の改善が認められた。具体的には、ＥＬＩＳＡを用いた抗原特異性試験で陽性であったＢ細胞の上清を含有するＣＧＲＰ培養プレートから得た３２個の個別のウェルを一緒にプールし、プール集団のサブ集団を陰性選択（Ｔｈｙ１．２）及び陽性選択（抗ウサギＦｃモノクローナルまたは抗ウサギＦｃポリクローナル）で染色した。初めに、陰性選択染色から得た９６個のウェルを分取した場合、ＦＳＣ／ＳＳＣでゲートしたＢ細胞の６９．８％がＶＨ鎖及びＶＬ鎖の増幅をもたらした。さらに、抗ウサギＦｃモノクローナル陽性選択染色から得た８０個のウェルを分取した場合、ＦＳＣ／ＳＳＣでゲートしたＢ細胞の９１．３％がＶＨ鎖及びＶＬ鎖の増幅をもたらした。最後に、抗ウサギＦｃポリクローナル染色から得た９６個のウェルを分取した場合、ＦＳＣ／ＳＳＣでゲートしたＢ細胞の８０．２％がＶＨ鎖の増幅を、８４．４％がＶＬ鎖の増幅をもたらした。
実施例６：所望の抗原特異性及び／または機能特性を持つモノクローナル抗体の組換え作製

単一のモノクローナル抗体を含む各ウェルについて、正確な完全長の抗体配列を確立し、Ｑｉａｇｅｎ固相法を用いてミニプレップＤＮＡを調製する。その後、このＤＮＡを用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトし、完全長の組換え抗体を産生させる。抗原認識及び機能特性について未処理の抗体産物を試験し、組換え抗体タンパク質中に元の特徴が認められるかどうか確認する。任意で、大規模な哺乳類細胞の一過性トランスフェクションを完了させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製する。標準的な方法（たとえば、ＰｒｏｔｅＯｎまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標））及び効力アッセイのＩＣ_５０でＫ_Ｄを評価する。
実施例７：単離したＢ細胞の可変軽鎖及び重鎖配列の回収ならびに組換え抗体の発現

軽鎖及び重鎖のコード配列を、−７０℃で先に保存した単一Ｂ細胞から回収した。２段階逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）プロセスを採用した。工程１では、標準的なＲＴに基づく方法で対象領域をコードするＲＮＡを回収し、続けて増幅した。工程２は、発現ベクターへの方向性クローニングに適切なＤＮＡ断片を生成するネステッドプライマーＰＣＲ増幅によって行った（軽鎖：ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷＩ、重鎖：ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ）。この回収プロセスのための特異的配列は、宿主動物のゲノムの配列解析から得た。新しい配列の主な出所は、ウサギ、マウス及びラットである。プライマー配列は以下の通りであった。

クローニングしたｃＤＮＡを、組換え軽鎖及び重鎖の発現を可能にする２つの異なる哺乳類発現ベクターに連結した（カッパ軽鎖定常部及びガンマ−１（γ−１）重鎖定常部）。これらの構築物をインフレームで作製し、配列回収に含まれる自然のシグナル配列を組み入れた。各発現プラスミドについて大規模なＤＮＡ調製を行い、両方のプラスミドを用いたヒト腎臓２９３細胞へのトランスフェクションによって、完全長のウサギ／ヒトキメラ抗体の一過性の生成を行った。５日間の培養後、得られた細胞を遠心分離により取り出し、抗原認識についての試験を直接馴化培地で行うか、またはプロテインＡクロマトグラフィーによって組換え抗体を親和性精製にかけた。

次に、上述したＥＬＩＳＡ法を用いて、抗原認識について抗体を試験した。さらに、精製した抗体については、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＯｃｔｅｔまたはＢｉｏＲａｄもしくはＰｒｏｔｅＯｎ測定によって、Ｋ_Ｄを確立した。最後に、回収した配列に関連した特定のウェルに起因する本来の機能修飾特性を試験した。
軽鎖及び重鎖の配列回収に関する実験方法

当該方法は、製造元によるＱｉａｇｅｎ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットの説明に記載された技術に基づくものである。一般的なマスターミックスを調製し、ＲＮＡの分解を防ぐためにＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含めた。工程１の各プライマー（プライマー配列番号：１、３、７及び９）０．５８μＭを含むＲＴ−ＰＣＲマスターミックス５０μＬを、事前に回収した凍結細胞を含む２５０μＬのエッペンドルフチューブに添加し、氷上で注意深く混合した。以下のサイクルスキームで１段階ＲＴ−ＰＣＲを行った。（１）５０℃、３０分、（２）９５℃、１５分、（３）９４℃、３０秒、（４）５４℃、３０秒、（５）７２℃、１分、（６）工程３に戻り、合計３５サイクル、（７）７２℃、３分、及び（８）４℃に保持。

これらのサイクルが完了したら、異なる反応液で第２のＰＣＲ増幅を行い、第１のＲＴ−ＰＣＲ反応液１．５μＬを用いて軽鎖及び重鎖の可変領域を回収した。以下のサイクルスキームを用いて、０．４μＭの第２のネステッドＰＣＲプライマー軽鎖（プライマー配列番号：２及び４、配列番号：２及び５、または配列番号：２及び６）ならびに重鎖（プライマー配列番号：８及び１０）で、ＫＯＤポリメラーゼを用いた増幅（Ｎｏｖａｇｅｎ）を行った。（１）９４℃、２分、（２）９４℃、３０秒、（３）６０℃、３０秒、（４）７２℃、４５秒、（５）工程２に戻り、合計３５サイクル、（６）７２℃、３分、及び（７）４℃に保持。

第２の増幅が完了したら、反応液１０μＬを取り、２％ＴＡＥアガロースゲル電気泳動により分析した。残りの反応液４０μＬをＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐキットによって精製し、７５μＬで溶出した。

続けて、これらのアンプリコンを、以下の条件を用いて、軽鎖の場合はＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷＩで、重鎖の場合はＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで消化した。精製したＰＣＲ産物１０μＬ、１０×Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ制限酵素バッファー２ ３μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩ ０．５μＬ（５Ｕ）、及びＢｓｉＷＩ ０．５μＬ（５Ｕ）またはＸｈｏＩ ０．５ｕＬを、３７℃で６０分、その後５５℃で３０分。消化断片をＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ法によって精製した。次に、これらの断片を適切な発現ベクターに連結した。この反応液２μＬを使用して、ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＸＬ−１０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のいずれかを形質転換し、形質転換した細胞をＬＢ／カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）上に播種した。

以下のプライマーを用いたＰＣＲスクリーニング法によって、得られたコロニーをインサートについてスクリーニングした。

コロニーを選択して、ＬＢ／カナマイシン６０μＬに入れ、３０分間インキュベートした。３０分の時点で約１μＬを取り、２μＭのプライマー対（配列番号：１１及び１２（重鎖）、及び配列番号：１１及び１３（軽鎖））を含む標準的な３０μＬのＫＯＤ増幅反応（Ｎｏｖａｇｅｎ）に使用した。増幅スキームは、以下とした。（１）９６℃、２分、（２）９６℃、２０秒、（３）６８℃、２５秒、（４）２に戻り、合計４０サイクル繰り返す、及び（５）６８℃、２分。

Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ分析を用いて増幅を確認した。その後、サンプルの配列をマルチウェルプレート形式、たとえば９６ウェルプレートで直接決定した。
実施例８：ヒトＰＣＳＫ９に結合する抗体の調製

本明細書に記載の抗体選択プロトコールを使用することにより、ヒトＰＣＳＫ９（ｈｕＰＣＳＫ９）に対して特異性を有する別個の抗体であるＡｂ１及びＡｂ２などの広範囲な抗体パネルを作製することができる。抗体は、ｈｕＰＣＳＫ９に対して高い親和性を有し（たとえば、約１０〜約９００ｐＭ Ｋ_Ｄ）、細胞ベーススクリーニングシステムにおいて、ｈｕＰＣＳＫ９の強力なアンタゴニスト作用を呈する（ＨｅｐＧ２）。さらに、この抗体コレクションは、ｈｕＰＣＳＫ９誘導プロセスに対して、異なる機序のアンタゴニスト作用を示した。

免疫付与方法：ウサギをｈｕＰＣＳＫ９（Ｒ＆Ｄ）で免疫にした。免疫付与は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）に含ませた１００μｇの最初の皮下（ｓｃ）注射と、その後、２週間の間を空けた、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）に含ませた各回５０μｇの２回の追加免疫とした。５５日目に動物から採血し、ＥＬＩＳＡ（抗体認識）によって血清力価を決定した。

抗体選択の力価評価：ヒトｈｕＰＣＳＫ９に結合する抗体を同定し、その特徴を調べるために、抗体含有溶液をＥＬＩＳＡで試験した。概略すれば、ニュートロアビジンコーティングプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＢＳで希釈したビオチン化ヒトＰＣＳＫ９（１ウェル当たり５０μＬ、１μｇ／ｍＬ）を用いて、室温で約１時間または４℃で一晩コーティングした。その後、プレートをＥＬＩＳＡ緩衝液を用いて室温で１時間ブロックし、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて洗浄した。試験用血清サンプルをＥＬＩＳＡ緩衝液（ｐＨ７．４のＰＢＳ中０．５％魚皮ゼラチン）を用いて連続希釈した。希釈した血清サンプルのうち５０μＬをウェルに移し、室温で１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄した。顕色のために、抗ウサギ特異的Ｆｃ−ＨＲＰ（ＥＬＩＳＡ緩衝液で１：５０００の希釈）をウェルに添加して、室温で４５分間インキュベートした。洗浄溶液による３回の洗浄工程の後、ＴＭＢ基質を使用してプレートを室温で２分間顕色させ、０．５Ｍ ＨＣｌを用いて反応を停止させた。ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。

組織採取：許容可能な力価が確立された時点でウサギを屠殺した。脾臓、リンパ節及び全血を採取し、以下の通り処理した。

脾臓及びリンパ節は、組織を分離して、２０ｃｃシリンジのプランジャーを用いて７０μｍの滅菌ワイヤーメッシュ（Ｆｉｓｈｅｒ）に通すことによって、単一細胞懸濁液へと処理した。低グルコースを含む、上述の改変ＲＰＭＩ培地に細胞を収集した。遠心分離によって細胞を２回洗浄した。最後の洗浄後、トリパンブルーで細胞を染色し、血球計算盤で計測することで細胞密度を決定した。細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、上清を破棄した。ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中の適量の１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）に細胞を再懸濁し、１ｍｌ／バイアルで分注した。その後、バイアルを−７０℃で２４時間保存してから、長期保存のために液体窒素（ＬＮ_２）タンク内に収納した。

全血を２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけ、血漿を除去し、残りの血液量をＰＢＳで５０ｍＬに再懸濁し、新しい２つの５０ｍＬコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に同容量になるよう分けることで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。８ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ Ｒａｂｂｉｔ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を注意深く血液混合物の下になるように入れ、室温で３０分間、２０００ｒｐｍでブレーキなしで遠心分離にかけた。遠心分離後、ガラス製パスツールピペット（ＶＷＲ）を用いてＰＢＭＣ層を注意深く除去し、合わせて、無菌５０ｍｌバイアルに注いだ。室温で１０分間２０００ｒｐｍの遠心分離にかけることで、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞密度をトリパンブルー染色で決定した。洗浄後、適量の１０％ＤＭＳＯ／ＦＢＳ培地に細胞を再懸濁させ、上述の通り凍結した。

Ｂ細胞の培養：Ｂ細胞の培養を開始する当日に、ＰＢＭＣ、脾細胞またはリンパ節のバイアルを使用のために解凍した。バイアルをＬＮ_２タンクから取り出し、３７℃の水浴中に解凍されるまで置いた。バイアルの内容物を１５ｍＬのコニカル遠心チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、上述した改変ＲＰＭＩ １０ｍＬをチューブにゆっくり添加した。細胞を１〜２Ｋｒｐｍで５分間遠心分離にかけ、上清を破棄した。細胞を新しい１０ｍＬの培地に再懸濁した。トリパンブルー染色で細胞密度と生存率を決定した。細胞を再度洗浄して、１Ｅ７細胞当たり１００μｌのリン酸緩衝配合物[（ＰＢＦ）：Ｃａ／ＭｇフリーＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−ビオチンフリー）]中に再懸濁した。洗浄中に、ビオチン化抗原をＰＢＦで約５μｇ／ｍｌに希釈した。ビオチン化抗原を１０〜２０μｌのＭＡＣＳ（登録商標）ストレプトアビジンビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｉ）と合わせ、４℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、被覆したビーズを、事前に湿らせたＭＡＣＳ（登録商標）ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｉ）に通した。被覆したビーズを５００μｌのＰＢＦで３回すすぎ、最初の容量で溶出した。被覆したビーズと解凍した細胞とを合わせ、混合し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞とビーズの混合物をＭＳカラムに通した。カラムを５００μｌのＰＢＦで５回洗浄し、磁石を取り外し、細胞を０．５〜１ｍＬのＰＢＦで溶出した。細胞を計測し、上述したほぼ同量の改変ＲＰＭＩで再懸濁した。陽性選択（濃縮）により平均１％の初期細胞濃度が得られた。培養物の細胞播種レベルに関する情報を得るために試験的な細胞スクリーニングを確立した。３〜１０個の９６ウェルプレートを３〜４群（合計最大４０プレート）にし、播種密度当たり１０、２０、５０及び１００個の濃縮Ｂ細胞とした。さらに、各ウェルには、最終容量２５０μｌ／ウェルの高グルコース改変ＲＰＭＩ培地中に、１ウェル当たり細胞５０Ｋ個の照射済みＥＬ−４．Ｂ５細胞（５，０００ラド）及び適切なレベルのＴ細胞上清（調製に応じて１〜５％の範囲）を含めた。培養物を３７℃、４％ＣＯ_２で５〜７日間インキュベートした。

選択的抗体分泌Ｂ細胞の同定：５日目から７日目の間に抗原認識及び機能活性について培養物を試験した。

Ｂ細胞培養物の抗原認識スクリーニング：抗原認識スクリーニングは、抗体の供給源としてＢ細胞培養物（ＢＣＣ）ウェル（全４０プレート）から得た上清５０μｌを用いたことを除き、力価評価について記載したＥＬＩＳＡフォーマットと同じものを用いた。馴化培地を抗原コーティングプレートに移した。陽性ウェルをＥＬＩＳＡで特定した後、陽性のＢ細胞培養ウェルから上清を取り、９６ウェルマスタープレートに移した。その後、４０μｌ／ウェルを残してすべての上清を取り除き、ＦＢＳ中の１６％ＤＭＳＯを６０μｌ／ウェルで添加して、当初の培養プレートを凍結した。凍結を遅らせるためにペーパータオルでプレートを包み、−７０℃に置いた。

機能活性スクリーニング：ｈｕＰＣＳＫ９−ＬＤＬｒ結合ＥＬＩＳＡでマスタープレートを機能活性についてスクリーニングした。ニュートロアビジンプレートをビオチン化したポリクローナル抗ｈｕＰＣＳＫ９（Ｒ＆Ｄ）でコーティングし、洗浄した。コーティング後、一過性トランスフェクションをしたヒト腎臓２９３細胞から得た未精製のＤ３７４Ｙ ｈｕＰＣＳＫ９をＢ細胞の上清とインキュベートしてから、ウェルに添加し、結合させた。追加の洗浄の後、組換えＨｉｓタグ化ＬＤＬｒ（Ｒ＆Ｄ）を室温で１時間添加した。再度洗浄した後、抗ＨｉｓタグＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し（ロットによる濃度）、ＬＤＬｒ結合を検出した。３回の追加洗浄の後、５０ｕｌのＴＭＢを添加して１５分間顕色させ、５０μｌの０．５Ｍ ＨＣｌを添加した。プレートを４５０ｎｍで読み取った。

Ｂ細胞回収−単一ウェル分取：目的のウェルを含むプレートを−７０℃から取り出し、ウェル当たり２００μｌの培地（１０％ＲＰＭＩ完全、５５μＭ ＢＭＥ）で５回洗浄して各ウェルから細胞を回収した。回収した細胞を遠心分離によりペレット状にし、上清を注意深く除去した。その後、各ウェルから得た細胞をＦＡＣＳチューブ内の２００μｌ培地中に再懸濁した。キャップを緩めに固定して、細胞を３７℃で１２０分間（４％ＣＯ２）インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離によりペレット状にし、最大２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ含有ダルベッコＰＢＳ）で洗浄して、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。

Ｂ細胞回収−プール分取：目的のウェルを含むプレートを−７０℃から取り出し、ウェル当たり２００μｌの培地（１０％ＲＰＭＩ完全、５５μＭ ＢＭＥ）で５回洗浄して各ウェルから細胞を回収した。回収した細胞をプールして遠心分離によりペレット状にし、上清を注意深く除去した。その後、細胞を１ウェル当たり２００μｌの培地中に再懸濁し、プールし、適量の組織培養フラスコに移した。細胞を３７℃で１２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離によりペレット状にし、最大２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ含有ダルベッコＰＢＳ）で洗浄して、プールしたウェルにつき１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁した。

Ｂ細胞回収−陽性染色：細胞混合物中に存在するマウスＥＬ４細胞に特異的な蛍光標識抗体（ＣＤ９０．２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５３０１４）を２〜１０μｇ／ｍＬ用いて、細胞を室温で約２０分間染色した。インキュベーション後、細胞を最大２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液１ｍｌ当たり約１×１０Ｅ６（１００万個）の細胞を再懸濁した。再懸濁後、ヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５６４６３）を０．２〜０．５μｇ／ｍｌ添加して、混合物中の死細胞を特定した。

Ｂ細胞回収−陰性染色：細胞混合物中に存在するウサギＢ細胞に特異的な蛍光標識抗体（抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＤＭＡＢ４７７９）を２〜１０μｇ／ｍｌ用いて、細胞を染色した。細胞を室温で約２０分間染色し、続けてインキュベーションを行い、最大２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液１ｍｌ当たり約１×１０Ｅ６（１００万個）の細胞を再懸濁した。再懸濁後、ヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５６４６３）を０．２〜０．５μｇ／ｍｌ添加して、混合物中の死細胞を特定した。

Ｂ細胞分取方法：目的のプールウェルまたは単一ウェルと組成が類似したコントロール培養ウェルを用いて、細胞分取ゲーティングを確立した。ゲーティング細胞サンプルを目的ウェルと並行して解凍し、染色した。非染色集団またはブランク集団について最初のゲートを確立した。染色コントロールサンプルをＦＡＣＳ（ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ）にかけ、ＥＬ４除外（ＣＤ９０．２陽性／ＣＤ９０．２＋）、Ｂ細胞包含（ＩｇＧ陽性／ＩｇＧ＋）、生存率（ＰＩ陰性／ＰＩ−）、及びＢ細胞とマウスＥＬ４細胞とを区別する物理的パラメータ（ＦＳＣ／ＳＳＣ）に関するゲートを確認した。後者のゲートは、培養物中のＥＬ４細胞を識別する物理的性質（大きさ／粒度）に基づくので、染色がなくても確立することができる。ゲートが確立したら、個々のウェルから得た細胞または複数のウェルのプール細胞からなるサンプルを処理し、一定の物理的性質（ＦＳＣ／ＳＳＣ）を持つＥＬ４陰性／ＩｇＧ陽性の生存細胞を、ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを予め充填した９６ウェルプレートのウェルに個別に分取した。分取後のプレートを分取器から取り外し、目的のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域をＰＣＲ増幅するために、サーマルサイクラーまたは−８０℃のいずれかに直接移した。

抗原特異的Ｂ細胞からの抗体配列の増幅及び配列決定：組み合わせＲＴ−ＰＣＲに基づく方法を用いて、単一の単離Ｂ細胞から、抗体配列を回収する。ウサギ免疫グロブリン配列などの標的免疫グロブリン遺伝子（重鎖及び軽鎖）の保存領域及び定常領域でアニールするように制限酵素を含有するプライマーを設計し、２段階方式のネステッドＰＣＲ法による回収を用いて抗体配列を増幅した。各ウェルのアンプリコンをＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ分析によって回収について分析し、必要に応じてサイズ完全性について（たとえば、電気泳動によって）分析した。得られた断片を配列確認に送った。この配列結果により、同一の抗体を容易に特定できる。ＰＣＲプライマー内に含まれる制限酵素部位を利用して、元の重鎖及び軽鎖のアンプリコン断片を消化して、発現ベクターにクローニングした。サブクローニングしたＤＮＡ断片を含むベクターを増幅して精製した。サブクローニングした重鎖及び軽鎖の配列を発現の前に検証した。

所望の抗原特異性及び／または機能特性を持つモノクローナル抗体の組換え作製：特異性Ｂ細胞から回収した抗体の抗原特異性及び機能特性を決定するために、対をなす所望の重鎖配列及び軽鎖配列の発現を行うベクターをヒト腎臓２９３細胞にトランスフェクトし、その後組換え抗体を培養培地から回収した。

ＥＬＩＳＡによる組換え抗体の抗原認識：組換え発現抗体の特性を決定するために、ヒトＰＣＳＫ９への結合能力について、抗体含有溶液をＥＬＩＳＡで試験した。すべてのインキュベーションを室温で行った。概略すれば、ニュートロアビジンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％魚皮ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１時間ブロックした。ブロック後、プレートをビオチン化ｈｕＰＣＳＫ９含有溶液（ＥＬＩＳＡ緩衝液中１μｇ／ｍＬ）で１時間コーティングした。その後、ヒトＰＣＳＫ９コーティングプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。コーティング後、プレートをＥＬＩＳＡ緩衝液で再び１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、その後、プレートを試験抗体の希釈系列と約１時間インキュベートした。インキュベーション終了時点で、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄して、２次抗体を含む溶液（ペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））と約４５分間さらにインキュベートして、３回洗浄した。次に、基質溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質、ＢｉｏＦｘ）を添加して、暗所で３〜５分間インキュベートした。０．５Ｍ ＨＣｌを添加することにより反応を停止し、プレートをプレートリーダーにて４５０ｎｍで読み取った。

ＨｅｐＧ２細胞のＬＤＬ−Ｃ取込み調節による組換え抗体の機能特性の決定：ＨｅｐＧ２細胞におけるｈｕＰＣＳＫ９によるＬＤＬ−Ｃ取込みの阻害を中和する抗ＰＣＳＫ９抗体の能力を細胞ベースアッセイで試験した。ＨｅｐＧ２細胞をコラーゲンコーティング９６ウェルプレートに播種した（３０，０００細胞／ウェル）。２４時間後、培地を０．５％低脂質ＦＢＳを含む新鮮な培地（ＭＥＭ）と取り替えた。種々の濃度の抗ＰＣＳＫ９抗体を３μｇ／ｍＬのｈｕＰＣＳＫ９と室温で１時間インキュベートし、その後、ＨｅｐＧ２細胞に添加し、３７℃で５時間インキュベートした。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＤＬを各ウェルに添加して、３７℃で一晩インキュベートした。培地を取り除き、細胞をＲＩＰＡバッファーで溶解し、細胞によって取り込まれたＢＯＤＩＰＹ−ＬＤＬの量をプレートリーダーで測定した（励起４８５ｎｍ、発光５３５ｎｍ）。

この実施例により、複数の抗ＰＣＳＫ９抗体配列が、同定した抗原特異的Ｂ細胞からクローニングされたことが示された。例示的な抗体Ａｂ１及びＡｂ２がｈｕＰＣＳＫ９への高い結合親和性を有することが示され（図６参照）、ｈｕＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの相互作用を阻害する能力が確認された（図７参照）。
実施例９：ＨｕＣＧＲＰαに結合する抗体の調製

本明細書に記載の抗体選択プロトコールを使用することにより、ＣＧＲＰαの強力な機能性アンタゴニスト作用を呈する抗体コレクションを作製することができる。ＣＧＲＰαにペプチドのＮ末端またはＣ末端で選択的に結合することができる抗体を同定した。たとえば、Ａｂ３及びＡｂ４であり、ＣＧＲＰαに対して特異性を有する異なる抗体であり、後者はほとんどが官能基からなる。

免疫付与方法：ウサギをヒトＣＧＲＰα（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ及びＢａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ ＣＡ）で免疫にした。免疫付与は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）中１００μｇのＫＬＨと混合した１００μｇの抗原による最初の皮下（ｓｃ）注射と、その後、２週間の間を空けた、それぞれ不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）中５０μｇと混合した５０μｇの抗原による２回の追加免疫とした。５５日目に動物から採血し、ＥＬＩＳＡ（抗体認識）と、ＳＫ−Ｎ−ＭＣにおけるＣＧＲＰによるｃＡＭＰ上昇の阻害とによって血清力価を決定した。

ＡＢＳ力価評価：以下の点を除き、ｈｕＰＣＳＫ９に関して記載したプロトコール（実施例８参照）によって、ＣＧＲＰαについての抗原認識アッセイを決定した。ニュートロアビジンプレートを上記の濃度にてＮ末端またはＣ末端をビオチン化したＣＧＲＰ−αでコーティングした。

機能性の力価評価：機能活性を有する抗体を同定し、その特徴を調べるために、電気化学発光（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＭＳＤ）を用いて、ＣＧＲＰによるｃＡＭＰレベル上昇阻害アッセイを行った。概略すれば、試験する抗体調製物を９６ウェル丸底ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中にＭＳＤアッセイ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ、ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３、ブロック剤Ａ１ｍｇ／ｍＬ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で連続希釈した。このプレートに、ヒトＣＧＲＰαを添加し（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、ＭＳＤアッセイ緩衝液で希釈し、３７Ｃで１時間インキュベートした。アッセイキット製造業者が提示する通りに、適切なコントロールを用いた。ＥＤＴＡ溶液（ＰＢＳ中５ｍＭ）を用いてヒト神経上皮腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＡＴＣＣ）を分離し、増殖培地（ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、抗生物質）を用いて遠心分離により洗浄した。細胞数をアッセイ緩衝液中１ｍＬ当たり２００万細胞に調整し、ｃＡＭＰアッセイプレート上に細胞を充填する直前にＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン、Ｓｉｇｍａ）を添加して最終濃度０．２ｍＭにした。抗体／ｈｕＣＧＲＰαを個別に混合し、室温で１時間インキュベートした。次に、この混合物を上述した１０ｕＬの細胞懸濁液とともにＭＳＤ ｃＡＭＰアッセイプレートに移した。このプレートを振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。同時に、停止溶液を調製した（溶解バッファーでＴＡＧ標識ｃＡＭＰ（ＭＳＤ）を１：２００に希釈）。１ウェル当たり２０ｕｌの停止溶液をＭＳＤアッセイプレートに添加し、室温でさらに２０分間振盪させた。読取り緩衝液１００μＬ（ＭＳＤ、水で１：４に希釈）を各ウェルに添加した。Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ２４００（ＭＳＤ）を用いてプレートを読み取り、Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータの適合性とＩＣ５０を決定した。

組織採取：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、ウサギの脾臓、リンパ節及び全血を採取し、処理し、凍結した（実施例８参照）。

Ｂ細胞培養（ＢＣＣ）：Ｎ末端及びＣ末端をビオチン化したｈｕＣＧＲＰαを用いて細胞濃縮を行ったことを除き、実施例８でｈｕＰＣＳＫ９に関して記載した通りにＢ細胞培養物を調製した。

Ｂ細胞培養物の抗原認識スクリーニング：上述した通りに、単一点として、抗原認識スクリーニングを実施した。

機能活性スクリーニング：Ｂ細胞上清に含まれる機能活性を決定するために、上清サンプルの機能性力価の決定について記載した手順と類似の手順を用いたが、以下の修正を加えた。概略すれば、希釈したポリクローナル血清サンプルの代わりにＢ細胞上清（２０μＬ）を用いた。

Ｂ細胞の回収：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、ＦＡＣＳ法を実施した（実施例８参照）。

抗原特異的Ｂ細胞から得た抗体配列の増幅及び配列決定：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した方法を用いて抗体配列を回収した（実施例８参照）。

所望の抗原特異性及び／または機能特性を持つモノクローナル抗体の組換え作製：特異性Ｂ細胞から回収した抗体の抗原特異性及び機能特性を決定するために、対をなす所望の重鎖配列及び軽鎖配列の発現を行うベクターをヒト腎臓２９３細胞にトランスフェクトし、その後組換え抗体を培養培地から回収した。

ＥＬＩＳＡによる組換え抗体の抗原認識：力価評価の項目に記載した通りに、組換え抗体を結合について評価した。Ｎ末端及びＣ末端をビオチン化したＥＬＩＳＡを個別に実施して、結合特異性を決定した。ＥＬＩＳＡで測定したように、例示的な抗体Ａｂ３及びＡｂ４について、ＣＧＲＰの結合親和性を決定した。図８を参照されたい。

ＣＧＲＰによる細胞内ｃＡＭＰレベルの調節による組換え抗体の機能特性の決定：組換え発現抗体の特性を決定するために、ＣＧＲＰαを介したｃＡＭＰの細胞レベル上昇を阻害する能力のアッセイに関して、電気化学発光アッセイキット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＭＳＤ）を用いた。概略すれば、試験する抗体調製物を９６ウェル丸底ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）においてＭＳＤアッセイ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ、ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３、ブロック剤Ａ１ｍｇ／ｍＬ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で連続希釈した。このプレートに、ヒトＣＧＲＰαを添加し（最終濃度２５ｎｇ／ｍＬ）、ＭＳＤアッセイ緩衝液で希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。アッセイキット製造業者が提示する通りに、適切なコントロールを用いた。ＥＤＴＡ溶液（５ｍＭ）を用いてヒト神経上皮腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＡＴＣＣ）を分離し、増殖培地（ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、抗生物質）を用いて遠心分離により洗浄した。細胞数をアッセイ緩衝液中１ｍＬ当たり２００万細胞に調整し、ｃＡＭＰアッセイプレート上に細胞を充填する直前にＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）を添加して最終濃度０．２ｍＭにした。抗体／ｈｕＣＧＲＰαを個別に混合し、室温で１時間インキュベートした。次に、この混合物を上述した１０μＬの細胞懸濁液とともにＭＳＤ ｃＡＭＰアッセイプレートに移した。このプレートを振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。同時に、停止溶液を調製した（溶解バッファーでＴＡＧ標識ｃＡＭＰ（ＭＳＤ）を１：２００に希釈）。１ウェル当たり２０μＬの停止溶液をＭＳＤアッセイプレートに添加し、室温でさらに２０分間振盪させた。読取り緩衝液１００μＬ（ＭＳＤ、水で１：４に希釈）を各ウェルに添加した。Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ２４００（ＭＳＤ）を用いてプレートを読み取り、Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータの適合性とＩＣ５０を決定した。

この実施例により、複数の抗ＣＧＲＰ抗体配列が、同定した抗原特異的Ｂ細胞からクローニングされたことが示された。例示的な抗体であるＡｂ３及びＡｂ４は、ＣＧＲＰに対して高い結合親和性を有することが示された（図９参照）。
実施例１０：標的１に結合する抗体の調製

本明細書に記載の抗体選択プロトコールを使用することにより、標的１の強力な機能性アンタゴニスト作用を呈する抗体コレクションを作製することができる。たとえば、標的１に対して特異性を有する異なる抗体であるＡｂ５及びＡｂ６である。

免疫付与方法：ＣＧＲＰαについて記載した個々のペプチド（実施例９参照）でウサギを免疫にした。細胞表面タンパク質の細胞外ループに対応する、３つの形態のペプチドを免疫化のために設計し、合成した。３つの断片は、抗体が完全な細胞構造に対してほぼ接触可能なエピトープを示す。

ＡＢＳ力価評価：実施例８でｈｕＰＣＳＫ９に関して記載したプロトコールによって、標的１についての抗原認識アッセイを決定した。力価決定のために、特異的ペプチドで免疫にしたウサギを当該ペプチドに対して評価した。

組織採取：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、ウサギの脾臓、リンパ節及び全血を採取し、処理し、凍結した（実施例８参照）。

Ｂ細胞の培養：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、Ｂ細胞の培養を設定した（実施例８参照）。

Ｂ細胞培養物の抗原認識スクリーニング：上述した通りに、単一点として、抗原認識スクリーニングを実施した（実施例８参照）。

Ｂ細胞の回収：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、ＦＡＣＳ法を実施した（実施例８参照）。

抗原特異的Ｂ細胞から得た抗体配列の増幅及び配列決定：ｈｕＰＣＳＫ９について記載した方法を用いて抗体配列を回収した（実施例８参照）。

所望の抗原特異性及び／または機能特性を持つモノクローナル抗体の組換え作製：特異性Ｂ細胞から回収した抗体の抗原特異性及び機能特性を決定するために、対をなす所望の重鎖配列及び軽鎖配列の発現を行うベクターをヒト腎臓２９３細胞にトランスフェクトし、その後組換え抗体を培養培地から回収した。

ＥＬＩＳＡによる組換え抗体の抗原認識：組換え発現抗体の特性を決定するために、標的１ペプチドへの結合能力について、抗体含有溶液をＥＬＩＳＡで試験した。図９を参照されたい。すべてのインキュベーションを室温で行った。概略すれば、ビオチン化標的１ペプチドを含む溶液（ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ）でニュートロアビジンプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を１時間コーティングした。その後、標的１ペプチドでコーティングしたプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％魚皮ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、プレートを約１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、その後、プレートを試験抗体の希釈系列と約１時間インキュベートした。このインキュベーション終了時点で、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄して、２次抗体を含む溶液（ペルオキシダーゼ結合ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））と約４５分間さらにインキュベートして、３回洗浄した。この時点で、基質溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質、ＢｉｏＦｘ）を添加して、暗所で３〜５分間インキュベートした。ＨＣｌ（０．５Ｍ）含有溶液を添加することにより反応を停止し、プレートをプレートリーダーにて４５０ｎｍで読み取った。

この実施例により、複数の抗標的１抗体配列が、同定した抗原特異的Ｂ細胞からクローニングされたことが示された。例示的な抗体であるＡｂ５及びＡｂ６は、標的１に対して高い結合親和性を有することが示された（図９参照）。
実施例１１：ヒトβ−ＮＧＦに結合する抗体の調製

本明細書に記載の抗体選択プロトコールを使用することにより、広範囲な抗体パネルを作製することができる。たとえば、β−ＮＧＦに対して特異性を有する異なる抗体であるＡｂ７及びＡｂ８が例示的な抗ＮＧＦ抗体である。当該抗体は、ＮＧＦに対して高い親和性を有し（約１０〜９００ｐＭ Ｋ_Ｄ）、細胞ベーススクリーニングシステムにおいて、ＮＧＦの強力なアンタゴニスト作用を呈する（ＴＦ１及びＰＣ−１２）。さらに、この抗体コレクションは、ＮＧＦ誘導プロセスに対して、異なる機序のアンタゴニスト作用を示した。

免疫付与方法：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した個々のペプチド（実施例８参照）でウサギを免疫にした。

ＡＢＳ力価評価：上述したｈｕＰＣＳＫ９に関するプロトコール（実施例８参照）によって、ｈｕＢ−ＮＧＦについての抗原認識アッセイを決定した。

機能性の力価評価：機能活性を有する抗体を特定し、その特徴を調べるために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（商標）９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ３５８０）を用いて、ＴＦ１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２００３）のＮＧＦ誘導増殖阻害を行った。概略すれば、９６ウェル丸底ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）において、試験する抗体調製物をＢ−ＮＧＦとともに１０％ＣＲＰＭＩ（完全ＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＢＳ）で連続希釈した。室温でインキュベートした後、抗体−ＮＧＦ複合体をＴＦ１細胞に添加し（１ウェル当たり２５，０００細胞）、４８時間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（商標）９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイを用いて、細胞生存率を決定した。得られたプレートを標準プレートリーダーにて４９２ｎｍで分析し、増殖応答をグラフ化して確立した。機能修飾力価により、本アッセイにおける増殖が減少する。

組織採取：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、ウサギの脾臓、リンパ節及び全血を採取し、処理し、凍結した（実施例８参照）。

Ｂ細胞の培養：ｈｕＰＣＳＫ９に関して記載した通りに、Ｂ細胞の培養を設定した（実施例８参照）。

Ｂ細胞培養物の抗原認識スクリーニング：上述した通りに、単一点として、抗原認識スクリーニングを実施した（実施例８参照）。上述の通り、Ｂ−ＮＧＦ認識に基づいて、マスタープレートを作成した。

機能活性スクリーニング：上述の通り、ＴＦ１増殖アッセイにおける機能活性について、マスタープレートをスクリーニングした。

Ｂ細胞の回収：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、ＦＡＣＳ法を実施した（実施例８参照）。

抗原特異的Ｂ細胞から得た抗体配列の増幅及び配列決定：ｈｕＰＣＳＫ９について記載した方法を用いて抗体配列を回収した（実施例８参照）。

所望の抗原特異性及び／または機能特性を持つモノクローナル抗体の組換え作製：特異性Ｂ細胞から回収した抗体の抗原特異性及び機能特性を決定するために、対をなす所望の重鎖配列及び軽鎖配列の発現を行うベクターをヒト腎臓２９３細胞にトランスフェクトし、その後組換え抗体を培養培地から回収した。

ＥＬＩＳＡによる組換え抗体の抗原認識：組換え発現抗体の特性を決定するために、ｈｕＢ−ＮＧＦへの結合能力について、抗体含有溶液をＥＬＩＳＡで試験した。図１０を参照されたい。すべてのインキュベーションを室温で行った。概略すれば、ビオチン化ｈｕＢ−ＮＧＦを含む溶液（ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ）でニュートロアビジンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１時間コーティングした。その後、ＨｕＢ−ＮＧＦペプチドでコーティングしたプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％魚皮ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、プレートを約１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、その後、プレートを試験抗体の希釈系列と約１時間インキュベートした。このインキュベーション終了時点で、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄して、２次抗体を含む溶液（ペルオキシダーゼ結合ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））と約４５分間さらにインキュベートして、３回洗浄した。この時点で、基質溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質、ＢｉｏＦｘ）を添加して、暗所で３〜５分間インキュベートした。ＨＣｌ（０．５Ｍ）含有溶液を添加することにより反応を停止し、プレートをプレートリーダーにて４５０ｎｍで読み取った。

ＴＦ１細胞増殖アッセイによる組換え抗体の機能特性の決定：ｈｕＢ−ＮＧＦの機能力価の項目にて記載したＴＦ−１増殖アッセイにおける機能に関して、組換えｈｕＢ−ＮＧＦ抗体を評価した。図１１を参照されたい。

この実施例により、複数の抗ｈｕＢ−ＮＧＦ抗体配列が、同定した抗原特異的Ｂ細胞からクローニングされたことが示された。例示的な抗体Ａｂ７及びＡｂ８は、Ｂ−ＮＧＦに対する高い結合親和性を有し（図１０参照）、ＴＦ１増殖アッセイにおいて増殖を減少させることが示された（図１１参照）。

実施例１２：標的２に結合する抗体の調製

本明細書に記載の抗体選択プロトコールを使用することにより、広範囲な抗体パネルを作製することができる。たとえば、標的２に対して特異性を有する異なる抗体であるＡｂ９及びＡｂ１０が例示的な抗標的２抗体である。作製した抗体は、様々なエピトープに結合することができ、標的２への特異性だけでなく、標的２と相同なタンパク質への結合性も有している。これらの抗体についても、機能性アッセイによって効力を評価した。

免疫付与方法：実施例９にて記載したＣＧＲＰαに関する方法（ＫＬＨと混合）にさらなる方法を加えて、ウサギを標的２で免疫にした。具体的には、標的２抗原は、ＫＬＨとウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）に直接コンジュゲートさせたペプチドである。それぞれの場合において、ＣＧＲＰαと同様に、最初の免疫付与には１００μｇの抗原またはＫＬＨ／ＲＳＡコンジュゲート抗原をＣＦＡとともに使用し、後続の免疫付与は５０μｇの追加免疫とした。コンジュゲート免疫付与の場合、μｇ量（最初に１００μｇ、追加で５０μｇ）は、遊離型非コンジュゲート抗原と一致させた。先に記載した時点で採血した。

ＡＢＳ力価評価：ｈｕＰＣＳＫ９に関して記載したプロトコール（実施例８参照）によって、ビオチン化形態の標的２を使用して、標的２についての抗原認識アッセイを決定した。

機能性の力価評価：イノシトール１−ホスフェートを基準にした２次メッセンジャーの読取りを用いた細胞ベースＨＴＲＦアッセイによって標的２に対する抗体の効力を検証した。

組織採取：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、ウサギの脾臓、リンパ節及び全血を採取し、処理し、凍結した（実施例８参照）。

Ｂ細胞の培養：ｈｕＰＣＳＫ９に関して記載した通りに、Ｂ細胞の培養を設定した（実施例８参照）。

Ｂ細胞培養物の抗原認識スクリーニング：上述した通りに、単一点として、抗原認識スクリーニングを実施し（実施例８参照）、抗原陽性ウェルからマスタープレートを作製した。

機能活性スクリーニング：上述の通り、ＨＴＲＦアッセイにおける機能活性について、マスタープレートをスクリーニングした。７０μｌの上清を抗体源として使用した。

Ｂ細胞の回収：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、ＦＡＣＳ法を実施した（実施例８参照）。

抗原特異的Ｂ細胞から得た抗体配列の増幅及び配列決定：ｈｕＰＣＳＫ９について記載した方法を用いて抗体配列を回収した（実施例８参照）。

所望の抗原特異性及び／または機能特性を持つモノクローナル抗体の組換え作製：特異性Ｂ細胞から回収した抗体の抗原特異性及び機能特性を決定するために、対をなす所望の重鎖配列及び軽鎖配列の発現を行うベクターをヒト腎臓２９３細胞にトランスフェクトし、その後組換え抗体を培養培地から回収した。

ＥＬＩＳＡによる組換え抗体の抗原認識：組換え発現抗体の特性を決定するために、標的２への結合能力について、抗体含有溶液をＥＬＩＳＡで試験した。図１２を参照されたい。すべてのインキュベーションを室温で行った。概略すれば、ビオチン化した標的２を含む溶液（ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ）でニュートロアビジンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１時間コーティングした。その後、標的２でコーティングしたプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％魚皮ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、プレートを約１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、その後、プレートを試験抗体の希釈系列と約１時間インキュベートした。このインキュベーション終了時点で、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄して、２次抗体を含む溶液（ペルオキシダーゼ結合ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））と約４５分間さらにインキュベートして、３回洗浄した。この時点で、基質溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質、ＢｉｏＦｘ）を添加して、暗所で３〜５分間インキュベートした。ＨＣｌ（０．５Ｍ）含有溶液を添加することにより反応を停止し、プレートをプレートリーダーにて４５０ｎｍで読み取った。

細胞ベースＨＴＲＦアッセイによる組換え抗体の機能特性の決定：機能性力価の項目において記載したように、細胞ベースＨＴＲＦアッセイにおける機能に関して、組換え標的２抗体を評価した。図１３を参照されたい。

この実施例により、複数の抗標的２抗体配列が、同定した抗原特異的Ｂ細胞からクローニングされたことが示された。例示的な抗体であるＡｂ９及びＡｂ１０は、標的２に対して高い結合親和性を有し（図１２参照）、ＨＴＲＦアッセイにおける機能活性が示された（図１３参照）。

実施例１３：標的３に結合する抗体の調製

本明細書に記載の抗体選択プロトコールを使用することにより、広範囲な抗体パネルを作製することができる。たとえば、標的３に対して特異性を有する異なる抗体であるＡｂ１１及びＡｂ１２が例示的な抗標的３抗体である。作製した抗体は、標的３に特異的な、様々なエピトープに結合する。

免疫付与方法：ＣＧＲＰαに関して実施例９で記載した方法（ＫＬＨと混合）にさらなる方法を加えて、ウサギを標的３で免疫にした。具体的には、標的３抗原は、ＫＬＨに直接コンジュゲートしたペプチドである。それぞれの場合において、ＣＧＲＰαと同様に、最初の免疫付与には１００μｇの抗原またはＫＬＨ／ＲＳＡコンジュゲート抗原をＣＦＡとともに使用し、後続の免疫付与は５０μｇの追加免疫とした。コンジュゲート免疫付与の場合、μｇ量（最初に１００μｇ、追加で５０μｇ）は、遊離型非コンジュゲート抗原と一致させた。先に記載した時点で採血した。

ＡＢＳ力価評価：ｈｕＰＣＳＫ９に関して記載したプロトコール（実施例８参照）によって、ビオチン化形態の標的３を使用して、標的３についての抗原認識アッセイを決定した。

機能性の力価評価：環状ＡＭＰを基準にした２次メッセンジャーの読取りを用いたセルベース電気化学発光（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＭＳＤ）アッセイによって、標的３に対する抗体の効力を検証できる。

組織採取：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、ウサギの脾臓、リンパ節及び全血を採取し、処理し、凍結した（実施例８参照）。

Ｂ細胞の培養：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、Ｂ細胞の培養を設定した（実施例８参照）。

Ｂ細胞培養物の抗原認識スクリーニング：抗原認識スクリーニングは、上述した通りに単一点として実施することができる（実施例８参照）。マスタープレートは、抗原陽性ウェルから作製した。

機能活性スクリーニング：上述の通り、ＭＳＤアッセイにおける機能活性について、マスタープレートをスクリーニングすることができる。抗体源には、７０μｌの上清を使用することができる。

Ｂ細胞の回収：ｈｕＰＣＳＫ９について上述した通りに、ＦＡＣＳ法を実施した（実施例８参照）。

抗原特異的Ｂ細胞から得た抗体配列の増幅及び配列決定：ｈｕＰＣＳＫ９について記載した方法を用いて抗体配列を回収した（実施例８参照）。

所望の抗原特異性及び／または機能特性を持つモノクローナル抗体の組換え作製：特異性Ｂ細胞から回収した抗体の抗原特異性及び機能特性を決定するために、対をなす所望の重鎖配列及び軽鎖配列の発現を行うベクターをヒト腎臓２９３細胞にトランスフェクトし、その後組換え抗体を培養培地から回収した。

ＥＬＩＳＡによる組換え抗体の抗原認識：組換え発現抗体の特性を決定するために、標的３への結合能力について、抗体含有溶液をＥＬＩＳＡで試験した。図１４を参照されたい。すべてのインキュベーションを室温で行った。概略すれば、ビオチン化した標的３を含む溶液（ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ）でニュートロアビジンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１時間コーティングした。その後、標的３でコーティングしたプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％魚皮ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、プレートを約１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、その後、プレートを試験抗体の希釈系列と約１時間インキュベートした。このインキュベーション終了時点で、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄して、２次抗体を含む溶液（ペルオキシダーゼ結合ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））と約４５分間さらにインキュベートして、３回洗浄した。この時点で、基質溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質、ＢｉｏＦｘ）を添加して、暗所で３〜５分間インキュベートした。ＨＣｌ（０．５Ｍ）含有溶液を添加することにより反応を停止し、プレートをプレートリーダーにて４５０ｎｍで読み取った。

細胞ベースＨＴＲＦまたはＭＳＤアッセイによる組換え抗体の機能特性の決定：機能性力価の項目において記載したように、細胞ベースＨＴＲＦアッセイにおける機能に関して、組換え標的３抗体を評価することができる。

この実施例により、複数の抗標的３抗体配列が、同定した抗原特異的Ｂ細胞からクローニングされたことが示された。例示的な抗体であるＡｂ１１及びＡｂ１２は、標的３に対して高い結合親和性を有することが示された（図１４参照）。

前述の実施例は、主題発明の実施法及び使用法に関する完全な開示及び説明を当業者に提供するために提案されるものであり、本発明とみなされる事項の範囲を限定することを意図するものではない。使用した数値（たとえば、量、温度、濃度など）に関しては、正確性を確保する努力を払ったが、一部の実験誤差及び偏差は許容されるものである。特に指定がない限り、部は重量部、分子量は平均分子量、温度はセ氏温度、圧力は略大気圧である。

例示した本発明の種々の実施形態に関する上記の説明は、すべてを包含することも、その厳密な開示形態に発明を限定することも意図していない。本発明に関する具体的な実施形態及び実施例は、例示的な目的で本明細書に記載されており、関連技術分野の当業者が認識するように、様々な等価の変更が本発明の範囲内で可能である。本明細書に記載した本発明の教示は、上述の実施例以外の他の目的にも応用することができる。

本発明は、前述の説明及び実施例に具体的に記載した方法以外の方法で実施してもよい。本発明の変更及び変形形態が上記の教示に照らして数多く可能であり、それゆえ、これらも添付の特許請求の範囲内である。

本発明に対するこれらの変更及び他の変更は、上記の詳細な説明に照らして行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において使用される用語は、本発明を、明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定するように解釈されるべきではない。したがって、本発明は本開示によって限定されるものではなく、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって完全に決定されるものである。

本明細書に引用した各文書の開示全体（特許、特許出願、論文、要旨、マニュアル、書籍または他の開示を含む）は、背景技術、発明の概要、詳細な説明及び実施例にて引用した各文書を含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (10)

1. 所望の機能特性を有する抗原特異的抗体をそれぞれ発現する抗原特異的Ｂ細胞を含む精製されたＢ細胞集団を単離する方法であって、
   （ｉ）目的の抗原で免疫したかまたは目的の抗原に自然感染した非ヒト宿主からＢ細胞を取得すること；
   （ｉｉ）目的の抗原に結合する抗体を産生するＢ細胞を、濃縮前のＢ細胞画分に比べてより高い割合で含有する、抗原特異的Ｂ細胞を含むＢ細胞の濃縮集団を得るために、前記宿主から単離されたＢ細胞の画分を濃縮すること；
   （ｉｉｉ）前記濃縮抗原特異的Ｂ細胞集団から得た１つ以上の画分を、目的の抗原に結合する単一の抗体を産生するクローン性Ｂ細胞集団の形成に有利な培養条件下で個別に培養すること、ここで該培養条件は、フィーダー細胞を含む培地中で、前記１つ以上のＢ細胞含有画分を培養することを含み、ここで
   （ａ）前記フィーダー細胞は照射済みＥＬ４細胞であり；
   （ｂ）前記培養培地は活性化Ｔ細胞の馴化培地を含み；
   （ｃ）前記濃縮Ｂ細胞は１％〜５％の活性化ウサギＴ細胞の馴化培地を含有する培地で培養され；かつ
   （ｄ）前記培養は少なくとも５〜７日間行われる；
   （ｉｖ）目的の抗原に結合する単一の抗体を産生する、結果として得られたクローン性Ｂ細胞集団を検出し、これにより抗原特異的Ｂ細胞を含むクローン性Ｂ細胞集団を同定すること；
   （ｖ）結合相手への抗原結合に対するアゴニスト作用もしくはアンタゴニスト作用、特定の標的細胞型の増殖の誘発もしくは阻害、標的細胞の溶解の誘発もしくは阻害、または抗原に関与する生物学的経路の誘発もしくは阻害から選択される少なくとも１つの所望の機能特性を有する抗原特異的抗体を産生するＢ細胞を含むクローン性抗原特異的Ｂ細胞集団を同定するために、前記工程（ｉｖ）にて同定されたクローン性抗原特異的Ｂ細胞集団をスクリーニングすること；
   （ｖｉ）工程（ｖ）または（ｖｉ）の後に異なるクローン性Ｂ細胞培養物から得た抗原特異的Ｂ細胞をプールすること；
   （ｖｉｉ）前記工程（ｉｖ）または工程（ｖ）もしくは工程（ｖｉ）を経て得た抗原特異的Ｂ細胞を、染色後のＢ細胞の陽性の選択を容易にする少なくとも１つの標識及び陰性の選択を容易にする少なくとも１つの標識で染色すること、ここで前記陰性抗原特異的Ｂ細胞選択方法は、Ｔｈｙ１．２に特異的な、照射済みＥＬ４細胞を染色する第１の標識と、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む、生存不能細胞を染色する第２の標識とでＢ細胞を染色することを含むフローサイトメトリーを使用して、すべての生存可能な非ＥＬ４細胞を分取することを含み、さらに前記陽性抗原特異的Ｂ細胞選択方法は、特定の種のＩｇＧに特異的な標識抗体を含む種特異的Ｂ細胞を染色する第１の標識で染色することにより、フローサイトメトリーを使用して、すべての生存可能な種特異的Ｂ細胞を分取することを含む；ならびに
   （ｖｉｉｉ）前記プールし染色した抗原特異的Ｂ細胞を、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）または免疫磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を用いるフローサイトメトリーにより、他の染色しプールした抗原特異的Ｂ細胞と比較して別個の物理学的性質（ＦＳＣ／ＳＳＣ集団）を有する分取後の生存可能な非ＥＬ４細胞集団を選択することにより、分取およびゲーティングし、それにより少なくとも１つの所望の機能特性を有する抗原特異的抗体をそれぞれ産生する抗原特異的Ｂ細胞の精製された集団を単離すること；
   を含む前記方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、
   （ｉｘ）工程（ｖｉｉｉ）で得た精製された抗原特異的Ｂ細胞によって発現される抗原特異的抗体の可変配列の増幅を容易にする、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の反応媒体に、前記精製された抗原特異的Ｂ細胞を入れること；
   （ｘ）前記増幅させた抗原特異的抗体の可変配列をコードする核酸の配列を決定すること；
   （ｘｉ）配列決定工程（ｘ）の前または後に、前記増幅させた抗原特異的抗体の可変配列をコードする核酸またはその変異体を発現させ、抗体ポリペプチドを作製すること；及び
   （ｘｉｉ）前記発現させた抗体ポリペプチドのうち目的の抗原に結合する抗体ポリペプチドを決定すること；
   によって、可変軽鎖領域及び可変重鎖領域をコードする、抗原特異的抗体の可変配列をクローニングすることをさらに含む、
   前記方法。
3. 請求項１または２に記載の方法であって、
   （ａ）前記濃縮工程（ｉｉ）が、前記宿主から単離された少なくとも１つのＢ細胞画分を、固体マトリックスまたは担体に直接的または間接的に付着させた抗原と接触させることによる、抗原特異的Ｂ細胞のアフィニティー精製を含み、ここで前記固体マトリックスが磁気ビーズ、カラムを含み、かつ、前記抗原が、前記固体マトリックスもしくは固体担体に直接的に付着しているか、またはストレプトアビジン、アビジンもしくはニュートロアビジンを介して前記固体マトリックスもしくは担体に間接的に付着しており、所望の抗原が直接的もしくは間接的に付着された前記固体マトリックスもしくは担体に結合するＢ細胞を単離する；
   （ｂ）前記濃縮工程（ｉｉ）が、（１）前記宿主から単離された少なくとも１つのＢ細胞画分とビオチン標識抗原を合わせること、（２）前記Ｂ細胞／ビオチン標識抗原の構成物を洗浄すること、（３）前記（１）または（２）のＢ細胞／ビオチン標識抗原の構成物にストレプトアビジンビーズを導入すること、（４）前記ストレプトアビジンビーズ／Ｂ細胞／ビオチン標識抗原の構成物をカラムに通すこと、及び（５）前記カラムを洗浄して、前記結合したＢ細胞を前記カラムから溶出させ、これにより、濃縮された抗原特異的Ｂ細胞集団を得ること、を含み；
   （ｃ）前記濃縮工程（ｉｉ）が、（１）ビオチン標識抗原とストレプトアビジンビーズを合わせること、（２）前記ビオチン標識抗原／ストレプトアビジンビーズの構成物をカラムに通すこと、（３）前記カラムを洗浄して、ビオチン標識抗原で被覆したビーズを前記カラムから溶出させること、（４）前記宿主から単離された少なくとも１つのＢ細胞画分と前記被覆ビーズを合わせること、（５）前記Ｂ細胞と被覆ビーズの混合物をカラムに通すこと、及び（６）前記カラムを洗浄して、前記結合したＢ細胞を前記カラムから溶出させ、これにより、濃縮された抗原特異的Ｂ細胞集団を得ること、を含み；あるいは、
   （ｄ）前記濃縮法が、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも１つまたは前記濃縮法の組み合わせを含み、前記濃縮法を少なくとも１回繰り返すことにより、濃縮された抗原特異的Ｂ細胞集団となる、前記方法。
4. 工程（ｉｉｉ）で培養された前記濃縮抗原特異的Ｂ細胞が、マルチウェルプレートで培養され、各ウェルが２５〜２００個の濃縮Ｂ細胞を含有し；照射済みＥＬ４細胞及びＴ細胞上清（ＴＳＮ）とマルチウェルプレートの各ウェル中で混合される、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記抗原認識検出工程（ｉｖ）が、下記工程の１つ以上を行うことにより、抗原反応性上清を含むマルチウェルプレートの個々のウェルを特定するために、前記培養した濃縮Ｂ細胞から上清を取り、前記上清を評価し、それにより抗原特異的Ｂ細胞を含有するウェルを検出することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法：
   （ａ）前記上清をＥＬＩＳＡによって評価し；
   （ｂ）前記濃縮Ｂ細胞を５〜７日間培養した後の抗原特異的ＩｇＧの産生及び総ＩｇＧ産生量について前記上清を評価し；
   （ｃ）（１）抗種Ｆａｂでプレートをコーティングすること、（２）培養したＢ細胞から得た上清を前記プレートに添加すること、及び（３）抗種ＩｇＧを用いて前記上清中の総ＩｇＧを検出することによって、総ＩｇＧ産生量について前記上清を評価し、ここで前記抗種Ｆａｂが抗ウサギＦａｂで、抗種ＩｇＧが抗ウサギＩｇＧであり；かつ／または
   （ｄ）（１）非標識抗原でプレートをコーティングすること、もしくはビオチン標識抗原でストレプトアビジンプレートをコーティングすること、（２）培養したＢ細胞から得た上清を前記プレートに添加すること、及び（３）抗種ＩｇＧを用いて前記上清中の抗原特異的ＩｇＧを検出することによって、抗原特異的ＩｇＧ産生について前記上清を評価し；ここで、前記抗種ＩｇＧが抗ウサギＩｇＧであり；
   ここで、マルチウェルプレート中の抗原特異的ウェルと総ＩｇＧウェルの比が、Ｂ細胞濃縮とクローン性とに相関する。
6. 前記機能活性スクリーニング工程（ｖ）が、Ｔ１１６５細胞の増殖を誘発もしくは阻害するか、ＴＦ１細胞の増殖を誘発もしくは阻害するか、またはＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞におけるｃＡＭＰ産生を誘発もしくは阻害する抗原特異的抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞を含有するウェルを特定するために、抗原特異的機能性アッセイを使用して抗原反応性上清を評価することをさらに含む、
   請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. （ａ）前記ＥＬＩＳＡスクリーニングによる抗原反応性上清を別のプレートに移し、凍結する；または
   （ｂ）１つ以上の凍結及び保存工程が前記方法工程の１つ以上の間に存在し、凍結または保存媒体の添加を含む、
   請求項５に記載の方法。
8. （ａ）抗原特異的抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞を含有する異なる個々のウェルを染色及び細胞分取の前に合わせるか、または（ｂ）類似の機能特性を有する抗原特異的抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞を含有する異なる個々のウェルを染色及び分取の前に合わせる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 工程（ｉ）が、免疫付与から２０〜９０日後、または免疫付与から５０〜６０日後に、前記宿主からＢ細胞を取得することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ゲーティング工程が、未染色細胞の自家蛍光に基づいてゲートを設けることを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。