CN115166241B - 一种同时筛选记忆b细胞和浆细胞的高效筛选技术及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术及应用，涉及免疫学筛选技术领域。本发明高效筛选技术如下：将Oleyl‑PEG4000‑NHS与金黄色葡萄球菌A蛋白偶联，得到Oleyl‑PEG4000‑NHS‑SPA；用荧光物质标记特异性抗原，得到荧光物质‑特异性抗原；将Oleyl‑PEG4000‑NHS‑SPA加入待筛选细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；将荧光物质‑特异性抗原加入到上述处理后的待筛选细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；加入不完全培养基，分选待筛选细胞，得到记忆B细胞和浆细胞。本发明的高效筛选技术能够同时筛选记忆B细胞和浆细胞，且本发明高效筛选技术不受种属限制，可以筛选人类和多种哺乳动物的记忆B细胞和浆细胞。

Description

一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术及应用
技术领域
本发明涉及免疫学筛选技术领域，尤其涉及一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术及应用。
背景技术
单克隆抗体是由单一克隆B淋巴细胞杂交瘤产生的、识别抗原分子某一特定抗原决定簇，具有高度特异性的抗体。单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少等特性，目前已广泛应用于检验医学的诊断试剂、蛋白质提纯和肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术等方面，目前单克隆抗体已经成为解决生物学、医学等诸多领域上的重要手段。
1975年，德国学者Kohler和Milstein发明了杂交瘤技术，成功将骨髓瘤细胞和产生特异性抗体的B淋巴细胞融合成杂交瘤细胞，这种合成的杂交瘤细胞可产生针对某一种特定抗原决定簇的单克隆抗体。1986年鼠源单克隆抗体药物Muromonab的上市拉开了单克隆抗体发展的序幕，随后的50年里，单克隆抗体药物经历了鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体四个阶段，产生了抗体偶联药物、抗体融合蛋白、单域抗体等多种新型抗体药物，标志着免疫疗法黄金时代的开启。单克隆抗体的推陈出新归根于单克隆抗体技术的不断发展与创新。目前广泛应用的单克隆抗体制备技术有：杂交瘤技术、噬菌体展示技术、天然全人源库技术和单个B细胞技术，其中单个B细胞技术，是近年来新发展的一类快速制备单克隆抗体的技术。
单个B细胞技术也叫单个B细胞抗体制备技术，是根据每一个B细胞只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，以及每一个B细胞只产生一种特异性抗体的特性，从免疫动物组织或外周血中分离单核细胞，然后通过荧光抗原结合B细胞膜上的特异性BCR将抗原特异性B细胞染色，通过流式分选和单细胞测序获得抗体基因序列，然后在真核细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。这种方法保留了重链和轻链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、全天然源性的特点，也成为了目前快速开发单克隆抗体的重要策略。
随着单个B细胞技术的发展，新型单个B细胞的高效精准筛选技术为制备特异性较高的抗体提供更好的平台，采用单个B细胞技术制备单克隆抗体中，需要筛选和分离单个B细胞，B细胞通常来源于免疫动物组织或者外周血中分离的浆细胞和记忆B细胞，目前对于细胞的筛选常用的方法将细胞染色后再进行筛选，现有细胞染色技术通常是采用细胞表面荧光检测法1(参照Li,X.；Bian,H.；Yu,S.A Rapid Method forAntigen-SpecificHybridoma Clone Isolation.Analytical Chemistry 2018,90(3),2224-2229.)，通过一种两亲性物质将抗原偶联在抗体分泌的细胞的表面，抗体分泌细胞分泌的抗体会被偶联在其表面的抗原捕获，再加入荧光标记的抗人IgG Fc二抗结合被抗原捕获的抗体，可将抗体分泌细胞染色。采用上述通过细胞表面荧光检测法筛选分泌特异性抗体的浆细胞时，会受到多方面的限制，首先这种细胞染色方法对二抗的种属性存在限制，需要根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗，并且二抗需要与一抗的类别和亚型相匹配。其次这种染色方法对于不能分泌抗体的记忆B细胞无法进行有效染色，以至于无法通过细胞表面荧光检测法同时分离筛选浆细胞和记忆B细胞，导致筛选效率较低。
发明内容
针对背景技术提出的问题，本发明的目的在于提出一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，能够同时对B淋巴细胞和浆细胞进行染色，从而能同时筛选记忆B细胞和浆细胞，同时，本发明高效筛选技术不受种属限制，可以筛选人类和多种哺乳动物的记忆B淋巴细胞和浆细胞，解决了现有荧光检测法在筛选浆细胞时存在种属性限制的问题，同时解决了现有荧光检测法能以对记忆B细胞进行染色和筛选的问题。
本发明的另一目的在于提出一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术的应用，能够筛选得到记忆B细胞和浆细胞。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，包括以下步骤：
(1)将Oleyl-PEG4000-NHS与金黄色葡萄球菌A蛋白偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-SPA；
(2)用荧光物质标记特异性抗原，得到荧光物质-特异性抗原；
(3)将Oleyl-PEG4000-NHS-SPA加入待筛选细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；
(4)将荧光物质-特异性抗原加入到步骤(3)中处理后的待筛选细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；
(5)在步骤(4)中处理后的待筛选细胞中加入不完全培养基，分选待筛选细胞，得到记忆B细胞和浆细胞。
进一步的，在所述步骤(3)中，所述Oleyl-PEG4000-NHS-SPA的浓度为0.05～0.15mg/mL；
按照48孔细胞培养板计算，所述Oleyl-PEG4000-NHS-SPA的添加量为每孔50～150μL。
进一步的，在所述步骤(4)中，采用不完全培养基对荧光物质-特异性抗原进行稀释，再将稀释后的荧光物质-特异性抗原加入到步骤(3)中处理后的待筛选细胞中进行培养；
所述荧光物质-特异性抗原的稀释倍数为100倍，按照48孔细胞培养板计算，所述荧光物质-特异性抗原的添加量为每孔50～150μL。
进一步的，在所述步骤(2)中，特异性抗原为猪流行性腹泻病毒N蛋白，或新型冠状病毒S蛋白的受体结合域肽段。
进一步的，在所述步骤(2)中，所述荧光物质为异硫氰酸荧光素和四甲基异氰酸罗达明中的任意一种。
进一步的，所述步骤(3)中培养的时间为40～90min。
进一步的，所述步骤(4)中细胞培养的时间为30～60min。
进一步的，在所述步骤(5)的操作方法如下，在步骤(4)中处理后的待筛选细胞中加入不完全培养基，使用单细胞挑取仪观察荧光下的细胞并挑取阳性细胞，或者使用流式细胞仪分选细胞，得到记忆B细胞和浆细胞。
上述的同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术的应用，其特征在于，用于筛选得到记忆B细胞和浆细胞。
上述技术方案具有以下有益效果：本技术方案同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，通过将Oleyl-PEG4000-NHS与金黄色葡萄球菌A蛋白(简称SPA)偶联得到Oleyl-PEG4000-NHS-SPA，使得本技术方案的高效筛选技术可以同时染色特异性记忆B细胞和分泌特异性抗体的浆细胞，从而能同时筛选记忆B细胞和浆细胞，由于SPA能与人及多种哺乳动物的IgG1、IgG2和IgG4分子的Fc段非特异性结合，且结合后的IgG分子Fab段仍能与抗原特异结合，使得本技术方案的高效筛选技术不受种属限制，可以筛选人类和多种哺乳动物的记忆B细胞和浆细胞；同时，由于现有高效筛选技术是通过荧光标记二抗与特异性抗体结合染色，因淋巴细胞表面存在Fc受体，可以与二抗的Fc端结合，容易造成假阳性结果，而本方案是通过荧光标记抗原与被捕获在金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)上的特异性分泌抗体结合而使细胞染色，无需使用二抗，可以避免二抗的特异性不强与细胞膜上Fc受体结合造成假阳性的结果。
附图说明
图1是本发明一个实施例的高效筛选技术中Oleyl-PEG4000-NHS-SPA-特异性分泌抗体-特异性荧光标记抗原染色的原理图；
图2是B淋巴细胞BCR特异性染色原理图；
图3为实施例1流式细胞仪分析阴性细胞结果图；
图4为实施例1流式细胞仪分析阳性细胞结果图；
图5为实施例2细胞染色后阳性细胞挑取前的结果图；
图6为实施例2细胞染色后阳性细胞挑取后的结果图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。
一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，包括以下步骤：
(1)将Oleyl-PEG4000-NHS与金黄色葡萄球菌A蛋白偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-SPA；
(2)用荧光物质标记特异性抗原，得到荧光物质-特异性抗原；
(3)将Oleyl-PEG4000-NHS-SPA加入待筛选细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；
(4)将荧光物质-特异性抗原加入到步骤(3)中处理后的待筛选细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；
(5)在步骤(4)中处理后的待筛选细胞中加入不完全培养基，分选待筛选细胞，得到记忆B细胞和浆细胞。
值得说明的是，本技术方案的同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，通过将Oleyl-PEG4000-NHS与金黄色葡萄球菌A蛋白(简称SPA)偶联得到Oleyl-PEG4000-NHS-SPA，使得本技术方案的高效筛选技术可以同时染色特异性记忆B细胞和分泌特异性抗体的浆细胞，从而能同时筛选记忆B细胞和浆细胞，由于SPA能与人及多种哺乳动物的IgG1、IgG2和IgG4分子的Fc段非特异性结合，且结合后的IgG分子Fab段仍能与抗原特异结合，使得本技术方案的高效筛选技术不受种属限制，可以筛选人类和多种哺乳动物的记忆B细胞和浆细胞；同时，由于现有高效筛选技术是通过荧光标记二抗与特异性抗体结合染色，因淋巴细胞表面存在Fc受体，可以与二抗的Fc端结合，容易造成假阳性结果，而本方案是通过荧光标记抗原与被捕获在金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)上的特异性分泌抗体结合而使细胞染色，无需使用二抗，可以避免二抗的特异性不强与细胞膜上Fc受体结合造成假阳性的结果。
Oleyl-PEG4000是指平均分子量约为4000的一端为油性的聚乙二醇，Oleyl-PEG4000-NHS是指Oleyl-PEG4000与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)偶联得到的偶联物，Oleyl-PEG4000-NHS是一种两亲性物质，其一端是亲脂性的，能与细胞膜结合，另一端的PEG聚合物是亲水性的，其末端连接的-COO-NHS是经NHS活化过的羧基，可以与金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)的氨基结合，形成Oleyl-PEG4000-NHS-SPA，浆细胞分泌的特异性抗体被SPA捕获在细胞膜表面，通过荧光标记抗原的特异性结合，筛选出特异性的单个浆细胞(原理图如图1所示)，并且通过荧光标记抗原与记忆B细胞表面的BCR结合(BCR即B细胞抗原受体，是一种位于B细胞表面的负责特异性识别及结合抗原的细胞表面分子)，可将表面具有特异性BCR的记忆B细胞染色(原理图如图2所示)，最后通过分选后获得单个记忆B细胞和浆细胞。本技术方案的高效筛选技术能够同时对记忆B细胞和浆细胞进行染色，能够有效提高筛选效率。
具体的，在步骤(2)中，当抗原是非完全抗原时，先将非完全抗原与载体蛋白偶联，再与荧光物质偶联；当抗原是完全抗原时，将抗原与荧光物质偶联即可。
值得指出的是，本技术方案中记忆B细胞即记忆B淋巴细胞。
进一步的说明，在所述步骤(3)中，所述Oleyl-PEG4000-NHS-SPA的浓度为0.05～0.15mg/mL；
按照48孔细胞培养板计算，所述Oleyl-PEG4000-NHS-SPA的添加量为每孔50～150μL。
值得说明的是，若步骤(3)中Oleyl-PEG4000-NHS-SPA的浓度过低或者是添加量过少，会导致待筛选细胞表面捕获的抗体浓度过低，从而导致细胞荧光值过低，不易筛选；若Oleyl-PEG4000-NHS-SPA的浓度过高或添加量过多，会造成物料的浪费。
具体来说，采用基本培养基稀释Oleyl-PEG4000-NHS-SPA，使其浓度控制在0.05～0.15mg/mL。
在所述步骤(3)中，Oleyl-PEG4000-NHS-SPA的浓度为0.1mg/mL，按照48孔细胞培养板计算，每孔的添加量为100μL，此时待筛选细胞表面捕获的抗体浓度较合适，有利于进行筛选。
进一步的说明，在所述步骤(4)中，采用不完全培养基对荧光物质-特异性抗原进行稀释，再将稀释后的荧光物质-特异性抗原加入到步骤(3)中处理后的待筛选细胞中进行培养；
所述荧光物质-特异性抗原的稀释倍数为100倍，按照48孔细胞培养板计算，所述荧光物质-特异性抗原的添加量为每孔50～150μL。
值得指出的是，不完全培养基的组成如下：链霉素和青霉素的混合液与RPMI1640培养基按体积比为1：99配比混合得到，其中，链霉素和青霉素的混合液中，链霉素和青霉素的浓度分别为1U/mL。
优选的，在所述步骤(2)中，特异性抗原为猪流行性腹泻病毒N蛋白，或新型冠状病毒S蛋白的受体结合域肽段。猪流行性腹泻比病毒N蛋白是检测常用的靶点，新型冠状病毒S蛋白的受体结合域肽段是抗病毒常用的靶点。
进一步的说明，在所述步骤(2)中，所述荧光物质为异硫氰酸荧光素和四甲基异氰酸罗达明中的任意一种。
进一步的说明，所述步骤(3)中培养的时间为40～90min。
值得说明的是，步骤(3)中细胞培养的时间会影响细胞表面的Oleyl-PEG4000-NHS-SPA数量和浆细胞分泌抗体的数量，均会影响筛选效果，若培养时间过短，会导致连接到细胞表面的Oleyl-PEG4000-NHS-SPA的数量过少，导致捕获分泌抗体不足，从而导致一些阳性细胞被漏选，造成假阴性；若培养时间过长，则造成分泌抗体量多，结合到非抗体分泌细胞，造成假阳性。
优选的，步骤(3)中培养的时间为60min。
进一步的说明，所述步骤(4)中细胞培养的时间为30～60min。
本技术方案的步骤(4)是为了等待荧光物质-特异性抗原与分泌的抗体结合，若培养的时间过短可能会导致结合数量少，容易造成假阴性；若培养的时间过长，会导致非特异性结合，造成假阳性筛选。
进一步的说明，在所述步骤(5)的操作方法如下，在步骤(4)中处理后的待筛选细胞中加入不完全培养基，使用单细胞挑取仪观察荧光下的细胞并挑取阳性细胞，或者使用流式细胞仪分选细胞，得到记忆B细胞和浆细胞。
本发明是通过单细胞挑取仪挑取或流式细胞仪分选细胞，获得单个特异性的记忆B细胞和分泌特异性抗体的浆细胞，具有高效、快速和低成本的优点。
上述的同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术的应用，用于筛选得到记忆B细胞和浆细胞。
本技术方案可以同时对特异性记忆B淋巴细胞和分泌特异性抗体的浆细胞进行染色，本技术方案的高效筛选技术不受种属限制，可以筛选人类和多种哺乳动物的记忆B淋巴细胞和浆细胞，通过采用单细胞挑取仪或者流式分选特异性性记忆B淋巴细胞和分泌特异性抗体的浆细胞，具有高效、快速和低成本的优点。
下面结合实施例进一步阐述本技术方案。
实施例1
本实施例同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，包括以下步骤：
(1)将Oleyl-PEG4000-NHS与金黄色葡萄球菌A蛋白偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-SPA，操作方法如下：
①称取1mg的Oleyl-PEG4000-NHS与1mL的PBS加入到玻璃瓶，置于冰上搅拌；
②吸取207uL的SPA缓慢加入①中，冰上搅拌6小时以上，得到Oleyl-PEG4000-NHS-SPA溶液；
③将获得的Oleyl-PEG4000-NHS-SPA溶液用超滤管超滤，除去没有偶联的SPA和Oleyl-PEG4000-NHS，再将超滤后的溶液进行过滤除菌，置于4℃保存；
(2)用荧光物质(猪流行性腹泻病毒N蛋白)标记特异性抗原，得到荧光物质-特异性抗原，操作方法如下：
①将1mg猪流行性腹泻病毒N蛋白溶于0.5mL交联反应液(0.756gNaHCO3、0.106gNaCO3、0.736gNaCl、ddH2O定容至100ml，pH为8.7)中，加入1mg的异硫氰酸荧光素(FITC)，混匀，4℃避光过夜(8h以上)
②加入1/100体积的交联反应终止液(终浓度为50mM NH4Cl)，4℃避光静置2h；
③进行超滤，除去未结合的FITC；
④测定蛋白质浓度；
(3)将Oleyl-PEG4000-NHS-SPA加入待筛选细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞，操作方法如下：
①小鼠免疫：按照文献“邝燕齐,莫梅君,何红玲,周金柱,周如月,郭霄峰.PEDVN蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立[J].华南农业大学学报,2020,41(05):27-35.”中提供的方法免疫小鼠；
②获取小鼠脾脏细胞，使用96孔培养板的细胞，弃上清，不完全培养基洗涤两次；
③用基本培养基稀释抗原复合物Oleyl-PEG4000-NHS-SPA至其浓度为0.1mg/mL，每孔加入100μL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱孵育60min，弃上清，不完全培养基洗涤两次；
(4)用不完全培养基稀释荧光物质-特异性抗原100倍后，加入到步骤(3)中处理后的待筛选细胞中，每孔加入100μL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱孵育40min，弃上清，不完全培养基洗涤两次；
(5)在步骤(4)中处理后的待筛选细胞中加入150μL不完全培养基，荧光显微镜观察可见光和荧光下的细胞，使用流式细胞仪分选细胞，获得特异性单个记忆B细胞和浆细胞。
具体的，通过单细胞测序技术，对所筛选的细胞进行单细胞测序。(参照文献“Viant,C.；Escolano,A.；Chen,S.T.；Nussenzweig,M.C.,Sequencing,cloning,andantigen binding analysis ofmonoclonal antibodies isolated from single mouse Bcells.STAR Protocols 2021,2(2),100389.”)，经过单细胞测序后比对分析，结果如下图3和图4所示。其中，图3为流式细胞仪分析阴性细胞结果图，图4为流式细胞仪分析阳性细胞结果图，图3和图4中圈内部分(P1处)表示淋巴细胞群，图3中圈内部分表示未被染色的阴性细胞，图4中圈内部分表示被染色后的特异性记忆B细胞和浆细胞，这两种细胞正是我们所需要的阳性细胞，由此可见本实施例可以同时对特异性记忆B细胞和分泌特异性抗体的浆细胞进行染色。
实施例2
本实施例同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，包括以下步骤：
(1)将Oleyl-PEG4000-NHS与金黄色葡萄球菌A蛋白偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-SPA，操作方法如下：
①称取1mg的Oleyl-PEG4000-NHS与1mL的PBS加入到玻璃瓶，置于冰上搅拌；
②吸取207uL的SPA缓慢加入①中，冰上搅拌6小时以上，得到Oleyl-PEG4000-NHS-SPA溶液；
③将获得的Oleyl-PEG4000-NHS-SPA溶液用超滤管超滤，除去没有偶联的SPA和Oleyl-PEG4000-NHS，再将超滤后的溶液进行过滤除菌，置于4℃保存；
(2)用荧光物质标记特异性抗原，特异性抗原为新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)肽段(简称S-RBD)，得到荧光物质-特异性抗原，操作方法如下：
①将1mg的S-RBD溶于0.5mL交联反应液中，加入1mg的异硫氰酸荧光素(FITC)，混匀，4℃避光过夜(8h以上)
②加入1/100体积的交联反应终止液(终浓度为50mM NH4Cl)，4℃避光静置2h；
③进行超滤，除去未结合的FITC；
④测定蛋白质浓度；
(3)将Oleyl-PEG4000-NHS-SPA加入待筛选细胞(外周血单个核细胞)中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞，操作方法如下：
①获取外周血单个核细胞(PBMC)，参照文献“Stephenson,E.,Reynolds,G.,Botting,R.A.et al.Single-cell multi-omics analysis of the immune response inCOVID-19.Nat Med 27,904–916(2021).”
②获取PBMC后，使用96孔培养板的细胞，弃上清，不完全培养基洗涤两次；
③用基本培养基稀释抗原复合物Oleyl-PEG4000-NHS-SPA至其浓度为0.1mg/mL，每孔加入100μL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱孵育60min，弃上清，不完全培养基洗涤两次；
(4)用不完全培养基稀释荧光物质-特异性抗原100倍后，加入到步骤(3)中处理后的待筛选细胞中，每孔加入100μL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱孵育40min，弃上清，不完全培养基洗涤两次；
(5)在步骤(4)中处理后的待筛选细胞中加入150μL不完全培养基，荧光显微镜观察可见光和荧光下的细胞，使用单细胞挑取仪挑取细胞，获得特异性单个记忆B细胞和浆细胞。其中，图5为本实施例细胞染色后阳性细胞挑取前结果图，图6为本实施例细胞染色后阳性细胞挑取后结果图，从图5和图6可知，本实施例可以同时对特异性记忆B细胞和分泌特异性抗体的浆细胞进行染色，同时，使用单细胞挑取仪挑取细胞，能够获得特异性单个记忆B细胞和浆细胞。
具体的，通过单细胞测序技术，对所筛选的细胞进行单细胞测序，经过单细胞测序后比对，验证其准确度。
实施例3
本实施例同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，包括以下步骤：
(1)将Oleyl-PEG4000-NHS与金黄色葡萄球菌A蛋白偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-SPA，操作方法如下：
①称取1mg的Oleyl-PEG4000-NHS与1mL的PBS加入到玻璃瓶，置于冰上搅拌；
②吸取207uL的SPA缓慢加入①中，冰上搅拌6小时以上，得到Oleyl-PEG4000-NHS-SPA溶液；
③将获得的Oleyl-PEG4000-NHS-SPA溶液用超滤管超滤，除去没有偶联的SPA和Oleyl-PEG4000-NHS，再将超滤后的溶液进行过滤除菌，置于4℃保存；
(2)用荧光物质标记特异性抗原，特异性抗原为新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)肽段(简称S-RBD)，得到荧光物质-特异性抗原，操作方法如下：
①将1mg的S-RBD溶于0.5mL交联反应液中，加入1mg的四甲基异氰酸罗达明(TRITC)，混匀，4℃避光过夜(8h以上)
②加入1/100体积的交联反应终止液(终浓度为50mM NH4Cl)，4℃避光静置2h；
③进行超滤，除去未结合的TRITC；
④测定蛋白质浓度；
(3)将Oleyl-PEG4000-NHS-SPA加入待筛选细胞(外周血单个核细胞)中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞，操作方法如下：
①获取外周血单个核细胞(PBMC)，参照文献“Stephenson,E.,Reynolds,G.,Botting,R.A.et al.Single-cell multi-omics analysis of the immune response inCOVID-19.Nat Med 27,904–916(2021).”
②获取PBMC后，使用96孔培养板的细胞，弃上清，不完全培养基洗涤两次；
③用基本培养基稀释抗原复合物Oleyl-PEG4000-NHS-SPA至其浓度为0.15mg/mL，每孔加入50μL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱孵育90min，弃上清，不完全培养基洗涤两次；
(4)用不完全培养基稀释荧光物质-特异性抗原100倍后，加入到步骤(3)中处理后的待筛选细胞中，每孔加入100μL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱孵育60min，弃上清，不完全培养基洗涤两次；
(5)在步骤(4)中处理后的待筛选细胞中加入150μL不完全培养基，荧光显微镜观察可见光和荧光下的细胞，使用单细胞挑取仪挑取细胞，获得特异性单个记忆B细胞和浆细胞。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将Oleyl-PEG4000-NHS与金黄色葡萄球菌A蛋白偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-SPA；
（2）用荧光物质标记特异性抗原，得到荧光物质-特异性抗原；
（3）将Oleyl-PEG4000-NHS-SPA加入待筛选细胞中，于37℃、5%CO2的条件下进行培养，培养的时间为40~90min，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；所述Oleyl-PEG4000-NHS-SPA的浓度为0.05~0.15mg/mL；按照48孔细胞培养板计算，所述Oleyl-PEG4000-NHS-SPA的添加量为每孔50~150μL；
（4）将荧光物质-特异性抗原加入到步骤（3）中处理后的待筛选细胞中，于37℃、5%CO2的条件下进行培养，细胞培养的时间为30～60 min，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；
（5）在步骤（4）中处理后的待筛选细胞中加入不完全培养基，分选待筛选细胞，得到记忆B细胞和浆细胞。
2.根据权利要求1所述的同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，采用不完全培养基对荧光物质-特异性抗原进行稀释，再将稀释后的荧光物质-特异性抗原加入到步骤（3）中处理后的待筛选细胞中进行培养；
所述荧光物质-特异性抗原的稀释倍数为100倍，按照48孔细胞培养板计算，所述荧光物质-特异性抗原的添加量为每孔50~150μL。
3.根据权利要求1所述的同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，特异性抗原为猪流行性腹泻病毒N蛋白，或新型冠状病毒S蛋白的受体结合域肽段。
4.根据权利要求3所述的同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，所述荧光物质为异硫氰酸荧光素和四甲基异氰酸罗达明中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选方法，其特征在于，在所述步骤（5）的操作方法如下，在步骤（4）中处理后的待筛选细胞中加入不完全培养基，使用单细胞挑取仪观察荧光下的细胞并挑取阳性细胞，或者使用流式细胞仪分选细胞，得到记忆B细胞和浆细胞。
6.权利要求1-5任意一项所述的同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选方法的应用，其特征在于，用于筛选得到记忆B细胞和浆细胞。
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