CN115125251B - 一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞筛选技术领域。本发明公开了一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，该方法包括以下步骤：(1)制备Oleyl‑PEG4000‑NHS‑二抗；(2)封闭外周血单个核细胞或CD138+细胞的细胞膜表面的Fc受体；(3)接着加入Oleyl‑PEG4000‑NHS‑二抗，进行培养；(4)将荧光物质标记的抗原加入处理后的细胞悬液中；(5)经分选式流式细胞仪富集抗原特异性的细胞后，使用单细胞显微挑取仪挑取强阳性细胞；(6)对强阳性细胞进行DNA提取，得到特异性全人单克隆抗体基因。本发明的方法获取强阳性的浆细胞的方法简单快捷，用到的设备成本低，且能获得特异性全人单克隆抗体基因。
Description
技术领域
本发明涉及细胞筛选技术领域，尤其涉及一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法。
背景技术
单克隆抗体(后简称单抗)是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单抗具有纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少等特点，目前是多种人类疾病诊断及治疗的重要工具。
特异性全人单抗基因的获取方法主要有杂交瘤+抗体人源化技术、噬菌体展示技术、单个B细胞技术和转基因小鼠技术等。其中，通过单个B细胞技术获取特异性单抗基因具有高通量、亲和力高、特异性强等优点，故在抗病毒治疗、神经性疾病治疗、免疫疾病治疗等方面显出了独特的优势和良好的应用前景。单个B细胞技术的原理是根据每一个B细胞只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，以及每一个B细胞只产生一种特异性抗体的特性，从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性B细胞，通过单细胞测序技术获得单个B细胞中特异性单抗可变区重链和轻链基因序列，然后在相应的表达系统表达即可获得具有生物活性的单抗。
尽管相对于杂交瘤+抗体人源化技术、噬菌体展示技术，利用单个B细胞技术获得特异性全人单抗基因具有许多突出优点，但是现有的单个B细胞技术获取特异性单抗基因仍然存在以下问题：(1)基于BCR染色单个B细胞技术，是利用荧光标记的抗原对B细胞的BCR进行染色的方法，BCR即B细胞抗原受体，是一种位于B细胞表面的负责特异性识别及结合抗原的细胞表面分子，只能通过检测BCR的特异性来获得BCR基因的可变区基因序列，虽然BCR基因的可变区与其分泌的抗体的可变区序列一样，但是该方法不能获得全抗体基因序列；(2)成熟的浆细胞表面没有BCR，所以该方法难以获得亲和力更高的浆细胞中的特异性抗体基因。单个浆细胞技术相对于基于BCR染色单个B细胞技术，其可以克隆到抗体的全基因序列，且亲和力更高。但目前现有的单个浆细胞技术仍然还有较大的改进空间：(1)单个浆细胞培养困难，单个细胞分泌的抗体量极低，需要约一周的培养时间才能检测到；(2)该方法不但需要使用分选式流式细胞仪，还需要使用单细胞培养和检测的大型贵重设备，成本更加昂贵。
发明内容
本发明的目的在于提出一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，以Oleyl-PEG4000-NHS-二抗的一端与浆细胞连接，另一端结合该浆细胞分泌的抗体，当分泌的抗原特异性的抗体与荧光物质标记的抗原结合后，当荧光物质被相应的激发光激发时，浆细胞能发出特定颜色的光，发光强度越大，表示浆细胞分泌抗体的能力越强，从而可分辨强阳性的浆细胞，可从强阳性的浆细胞得到特异性全人单克隆抗体基因。本发明的方法获取强阳性的浆细胞的方法简单快捷，用到的设备成本低，且能获得特异性全人单克隆抗体基因。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将Oleyl-PEG4000-NHS与二抗偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-二抗；
(2)在外周血单个核细胞或CD138+细胞中加入Fc受体封闭剂，封闭细胞膜表面的Fc受体；
(3)接着加入Oleyl-PEG4000-NHS-二抗，之后进行细胞培养，培养过程中外周血单个核细胞或CD138+细胞分泌抗原特异性的抗体lgG，之后，洗去未被Oleyl-PEG4000-NHS-二抗捕获的lgG，得到细胞膜上连接有Oleyl-PEG4000-NHS-二抗-lgG的外周血单个核细胞或CD138+细胞，即得到处理后的细胞；
(4)以荧光物质标记抗原；
(5)将荧光物质标记的抗原加入处理后的细胞悬液中，进行培养，处理后的细胞的细胞膜表面形成Oleyl-PEG4000-NHS-二抗-lgG-荧光物质标记的抗原；
(6)经分选式流式细胞仪富集抗原特异性的外周血单个核细胞或CD138+细胞后，使用单细胞显微挑取仪挑取强阳性浆细胞；
(7)对强阳性浆细胞进行DNA提取，得到特异性全人单克隆抗体基因。
进一步的，所述抗原为新冠病毒刺突S蛋白。
进一步的，所述二抗为羊抗人lgGFc、兔抗人IgGFc或SPA蛋白。
进一步的，所述步骤(1)中，偶联方法为：将Oleyl-PEG4000-NHS溶液在4℃下搅拌，边搅拌边加入二抗，持续搅拌8h，进行超滤和过滤除菌，得到Oleyl-PEG4000-NHS-二抗。
进一步的，所述步骤(2)中，Fc受体封闭剂为CD16/32抗体、羊抗人lgG，封闭条件为：4℃和30min。
进一步的，所述步骤(4)中，荧光物质为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白和AlexaFluor488中的一种。
进一步的，所述步骤(3)中，细胞培养的培养条件为：37℃、5％CO2和30min。
进一步的，所述步骤(5)中，细胞培养的培养条件为：37℃、5％CO2和30min。
进一步的，所述步骤(5)中，采用1640不完全培养基进行培养。
上述高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法所得的特异性全人单克隆抗体基因的用途：应用于制备抗体。
本发明提供的技术方案可以包括以下有益效果：
本发明通过一种两亲性物质Oleyl-PEG4000-NHS能够快速简便染色分泌抗原特异性抗体的浆细胞，经分选式流式细胞仪分选富集抗原特异性的浆细胞后，使用单细胞显微挑取仪挑取强阳性浆细胞，利用单细胞测序技术即可获得亲和力更高的浆细胞中的特异性抗体基因，缩短了高亲和力特异性抗体基因的筛选时间，不依赖单细胞培养和检测的大型贵重设备，减少了人力和成本。
附图说明
图1是本发明一个实施例的荧光下经单细胞显微挑取仪挑取后毛细管中的抗原特异性的浆细胞效果图；
图2是本发明一个实施例的可见光下经单细胞显微挑取仪挑取后毛细管中的抗原特异性的浆细胞效果图。
图3是本发明一个实施例的将偶联后的Oleyl-PEG4000-NHS-二抗进行SDS-PAGE电泳后的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提供一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将Oleyl-PEG4000-NHS与二抗偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-二抗；
(2)在外周血单个核细胞或CD138+细胞中加入Fc受体封闭剂，封闭细胞膜表面的Fc受体；
(3)接着加入Oleyl-PEG4000-NHS-二抗，之后进行细胞培养，培养过程中外周血单个核细胞或CD138+细胞分泌抗体lgG，之后，洗去未被Oleyl-PEG4000-NHS-二抗捕获的lgG，得到细胞膜上连接有Oleyl-PEG4000-NHS-二抗-lgG的外周血单个核细胞或CD138+细胞，即得到处理后的细胞；
(4)以荧光物质标记抗原；
(5)将荧光物质标记的抗原加入到处理后的细胞悬液中，用1640不完全培养基进行培养，处理后的细胞的细胞膜表面形成Oleyl-PEG4000-NHS-二抗-lgG-荧光物质标记的抗原；
(6)经分选式流式细胞仪富集抗原特异性的外周血单个核细胞或CD138+细胞后，使用单细胞显微挑取仪挑取强阳性细胞(如图1和图2所示)；
(7)对强阳性浆细胞进行DNA提取，得到特异性全人单克隆抗体基因。
本发明的方法中，采用两亲物质Oleyl-PEG4000-NHS中的羧基可与二抗的氨基相结合，另一端结合细胞膜，将Oleyl-PEG4000-NHS-二抗加入细胞悬液中孵育，孵育后，Oleyl-PEG4000-NHS-二抗的一端连接在细胞膜上，同时，Oleyl-PEG4000-NHS-二抗中的二抗与外周血单个核细胞或CD138+细胞分泌的抗原特异性的抗体lgG结合，在加入荧光物质标记的抗原后，在细胞膜表面形成Oleyl-PEG4000-NHS-二抗-lgG-荧光标记的抗原，经分选式流式细胞仪富集抗原特异性的外周血单个核细胞或CD138+细胞后，以单细胞显微挑取仪挑取强阳性细胞，对强阳性浆细胞进行DNA提取，即可获得特异性全人单克隆抗体基因。该方法无需经过繁琐的实验筛选，就能快速得到高亲和力的全人抗体基因，效率获得极大提高。
需要说明的是，结合在细胞膜表明的Oleyl-PEG4000-NHS-二抗首先捕捉到该外周血单个核细胞或CD138+细胞分泌出抗原特异性的抗体lgG，Oleyl-PEG4000-NHS-二抗结合抗体量的能够表征该浆细胞分泌抗原特异性抗体的能力，因此，外周血单个核细胞或CD138+细胞分泌的抗原特异性抗体与荧光物质标记的抗原结合后，细胞的荧光强弱能体现该细胞分泌抗原特异性抗体的能力。
另一方面，本发明的方法中，先封闭细胞膜表面的Fc受体，再加入Oleyl-PEG4000-NHS-二抗结合浆细胞分泌的抗体lgG，用荧光物质标记的抗原结合分泌的抗体来筛选阳性细胞，能防止浆细胞分泌的抗体结合在不分泌抗体的细胞细胞膜表面的Fc受体上而出现假阳性，有利于高效获得特异性全人单克隆抗体基因。
上述高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法所得的特异性全人单克隆抗体基因应用于抗体的制备。
需要说明的是，外周血单个核细胞(PBMC)主要包括淋巴细胞、单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞等，其中浆细胞来源于PBMC中的淋巴细胞；CD138是浆细胞的关键标志物，经磁珠富集的CD138+细胞即为浆细胞。
更进一步说明，抗原为新冠病毒刺突S蛋白，由此，本发明的方法所得的特异性全人单克隆抗体基因能够编辑对应新冠病毒刺突S蛋白的抗体，有利于进行新冠病毒治疗药物的研发。
更进一步说明，二抗为羊抗人lgGFc、兔抗人IgGFc或SPA蛋白，这几种二抗均与人浆细胞分泌的人lgGFc有较好的结合效果，较为易得且价格便宜，在实际应用中可大大降低成本，降低本发明方法实施的难度。
更进一步说明，步骤(1)中，偶联方法为：将Oleyl-PEG4000-NHS溶液在4℃下搅拌，边搅拌边加入二抗，继续搅拌8h，在该时间下，二抗能与Oleyl-PEG4000-NHS充分偶联，该偶联方法中温度和时间的设置能够为操作人员提供更为充足的处理细胞(即从外周血获取外周血单个核细胞或CD138+细胞，以及对细胞进行封闭的操作)的时间，进行超滤和过滤除菌，得到Oleyl-PEG4000-NHS-二抗，得到的Oleyl-PEG4000-NHS-二抗在4℃下保存备用。该偶联方法简单快捷。
更进一步说明，步骤(4)中，荧光物质为异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)和AlexaFluor488中的一种。这三种荧光物质均能在相应的激发光下有很好的发光效果。
更进一步说明，步骤(2)中，Fc受体封闭剂为CD16/32抗体、羊抗人lgG，封闭条件为：4℃和20～30min。该封闭条件下，CD16/32抗体和羊抗人lgG能够充分结合细胞膜表面的Fc受体。需要说明的是，培养时间不能过短，否则会发生CD16/32抗体和羊抗人lgG不能充分结合细胞膜表面的Fc受体，造成由于封闭不完全而出现的假阳性。优选的，封闭时间为30min。
更进一步说明，步骤(3)中，细胞培养的培养条件为：37℃、5％CO2和20～30min。该培养条件下，Oleyl-PEG4000-NHS-二抗能够充分的结合在细胞膜表面，浆细胞有足够的抗体分泌时间，使得结合在细胞膜表面的Oleyl-PEG4000-NHS-二抗能够充分的捕获浆细胞分泌的抗体。需要说明的是，培养时间不能过短，否则会发生浆细胞分泌的特异性抗体过少的情况，从而造成阳性率低，但是若培养时间过长，可能会增加非特异性结合，造成假阳性。优选的，培养时间为30min。需要说明的是，在培养完成后，需要用1640不完全培养基洗涤，洗去未与细胞膜表面的Oleyl-PEG4000-NHS-二抗结合的lgG。
更进一步说明，步骤(5)中，用1640不完全培养基进行培养的培养条件为：37℃、5％CO2、30～60min。在该培养条件下，荧光物质标记的抗原能充分与浆细胞分泌的抗原特异性的抗体结合。
需要说明的是，步骤(3)和步骤(5)中，在培养完成后用不完全培养基洗涤细胞。不完全培养基由链霉素和青霉素混合液与RPMI1640培养基按体积比1：99配比混合得到，其中，链霉素和青霉素混合液中链霉素和青霉素的浓度分别为1U/ml。
以下通过实施例进一步阐述本发明。
实施例1
一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1：抽取接种新冠疫苗加强针7天的志愿者和未接种过新冠疫苗的志愿者，外周血各10ml(使用肝素抗凝管)，Ficoll-Paque法提取PBMC，即在离心管中加入淋巴细胞分离液，取抗凝外周血与无菌PBS按照1:1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1:1:1，水平离心400g，30分钟，离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，去除部分上层液体，余下约1mL，用移液器插到云雾层狭窄带，吸取单个核细胞(PBMC)，置入另一离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g，10分钟，洗涤细胞两次，末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，加入10mLPBS，离心300g，10分钟，洗涤细胞两次，末次离心后，弃上清，加入1640不完全培养基重悬细胞，细胞计数，用1640不完全培养基将细胞稀释至107个/ml；
步骤2：称取10mgOleyl-PEG4000-NHS溶于1mlPBS，用PBS稀释到1mg/ml，得到1mg/mlOleyl-PEG4000-NHS溶液；接着取500μl1mg/mlOleyl-PEG4000-NHS加入试剂瓶中在4℃下搅拌，取500μl1mg/ml羊抗人lgGFc缓慢加入Oleyl-PEG4000-NHS溶液中，边搅拌边加入，持续搅拌8h后用30KD的超滤管超滤，得到Oleyl-PEG4000-NHS-羊抗人lgGFc溶液；接着进行过滤除菌，置于4℃保存备用；
通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)和紫外可见分光扫描对得到的Oleyl-PEG4000-NHS-羊抗人lgGFc溶液进行鉴定，其中，SDS-PAGE测试的结果图如图3所示，图3中，1号泳道是蛋白阶梯，2号、3号和4号泳道为Oleyl-PEG4000-NHS-羊抗人lgGFc溶液样品，从图3中可以看出，3个Oleyl-PEG4000-NHS-羊抗人lgGFc溶液样品均在同一梯度显色，结果表明的确获得Oleyl-PEG4000-NHS-羊抗人lgGFc；
步骤3：将分离得到的PBMC洗涤后用1ml的不完全培养基重悬，进行细胞计数，细胞浓度为5×107个/ml，用不完全培养基将PBMC浓度稀释为107个/ml；
向体积为400ul，PBMC浓度为107个/ml的EP管中加入8ul0.5mg/mlCD16/32抗体和1ul5mg/ml的羊抗人lgG，在4℃冰箱中，封闭30min；
步骤4：向步骤3的EP管中加入400μl0.3mg/mlOleyl-PEG4000-NHS-羊抗人lgGFc，置于细胞培养箱孵育30min，弃上清，用不完全培养基洗两次，用400ul不完全培养基重悬；
步骤5：488标记S蛋白，具体的，在58.4uL待标记的S蛋白(0.8mg/ml)中加入5.84uLModifier试剂，轻柔混匀，打开AlexaFluor488偶联混合物的瓶盖，用移液枪头吸取蛋白样本(已加入Modifier试剂)，直接加在冻干粉材料上。用移液枪头吸液体混匀，重复一次或两次，轻柔重悬，盖上瓶盖，室温下避光放置15分钟，孵育15分钟之后，在5.84uL反应中的蛋白内加入5.84uLQuencher试剂,轻柔混匀，5分钟后偶联蛋白即可使用，无需纯化；
步骤6：向步骤4的重悬的细胞悬液中加入400μl 8ug/ml的488标记S蛋白，置于细胞培养箱孵育30min，弃上清，用不完全培养基洗两次，最后用400ul流式缓冲溶液重悬；
步骤7：分选式流式细胞仪分选富集抗原特异性的浆细胞；
步骤8：对于分选式流式细胞仪分选富集得到的抗原特异性的浆细胞，使用单细胞显微挑取仪挑取荧光较强的强阳性细胞；
步骤9：对单个的强阳性细胞(特异单个B细胞)测序，得到特异性全人单克隆抗体基因。
通过overlappingPCR的方法将得到的特异性全人单克隆抗体基因连入载体表达载体中。将重组后的表达载体导入宿主细胞进行表达，进行抗体生产和纯化。
实施例2
一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1：抽取接种新冠疫苗加强针7天的志愿者和未接种过新冠疫苗的志愿者，外周血各10ml(使用肝素抗凝管)，Ficoll-Paque法提分别取PBMC，同实施例1；
步骤2：用磁珠富集PBMC中的CD138+细胞，即加入autoMACS运转缓冲液(90ul缓冲液/107个细胞)重悬细胞，加入10ul0.5mg/ml的CD16/32抗体封闭Fc受体，4℃反应20min，加入CD138分选磁珠(10ulCD138分选磁珠/107个细胞)，充分混匀后4℃反应15min；加入autoMACS运转缓冲液(1-2mlautoMACS运转缓冲液/107个细胞)，300g离心10min，弃上清；重复上一步骤，加入500ulautoMACS运转缓冲液重悬细胞；用磁分离器分离CD138+细胞；细胞计数；用10mLPBS稀释CD138+细胞，360g离心5min，弃上清；重复上一步骤，用1640不完全培养基重悬细胞，细胞浓度为1×105个/100ul；
步骤3：向体积为400ul，CD138+细胞浓度为105个/100ul的EP管中加入8ul0.5mg/mlCD16/32抗体和1ul5mg/ml的羊抗人lgG，在4℃冰箱中，封闭30min，封闭CD138+细胞表面Fc受体；
步骤4：制备Oleyl-PEG4000-NHS-羊抗人IgGFc，同实施例1；
步骤5：向经封闭Fc受体后的CD138+细胞加入Oleyl-PEG4000-NHS-羊抗人IgGFc，细胞培养箱培养30min，300g离心5min，弃上清，洗涤3次，用400ul不完全培养基重悬细胞；用400ul不完全培养基重悬细胞；
步骤6：488标记S蛋白，同实施例1；
步骤7：向细胞悬液中，加入400μl8ug/ml的488标记S蛋白，置于细胞培养箱孵育30min，300g离心5min，洗涤3次弃上清，用400ul不完全培养基重悬细胞；
步骤8：分选式流式细胞仪分选富集抗原特异性的浆细胞；
步骤9：对于富集得到的抗原特异性的浆细胞，使用单细胞显微挑取仪挑取荧光较强的强阳性细胞；
步骤10：对单个的强阳性细胞(特异单个B细胞)测序，得到特异性全人单克隆抗体基因。
通过overlappingPCR的方法将得到的特异性全人单克隆抗体基因连入载体表达载体中。将重组后的表达载体导入宿主细胞进行表达，进行抗体生产和纯化。
根据本发明实施例的一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法的其他构成等以及操作对于本领域普通技术人员而言都是已知的，这里不再详细描述。
在本说明书的描述中，参考术语“实施例”、“示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）将Oleyl-PEG4000-NHS与二抗偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-二抗；
（2）在CD138＋细胞中加入Fc受体封闭剂，封闭细胞膜表面的Fc受体；
（3）向步骤（2）得到的细胞悬液中加入Oleyl-PEG4000-NHS-二抗，之后进行细胞培养，培养过程中CD138＋细胞分泌抗体lgG，之后，洗去未被Oleyl-PEG4000-NHS-二抗捕获的lgG，得到细胞膜上连接有Oleyl-PEG4000-NHS-二抗-lgG的CD138＋细胞；
（4）以荧光物质标记抗原，所述抗原为新冠病毒刺突S蛋白；
（5）将荧光物质标记的抗原加入到步骤（3）处理后的细胞悬液中，进行培养，处理后的细胞的细胞膜表面形成Oleyl-PEG4000-NHS-二抗-lgG-荧光物质标记的抗原，处理后的细胞为抗原特异性的CD138＋细胞；
（6）步骤（5）所得的细胞悬液经分选式流式细胞仪富集抗原特异性的CD138＋细胞后，使用单细胞显微挑取仪挑取强阳性细胞；
（7）对强阳性细胞进行DNA提取，得到特异性全人单克隆抗体基因。
2.根据权利要求1所述的高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，其特征在于，所述二抗为羊抗人lgGFc、兔抗人IgGFc或SPA蛋白。
3.根据权利要求1所述的高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，偶联方法为：将Oleyl-PEG4000-NHS溶液在4℃下搅拌，边搅拌边加入二抗，持续搅拌8h，进行超滤和过滤除菌，得到Oleyl-PEG4000-NHS-二抗。
4.根据权利要求1所述的高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，Fc受体封闭剂为CD16/32抗体和羊抗人lgG，封闭温度为4℃，封闭时间为30min。
5.根据权利要求1所述的高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，荧光物质为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白和AlexaFluor488中的一种。
6.根据权利要求1所述的高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，细胞培养的培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5%，培养时间为30min。
7.根据权利要求1所述的高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，细胞培养的培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5%，培养时间为30min。
8.根据权利要求1所述的高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，采用1640不完全培养基进行培养。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104977408A (zh) * | 2015-06-15 | 2015-10-14 | 暨南大学 | 一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用 |
| CN105308457A (zh) * | 2013-03-14 | 2016-02-03 | 斯坦福大学托管董事会 | 检测供体特异性抗体的方法和用于实施所述方法的系统 |
| CN110879293A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-03-13 | 暨南大学 | 一种筛选分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法与应用 |
| CN111925439A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 快速筛选新冠病毒rbd特异性全人源中和性单克隆抗体方法 |
| CN112469816A (zh) * | 2018-06-06 | 2021-03-09 | 加拿大干细胞技术公司 | 用于富集髓系来源的抑制细胞的试剂盒、组合物和方法 |
| CN114441752A (zh) * | 2020-11-03 | 2022-05-06 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种筛选方法 |
| CN114560940A (zh) * | 2020-11-27 | 2022-05-31 | 缔码生物科技(武汉)有限公司 | 一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用 |
-
2022
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105308457A (zh) * | 2013-03-14 | 2016-02-03 | 斯坦福大学托管董事会 | 检测供体特异性抗体的方法和用于实施所述方法的系统 |
| CN104977408A (zh) * | 2015-06-15 | 2015-10-14 | 暨南大学 | 一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用 |
| CN112469816A (zh) * | 2018-06-06 | 2021-03-09 | 加拿大干细胞技术公司 | 用于富集髓系来源的抑制细胞的试剂盒、组合物和方法 |
| CN110879293A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-03-13 | 暨南大学 | 一种筛选分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法与应用 |
| CN111925439A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 快速筛选新冠病毒rbd特异性全人源中和性单克隆抗体方法 |
| CN114441752A (zh) * | 2020-11-03 | 2022-05-06 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种筛选方法 |
| CN114560940A (zh) * | 2020-11-27 | 2022-05-31 | 缔码生物科技(武汉)有限公司 | 一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CD8 cell counting in whole blood by a paper-based time-resolved fluorescence lateral flow immunoassay;Wei Xiao, et al;Analytica chimica acta;第1179卷(1179(2021)338820);1-10 * |
| Wei Xiao, et al.CD8 cell counting in whole blood by a paper-based time-resolved fluorescence lateral flow immunoassay.Analytica chimica acta.2021,第1179卷(1179(2021)338820),1-10. * |
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