CN1181347C - 鉴别产生lgG的细胞与不产生lgG的细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种用于区分产生IgG细胞和不产生IgG细胞的新方法，这种方法是通过用流式细胞术区分荧光标记的包胶化的产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞。

Description

鉴别产生IgG的细胞与不产生IgG的细胞的方法
本发明涉及一种新的鉴别产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞的方法，所述的方法通过用流式细胞术鉴别荧光标记的包胶化的产生IgG和不产生IgG的细胞。
在人类医学的诊断和治疗目的中越来越广泛地使用免疫球蛋白G(IgG)(Scheinberg，D.A.和Chapman，P.B.，Birch，J.R.和Lennox，E.S.编辑，1995，Wiley，45-105)。
使用细胞包胶化从而区分产生IgG细胞和不产生IgG的细胞的鉴别方法是已知的(Gray，F.等人，1995，J.Imm.Meth.，182，155-163；Kenney，J.S.等人，1995，Bio/Tech 13，787-790)，而且这些方法可以从如One Cell SystemInc.(Cambridge，MA)购置的。然而，所述的这些方法有一些缺陷，即它们对于鉴别高产细胞系没有足够的分辨率。
本发明的目的是提供一种改良的方法，其具有较高的分辨率，可以鉴别高水平的高产量细胞系。
权利要求1所述的新方法实现了这一目的。
在本发明中，如下将产生IgG的细胞与不产生IgG的细胞区分开：
a)将产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞包埋于基质中，该基质含有针对产生的IgG的捕捉剂；
b)在产生IgG的时间段中培育所述的基质；
c)荧光标记所述的产生的IgG；
d)用流式细胞术鉴别荧光标记的、包胶化的产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞；
其中所述的捕捉剂是蛋白质A和/或蛋白质G。
图1显示了包胶化的细胞产生的IgG捕捉的流程图。
图2显示了与抗体相比用蛋白质A作为捕捉剂对IgG的捕捉
图3显示了蛋白质A的工作浓度。
图4显示了培养物中非产生性GS-NSO细胞的百分比与流式细胞术估计的百分比之间的比较。
细胞
按IgG的表达和分泌的效率，将用于本发明的细胞定义为产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞。不产生IgG的细胞可产生和分泌少量的IgG(至多为约0.1-0.2μg/ml)或根本不表达或分泌IgG。产生IgG的细胞可表达和分泌约0.2μg/ml以上的IgG。用于鉴别产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞的优选细胞是哺乳动物的细胞。
本发明可以使用各种哺乳动物细胞。可以使用的哺乳动物细胞的实例为浆细胞瘤(plastocytoma)、骨髓瘤、杂交瘤、中国仓鼠卵巢(CHO)、纤维肉瘤或鼠源性或人源性淋巴母细胞瘤样细胞(lymphoblastoid)。本发明优选使用的哺乳动物细胞是鼠骨髓瘤细胞。鼠骨髓瘤细胞的实例是NSO和用谷氨酰胺-合成酶转染的NSO(GS-NSO)。特别有用的是GS-NSO。
IgG
由本发明使用的细胞产生的IgG可以是人、猪、豚鼠、牛、山羊、绵羊、猴、马、小鼠、大鼠或仓鼠的IgG。也可以产生人源化的嵌合IgG。优选产生人IgG。另外，细胞也可以产生IgG的片段，如Fc-、Fab-、(Fab)2-片段。
包埋化
可用如WO82/02561所述的标准方法或One Cell Systms Inc提供的流程将产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞包埋化。
通常，将细胞加入含有包胶化(encapsulation)基质(如可从One CellSystem Inc.，购得的CelBioGelTM包胶化基质)的液化凝胶。包胶化基质通常由琼脂糖构成。可以将基质生物素化。特别优选的是生物素化的琼脂糖基质。
加入到液化凝胶的细胞的优选数量在105到108细胞/ml之间，优选的为5×105到107细胞/ml之间。
用乳化基质和微滴形成剂(如CelISys 101TM微滴形成剂)可以进一步处理在液化的包胶化基质中的细胞，从而产生凝胶微滴(GMD)，每个GMD含有至少一个细胞，所述的乳化基质通常由油(宜为矿物油)构成，如CelMixTM乳化基质。可以从One Cell Systems Inc.购得CelMixTM乳化基质和CellSys 101TM微滴形成剂。
在产生GMD之前或之后，可以将捕捉剂蛋白质A和/或蛋白质G结合于基质。较佳地，在产生GMD之后结合蛋白质A和/或蛋白质G。结合的发生通常是首先将基质与接头一起培育，随后与蛋白质A和/或蛋白质G一起培育。当基质是生物素化的时，优选的接头是亲和素，如链霉亲和素。优选使用的是链霉亲和素。可以将蛋白质A和/或蛋白质G生物素化，从而当接头是亲和素时可以结合于该接头。较佳地，使用生物素化的蛋白质A和/或蛋白质G，尤其是生物素化的蛋白质A。一般加入基质或GMD中的蛋白质A和/或蛋白质G的量为0.001到5mg/ml之间，宜为0.01到0.1mg/ml之间。
产生IgG的培育
产生IgG的培育时间取决于细胞的具体的IgG的产率以及所用的细胞类型。当使用鼠骨髓瘤细胞时，培育时间通常为1到15分钟之间，较佳地为3到12分钟。
培育温度还取决于细胞的具体的IgG的产率以及所用的细胞类型。当使用鼠骨髓瘤细胞时，培育在2℃到15℃之间，较佳地2℃到8℃之间的温度进行。一般在培育过程中加入对照IgG，以确认捕捉剂的结合。
标记和用流式细胞术筛选
任何识别产物IgG而且偶联于荧光化合物的物质都可用作荧光标记物。通常，可以使用缀合于荧光化合物且对产物IgG是特异性的抗体，或缀合于荧光化合物且对产物IgG特异性的抗原。较佳地，使用缀合于荧光化合物且对产物IgG特异性的抗体。对产物IgG特异性的抗体可以是选自A、D、E、G或M类的免疫球蛋白的免疫球蛋白，而且该抗体应衍生自与表达和分泌IgG的细胞无关的宿主细胞。较佳地，对产生的IgG特异性的抗体也是IgG。当表达和分泌产物IgG的细胞是鼠细胞时，标记抗体抗原是如从山羊衍生的IgG。
荧光化合物的实例为藻红蛋白、异硫氰酸荧光素、得克萨斯红、罗丹明或花青染料。可以将缀合于藻红蛋白且对产物IgG特异性的IgG用作优选荧光标记物。含有荧光化合物且对产物IgG特异性的IgG是可以购得的。
当将对IgG特异性的抗体用作标记物时，宜在标记前将封阻剂加至包胶化的细胞中，从而防止分泌的其它产物发生结合并减少非特异性结合。可以将胎牛血清或脱脂乳溶液(如Marvel)用作优选的封阻血清。
按One Cell System Inc.提供的流程选择进行常规流式细胞术条件，以鉴别产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞。通常，用线性正向散射(FSc)和对数侧向散射(SSc)曲线上显现的散射特性来检测空GMD和含有至少一个细胞的GMD。首先测试阴性对照(无捕捉剂)，调节FSc和SSc直到在FSc/SSc图的中央附近出现占有群体。调节临界鉴别器以减少空GMD的出现。单占有亚群体被选通(gated)，并在适合荧光染料的检测PMT(光电倍增管)(设为对数状态)上的分析荧光值。调节荧光检测PMT，使群体位于荧光频率分布图的第一对数十进位(first log decade)。然后测试阳性和待测样品，通常每份样品收集10,000个值。由流式细胞术进行的鉴别可以是分析性或制备性的。任选地，在流式细胞术之前可以将GMD染色，从而通过将细胞与染色化合物(如碘化丙锭)接触而筛选活细胞。
在产生IgG的细胞和不产生IgG细胞的群体中得到的产生IgG的细胞的检测极限，通常为总细胞数量的95和99.99％之间，较佳地为总细胞数量的99到99.5％之间。
本发明的另一主题是含有作为IgG捕捉剂的生物素化的蛋白质A和/或蛋白质G的生物素化的琼脂糖基质，其中用亲和素接头将生物素化的蛋白质A和/或蛋白质G连接于基质。较佳地，基质含有蛋白质A作为IgG捕捉剂，且亲和素接头是链霉亲和素。
实施例
实施例1
细胞和基质的制备
在无菌闪烁管中将15ml CelMixTM 200cs乳化基质平衡至37℃。在200×g离心10分钟得到106个活GS-NSO细胞。将这些细胞重悬浮于100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在400μl液化的CelBioGelTM中加入25μl无菌过滤处理过的Pluronic acid，并在37℃平衡凝胶3分钟。将重悬浮的细胞加入CelBioGelTM中，轻微混合，并在37℃培育3分钟。用1ml移液管将此CelBioGelTM细胞混合物以螺旋方式(从底部到顶部)逐滴加至试管中温热的乳化基质油中，以避免加入气泡。用CellSys 101TM微滴形成剂乳化此混合物，其在室温以2100rpm离心1分钟，在冰浴中以2100rpm离心1分钟和在冰浴中以1100rpm离心10分钟从而产生25μm微滴。将包胶化的混合物分配到2个15ml的锥形管中，小心地用5ml PBS覆盖。在600g离心此溶液10分钟，从而可以看见GMD沉淀。用移液管除去油相，抽出上清液，混合这两支管中的沉淀物，并加入2ml PBS。将每份10ml PBS加入15ml锥形管中，并用GMD覆盖。在400×g离心此混合物(如果需要，重复该步骤)。除去上清液，将细胞重悬浮于合适的溶液中。
A.链霉亲和素桥接
将GMD沉淀物重悬浮于2.3ml冷DMEM培养液中，评估10μl等份的％占有率。将0.3ml用作“未染色”的阴性对照。80μl 1mg/ml的链霉亲和素用2ml冷L15细胞培养基(Biowhittaker)稀释，并加到2ml GMD中，用旋转仪在室温培育15分钟。用10ml冷PBS洗涤此混合物(在400×g离心5分钟，2次)。
B.生物素化的捕捉IgG的结合
将GMD悬浮于2.3ml L15培养基(0.3ml用作“未捕捉”的阴性对照)。用2ml冷L15稀释80μl 1.0mg/ml生物素化的蛋白质A捕捉剂(Pierce)。将稀释的捕捉剂加入2ml GMD中，用旋转仪在室温培育此溶液15分钟，用冷PBS洗涤(在400×g离心5分钟，2次)，并重悬浮于3.3ml冷L15中(0.3ml用作阳性对照)。
C.包胶化细胞的分泌培育
将GMD加入25ml冷L15中，4℃在T75烧瓶中平衡，并在4℃培育10分钟。用0.8ml L15稀释6μl对照IgG(Chromepure公司的人IgG)。在各对照中加入0.4ml稀释的对照IgG，室温用旋转仪培育此溶液15-30分钟。培育结束后，用冷PBS/2％胎牛血清(FBS)洗涤所有样品(在400×g离心5分钟)二次。将分泌样品重悬浮于2ml冷L15+5％FBS中，将对照悬浮于1ml冷L15+5％FBS中。
D.用检测抗体染色
用2ml冷L15+5％FBS稀释40μl(用于样品)和4μl(用于对照)0.5mg/ml山羊抗人IgG-抗-(f(ab’)2-R-藻红蛋白(R-PE)检测抗体。将40μl制备物加入GMD，并将4μ1制备物中的1μl加入各对照。室温(暗处)旋转此混合物15分钟。用10ml冷PBS/2％FBS洗涤2次。(在400×g离心5分钟)并将各样品重悬浮于2.0mlPBS中，用于流式细胞术。
E.流式细胞术分析包胶化的细胞
所用的装置是Coulter EPICS ELITE细胞分选仪，其配有488nm氩离子激光器(预先用Flowcheck荧光球校准)。用线性正向散射(FSc)和对数侧向散射(SSc)曲线上呈现的散射特性来检测空的GMD和被占有的GMD。首先测试阴性对照(无捕捉剂)，调节FSc和SSc直到在FSc/SSc图的中央附近出现占有群体。调节临界鉴别器以减少空GMD的出现。单占有亚群体被选通，并在适合荧光染料的检测PMT(光电倍增管)(设定为对数状态)上分析荧光值。调节荧光检测PMT，使群体位于荧光频率分布图的第一对数十进位(first log decade)。然后检测阳性和测试样品，通常每份样品收集10,000个值。
实施例2
比较分别用蛋白质A和抗体作为捕捉剂时对产物嵌合IgG的捕捉情况
将产物嵌合IgG的不同稀释液与含有生物素化的蛋白质A捕捉剂或生物素化的山羊抗-人IgG Fcγ片段特异性抗体捕捉剂的空GMD接触。在所有产物浓度下，与抗体作为捕捉剂相比，掺入蛋白质A的GMD具有高得多的荧光值(见图2)。
实施例3
测定蛋白质A的工作浓度
将GS-NS0细胞系用作产生IgG产物的包胶化的测试细胞。将不含生物素化的蛋白质A的包胶化的细胞用作阴性对照。用掺加的人IgG包胶化的细胞作为Fc阳性对照。使用1mg蛋白质A/ml PBS的原液(见图3)。

Claims (7)

1.一种鉴别产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
a)将产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞包埋于基质中，该基质含有针对产生的IgG的捕捉剂；
b)在产生IgG的时间段中培育所述的基质；
c)荧光标记所述的产生的IgG；
d)用流式细胞术鉴别荧光标记的、包胶化的产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞；
其中所述的捕捉剂是蛋白质A和/或蛋白质G，所述的不产生IgG的细胞和产生IgG的细胞是哺乳动物细胞。
2.如权利要求1所述的鉴别产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞的方法，其特征在于，所述的哺乳动物细胞是鼠骨髓瘤细胞。
3.如权利要求1-2任一所述的鉴别产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞的方法，其特征在于，其中产生的IgG是人IgG。
4.如权利要求1-2任一所述的鉴别产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞的方法，其特征在于，所述的蛋白质A和/或蛋白质G是生物素化的。
5.如权利要求2所述的鉴别产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞的方法，其特征在于，所述的产生IgG的时间过程为1-15分钟之间。
6.如权利要求2所述的鉴别产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞的方法，其特征在于，所述的培育是在2℃到15℃之间的温度进行的。
7.一种用于权利要求1所述的鉴别产生IgG的细胞和不产生IgG的细胞的方法中的生物素化琼脂糖基质，其特征在于，含有用作IgG捕捉剂的生物素化的蛋白质A和/或蛋白质G，此生物素化的蛋白质A和/或蛋白质G通过亲和素接头结合于基质。
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