JP6422075B2 - 組成物及び組成物を利用したモーター蛋白デバイス - Google Patents
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(2)上記抗体結合タンパク質は、上記(1)に記載の組成物において、プロテインAであってもよい。
(3)上記レールタンパク質は、上記(1)又は(2)に記載の組成物において、アクチンフィラメント及び微小管を構成するタンパク質から選択される1種又は2種以上であってもよい。
(4)上記レールタンパク質結合タンパク質は、上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の組成物において、ファロイジンであってもよい。
(5)上記ビオチン結合タンパク質は、上記(1)ないし(4)のいずれかに記載の組成物において、アビジン又はストレプトアビジンであってもよい。
(6)本発明に係る1つの態様は、抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、化学平衡を利用して上記担体分子から上記目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域と、を含み、上記担体分子が上記(1)ないし(5)のいずれかに記載の組成物であるモーター蛋白デバイスを提供する。
図1(a)は、本発明の一実施形態に係る組成物の構造を示す図であり、図1(b)は、本発明の一実施形態に係る組成物を介して、抗体とレールタンパク質とが結合した一例を示す図である。図1(a)及び図1(b)に示すように、本発明の第1実施形態に係る組成物1は、抗体Ab1に結合する抗体結合タンパク質10と、抗体結合タンパク質10とビオチン30aを介して結合する1又は2以上のビオチン結合タンパク質20と、ビオチン30cを介して結合し、かつ、レールタンパク質RPと選択的に結合する1又は2以上のレールタンパク質結合タンパク質40とを備え、抗体Ab1とレールタンパク質RPとを結合するコネクタとして作用する。
抗体結合タンパク質10は、抗体Ab1と特異的に結合することができ、また、1又は2以上のビオチン結合タンパク質20とビオチン30(30a〜30d)を介して結合することができるものであれば特に限定されない。抗体結合タンパク質10としては、例えば、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、プロテインLが挙げられる。なかでも、入手性・知見の多さの点から、プロテインAが好ましい。また、抗体結合タンパク質10は、タンパク質全体に限定されず、抗体結合能を持つドメイン(例えば、プロテインAにおけるBドメイン)のみを使用することができる。
ビオチン結合タンパク質20は、ビタミンB群に分類される低分子ビタミンの一種であるビオチン30と特異的に結合することができるものであれば特に限定されず、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが挙げられる。アビジン等のビオチン結合タンパク質20が複数個結合した融合タンパク質であってもよく、この融合タンパク質は、リンカーで化学的に結合されたものであってもよい。
レールタンパク質結合タンパク質40は、ビオチン30と結合能を有し、また、レールタンパク質RPと選択的に結合することができるものであれば特に限定されない。そして、レールタンパク質RPは、モータータンパク質MPに対して滑り運動を発現するタンパク質であれば特に限定されず、例えば、アクチン、アクチンフィラメント、チューブリン、微小管が挙げられる。アクチンは、マイクロフィラメントの1種であるアクチンフィラメントを構成する球状タンパク質として知られており、分子量が約42000の球形アクチンはG−アクチンと呼ばれている。また、アクチンフィラメントは、こうしたアクチンの重合体であって、螺旋状の多量体を形成する糸状の重合体である。アクチンフィラメントを構成するタンパク質には、必要に応じて、各種アクチンフィラメント結合タンパク質、アクチン調節タンパク質等を備えていてもよく、例えば、トロポミオシン、フィンブリン、α−アクチニン、フィラミン、ゲルゾリン、スペクトリンを挙げることができる。チューブリンは、微小管や中心体を構成するタンパク質であり、α、β及びγがあることが知られている。通常、α−チューブリンとβ−チューブリンが1個ずつ結合したヘテロ二量体を基本ユニットとして、繊維状に連結した微小管のプロトフィラメントを構成し、このプロトフィラメントが管状に11〜16本程度結合したものが微小管である。微小管を構成するタンパク質には、必要に応じて、微小管結合タンパク質等の微小管構成タンパク質以外のタンパク質を含んでいてもよい。
本発明の組成物1の製造方法は、例えば、(a)抗体結合タンパク質10をビオチン化する工程と、(b)レールタンパク質結合タンパク質40をビオチン化する工程と、(c)ビオチン化した抗体結合タンパク質10とビオチン化したレールタンパク質結合タンパク質40とを混合する工程と、(d)(c)工程で得られたビオチン化した抗体結合タンパク質10とビオチン化したレールタンパク質結合タンパク質40との混合液に、ビオチン結合タンパク質20を添加して混和する工程と、(e)さらにビオチン30を添加して混和する工程と、を含むことができる。この製造方法によれば、従来の製造方法と比較して、効率よく合成ができ、収率の高い、抗体Ab1とレールタンパク質RPとを結合する組成物1を得ることができる。
本発明のモーター蛋白デバイスは、抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、化学平衡を利用して上記担体分子から上記目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域とを含み、上記担体分子として組成物1を使用するものである。図2は、本発明の一実施形態に係るモーター蛋白デバイスの基本構成を例示する図である。モーター蛋白デバイス100は、捕集領域110、荷降ろし領域120を含む。これらの領域は、例えば、タンパク質を固定化可能な基板上に設けられ、緩衝溶液等で満たされる。また、当該緩衝溶液は、必要に応じ、モータータンパク質を活性化するためのATP(アデノシン3リン酸)やCaged−ATP等の誘導体を含有することができる。
輸送ユニット蛋白と、骨格筋アクチン繊維を溶媒(50mM imidazole−HCl(pH=7.4)、2.0mM MgCl2、1.0mM ATP、1mM DTT、10mMクレアチンリン酸、100U/mLクレアチンキナーゼ)中にて混合し、担体分子150となるナノ輸送繊維を得る。これを、Si半導体基板210上に15μL滴下し、さらに、2.0μLを滴下し、表面の溶液2.0μLを吸引洗浄する。Si半導体基板210上に、ジエチルアミノエチル(DEAE)イオン交換膜を装着、周囲の水分を吸引する。表面処理を行ったカバーガラスを装着し、親水性接着剤を用い、加圧して接着する。
まず、本発明の組成物1を製造した。プロテインAをpH=7.4の緩衝液に1.0mg/mL以上10.0mg/mL以下の濃度にて溶解する。プロテインAが溶解されていた溶液が以降の反応に適していない場合には、透析等による溶液置換を行った。次に、プロテインA 1.0モル当たり、ビオチンを2倍モル量添加し、4℃、1時間反応させた後、L−システインをプロテインAと当モル量添加し、反応を停止させ、ビオチン化プロテインAを回収した。
抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、化学平衡を利用して前記担体分子から前記目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域と、を含むモーター蛋白デバイス100の担体分子として、作製した組成物1を使用し、アジレント・テクノロジー社のプレシジョン インピーダンスアナライザ4294Aにインピーダンス・プローブ・キット42941Aを組み付けたものを用いて、インピーダンスの測定を試みた。該プローブをパッケージングされたモーター蛋白デバイス100のPINと接続し、インピーダンス変化を測定・評価した。代表的なタンパク質であるBSAウシ血清アルブミン(Bovine serum albumin)をモーター蛋白デバイス100上で輸送濃縮した結果、BSAの濃度に対するインピーダンス(3.16MHz)の変化を図4に示す。図4に示す通り、組成物1を用いたモーター蛋白デバイス100は、BSAの濃度変化をインピーダンスとして出力・測定できた。
本組成物1を用いて、がんセンサアレーを作製し、そのインピーダンスを計測した。まず、図3(a)に例示する、トラック状の流路を有する表面構造をもつSi半導体基板を、標準CMOSプロセスにより製作した。ここで、荷降ろし領域120と参照領域125の流路幅は1.2μm、荷積み領域90の円弧の流路幅は10μmとした。荷降ろし領域120と参照領域125の流路には、メタル配線層を利用した対向電極及び電極パッド191を形成した。さらに、トラック状流路以外のエリアにはリフトオフ用のレジストをコートした。
得られたSi半導体基板を、イソプロピルアルコールで1時間超音波洗浄し、無塵中で、60℃2時間加熱し、乾燥させた。さらに、表面コート剤(信越化学工業製、KJC7022)を0.001mg/mLに調整し、Si半導体基板にスピンコーターでコーティングした。これを無塵中で、60℃5時間加熱して乾燥させ、Si半導体基板の表面の疎水化処理を行った。さらに、70℃のNMP(N‐メチルピロリドン)溶液中でリフトオフ処理を行い、レジストを除去し、トラック内だけを疎水性になるようにした。
チップ全体を覆う粘着層付きアルミラミネートカバーフィルム所定の大きさにカット、チップ表面に張った。
26μg/mLの骨格筋ミオシンを、25mM KCl、3.0mM MgCl2、5.0mM pH緩衝液(Tris−HCl)で希釈して得たpH=8.0のモーター蛋白溶液に、カバー蛋白質20μg/mLを加えた溶液を10作製し、スポッティングディスペンサーでSi半導体基板のトラック全面に印刷した。
初期肺がんの腫瘍マーカーである、抗ヒトCEAモノクローナル抗体(1.0mg/mL)を抗体として選択し、荷降ろし領域120にスポッティングディスペンサーで印刷した。
Sephadex G−25を用い、1.0mg/mLの抗ヒトCEAモノクローナル抗体0.1mLを、50mMリン酸緩衝液にて調整した。これに本発明の組成物1を加え、輸送ユニット蛋白を調整した。
輸送ユニット蛋白と、骨格筋アクチン繊維を1:10000の割合で、溶媒(50mM imidazole−HCl(pH=7.4)、2.0mM MgCl2、1.0mM ATP、1mM DTT、10mMクレアチンリン酸、100U/mLクレアチンキナーゼ)中にて混合し、担体分子50となるナノ輸送繊維を得た。これを、Si半導体基板上に15μL滴下した。さらに、2.0μLを滴下し、表面の溶液2.0μLを吸引洗浄した。Si半導体基板上に、ジエチルアミノエチル(DEAE)イオン交換膜を装着、周囲の水分を吸引した。表面処理を行ったカバーガラスを装着し、親水性接着剤を用い、加圧して接着した。
10 抗体結合タンパク質
20 ビオチン結合タンパク質
30,30a,30b,30c,30d ビオチン
40 レールタンパク質結合タンパク質
100 モーター蛋白デバイス
110 捕集領域
120 荷降ろし領域
140 分析部
150 担体分子
160 目的分子
Ab1,Ab2 抗体
MP モータータンパク質
RP レールタンパク質
Claims (6)
- 抗体とレールタンパク質とを結合する組成物であって、
抗体結合タンパク質と、
ビオチンを介して前記抗体結合タンパク質に結合した1又は2以上のビオチン結合タンパク質と、
ビオチンを介して前記ビオチン結合タンパク質に結合した1又は2以上のレールタンパク質結合タンパク質と、を備え、
前記抗体結合タンパク質が前記抗体と結合することができ、
前記レールタンパク質結合タンパク質がレールタンパク質と選択的に結合することができることを特徴とする組成物。 - 前記抗体結合タンパク質は、プロテインAであることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記レールタンパク質は、アクチンフィラメント及び微小管を構成するタンパク質から選択される1種又は2種以上であることを特徴とする請求項1または2に記載の組成物。
- 前記レールタンパク質結合タンパク質は、ファロイジンであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ビオチン結合タンパク質は、アビジン又はストレプトアビジンあることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、
化学平衡を利用して前記担体分子から前記目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域と、を含み、
前記担体分子が請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物であることを特徴とするモーター蛋白デバイス。
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