CN112521452B

CN112521452B - 靶向干扰素γ的多肽及其应用

Info

Publication number: CN112521452B
Application number: CN202011423132.7A
Authority: CN
Inventors: 高理钱; 石子寒; 杨芬; 肖奇才; 谢刘幸; 贾艳; 李少云; 张达
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2020-12-08
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2040-12-08
Also published as: CN112521452A

Abstract

本发明公开了靶向干扰素γ的结合多肽及其应用，所述多肽的氨基酸序列为：TAKRLS、TWVKYT、VYWHFT、LTHLLV、WSYWAP、LVVKYS、VVLYYKYS、FVLYYKYS的至少一条。本发明提供的多肽具有亲和力高、特异性强的特点，具有很好的检测效果，克服了现有检测技术中运用抗体时的获取困难和易变性等特点。本发明为制备检测血液细胞因子的试剂盒提供了借鉴，有助于免疫疾病的防治及诊断。

Description

靶向干扰素γ的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及靶向干扰素的多肽及其应用，特别涉及靶向干扰素-γ(Interferon-γ)的高亲和力多肽及其在检测分析血液IFN-γ中的应用。

背景技术

干扰素(Interferon,IFN)是1957年英国科学家Alick Isaacs和Iean Lindenmann利用鸡胚绒毛尿囊研究流感干扰现象时,发现的一种能够干扰病毒繁殖的物质。Ⅱ型干扰素(IFN-γ)是一种异型糖蛋白，主要由抗原和有丝分裂原等刺激活化的CD4+Th1、CD8+T细胞及NK细胞所产生。除了以上人们所熟知的产生IFN-γ的细胞，NKT细胞、树突状细胞(DC)和巨噬细胞(MΦ)和B细胞也都能产生IFN-γ。IFN-γ与相应的IFN-γ受体结合，可发挥抗病毒、影响细胞生长分化、抗肿瘤及免疫调节等多种活性。

IFN-γ又被称为免疫调节型干扰素，它对机体免疫系统具有强大的调节作用，能广泛地使多种类型的细胞表达MHC-Ⅱ类抗原，放大和增强免疫应答的识别，诱导机体产生多种防御因子，促进T、B细胞分化和细胞毒性T细胞(CTL)成熟，刺激B细胞分泌抗体，激活单核巨噬细胞，是机体发挥免疫功能、清除体内病原体不可缺少的成分。

鉴于以上干扰素γ在细胞活动中的重要性，针对干扰素γ的检测试剂或者试剂盒具有很高的基础和的临床应用价值。当前检测干扰素γ的方法有生物学方法及免疫学方法，但传统的抗体检测方法都存在着一些缺点和不足，如生产成本高，稳定性差等。因此，设计和寻找一种更灵敏的靶向干扰素γ检测试剂/试剂盒，以及建立起一种高通量药物快速筛选方法解决上述问题将在基础理论研究和临床应用都具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有选择性靶向IFN-γ的多肽及其在作为血液检测方面的应用。此外，还提供上述靶向IFN-γ结构域的高亲和力多肽筛选方法；基于此方法能够筛选到特异性好和亲和力强的结合IFN-γ的先导多肽，并开发新一代以多肽为基础的蛋白捕捉试剂，能为日后开发诊断试剂盒打下重要的基础。

本发明第一个方面的目的在于提供靶向IFN-γ的多肽。

本发明第二个方面的目的在于提供上述多肽在检测干扰素方面的应用。

本发明第三个方面的目的在于提供上述多肽在制备干扰素检测试剂中的应用。

本发明第四个方面的目的在于提供上述多肽在制备干扰素检测试剂盒中的应用。

本发明第五个方面的目的在于提供一种检测试剂，包含上述的多肽。

本发明第六个方面的目的在于提供一种检测试剂盒，包含上述的多肽。

本发明第七个方面的目的在于提供靶向IFN-γ的多肽的筛选方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供靶向IFN-γ的多肽，靶向IFN-γ的多肽，所述多肽的序列由6到8个非天然氨基酸所组成：AA8AA7(AA6AA5AA4AA3AA2AA1)；

其中，AA1为Ser、Thr、Val或Pro中的一种，AA2为Leu、Tyr、Phe或Val中的一种，AA3为Arg、Lys、His、Leu或Trp中的一种，AA4为Lys、Val、Trp、His或Tyr中的一种，AA5为Ala、Trp、Try、Thr和Ser中的一种，AA6为Thr、Val、Leu和Trp中的一种，AA7为Val，AA8为Val或Phe中的一种。

优选地，所述多肽的氨基酸序列为TAKRLS(SEQ ID NO.1)、LVVKYS(SEQ ID NO.2)、VVLYYKYS(SEQ ID NO.3)、TWVKYT(SEQ ID NO.4)、VYWHFT(SEQ ID NO.5)、LTHLLV(SEQ IDNO.6)、WSYWAP(SEQ ID NO.7)和FVLYYKYS(SEQ ID NO.8)中的至少一种。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的多肽在检测干扰素方面的应用。

优选地，所述干扰素为IFN-γ。

进一步地，所述干扰素为血液中的干扰素。

本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的多肽在制备干扰素检测试剂中的应用。

优选地，所述干扰素为IFN-γ。

进一步地，所述干扰素为血液中的干扰素。

本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的多肽在制备干扰素检测试剂盒中的应用。

优选地，所述干扰素为IFN-γ。

进一步地，所述干扰素为血液中的干扰素。

本发明的第五个方面，提供一种检测试剂，包含本发明第一个方面所述的多肽。

本发明的第六个方面，提供一种检测试剂盒，包含本发明第五个方面所述的检测试剂。

本发明的第七个方面，提供靶向IFN-γ的多肽的筛选方法，包括以下步骤：

S1.采用一珠一化合物(OBOC)方法构建随机多肽库；

S2.将步骤S1多肽库中的多肽与IFN-γ孵育，筛选特异性结合IFN-γ的多肽。

进一步地，步骤S2中所述IFN-γ标记有荧光染料。

更进一步地，步骤S1中多肽库的多肽的序列由6到8个D-型非天然氨基酸组成：AA₈AA₇(AA₆AA₅AA₄AA₃AA₂AA₁)。其中AA₁为Ser、Thr、Val和Pro中的一种，AA₂为Leu、Tyr、Phe和Val中的一种，AA₃为Arg、Lys、His、Leu和Trp中的一种AA₄为Lys、Val、Trp、His和Tyr中的一种，AA₅为Ala、Trp、Try、Thr和Ser中的一种，AA₆为Thr、Val、Leu和Trp中的一种，AA₇为Val，AA₈为Val和Phe中的一种。

更具体地，根据本发明第七个方面所述的筛选方法，包括以下步骤：

S01.合成大批量的随机的多肽库；

S02.将多肽库与标记了染料的蛋白进行孵育后用COPAS将阳性树脂(即树脂上的多肽结合了荧光标记的蛋白而显荧光)分选出来；

S03.通过CNBr将氨基酸剪切下来后用MALDI-TOF/TOF仪器进行测序；

S04.根据测序结果设计和合成集中多肽库进行二次筛选；

S05.筛选得到靶向干扰素γ的高亲和力的多肽，使用Fmoc固相合成方法进行合成；

本发明的筛选方法，一珠一化合物(One-Bead-One-Compound,OBOC)，是运用组合化学的方法和“分-聚”(Split-Mix)策略合成一个结构多样性巨大的多肽化合物库。然后，再将多肽库中的多肽珠与目标蛋白进行孵育，COPAS分选出具有好的亲和力的肽珠后，MALDI TOF/TOF测序得到最终目标多肽及其氨基酸序列。

该筛选方法能够一次性合成一个巨大的多肽化合物库，克服了传统筛选方法步骤繁琐、实验速度慢和效率低的缺点。

该筛选方法特点是：快速建立一个无“偏好性”且种类多样性的多肽化合物库。不需要单独对化合物进行合成以及分离纯化，也可以达到快速筛选出能与IFN-γ结合的多肽。本发明还将筛选到的多肽，运用在血液中细胞因子的检测当中，为日后开发血液细胞因子检测试剂盒提供了理论基础。

本发明的有益效果是：

本发明公开了靶向干扰素γ的结合多肽及其应用，所述多肽的氨基酸序列为：TAKRLS、TWVKYT、VYWHFT、LTHLLV、WSYWAP、LVVKYS、VVLYYKYS、FVLYYKYS中的至少一种。本发明提供的多肽具有亲和力高、特异性强的特点，具有很好的检测效果，克服了现有检测技术中抗体获取困难易变性等特点。同时本发明为研发血液检测细胞因子试剂盒提供了借鉴，将有助于各种免疫疾病的防治及诊断。

本发明还提供了提供靶向IFN-γ的多肽的筛选方法，采用一珠一化合物(One-Bead-One-Compound,OBOC)，运用组合化学的方法和“分-聚”(Split-Mix)策略合成一个结构多样性巨大的多肽化合物库,然后，再将多肽库中的多肽珠与目标蛋白进行孵育，COPAS分选出具有好的亲和力的肽珠后，MALDI TOF/TOF测序得到最终目标多肽及其氨基酸序列。该方法能够一次性合成一个巨大的种类多样的多肽化合物库,克服了传统筛选方法步骤繁琐、试验速度慢和效率低等缺点。其最大的特点是：可以快速的建立一个没有任何“偏好性”且种类多样性的多肽化合物库。而不需要对化合物进行一个一个合成和分离纯化，通过此方法能够快速的筛选出于IFN-γ结合力好的多肽序列。并通过实验将多肽运用于血液中细胞因子的检测当中，为今后开发新的检测试剂盒提供借鉴。

附图说明

图1为第一次构建6肽库时筛选的多肽序列热图，A和D是第一次筛选结果，B和E是第二次筛选结果，C和F是第三次筛选结果。

图2为第一次筛选结果构建的氨基酸文库以及氨基酸结构，A为氨基酸结构，B是集中化合物库1，C是集中化合物库2。

图3为根据多肽文库筛选出来的多肽序列热图，A是集中化合物库1的结果、B是集中化合物库2的结果。

图4为在C端和在N端的筛选结果的比较图，A是对照组，B是在C端，C是在N端。N-elongation是在N端，C-elongation是在C端。

图5为将6肽延长至8肽的筛选结果热图。

图6为8条多肽蛋白浓度-相应曲线，并由曲线分析得出相应多肽与蛋白间K_D值，其中A是takrls，B是twvkyt，C是vywhft，D是lthllv，E是wsywap，F是lyykys，G是vvlyykys，H是fvlyykys。

图7为筛选出的6肽pull down的实验结果，其中Probe#1是takrls、Probe#2是twvkyt、Probe#3是vywhft、Probe#4是lthlly、Probe#5是wsywap、Probe#6是lyykys。

图8为多肽Paper Based Assay的实验结果，A是多肽lyykys，B是多肽takrls，C是多肽vvlyykys。Spiked IFN-γin serum是在血清中标记出IFN-γ蛋白，IFN-γamount(50μL)是用1000ng/mL的蛋白母液按所需浓度逐步稀释至终浓度并最终取量是50μL，Ctrl(0)是空白对照PBS缓冲液。

具体实施方式

以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

本发明在于提供一种靶向IFN-γ的高亲和力的多肽，所述多肽序列为TAKRLS、TWVKYT、VYWHFT、LTHLLV、WSYWAP、LVVKYS、VVLYYKYS、FVLYYKYS；所述多肽均为D型氨基酸。以及上述多肽在IFN-γ检测中的应用。

发明中首先选取随机构建的6肽化合物库，多肽均为D型非天然氨基酸(除半胱氨酸和甲硫氨酸)以改善天然氨基酸在体内易被水解的特性。

本发明首先将随机合成的巨大的多肽化合物库与用染料标记的目标蛋白孵育后，通过COPAS系统将带有荧光的阳性磁珠分选出来，再运用MALDI-TOF/TOF对所筛选出的多肽进行测序，对测序结果进行分析统计后选出高频出现的氨基酸。再重新构建集中多肽库进行二次筛选。再次通过分选系统将阳性结果分选出来，后用固相合成的方法将多肽合成、分离和纯化出来用于下游的验证实验。

本发明通过OBOC的筛选策略，筛选出具有选择性识别IFN-γ的结合多肽，能够大大缩短筛选时间，提高筛选效率且样本量巨大，对今后的多肽药物筛选具有重要意义和提供了一个很好的高通量药物筛选策略。

本发明通过基于OCTET的动力学测试实验，获得了多肽与靶标蛋白之间结合的K_D值，准确量化多肽与蛋白之间亲和力的大小，为细胞因子的检测提供了更为精准的数据。

本发明通过纸实验(Paper Based Assay)，进一步表征多肽的体外检测效果，确证本发明中保护的多肽在血液检测IFN-γ细胞因子中的应用。

实施例1靶向IFN-γ多肽的筛选

首先通过构建一个六肽长度的化合物库，每个位点的氨基酸都为非天然氨基酸(D-型氨基酸)中的任意一种。通过多肽自动合成仪进行多肽化合物库的合成，而后通过COPAS进行初步筛选及质谱测序后选出在每个位点出现频率较高的氨基酸，进一步构建了两个集中多肽化合物库(集中化合物库1和2)。在此基础上再进行筛选得到具有靶向性且具有较高亲和力的多肽序列并进行优化。

1)化合物库的选取和多肽合成

利用全自动多肽合成仪Titan 357(AAPPTEC)合成多肽库。通过“分裂-聚合”的方法在TentaGel S-NH2(90μm,0.29mmol/g,2.86×10⁶beads/g)树脂上合成所需多肽。步骤：首先将树脂放置在聚合容器内(CV)用NMP溶液溶胀2h，抽干溶液后加入1eq Fmoc-Met(甲硫氨酸)，2eq TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸)，5eq DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，反应30min后用NMP(N-甲基吡咯烷酮)洗涤4次。再加入含有20％哌啶/NMP溶液反应15min，脱保护，后用NMP和DCM溶液各洗4次。将磁珠彻底清洗干净后均分置18个反应容器内(RV)。在每个RV中加入一种非天然氨基酸及4eq TBTU，8eq DIEA，反应4h后用NMP清洗4次，加入20％哌啶/NMP溶液脱保护30min，用NMP和DCM溶液各洗4次。

将所有树脂放置在CV中，混匀后再次均分置18个RV中重复上述步骤，直至合成完6肽(是序列随机的多肽)。反应结束后将树脂转移至反应管中用二氯甲烷(DCM)，甲醇，水冲洗九遍后，减压干燥树脂。

2)蛋白表达纯化及蛋白染色标记

将转染重组质粒的大肠杆菌在5mL LB培养基37℃，230rpm摇床中过夜培养，次日按照1:100的比例将大肠杆菌在200mL培养基中扩大培养，大肠杆菌的生长达到OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达，IPTG的工作浓度为0.1mM。加入IPTG后在16℃，230rpm摇床中继续培养18～20h。

诱导表达结束后，将培养基在3500rpm下离心10～15min，弃去上清，收集大肠杆菌沉淀。PBS重悬沉淀后，利用超声破碎细菌外壳，之后再4000rpm、4℃离心30min，将含有蛋白的上清液加到含有Ni-NTA树脂的层析柱中，4℃下360°旋转反应1h。

反应结束后先用20mM的咪唑PBS溶液大量冲洗柱中树脂，8～10遍后，加入2mL250mM咪唑PBS溶液洗脱目标蛋白并收集，重复6～8遍。最后用超滤管换液并浓缩蛋白溶液，并测定蛋白浓度用于后续的蛋白标记。

用ZW700-1染料标记IFN-γ，将100nM的IFN-γ溶解于PBS(pH 8.0)溶液中，与溶解于DMSO中4摩尔当量的NHS活化染料混合。混合物在室温黑暗条件下孵育1h。

3)磁珠的筛选

OBOC筛选实验中用分选仪器COPAS(Complex Object Parametric Analyzer andSorter)分离出目的多肽珠。COPAS系统主要是利用荧光信号强弱的不同区别阳性和阴性的多肽珠。如果一些多肽结合蛋白的能力很强，有荧光标记的蛋白就会被结合附着在肽珠的表面，从而使肽珠具有相应的荧光。一旦检测器检测到相应的荧光，分选系统就会分离出那个阳性的肽珠到96孔板上，供后续的实验分析。

为了进行筛选，发明人将步骤1)中的树脂转移到Alltech容器(8mL，配备过滤器)中，并在封闭溶液中预培养，该封闭溶液包含(0.05％NaN3、0.05％吐温-20和1％BSA)，在PBS缓冲液(pH 7.3)中，在25℃的360°摇床上放置1h。后将液体排干，把用染料标记的蛋白添加到最终浓度为100nM的溶液中，并在4℃的360°摇瓶上孵育过夜。将液体排干，然后用封闭溶液将树脂洗涤三次，再用0.05％吐温-20在PBS缓冲液中依次洗涤三次。洗涤后，将珠子转移到COPAS Plus(Union Biometrica)的样品容器中，并用200mL PBS缓冲液(0.05％吐温20)稀释(pH7.4)。之后会对树脂进行两次分选，阳性的珠子被直接分为96锥形孔板。

4)多肽的剪切，质谱测序

用氩气吹扫96孔筛分珠板15min，然后在每孔中加入CNBr(10μL，0.5M，0.2N盐酸溶液)。经氩气/氮气吹扫15min后，将96孔板用薄膜密封，置于微波辐射下1min，所得溶液在45℃离心真空下浓缩2.5h。每孔分别加入CHCA(7μL，0.4％乙腈/水溶液(1:1))和乙腈/水(7μL，1:1，0.1％三氟乙酸(v/v))。将2.5μL混合物点在384孔MALDI板上，将得到的平板晾干15min。使用Bruker公司的ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF仪器的FlexControl软件，通过自动采集方法获得每条多肽的质谱信息。在FlexAnalysis软件中手动识别每个质谱的母峰，并将其复制到FlexControl中的数据表中，以自动获取MS/MS谱图。后用PEAKS软件对肽序列进行半自动分析。

5)基于初步筛选结果的分析及优化

在获得阳性磁珠的测序结果后，用http://weblogo.berkeley.edu网站分析得出多肽序列的柱状图，挑选出在各个位点重复出现次数较多的氨基酸，并设计出集中多肽化合物库1和2(见图1和图2)。按照步骤1)～4)再次进行多肽库的合成筛选及测序(见图3)。同时将多肽序列延长至8肽，以增加多肽的空间结构的复杂程度，来筛选出具有更好结合力的靶向干扰素γ(IFN-γ)的多肽。

本发明从6肽中选取出结合力较好的多肽序列LYYKYS，选择在其C端或N端加两个氨基酸进行筛选，筛选结果显示在N端延长肽链比在C端延长肽链结果要好(见图4)。称取25mg的树脂构建在C端或N端延长两个氨基酸的多肽文库，按照上述方法进行筛选并测序(见图5)。

6)多肽合成及动力学测试

在筛选出靶向干扰素γ(IFN-γ)、亲和力更强的多肽后，用固相合成的方法合成。

实验步骤：

反应物质的摩尔比如下，树脂：Fmoc氨基酸：TBTU：DIEA＝1:4:4:8

1.膨胀树脂：称取0.1g的Fmoc-Rink Amide树脂至反应器中(根据合成需要改变重量)，加入约2-5mL的DMF，放置0.5h-1h使树脂膨化。

2.脱Fmoc保护基团：抽滤去除管内溶剂，加入约2-3mL的20％哌啶/DMF溶液，旋转混匀器上反应1h。

3.冲洗：抽去反应器内的溶液，分别用DMF、DCM、DMF冲洗各三遍，共冲洗9遍。

4.偶联氨基酸：在提前称好的Fmoc-氨基酸、TBTU固体中先加入2-4mL的DMF溶剂，并加入DIEA充分混匀震荡溶解氨基酸和TBTU，并放置2～3min，再将混合溶液加至反应器中，旋转混匀器上反应4h。

5.冲洗：抽去反应器内的液体，分别用DMF、DCM、DMF冲洗各三遍，共冲洗9遍。

6.重复上述步骤2～5偶联剩余的氨基酸，直至完成最后一个氨基酸的偶联和脱保护，在氮端链接上一个Biotin用于后续的动力学测试。

7.完成最后一个氨基酸偶联和脱保护之后，剪切树脂：多肽用DMF、DCM分别冲洗三次后，用甲醇冲洗2～3次，室温放置让甲醇挥发干燥树脂。配制95％三氟乙酸(TFA)溶液(95％的TFA+2.5％三异丙基硅烷(TIS)+2.5％水)。根据产物的量加适量的95％TFA溶液(约1～2mL，不需要加太多)旋转混匀器上反应2-3h(若多肽中含有精氨酸时间延长至3-4h)。

8.冰乙醚沉淀多肽：将含有多肽的TFA溶液进行过滤，除去树脂固体，溶液转移至干净EP管内。用氮气吹去所有的TFA。加入8-10mL冰乙醚，放入-80℃中冷藏过夜，进一步沉淀析出所有的多肽。

9. 3500rpm离心10分钟，弃去上清乙醚，多肽沉淀在底部。再加入8-10mL冰乙醚重悬固体，同样的，在3500rpm下离心10分钟，重复两遍。弃去上清后，室温下挥干乙醚。

10.多肽合成结束后用LC-MS进行分子量鉴定，最后HPLC分离纯化。

Octet-Red系统(美国ForteBio公司)是基于生物膜干涉技术开发的一种仪器，用于使用光纤传感器实现自动、无标签、实时检测分子间的相互作用。简言之，此方法通过将链霉亲和素生物传感器(FortéBio，Fremont，USA)放置在微孔板中并测量随时间(s)的生物膜厚度变化(nm)来进行分析。首先用动态缓冲液(1mM磷酸盐，15mM NaCl,0.1mg/ml BSA,0.002％Tween-20)冲洗传感器300s结果作为基线，然后传感器用含有生物素化的多肽200μL培养基固定600秒，之后传感器在动态缓冲液中再清洗600秒，将传感器暴露在一系列稀释的蛋白样品中，在同一分析中以200μL的体积运行。BSA作为阴性对照。(结果见图6)

7)Pull-down

将70μL链霉亲和素琼脂糖树脂(Thermo Scientific)添加到1mL PBS中，并排出所有溶液。将过量的的生物素化多肽添加到链霉亲和素琼脂糖树脂中并在300μL PBS中培养2h。而后使用PBS和PBST(0.05％)洗涤树脂3-4次以去除多余的多肽。将其与靶蛋白IFN-γ在4℃下孵育过夜并洗涤。将4×SDS负载缓冲液、还原剂加入树脂中，在99℃下煮沸10min变性。荧光图像采用染料标记蛋白，为ZW700-1标记的IFN-γ(结果见图7)。

实施例2靶向IFN-γ多肽

发明人采用实施例1中的筛选方法，最终筛选得到具有以下特征的靶向IFN-γ的多肽，多肽的序列由6到8个非天然氨基酸所组成：AA8AA7(AA6AA5AA4AA3AA2AA1)；其中，AA1为Ser、Thr、Val或Pro中的一种，AA2为Leu、Tyr、Phe或Val中的一种，AA3为Arg、Lys、His、Leu或Trp中的一种，AA4为Lys、Val、Trp、His或Tyr中的一种，AA5为Ala、Trp、Try、Thr和Ser中的一种，AA6为Thr、Val、Leu和Trp中的一种，AA7为Val，AA8为Val或Phe中的一种。

具体的氨基酸序列分别为：TAKRLS(SEQ ID NO.1)、LVVKYS(SEQ ID NO.2)、VVLYYKYS(SEQ ID NO.3)、TWVKYT(SEQ ID NO.4)、VYWHFT(SEQ ID NO.5)、LTHLLV(SEQ IDNO.6)、WSYWAP(SEQ ID NO.7)和FVLYYKYS(SEQ ID NO.8)。

以上多肽均为D型非天然氨基酸。

实施例3多肽的应用Paper Based Assay

共轭垫准备。制备载有金纳米颗粒的干偶联物垫(亲水性玻璃纤维垫)，将检测器抗体偶联的金纳米颗粒缓冲在5％蔗糖，0.5％BSA和2mM Tris(pH 7.4)中。将80μL的缓冲金纳米颗粒溶液施加到试剂垫上，并在环境条件下完全干燥。

试纸准备。用10mM Tris(pH 7.4)将捕获抗体稀释至1mg/mL。将1μL捕获抗体点样到测试条(硝酸纤维素条)上，并在真空室中干燥30分钟。随后将测试条用封闭溶液(购自Candor Inc.)封闭，以防止非特异性蛋白质吸附。将封闭的膜在5mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中洗涤，并在真空室中干燥。

测定。将样品在含有1×PBS，5％BSA和0.05％Tween-20(或血清)的运行缓冲液中稀释至试剂垫。运行缓冲液从试剂垫中释放出干燥的结合物，并将其带至测试条。20分钟后读取信号。

结果如图8所示，实施例2中筛选得到的多肽可以在体外及血清中对IFNγ蛋白的检测具有高效简便的优点。

综上所述，发明人将随机合成的巨大的多肽化合物库与用染料标记的目标蛋白孵育后，通过COPAS系统将带有荧光的阳性磁珠分选出来，再运用MALDI-TOF/TOF对所筛选出的多肽进行测序，对测序结果进行分析统计后选出高频出现的氨基酸。再重新构建集中多肽化合物库进行二次筛选。再次通过分选系统将阳性结果分选出来，后用固相合成的方法将多肽合成出来。通过OBOC的筛选策略，筛选出具有选择性识别IFN-γ的结合多肽，能够缩短筛选时间提高选择性且样本量巨大，具有重要意义。

发明人还基于OCTET分析实验，获得了多肽与靶标蛋白之间的K_D值，准确量化多肽与蛋白之间亲和力的大小，为细胞因子的检测提供了更精准的数据。另外发，发明人通过纸实验，检验本发明多肽在血液检测IFN-γ细胞因子中的应用，进一步验证多肽的应用。

说明实施例2中筛选得到的多肽有着合成方便等优点，在临床上将具有良好的应用价值。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 靶向干扰素γ的多肽及其应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Thr Ala Lys Arg Leu Ser

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Val Val Lys Tyr Ser

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Val Val Leu Tyr Tyr Lys Tyr Ser

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Trp Val Lys Tyr Thr

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Val Tyr Trp His Phe Thr

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Leu Thr His Leu Leu Val

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Trp Ser Tyr Trp Ala Pro

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Phe Val Leu Tyr Tyr Lys Tyr Ser

1 5

Claims

1.靶向IFN-γ的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为TAKRLS（SEQ ID NO.1）、LVVKYS（SEQ ID NO.2）、VVLYYKYS（SEQ ID NO.3）、TWVKYT（SEQ ID NO.4）、VYWHFT（SEQ IDNO.5）、LTHLLV（SEQ ID NO.6）、WSYWAP（SEQ ID NO.7）和FVLYYKYS（SEQ ID NO.8）中的至少一种。

2.权利要求1所述的多肽在体外用于非诊断目的的检测干扰素IFN-γ方面的应用。

3.权利要求1所述的多肽在制备干扰素IFN-γ检测试剂中的应用。

4.权利要求1所述的多肽在制备干扰素IFN-γ检测试剂盒中的应用。

5.一种检测试剂，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽。

6.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求5所述的检测试剂。