KR20120089637A - 동질량의 아미노산 및 기타 종의 분별 - Google Patents

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이수성
임재홍
차준회
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쉬 윤 여
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에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
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Abstract

본 발명은 동질량의 종을 분별하기 위한 기술에 관한 것이다. 동질량의 종은 질량 분석법을 이용하여 확인된 태깅 종으로 치환될 수 있다. 동질량의 종은 규정된 서열을 갖는 제1 폴리머의 서브유닛이어도 좋고, 예를 들면, 동질량의 종은 단백질 또는 펩티드 서열에서 아미노산이어도 좋다. 태깅 종은 제1 폴리머로서 동일한 서열을 갖는 제2 폴리머에서 동질량의 종에 대해 치환될 수 있다. 제2 폴리머는 제1 폴리머로서 동일한 수의 서열, 및 사실상 동일한 서열의 서브유닛을 가질 수 있지만, 이를테면 동질량의 종에 대한 태깅 종은 예외이다. 제1 폴리머 및 제2 폴리머는 동일한 반응 용기에서 제조될 수 있다. 동질량의 종 또는 태깅 종을 함유하는 규정된 스브유닛 서열의 폴리머/단백질은 질량 분석법에 의해 분석되어 서열을 결정할 수 있다.

Description

동질량의 아미노산 및 기타 종의 분별{Differentiation Of Isobaric Aminoic Acid And Other Species}
본 발명은 일반적으로 동질량의 종을 분별하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 동질량의 아미노산이 분별된다.
분할-혼합 (split-and-mix) 합성법은 개별적인 펩티드 분자를 함유하는 각각의 작은 비드 상에 펩티드 라이브러리 (libraries)를 생성하는 데 이용되어 왔다. 이러한 라이브러리는 1-비드-1-화합물 (one-bead-one-compound, OBOC) 라이브러리라 불리운다. OBOC 라이브러리는 관심 있는 일부 기능을 수행하는 라이브러리로부 분자를 확인하는 데 통상적으로 이용된다. 일 예로서, OBOC 라이브러리는 단백질과 연합되는 비드 ("히트(hit)" 비드)에 대한 라이브러리를 스크리닝함으로써 특정 단백질에 결합하는 분자 (즉 펩티드)를 확인하는 데 사용될 수 있다. 히트 비드는 라이브러리의 잔류물 (rest)로부터 분리될 수 있고, 그리고 특정 히트 비드 상의 펩티드는 펩티드 서열화 전략 (sequencing strategy)을 이용함으로써 확인될 수 있다.
질량 분석법을 이용한 펩티드 서열화는, 질량 분석법으로 분별할 수 없는 유사한 질량을 갖는 아미노산(예를 들면, 동질량의 아미노산)이 존재하기 때문에 복잡하다. 그러므로 동질량의 아미노산을 분별하는 방법이 필요하다.
본 발명은 일반적으로 동질량의 종을 분별하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 동질량의 아미노산을 분별한다. 본 발명의 요지는, 어떤 경우에, 상호 관련된 생성물, 특정 문제에 대한 대체 해법 및/또는 1 또는 그 이상의 시스템 및/또는 아티클(article)의 여러 가지 서로 다른 용도를 포함한다.
본 발명의 일 요지는 한 방법에 관한 것이다. 일련의 실시양태에서 본 발명의 방법은 표면상에 아미노산 서열을 성장시키는 작용을 포함한다. 어떤 경우에, 아미노산 서열 내에 있는 적어도 하나의 아미노산은 동질량의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 동질량의 아미노산이 배지에 첨가하기 위한 서열에 노출된 배지에 첨가될 때, 동질량의 아미노산을 함유하는 배지는, 동질량의 아미노산과 다른 분자량을 갖는 아미노산 서열에 혼입될 수 있는 엔티티(entity)를 더 함유한다.
또 다른 일련의 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 질량 분석법(mass spectrometry)을 이용하여 제1 서열과 동일한 수의 아미노산 잔기(residue)를 갖는 제2 아미노산 서열로부터 제1 아미노산 서열을 분별하는 작용을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 제2 아미노산 서열은, 제1 아미노산 서열이 제1, 동질량의 아미노산을 함유하는 1 또는 그 이상의 부위를 제외하고는, 제1 아미노산 서열과 동일하다. 어떤 경우에, 제2 아미노산 서열은 제1 아미노산과 다른 분자량을 갖는 제2 아미노산을 함유한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따라서, 본 발명의 방법은 표면에 부착된 아미노산 서열을, 동질량의 아미노산을 함유하는 용액에 노출하는 것을 포함한다, 본 발명의 일부 실시양태에서, 동질량의 아미노산은 제1 아미노산 종(species) 및 제2 아미노산 종으로 이루어진 동질량 그룹의 멤버이다. 특정 경우에, 아미노산 서열에 혼입된 동질량의 아미노산이 제1 아미노산 종일 때, 그 용액은, 동질량의 아미노산과 다른 분자량을 갖는 아미노산 서열에 혼입 가능한 엔티티를 더 포함한다. 어떤 경우에, 아미노산 서열에 혼입된 동질량의 아미노산이 제2 아미노산 종일 때, 용액에는 혼입 가능한 엔티티를 사실상 갖지 않는다.
본 발명의 또 다른 요지는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 일련의 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 제1 아미노산 서열; 및 제1 서열과 동일한 수의 아미노산 잔기를 갖는 제2 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 경우에, 제2 아미노산 서열은, 제1 아미노산 서열이 제1, 동질량의 아미노산을 함유하는 1 또는 그 이상의 부위를 제외하고는, 제1 아미노산 서열과 동일하다. 특정의 경우에, 제2 아미노산 서열은 제1 아미노산과 다른 분자량을 갖는 제2 아미노산을 함유한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 아티클(article)에 관한 것이다. 일련의 실시양태에 따라서, 아티클은 절단 가능한 모이어티(moiety)를 통해 각각 제1 아미노산 서열 및 제2 아미노산 서열이 부착되는 표면을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 제2 아미노산 서열은 제1 서열과 동일한 수의 아미노산 잔기를 갖는다. 특별한 경우에, 제2 아미노산 서열은, 제1 아미노산 서열이 제1, 동질량의 아미노산을 함유하는 1 또는 그 이상의 부위를 제외하고는, 제1 아미노산 서열과 동일하다. 어떤 경우에, 제2 아미노산 서열은 제1 아미노산과 다른 분자량을 갖는 제2 아미노산을 함유한다.
본 발명의 기타 장점과 특징은, 첨부 도면을 참고로 하고, 본 발명의 여러 실시예를 상세히 설명함으로써 분명해진다. 그러나 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서와 본 명세서에서 참고로 하는 문헌이 서로 불일치하거나 모순되는 경우, 본 명세서가 우선한다. 본 명세서에서 참고로 하는 2 이상의 문헌이 서로 불일치하거나 모순되는 경우, 나중 유효 날짜를 갖는 문헌이 우선한다.
첨부 도면을 참고로, 본 발명의 실시양태를 실시예에 의해 비제한적으로 설명한다. 도면은 개략적인 것이며 일정 비율로 작성된 것이 아니다. 도면에서 도시된 동일하거나 거의 동일한 각각의 요소는 통상적으로 단순한 숫자로 나타냈다. 의미를 분명하게 하기 위해서, 모든 도면에서 매 요소마다 라벨을 붙이지 않고, 본 발명의 각 실시양태의 매 요소마다 표시를 하지 않았다. 본 기술 분야의 숙련자가 본 발명을 이해할 수 있도록 하기 위해서 도해는 반드시 필요하지 않다.
도 1a는 본 발명의 실시양태에 따른 분석 방법을 나타낸다.
도 1b는 본 발명의 또 다른 실시양태에 따른 분석 방법을 나타낸다.
도 1c는 본 발명의 또 다른 실시양태에 따른 로직 트리(logic tree) 분석 플로우차트를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 또 다른 실시양태에 따른 서열화 플로우 차트를 나타낸다.
도 3은, 본 발명의 실시양태에 따라, 히트 펩티드 및 대응하는 모(parent) 피크 질량의 표를 나타낸다.
도 4a는, 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라 동질량의 아미노산을 함유하는 히트 펩티드의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 4b는, 본 발명의 실시양태에 따라, 동질량의 아미노산을 함유하는 히트 펩티드로부터 모 피크의 MALDI-TOF MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 4c는, 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 모 피크보다 적은 질량 피크 71 Da의 MALDI-TOF MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는, 본 발명의 실시양태에 따라, bCAII을 갖는 OBOC 헥사머 펩티드 라이브러리의 스크리닝으로부터 발생된 히트 서열의 표를 나타낸다.
도 6은, 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 동질량의 아미노산을 함유하는 히트 펩티드의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은, 본 발명의 실시양태에 따라, 펩티드의 Edman 분해(degradation) 서열화로부터의 HPLC 흔적(trace)을 나타낸다.
도 8은, 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, HIRYKR-CONH2를 bCAII에 결합하기 위한 SPR 센서그램(sensorgram)을 나타낸다.
이하, 동질량의 종을 분별하는 기술에 대해서 설명한다. 본 발명의 일 요지에서, 동질량의 종은 질량 분석법을 이용하여 확인될 수 있는 태깅(tagging) 종으로 치환될 수 있다. 동질량의 종은 한정된 서열을 갖는 제1 폴리머의 서브유닛일 수 있다. 예를 들면, 동질량의 종은 단백질 또는 펩티드 서열 내의 아미노산일 수 있다. 태깅 종은 제1 폴리머와 동일한 서열을 갖는 제2 폴리머에서 동질량의 종에 대해 치환될 수 있다. 예를 들면, 제2 폴리머는, 동질량의 종에 대한 태깅 종과 같은 일부를 제외하고는, 제1 폴리머와 동일한 수의 서열, 및 사실상 같은 서열의 서브유닛을 가질 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 제1 폴리머 및 제2 폴리머는 동일한 반응 용기에서 본질적으로 동시에 제조된다. 한정된 서브유닛 서열을 갖고 동질량의 종 또는 태깅 종을 함유하는 폴리머 (예, 단백질)는 폴리머의 서열을 결정하기 위해 질량분석에 의해 분석될 수 있다.
본 발명의 일 요지에서, 단백질 또는 펩티드와 같은 미지의 엔티티를 결정할 수 있다. 예를 들면, 미지의 엔티티는 펩티드 서열일 수 있으며, 이들 중 일부는 관심 있는 단백질 표적과 상호작용을 하지만, 일부는 상호작용을 하지 않는다. 미지의 엔티티는 관심 있는 단백질 표적에 노출될 수 있고, 결합되거나 상호작용하지 않는 서열로부터, 결합하거나 관심있는 단백질 표적과 상호 작용하지 않는 미지의 엔티티를 분리하고, 또 결합 또는 상호작용하는 미지의 엔티티를 분석함으로써 (예를 들면, 질량분석법을 이용), 미지의 엔티티에 관한 정보가 얻어질 수 있다. 그러나 어떤 경우에, 미지의 엔티티 중 일부는 동질량의 종, 이를테면 동질량의 아미노산을 함유할 수 있으며, 이러한 아미노산은 특정 기술, 이를테면 특정 질량분석 기술을 이용하여 적당히 분별될 수 없다.
동질량의 종은, 상이한 분자 구조를 갖지만 분별될 수 없는 질량을 갖는 종이다. 예를 들면, 동질량의 종은 서로에 대해 이성질체 구조를 가질 수 있거나, 또는 동일한 원자 질량을 이루지만 서로 다른 원자를 함유한다. 동질량의 그룹 멤버는 동질량의 그룹의 기타 멤버 (예, 동일한 질량을 갖는 2개의 아미노산)로부터 분별될 수 없는 조성물에 관한 것이다. 동질량의 그룹의 예로는 류신/이소류신 및 글루타민/리신이 있다. 동질량의 그룹 멤버는 어떠한 형태의 조성물이어도 좋다. 예를 들면, 동질량의 그룹 멤버는 단일 분자(즉, 아미노산, 뉴클레오시드, 슈가 등) 또는 분자의 그룹(즉, 다이머, 트리머, 테트라머 등)이어도 좋다.
어떤 경우에, 동질량의 종은 화학 전환반응을 실시한 후 동질량의 그룹의 기타 멤버로부터 분별할 수 없다. 즉, 동질량의 종은 화학 전환반응을 실시한 후 충분히 분별될 수 없다. 예를 들면, 동질량의 그룹의 2 멤버는, 폴리머에 혼입될 때 동질량이 될 수도 있거나 되지 않을 수도 있다(즉, 질량에 의해 분별 가능함). 그러나, 질량분석법과 같은 기술로 분석할 때, 1 또는 그 이상의 동질량의 그룹 멤버는 화학 전환반응(즉, 단편화, 이온화 등)을 실시하여, 질량을 기준으로 서로 분별될 수 없다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 제1 기술에 의해 분석될 때 동질량일 수 있는 일부 종은, 제2 기술에 의해 분석될 때 반드시 동질량일 필요는 없다는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 실시예에서 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 실시예가 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 도 1A는 프로브(probe) 엔티티 (110) 및 링커 (150)를 통해 입자의 표면에 부착된 태깅 엔티티 (130)를 갖는 입자 (100)를 나타낸다. 입자가 도 1A에 도시되어 있을지라도, 이는 예에 지나지 않으며, 다른 실시양태에서는 기타 시스템이 이용될 수 있다는 것으로 이해하여야 한다. 예를 들면, 프로브 엔티티 및 태깅 엔티티는 용액 중에 있거나, 편평한 섭스트레이트에 부착되거나 하는 등으로 이용될 수 있다. 프로브 엔티티 (110)는 서브유닛의 풀(pool)로부터 선택된 서브유닛의 서열을 포함하고, 그리고 동질량의 그룹 멤버 (120) (즉, 동질량의 그룹 멤버 (120)는 서브유닛의 풀에 있는 1 또는 그 이상의 기타 서브유닛과 동일한 질량을 갖는다)를 포함한다. 태깅 엔티티 (130)는, 동질량의 그룹 멤버가 동질량의 그룹 멤버 (120)와 다른 질량을 갖는 태깅 종 (140)로 치환되는 것을 제외하고는, 프로브 엔티티 (110)와 동일한 서브유닛의 서열을 포함한다. 태깅 종은 프로브 엔티티 (110) 내에 있는 동질량의 그룹 멤버 (120)의 존재에 대해 코딩한다. 프로브 엔티티 및 태깅 엔티티는, 하기에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 이를테면 링커 (150)를 통해 입자로부터 절단되어 혼합물을 형성할 수 있으며, 여기서 혼합물은 질량분석법(또는 기타 기술)에 의해 후속적으로 분석되어 질량 스펙트럼(180)을 형성한다. 프로브 엔티티 및 태깅 엔티티는 각각 동질량의 그룹 멤버와 태깅 종의 존재에 의해서만 달라지기 때문에, 혼합물의 질량 스펙트럼은 동질량의 그룹 멤버 및 태깅 종 사이의 질량 차와 일반적으로 동일한 양에 의해서 태깅 엔티티에 대한 모 피크(184)로부터 질량이 다른 프로브 엔티티에 대한 모 피크 (182)를 나타낸다. 그러므로 이러한 예에서, 이러한 질량 차를 갖는 2 피크들이 존재한다는 것은, 프로브 엔티티 내에 동질량의 그룹 멤버가 존재한다는 것을 나타낸다. 프로브 엔티티에 대한 모 피크 (182)는 단편화된 후 질량분석되어 프로브 엔티티 (질량 스펙트럼 181)의 서열을 결정한다. 스펙트럼 (181)은 왼쪽으로부터 오른쪽으로 증가하는 질량의 순서로 펩티드(160)의 단편을 나타낸다. 일반적으로, 피크들 사이의 질량 차는 프로브 엔티티 내에 있는 서브유닛의 질량을 나타내며, 예를 들면 공지 기술 또는 쉽게 이용할 수 있는 기술을 이용하여 서브유닛을 확인할 수 있다.
또 다른 비제한적인 실시예에서, 2 또는 그 이상의 동질량의 그룹 멤버를 함유하는 프로브 엔티티는 탠덤(tandem) 질량 분석법을 이용하여 서열화될 수 있다. 도 1B를 참고로 하면, 링커 (250)를 통해 입자의 표면에 부착된 프로브 엔티티 (210) 및 태깅 엔티티 (230)을 갖는 입자(200)를 나타낸다. 프로브 엔티티 (210)는 서브유닛의 풀로부터 선택된 서브유닛의 서열을 포함하고, 그리고 화학 구조는 다르지만 동일한 질량을 갖는 2개의 동질량의 그룹 멤버(216, 222)를 포함한다. 태깅 엔티티 (230)는, 동질량의 그룹 멤버 (216)가 동질량의 그룹 멤버(216, 222)의 질량과 다른 질량을 갖는 태깅 종 (240)으로 치환된 것을 제외하고는, 서브유닛의 동일한 서열을 포함한다. 태깅 종은 프로브 엔티티 (210)에서 동질량의 그룹 멤버 (216)의 존재를 위해 코딩한다. 프로브 엔티티 및 태깅 엔티티는 입자로부터 절단되어 혼합물을 형성하고, 이 혼합물은 즉시 질량 분석법에 의해 분석되어 질량 스펙트럼 (280)을 형성한다. 혼합물의 질량 스펙트럼은, 동질량의 그룹 멤버와 태깅 종 사이의 질량 차와 동일한 양만큼 태깅 엔티티에 대한 모 피크 (284)와 질량이 다른 프로브 엔티티에 대한 모 피크 (282)를 나타낸다. 단편화 (스펙트럼 281)에 의한 모 피크 (282) (즉, 프로브 엔티티 (210))의 서열화는 서로 구별하지 못하는 2개의 동질량의 그룹 멤버들의 위치를 나타낸다. 단편화(스펙트럼 283)에 의한 모 피크 (284) (즉, 태깅 엔티티 230)의 서열화는, 위치 2가 동질량의 그룹 멤버들과 서로 다른 질량을 갖는다는 것을 나타내고, 이는 다시 동질량의 그룹 멤버 (216)가 위치 2에 있고, 그리고 동질량의 그룹 멤버 (222)가 위치 4에 있다는 것을 나타낸다.
따라서, 질량 분석 데이터의 차이 및 입자와 그들의 프로브 및 태깅 엔티티에 대한 정보를 기본으로, 폴리머, 이를테면, 펩티드 또는 단백질은, 동질량의 종, 이를테면 동질량의 아미노산을 함유하거나 함유할 것으로 생각되는 서열을 결정하는 질량 분석법이나 기타 기술을 이용하여 분석될 수 있다. 그러므로 입자 및 그들 프로브의 일부(subset)가, 이를테면 미지의 엔티티와의 상호 작용이나 반응 시에 수집된 후, 프로브는 분석되어 프로브의 서열을 결정하고, 그 결과 미지의 엔티티에 관한 정보 (예를 들면, 서열 정보)를 결정할 수 있다.
그러므로, 일부 예에서, 적어도 동질량의 종을 함유하는 것으로 생각되는 입자들은 다음과 같이 분석될 수 있다. 질량 분석 데이터를 분석하는 데 사용된 로직 트리 분석 플로우 차트와 관련하여 적당한 기술의 비제한적인 예중 하나를 도 1C에 나타냈다. 이러한 예에서, 프로브 엔티티 및 태깅 엔티티는 펩티드이지만, 기타 프로브 엔티티 및 태깅 엔티티도 유사한 방식으로 분석될 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 이러한 예의 플로우차트는 분리된 펩티드 샘플에 대한 질량 스펙트럼 (MS 스펙트럼)의 확인으로 시작한다. 질량 스펙트럼은 프로브 엔티티의 모 피크와 어떠한 추가적인 피크(즉, 태깅 엔티티 모 피크)에 대해 분석된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 프로브 엔티티 및 태깅 엔티티는, 모든 가능한 질량이 알려지는 엔티티의 라이브러리 멤버이다. 그러므로 프로브 엔티티의 모 피크는, 예를 들면, 프로브 엔티티에 대해 가능한 질량의 리스트를 비교함으로써 확인될 수 있다. 마찬가지로 태깅 엔티티의 모 피크도 또한 확인될 수 있다. 프로브 엔티티 모 피크 이외에 피크가 존재하지 않는 경우, 모 피크는 서열화되어 모 피크의 정체를 결정할 수 있다. 즉, 펩티드의 모 피크는 분절되어 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 태깅 엔티티가 존재하지 않기 때문에, 이는 프로브 엔티티가 (1) 동질량의 아미노산을 함유하지 않았거나 또는 (2) 태깅 종에 의해 코드되지 않은 동질량의 아미노산을 함유하였다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 동질량의 아미노산 쌍 류신 및 이소류신에 대해서, 류신은 알라닌에 의해서 코드될 수 있고, 그리고 이소류신은 코드되지 않을 수 있다. 그러므로 펩티드 샘플의 질량 스펙트럼이 태깅 엔티티에 상응하는 제2 모 피크를 갖지 않는 경우, 프로브 엔티티는 이소류신을 함유하거나 또는 동질량의 아미노산을 함유하지 않는다. 역으로, 질량 스펙트럼이 태깅 엔티티에 대응하는 제2 모 피크를 나타내는 경우에는, 프로브 엔티티는 류신을 함유한다.
도 1C를 참고로 하면, 프로빙 엔티티 (probing entity) 모 피크 이외에 제2 모 피크가 존재하는 경우, 이는 프로브 엔티티 내에 있는 동질량의 아미노산에 상응하는 제2 모 피크에 태깅 종이 존재한다는 것을 나타낸다. 그 다음 제1 모 피크가 서열화된다. 1보다 많은 동질량의 아미노산이 프로브 엔티티에 존재하지 않는 경우, 프로브 엔티티의 서열은 프로브 엔티티의 모 질량을 서열화 함으로써만이 얻어질 수 있다. 그러나 1보다 많은 동질량의 아미노산이 프로브 엔티티에 존재하는 경우에, 태깅 엔티티는 서열화되어 태깅 종 (즉, 태깅된 아미노산)의 위치를 결정하게 된다. 어떤 경우에, 더 많은 동질량의 아미노산이 프로브 엔티티에 존재할 경우, 이러한 것은 반복될 수 있다.
엔티티의 질량을 결정하기 위해서, 적당한 기술, 예를 들면, 질량 분석법, 질량 침강법(sedimentation) 등과 같은 기술을 이용할 수 있다. 질량 분석법을 포함하는 실시양태에서는 어떠한 질량 분석 기술도 이용될 수 있다. 예를 들면, MALDI, ESI, FAB 등과 같은 기술은 종을 이온화하는데 이용될 수 있다. 이온화된 분석물의 질량은 분석기, 이를테면 타임-오브-플라잇(TOF), 사중극(quadrupole), 푸리어 트랜스폼 이온 사이클로트론 공명(Fourier transform ion cyclotron resonance), 오빗트랩(orbitrap), 섹터 필드(sector field) 등을 이용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 이온은 분절되어 2차 이온을 형성할 수 있다. 2차 이온은 또한, 예를 들면 탠덤 질량 분석법과 같은 기술을 이용하여 분절될 수 있다. 예를 들면, 충돌-유발 분해(collision-induced dissoc1Ation), 전자 포획 분해(electron capture dissoc1Ation), 전자 전달 분해(electron transfer dissoc1Ation), 적외선 멀티포톤 분해(infrared multiphoton dissoc1Ation), 흑체 적외선 방사 분해(blackbody infrared rad1Ative dissoc1Ation) 등과 같은 방법이 이온을 분절하는데 이용될 수 있다.
프로브 엔티티는 동질량의 그룹 멤버를 함유할 수 있는 어떠한 조성물이어도 좋다. 예를 들면, 프로브 엔티티는 서브유닛을 함유할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 프로브 엔티티는 펩티드이어도 좋고 및 서브유닛은 펩티드의 아미노산 잔기이어도 좋다. 펩티드는 아미노산, 예를 들면 알라닌, 시스테인, 아스파트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 아르파라긴, 피롤리즘, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 셀레노시스테인, 발린, 트립토판, 티로신 등을 포함할 수 있다. 어떤 경우에는 인조 아미노산을 포함한 기타 아미노산이 또한 사용될 수 있고, 그리고 본 발명의 일부 실시양태에서는 인조 아미노산이 예를 들면 기타 인조 아미노산 및/또는 천연 아미노산과 동질량일 수 있다. 그러므로 펩티드는 본 기술분야에서 공지된 기술을 이용하여 변형될 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 N-말단 및/또는 C-말단에서 변형될 수 있다. 아미노산의 사이드 기도 변형될 수 있다. 어떤 경우에, 펩티드의 골격이 변형될 수도 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 펩티드는 또 다른 폴리머, 예를 들면 생물학적 폴리머 이를테면, 핵산 및/또는 다당류에 연결될 수 있다. 펩티드는 또한 기타 폴리머, 예를 들면 폴리에스테르(예를 들면, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, PLGA, 폴리카프로락톤 등), 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리안하이디라이드 등 및 이들의 조합물에 연결될 수 있다.
"아미노산"이란 용어는 생화학 분야에서 통상적으로 사용되는 의미이다. 분리된 아미노산은 항상 그렇지는 않지만 통상적으로 (예를 들면 프롤린의 경우에서 처럼) 화학식 NH2-CHR-COOH를 갖는다. 여기서 R은 어떠한 적당한 잔기, 예를 들면 수소 원자, 메틸기 또는 이소프로필 기이어도 좋다. 일련의 분리된 아미노산들은 연결되어 한 아미노산의 -NH2 와 또 다른 아미노산의 -COOH와 반응하여 펩티드 결합 (-CO-NH-)을 형성하게 됨으로써 펩티드나 단백질을 형성하게 된다. 이러한 경우에, 펩티드 또는 단백질 상에 있는 R 기의 각각은 아미노산 잔기라 할 수 있다. 아미노산은 자연에서 일반적으로 발견할 수 있는 20 아미노산들("천연 아미노산") 중 하나, 또는 인조 아미노산, 즉 아미노산 천연 아미노산들 중 하나가 아닌 아미노산이어도 좋다. 인조 아미노산의 예로는 다음과 같은 것들이 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다: 알로이소류신, 알로트레오닌, 호모페닐알라닌, 호모세린, 호모시스테인, 5-히드록시리신, 4-히드록시프롤린, 4-카르복시글루탐산, 시스테인산, 시클로헥실알라닌, 에틸글리신, 노르류신, 노르발린, 3-아미노부티르산, 베타-아미노산 (예를 들면, 베타-알라닌), N-메틸화 아미노산류, 이를테면 N-메틸글리신, N-메틸알라닌, N-메틸발린, N-메틸류신, N-메틸이소류신, N-메틸노르류신, N-메틸-2-아미노부티르산, N-메틸-2-아미노펜타노산 등, 뿐만 아니라 천연 아미노산의 D-이성질체.
태깅 엔티티는 프로브 엔티티와 동일해도 좋고, 또는 어떤 경우에는 태깅 엔티티는 1 또는 그 이상의 장소에서 프로브 엔티티와 달라도 좋다. 예를 들면, 1 또는 그 이상의 상응하는 서브유닛이 태깅 종으로 치환되므로, 태깅 엔티티는 동일한 순서로 배열되지만 프로브 엔티티와 서로 다른 서브유닛을 포함할 수 있다. 예를 들면, 펩티드 프로브 엔티티는 제1 아미노산 및 제2 아미노산을 함유하는 동질량의 그룹으로부터 제1 아미노산을 함유할 수 있으며, 동질량의 그룹 멤버로부터 구별할 수 있는 질량을 갖는 태깅 종은 제1 아미노산에 대해 치환될 수 있다(즉, 태깅 종은 제1 아미노산에 대해 “코드”한다), 본 발명의 일부 실시양태에서, 제1 태깅 종은 제1 아미노산에 대해 치환될 수 있고, 그리고 제2 태깅 종은 제2 아미노산에 대해 치환될 수 있다.
태깅 종은 동질량의 그룹의 멤버를, 예를 들면, 질량 차에 의해 구별할 수 있는 어떠한 조성물이어도 좋다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 태깅 종은 폴리머 속으로 혼입될 수 있는 조성물이어도 좋다. 예를 들면, 태깅 종은 아미노산, 뉴클레오시드, 당류 등이어도 좋다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 태깅 종은 폴리머 내의 서브유닛에 대해 치환될 수 있지만, 폴리머 내의 기타 서브유닛과 동일한 화학 기에 속하지 않는 조성물이어도 좋다. 예를 들면, 태깅 종은, 펩티드 속으로 혼입될 수 있지만 아미노산이 되지 않도록, 아미노기와 카르복시기를 가질 수 있다.
어떤 경우에, 프로브 엔티티 및 태깅 엔티티는 표면, 예를 들면 입자의 표면, 편평한 섭스트레이트의 표면 등에 부착될 수 있다. 엔티티는 적당한 방법에 의해 부착될 수 있다. 예를 들면, 표면은 프로브 엔티티 및/또는 태깅 엔티티가 연결및 부착될 수 있는 관능기를 가질 수 있다. 엔티티는 공유 결합, 이온 결합, 반 데르 발스(van der Waals) 힘, 소수성 상호작용 등을 이용하여 표면에 연결될 수 있다. 엔티티를 표면에 부착하기 위해서, 에스테르, 아미드, 에테르, 무수물, 우레탄 등과 같은 화학 결합이 이용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 엔티티를 표면에 부착하기 위해서 금속-황 결합 (즉, 금-황)이 이용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 엔티티를 표면 (즉, 입자)에 연결하기 위해서 이용될 수 있다. 이러한 링커는 본 기술분야, 예를 들면 고상(solid-phase) 펩티드 합성 및 고상 올리고뉴클레오티드 합성 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 메티오닌 잔기가 링커로서 이용될 수 있다. 메티오닌 링커는 시약, 이를테면 메티오닌 잔기의 C-말단에서 펩티드 결합을 절단하는 CNBr에 의해 절단될 수 있다. 사용될 수 있는 기타 형태의 링커에 대한 예로는 산-절단 가능한 링커, 염기-절단 가능한 링커, 광-절단 가능한 링커, 및 레독스-절단 가능한 링커, 이를테면 페리오데이트, 2,3-디클로로-5,6-디시아노벤조퀴논(DDQ), 세륨(IV) 암모늄 질산염(CAN) 등에 의해 매개된 것들이 있다. 절단 가능한 링커는 엔티티에 본질적으로 유리한 조건 하에서 절단되기 쉽다. 본 발명의 기타 실시양태에서, 엔티티는 링커에서 절단되는 이외에 1 또는 그 이상의 장소에서 절단될 수 있다.
본 발명의 일부 요지에서, 프로브 엔티티 및 태깅 엔티티는 본질적으로 동시에 합성될 수 있다. 예를 들면, 펩티드 엔티티의 경우에, 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 고상 합성 기술이 동일한 반응 용기에서 아미노산 잔기를 성장하는 펩티드 사슬에 순서적으로 첨가함으로써 프로브 엔티티 및 태깅 엔티티를 본질적으로 동시에 합성하기 위해 이용될 수 있다. 특이적 비-동질량의 아미노산을 펩티드 사슬에 첨가할 필요가 있을 때, 펩티드 사슬은 본질적으로 하나의 비-동질량의 아미노산을 함유하는 반응 혼합물에 노출될 수 있다. 이와는 대조적으로, 태깅 종 (즉, 서로 다른 질량을 갖는 또 다른 아미노산)을 부여한 펩티드 사슬에 동질량의 아미노산을 첨가하기 위해서, 펩티드는 동질량의 아미노산 및 태깅 종의 조합물을 함유하는 반응 혼합물에 노출될 수 있다. 동질량의 아미노산 대 태깅 종의 비는 어떠한 적당한 비로 될 수 있는데, 이를테면 약 100:1 미만, 약 10:1 미만, 약 5:1 미만, 약 2:1 미만, 약 1:1 미만, 약 1:2 미만, 약 1:5 미만, 약 1:10 미만, 약 1:100 미만 등으로 될 수 있다.
어떤 경우에, 프로브 엔티티 및 태깅 엔티티의 라이브러리가 제조될 수 있다. 어떤 경우에, 엔티티의 라이브러리는 입자 (즉, 비드)에 부착될 수 있다. 예를 들면, 1 비드-1 화합물 (OBOC) 라이브러리는 일 실시양태에서 발생될 수 있다. OBOC 라이브러리는, 일반적으로 각 비드가 단일 화합물의 1 또는 그 이상의 복제(즉, 프로브 엔티티)에 부착되는 다수의 비드를 함유한다. 예를 들면, 제1 비드는 제1 서열을 갖는 제1 펩티드에 부착될 수 있고, 그리고 제2 비드는 제2 서열을 갖는 제2 펩티드에 부착될 수 있으며, 여기서 제2 서열은 제1 서열과 통상적으로 다르다. 이러한 예에서, 비드의 각각은 또한 비드에 부착된 프로브 엔티티에 대응하는 태깅 엔티티에 부착될 수 있다는 것을 알아야 한다. 펩티드 OBOC 라이브러리는 본 기술 분야에서 숙련된 자들에게 공지된 분할-풀(split-and-pool) 합성 기술에 따라 발생될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 라이브러리 멤버가 관심 있는 표적 (즉, 단백질)과 상호 작용한다는 것을 알 필요가 있다. 라이브러리 멤버는 관심 있는 적당한 표적과 접촉될 수 있고, 그리고 관심 있는 표적에 결합하는 멤버는 본 기술분야에서 공지된 기술, 이를테면 형광 분류법(fluorescence sorting)을 이용하여 풍부해질 수 있다. 이 공정은 "히트" (즉, 표적에 결합하는 라이브러리 멤버)의 수를 줄이기 위해서 1 또는 그 이상의 횟수로 반복될 수 있다. 그 다음 분리된 히트는 상술한 방법을 거쳐 히트의 정체를 결정할 수 있다. 관심 있는 표적의 예로는 바이오폴리머, 이를테면 단백질, 핵산, 다당류, 및 비특이성 조성물이 있다.
다음 실시예는 예증 목적으로만 제공되며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예에서는 OBOC 헥사머 펩티드 라이브러리의 합성을 예증한다. 자동 합성기 (Titan 357, AAPPTEC)를 사용하여 펩티드 라이브러리의 “분할-혼합”(Split-and-mix) 합성을 실시하였다. TentaGel S 아미노 비드 (2.2 g, 직경 90 마이크론, NH2 의 로딩: 0.24 mmol/g)를 수집 용기(CV) 내의 NMP (27 ml)중에서 2 시간 동안 팽윤하였다. 링커로서 100% 메티오닌을 혼입하기 위해, 용매를 배출한 후, fmoc-Met (2 당량, NMP 중 0.2 M 용액), TBTU (2 당량, NMP 중 0.2 M 용액), 및 DIEA (5 당량, NMP 중 0.5 M 용액)을 수집 용기(CV)에 첨가하였다. 그 결과 얻어진 혼합물을 30 분 동안 교반하였다. 용액을 배출한 후, 새로운 시약 용액을 사용함으로써 커플링 단계를 반복하였다. 그 결과 얻어진 비드를 NMP (27 ml x 4)로 완전히 세척하였다. 그 다음, NMP (27 ml) 중 20% 피페리딘을 첨가하고 수집 용기(CV)를 5분 동안 교반하였다. 액체를 배출하고, NMP (27 ml) 중 20% 피페리딘의 새로운 용액을 첨가하고, 수집 용기(CV)를 15 분 동안 더 교반하였다. 그 결과 얻어진 비드를 NMP (27 ml x4) 및 DCM (27 ml x 4)으로 완전히 세척한 후, 11개의 반응 용기 (RV)에 동일하게 배분하였다. 다양한 요소 (F, H, K, L, R, S, V, W, Y, Q 및 G의 9:1 혼합물, 및 I 및 A의 9:1 혼합물, 각 3 당량)로서 11개의 선택된 Fmoc-보호 D-아미노산 중 하나, TBTU (3 당량) 및 DIEA (7.5 당량)를 각 반응 용기(RV)에 첨가하였다. 그 다음 반응 용기(RV)를 30 분 동안 교반하였다. 용액을 배출한 후, 커플링 단계를 반복하였다. 그 결과 얻어진 각 반응 용기(RV) 내의 비드를 NMP (2 ml x 4)로 세척하였다. 다시, NMP (2ml x 4) 중 20% 피페리딘을 각 반응 용기(RV)에 첨가한 후, 15 분 동안 교반하였다. 액체를 배출한 후, NMP (2 ml x 4) 중 20% 피페리딘의 새로운 용액을 30 분 동안 교반함과 동시에 첨가하였다. 각 반응 용기(RV) 내에 있는 비드를 NMP (2 ml x 4) 및 DCM (2 ml x 4)으로 완전히 세척한 다음, 수집 용기(CV)에 넣어 혼합하였다. 초기 메티오닌을 제외하고, 비드가 헥사머를 부착할 때까지 전체적인 분할, 커플링, 보호해제 및 혼합 공정을 반복하였다. 비드를 필터가 구비된 50 ml 반응기에 옮겼다. 잔기 내의 보호 기를 TFA-물-TIS (27 ml, 94:3 :3, v/v) 중에서 2 시간 동안 흔들어줌으로써 제거하였다. 액체를 배출하고, 그 결과 얻어진 비드를, DCM (27 ml x 3), 메탄올 (27 ml x 3), 물 (27 ml x 3), 메탄올 (27 ml x 3), DCM (27 ml x 3), 및 디에틸에테르 (27 ml)로 연속하여 완전 세척한 다음, 감압 하에서 24 시간 동안 건조하였다.
실시예 2
본 실시예는 라이브러리 스크리닝을 예증한다. 공급자의 프로토콜에 따라 소(bovine) 탄산탈수효소 (bCAII)를 라벨링하기 위한 반응 염료로서 Alexa Fluor® 647 단백질 라벨링 키트 (A20173, 인비트로겐)를 선택하였다. 라벨링에 대해서 간단히 설명하면, 0.1 M 중탄산나트륨 용액 (pH-8.3) 1 ml에 bCAII 2 mg을 용해함으로써 제조된 bCATI 용액 0.5 ml를, 반응성 염료를 함유하는 바이얼로 옮겼다. 바이얼의 뚜껑을 닫은 다음, 염료를 완전 용해할 때까지 수회 거꾸로 하였다. 반응 혼합물을 실온의 어두운 상태에서 1 시간 동안 교반하였다. Alexa Fluor® 647 라벨된 bCAII (bCAII-A647)를 키트 내의 크기 배제 정제 수지(size exclusion purification resin)를 사용하여 혼합물로부터 정제되었다. 정제 및 라벨된 bCAII-A647는 SDS-PAGE 후에 NanoDrop (Thermo Scientific) 및 젤 다큐멘테이션 (Typhoon)으로 특징지어졌다. 200 mg의 건조된 라이브러리 수지를 8 ml Alltech 용기로 옮긴 후, 블로킹(blocking) 용액, 0.05% NaN3, 0.1% Tween 20 및 PBS 완충액 (pH 7.4) 중의 0.1% BSA에서, 실온에서 1 시간 동안 360°셰이커 상에서 미리 배양하였다. 완충액을 진공에 의해 버린 다음, 블로킹 용액에 희석된 5 ml의 50 nM의 염료 라벨된 bCAII을 팽윤된 수지에 첨가하였다. 그 결과 얻어진 혼합물을 360°회전 자동 온도조절 셰이커에서, 25℃에서 15 시간 동안 배양하였다. 액체를 진공에 의해 배출시키고, 비특이적으로 결합된 단백질은, 블로킹 용액으로 3회, PBS 중의 0.1% Tween 20으로 7회 연속으로 세척함으로써 제거되었다. 엄격하게 세척한 후에, 200 mg의 분석된 라이브러리 수지를 COPAS Plus (Union Biometrica)의 샘플 용기로 옮긴 후, PBS 완충액 중 0.1% Tween 20(200 ml)로 희석하였다.
히트 비드는 COPAS Plus를 사용하여 96 웰 플레이트의 원추형 웰 속으로 분류되었다. 게이팅(gating) 및 분류 영역은 COPAS Plus 상의 비드를 분류하기 위해서 형성되었다. 게이팅 영역은 타임-오브-플라이트(time-of-fiight, TOF) 및 적색 형광을 기본으로 비드에 대해 형성되었고, 그리고 분류 영역은 bCAII-A647로, 배양한 후 타임-오브-플라이트(TOF)와 균일 적색 형광을 기본으로 비드를 선택하기 위해 선정되었다. 2-단계 분류 전략이 신속하고도 확고한 분류를 위해 이용되었다. 제1 분류에서는 비드를 높은 농도 범위 (>1,000 비드/mL)로 정제하였다. 제1 단계 분류 동안, PBS 내에서 분석된 라이브러리 비드 중 200 mg (약 300,000 비드)가 시드(sheath) 용액으로서 탈이온수를 사용하여 분류되었다. 샘플 컵 내의 비드를 플로우 셀(flow cell)에 통과시킨 후, >100 개체/초의 속도로 유체역학적으로(hydrodynamically) 집중시켰다. TOF, 적색 형광 및 비드의 적색 형광 피크 높이가 적색 다이오드 레이저(λ=635 nm)에 의해 검출되었다. 비드의 자동 형광 발광으로 인해, 아르곤 이온 레이저가 의도적으로 꺼져 블리드-스루(bleed-through) 효과를 최소화하였다. 5,000 미만의 비드 (총 비드의 1.7% 미만)가 제1 분류 단계에서 수집되었다. 제2 단계 분류를 위해, 제1 단계로부터 분류된 비드를 탈이온수로 완전 세척한 후, COPAS Plus의 샘플 컵에 옮긴 다음, 100 mL의 탈이온수로 희석하였다. 샘플 컵 내의 비드를 <5 개체/초의 속도로 플로우 셀에 통과시켰다. 각 히트 비드는 원추형 웰을 갖는 96 웰 플레이트 원추형 웰 속으로 직접 분류되었다.
실시예 3
본 실시예에서는 펩티드의 MALDI 질량 분석법을 예증한다. CNBr (10 마이크로리터, 0.50 M, 0.2 N HCl 용액)을 실시예 2의 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 아르곤으로 퍼지한 다음, 1 분 동안 마이크로파로 처리하였다. 그 결과 얻어진 용액을 원심 진공 하에서 2 시간 동안 농축하였다.
각 바이얼이나 웰에 CHCA (10 마이크로리터, 아세토니트릴/물 (70:30) 중 0.5% 용액)을 첨가한 다음, 아세토니트릴/물 (10 마이크로리터, 0.1% 트리플루오로아세트산(v/v)을 함유, 70:30)을 첨가하였다. 이 샘플을 2 분 동안 원심분리한 다음, 2 마이크로리터를 배출한 후, 384-웰 MALDI-MS 플레이트 상에 스포팅한 다음, 15 분 동안 방치하여 샘플을 증발시켰다.
실시예 4
본 실시예에서는 질량 분석법을 이용하여 동질량의 아미노산을 함유하는 펩티드를 서열화하는 것에 대해 예증한다. 실시예 2의 bCAII에 대해 OBOC 헥사머 펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 얻어진 히트 펩티드는 동질량의 분별법을 이용함으로써 연속적으로 서열화되었다. 실시예 1에서 나타낸 바와 같이, 글리신 (G)은 K 와 Q 사이를 분별하기 위해서 Q에 대한 태그로서 사용되었고, 그리고 알라닌 (A)는 I와 L 사이를 분별하기 위해서 I에 대한 태그로서 사용되었다. 도 2는 완전한 펩티드 서열을 얻기 위해 사용된 반응식(scheme)을 예증한다. MALDI-TOF/TOF를 사용하여 얻어진 MS 스펙트럼은 모 질량 피크 이외에 어떠한 추가적인 질량 피크를 확인하기 위해서 먼저 실험되었다. 본 실시예에서, 모 피크보다 더 작은 피크 42 amu는, I가 서열에 존재한다는 것을 나타내고, 그리고 모 질량 피크보다 더 작은 피크 71 amu는, Q가 서열에 존재한다는 것을 나타낸다. 모 피크의 서열은 그의 MS/MS 스펙트럼 분석에 의해 얻어진다. 서열이 오직 하나의 L/I 또는 하나의 K/Q만을 함유하는 경우, L/I는 I이 되는 반면, K/Q는 Q가 된다. 그러나 모 펩티드가 1보다 많은 K/Q 또는 하나의 L/I을 함유하는 경우, 추가적인 질량 피크가 MS/MS 단편화에 도입되어 동질량의 아미노산 I 또는 Q의 위치를 확인하게 된다.
도 2의 서열화 반응식은, 도 3에 나타낸 바와 같이, bCAII 에 대하여 헥사머 라이브러리를 스크린함으로써 얻어진 히트 펩티드에 적용되었다. 히트 펩티드는 표적된 단백질과의 결합 작용을 갖는 펩티드를 말한다. 59 히트 비드로부터의 펩티드는, 질량 분석되기 전에 먼저 비드로부터 절단되었다.
도 4A 내지 4C는 동질량의 아미노산을 함유하는 히트 펩티드를 스크린하는 예를 예증한다. 도 4A에서, 단일 비드로부터 방출된 펩티드의 MS 스펙트럼은 모 피크 이외에 2개의 추가적인 작은 피크를 나타냈다. 가장 높은 강도를 갖는 모 피크는 m/z 값 911을 가졌다. 기타 2개의 더 작은 피크는 모 질량과 -42 amu 및 -71 amu의 m/z 차를 가졌다. 도 2의 분석에서 나타낸 바와 같이, m/z 값 869를 갖는 피크가 존재하면, I가 서열에 존재한다는 것을 나타내고, 반면에, m/z 값 840을 갖는 피크가 존재하면, Q가 서열에 존재한다는 것을 나타낸다. 도 4B의 MS/MS 스펙트럼으로부터, 모 펩티드의 서열은 새로운 서열화에 의해 결정될 수 있다. 펩티드 서열은 (I/L)(Q/K)H(Q/K)RF를 제공하는 b- 및 y-형 이온을 발견함으로써 위를 아래로 또는 아래를 위로 하는 방식으로 결정될 수 있다. -42 amu 피크에 의해 나타난 바와 같이, 펩티드 서열에 I 가 있기 때문에, 펩티드 서열은 I(Q/K)H(Q/K)RF 로 될 수 있다. 모 펩티드 서열에 존재하는 I/L 동질량의 쌍으로부터 오직 하나의 아미노산이 존재함에 따라, -42 amu 질량 피크는 MS/MS 단편화를 실행할 필요가 없다. IGHGRF에 대한 -142 amu 피크가 없기 때문에, 펩티드는 하나의 Q와 하나의 K를 가져야 한다. 서열 내에서 Q의 위치를 확인하기 위해서, 질량 피크 840에 대해 MS/MS 분석을 실시하였다. 도 4C는 -71 amu 피크(m/z = 840)의 MS/MS 스펙트럼으로부터 서열화하는 것을 나타낸다. 펩티드 서열에 G가 존재한다는 것은, 그 위치에 Q가 존재한다는 것을 나타낸다. 결과적으로, 최종 서열은 IQHKRF (SEQ ID NO:1)이어야 한다.
실시예 5
본 실시예에서는 10% 절단 가능한 OBOC 펩티드 라이브러리로부터 펩티드를 서열화하는 것에 대해 설명하고 있는데, 여기서 펩티드는 동질량의 아미노산을 함유한다. bCAII에 대해 OBOC 헥사머 펩티드 라이브러리를 스크린하여 얻어지고, 여기서 펩티드의 10% 만이 절단 가능한 메티오닌 링커 기를 갖는 히트 펩티드는 동질량의 분별법으로 연속적으로 서열화될 수 있다. 비드 상에 10% 만의 펩티드를 가짐에 따라, 링커 기가 스크린 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 링커 기는 중요한 결과를 가져온다. 도 5는 스크린으로부터 8개의 히트 서열을 나타낸다.
가장 밝은 비드로부터 히트 펩티드의 질량 스펙트럼에 대한 예를 도 6에 나타냈다. MS/MS 분석법에 의해 결정된 펩티드 (모 m/z = 955)의 서열은 H(I/L)RY(Q/K)R 이었다. 모 피크보다 더 작은 42 amu를 갖는 m/z 931에서의 피크는 I가 존재하였다는 것을 나타낸다. 그러므로 서열은 HIRY(Q/K)R 으로 밝혀졌다. 모 피크보다 더 작은 피크 71 amu 가 없기 때문에, Q는 존재하지 않는다. 그 결과, 최종 펩티드 서열은 HIRYKR (SEQ ID NO:2)이다.
이러한 IRYKR의 펩티드 서열은 절단 가능한 링커를 함유하지 않는 회수된 비드 상에 남아 있는 90%의 펩티드의 Edman 분해에 의해 확인될 수 있다 (도 7). 도 7로부터, 펩티드에 존재하는 아미노산의 형태와 위치를 HPLC에 의해 확인할 수 있다. 각각의 개별적인 HPLC 스펙트럼은 보유 시간을 일치함으로써 아미노산 표준과 비교되었다. HPLC 분석 결과, 서열 내의 제1 아미노산은 H이고, 서열 내의 제2 아미노산은 I임이 밝혀졌다. 펩티드 내의 제2 위치에 있어서, 10% A가 I의 커플링에서 태그로서 첨가되었기 때문에, A에 상응하는 더 작은 피크는 I에 상응하는 피크 이외의 스펙트럼에 나타내진다. 그러므로 Edman 분해에 의해 발생된 펩티드 서열은 MALDI-TOF/TOF에 의해 얻어진 서열과 일치한다.
HIRYKR의 '히트' 펩티드 서열은 재합성되었고, 그 결과 단백질에 대한 펩티드의 친화력은 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정될 수 있다. Titan 357 자동화 합성기 (AAPPTEC) 내의 반응 용기(RV)를 반응기로서 사용하였다. 링크(Rink) 아미드 수지 (200 mg, NH2 로딩: 0.29 mmol/g)를 NMP (5 ml) 중에서 2 시간 동안 평형에 이를 때까지 팽윤한 다음, 용매를 배출하였다. Fmoc-d-Arg(Pbf)-OH (2 당량, NMP 중 0.2 M 용액), TBTU (2 당량, NMP 중 0.2 M 용액), 및 DIEA (5 당량, NMP 중 0.2 M 용액)를 연속적으로 첨가하고, 그 결과 얻어진 비드를 30 분 동안 교반하였다. 액체를 배출시킨 후, 시약 용액의 새로운 부분을 사용하여 커플링 단계를 반복하였다. 그 결과 얻어진 비드를 NMP (3 ml x 4)로 완전히 세척하였다. 그 다음, NMP (5 ml, v/v) 중 20% 피페리딘을 첨가한 후, 반응 용기(RV)를 5 분 동안 교반하였다. 액체를 배출시키고, NMP(3 ml, v/v) 중 20% 피페리딘의 새로운 용액을 첨가한 후, 반응 용기(RV)를 15 분 동안 더 교반하였다. 그 결과 얻어진 비드를 NMP (3 ml x 4) 및 DCM (3 ml x 4)으로 완전히 세척하였다. fmoc-d-Lys(Trt)-OH, fmoc-d-Tyr(t-Bu)-OH, fmoc-d-Arg(Pbf)-OH, fmoc-Ile-OH, 및 fmoc-d-His(Trt)-OH를 연속적으로 사용하여 상술한 바와 같이 남아있는 아미노산에 대한 커플링을 실시하였다. 비드를 필터가 구비된 8 ml 반응기로 옮긴 후, 트리플루오로아세트산 (TFA)/물/트리이소프로필실란 (TIS) (94/3/3, v/v/v) 3 ml에서 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 절단 용액은 비드를 린스하기 위해 사용된 또 다른 부분의 TFA (3 ml)와 함께 수집되었다. 혼합된 용액은 원심 농축기 GeneVac EZ2 Plus를 사용함으로써 거의 증발되었고, 그리고 디에틸에테르 (약 5 ml)는 원래의 펩티드를 경사분리(decant) 하기 위해 첨가되었다. 준비된 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제를 실시하여 백색 고체(3.5 mg, 순도 >99%)로서 카르복사미드 C-말단을 갖는 HIRYKR 펩티드를 얻었다.
친화력은 실험실 급 CM5 센서 칩(GE Heathcare)이 구비된 B1Acore 3000 시스템 (GE Heathcare)을 사용하여 측정되었다. CM5 센서 칩은 HBS-EP (GE Heathcare) 완충액으로 기구를 도킹(docking) 및 프라임처리한 후 미리 콘디셔닝되었다. 비특이적 결합, 드리프트(drift) 및 벌크 굴절률을 빼기 위해 참고로 플로우 셀 1(또는 3)을 사용하였다. 20 마이크로리터/분의 유속을 이용하여, 센서 칩의 4 플로우 셀은, 아민-커플링 키트 (GE Healthcare) (0.4 M EDC 및 0.1 M NHS의 1:1 혼합물)의 7분 동안 주입하면서 25 ℃에서 활성화되었다. bCAII 표면을 형성하기 위해서, 1 mg의 bCAII을 1 mL의 10 mM 나트륨 아세테이트 (pH 5.0)에 용해시킨 후, 플로우 셀 2에만 주입하였다. bCAII의 약 1000 응답 유닛(RU)이 이러한 표면 상에 부동화되었다. 최종적으로, 1.0 M 에탄올아민 (pH 8.5)을 4개의 플로우 셀을 통해 4분 동안 주입하여 표면을 탈활성화 하였다. bCAII 부동화 후, 실험(running) 완충액(lx PBS + 3% DMSO)을 사용하여 기구를 3회 프라임처리 하였다. HIRYKR 펩티드 (26.13 마이크로그램)를 18 마이크로리터의 DMSO에 용해한 후, HBS-EP 완충액으로 희석하여 50 마이크로몰의 펩티드 스톡 용액을 생성하였다. 펩티드 스톡 용액을 팩터 2에 의해 농도 390 nM까지 연속적으로 희석하였다. 일련의 농도를 갖는 펩티드 용액을 30 마이크로리터/분의 유속으로 25 ℃에서 6 분 동안 플로우 셀 2 (또는 4)로 주입하였다. 플로우 셀 2 (또는 4)는 각 펩티드 용액의 주입 후 글리신 2.5 (GE Healthcare)에 의해 재생되었다. 데이터 프로세싱 및 동역학적 분석은, B1Aevaluation 소프트웨어 (버전 4.1, B1Acore)를 이용하여 실시되었다. SPR 데이터는 시간에 따른 응답 유닛(RUs)의 함수로서 작성되었다(센서그램) (도 8). 1:1 Langmuir 결합 곡선(하나의 리간드 결합에 대한 하나의 분석치)으로 곡선이 작성되었으며, 그리고 분해상수 (KD)는 마이크로몰 범위에 들도록 결정되었다. 이러한 실험에 의해, 히트 펩티드 HIRYKR가 단백질 bCAII에 대해 강한 결합 친화력을 갖고 있다는 서열화 결과를 확인하였다.
본 명세서에서 본 발명에 대한 몇 가지 실시양태를 설명하고 예증하였지만, 본 기술 분야에서 숙련된 사람들은 기능을 실시하고 및/또는 본 명세서에서 설명된 결과 및/또는 1 또는 그 이상의 장점들을 얻기 위한 기타 여러 가지 수단 및/또는 구조를 쉽게 생각해 낼 수 있을 것이며, 그리고 이러한 변형 및/또는 변경의 각각은 본 발명의 범위 내에 속하게 될 것이다. 더욱 일반적으로, 본 기술 분야에서 숙련된 자들은 본 명세서에서 설명된 모든 파라메터, 치수, 물질, 및 구조가 예시적인 것을 의미하며, 그리고 실제적인 파라메터, 치수, 물질, 및/또는 구조가 특정 분야 또는 본 발명의 가르침이 이용되는 분야에 따라 달라지게 된다는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 본 기술 분야에서 숙련된 자들은 일상적인 실험 이외의 것들, 그리고 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시양태와 동일한 수많은 것들을 인식할 수 있고, 확인할 수 있을 것이다.
그러므로, 상기 실시양태는 예시적인 목적으로만 제공되며, 그리고 첨부된 특허청구범위 및 그에 해당 사항 내에서 본 발명이 특별히 설명되고 청구된 것 이외로 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 본 명세서에서 설명한 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법들이 서로 불일치하지 않는다면, 2 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법들을 어떠한 방법으로도 조합하는 것은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 명세서의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 기재된 모든 정의는 사전적 정의 및 본 명세서에서 참고로 하는 문헌에서의 정의 및/또는 한정된 용어의 일반적인 의미를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 사용된 부정 관사 "a" 및 "an"은, 별도로 분명히 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 "및/또는"이란 용어는, 상기와 같이 결합된 요소, 즉 어떤 경우에 결합하여 존재하는 요소 그리고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소의 "어느 하나 또는 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 열거된 다수의 요소들은 동일한 방식, 즉 상기와 같이 결합된 요소의 "1 또는 그 이상의"로 해석되어야 한다. 특별히 확인된 요소들과 관련되거나 관련되지 않을지라도. 기타 요소들은 "및/또는" 용어로 특별히 확인된 요소 이외에 임의로 존재할 수 있다. 이와 같이, 비제한적인 예로서, “포함하는”과 같이 오픈-엔드 언어와 관련하여 사용될 때, "A 및/또는 B"는, 일 실시양태에서 A 만 (B 이외의 요소를 임의로 포함)을 의미하고; 또 다른 실시양태에서 B 만(A 이외의 요소를 임의로 포함)을 의미하고; 또 다른 실시양태에서는 A 및 B 모두(기타 요소들을 임의로 포함)을 의미한다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, "또는"이란 용어는 상술한 바와 같이 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 리스트에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 즉, 숫자 또는 요소의 수 및 임의적으로는 추가적인 항목 중 적어도 하나를 포함할 뿐만 아니라 1보다 큰 것을 포함하는 의미로 해석되어야 한다.
별도로 분명하게 언급되지 않은 용어, 이를테면 "오직 하나 또는 "정확히 하나" 또는, 청구범위에서 "구성되는"은 숫자나 요소 리스트의 정확히 한 요소를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로, 본 명세서에서 "또는"이란 용어는 "어느 하나", "중 하나", "중 오직 하나" 또는 "중 정확히 하나"와 같이 배제성을 띄는 용어로 나올 때 배타적인 용어(즉 "하나 또는 다른 것, 그렇지만 둘은 아닌 것)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 특허청구범위에서 사용되는 "주로 구성되는"이란 용어는 특허법 분야에서 사용되는 일반적인 의미를 갖는다.
본 명세서의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 1 또는 그 이상의 요소에 대한 리스트와 관련하여 “적어도 하나”라는 용어는, 요소의 리스트에서 1 또는 그 이상의 어떠한 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해하여야 하지만, 요소의 리스트 내에 특별히 열거된 매 요소들 중 적어도 하나를 포함하고 요소의 리스트 중 어떠한 조합의 요소들을 반드시 포함하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해하여야 한다.
특별히 확인된 상기 요소들과 관련이 있든 없든 간에, 이러한 정의는 또한 "적어도 하나"라는 용어가 관련된 요소의 리스트 내에서 특별히 확인된 요소들 이외에 요소들이 선택적으로 존재할 수 있다는 것이 가능하다. 그러므로 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는, 동등하게는, “A 또는 B 중 적어도 하나" 또는, 동등하게는 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 일 실시양태에서 적어도 하나, 임의적으로는 1 보다 큰 것, A, B가 존재하지 않는 것(및 B 이외의 요소들을 임의로 포함)을 의미할 수 있고; 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나, 임의적으로는 1보다 큰 것, B, A가 존재하지 않는 것(및 A 이외의 요소들을 임의로 포함)을 의미할 수 있고; 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나, 임의적으로는 1보다 큰 것, A, 및 적어도 하나, 임의적으로는 1보다 큰 것, B (및 기타 요소들을 임의로 포함)를 의미할 수 있다.
또한, 별도 언급이 없는 한, 1 단계 이상을 포함하여 청구된 어떠한 방법에서, 방법의 단계나 동작의 순서는, 방법의 단계나 동작이 인용되는 순서에 제한될 필요가 없는 것으로 이해되어야 한다.
상세한 설명 및 특허청구범위에서, "포함하는", "갖는", "함유하는", "유지하는", "이루어진“ 등과 같은 표현은 제한적이지 않은 표현으로 이해되어야 한다. "구성되는” 및 "본질적으로 구성되는“이라는 표현만이, 미국특허청, 특허심사 규정 매뉴얼, 섹션 2111.03에 규정된 바와 같이, 각각 폐쇄적 또는 반폐쇄적인 표현이다.
100, 200: 입자 110, 210: 프로브 엔티티
130, 230: 태깅 엔티티 120, 216, 222: 동질량의 그룹 멤버
140: 태깅 종 150, 250: 링커
160: 펩티드 181, 280: 질량 스펙트럼
182, 184, 282, 284: 모 피크
<110> Agency for Science, Technology and Research Heath, James R Lee, Su S Lim, Jaehong Cha, Junhoe Tan, Sylvia Yeo, Shi Y <120> Differentiation of Isobaric Amino Acids and Other Species <130> S1507.70018WO00 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Ile Gln His Lys Arg Phe 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 His Ile Arg Tyr Lys Arg 1 5

Claims (35)

  1. 아미노산 서열을 표면에 성장하는 단계를 포함하고, 여기서 아미노산 서열 내의 아미노산 중 적어도 하나가 동질량의 아미노산이고, 그리고 동질량의 아미노산이 서열에 노출된 배지에 첨가될 때, 동질량의 아미노산을 함유하는 배지가, 아미노산 서열에 혼입될 수 있고 동질량의 아미노산과 다른 분자량을 갖는 엔티티를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 아미노산 서열의 적어도 일부가 절단 가능한 링커에 의해 표면에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 질량 분석법에 의해 아미노산 서열을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 질량 분석법이 MALDI-TOF/TOF를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 아미노산 서열을 분석하는 방법이 아미노산 서열을 서열화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나에 있어서, 동질량의 아미노산이 인조 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나에 있어서, 엔티티가 인조 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 서열과 동일한 수의 아미노산 잔기를 갖는 제1 아미노산 서열 및 제2 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 제2 아미노산 서열은, 제1 아미노산 서열이 제1 동질량의 아미노산을 함유하고, 그리고 제2 아미노산 서열이 제1 아미노산과 다른 분자량을 갖는 제2 아미노산을 함유하는 1 또는 그 이상의 부위를 제외하고, 제1 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 제1 아미노산 서열 및 제2 아미노산 서열을 포함하는 입자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 제1 아미노산 서열 및 제2 아미노산 서열이 각각 절단 가능한 링커에 의해 입자에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 절단 가능한 링커가 메티오닌 잔기인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 8항 내지 제 11항 중 어느 하나에 있어서, 동질량의 아미노산이 류신 또는 이소류신인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 8항 내지 제 12항 중 어느 하나에 있어서, 동질량의 아미노산이 리신 또는 글루타민인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 8항 내지 제 13항 중 어느 하나에 있어서, 상기 동질량의 아미노산이 인조 아미노산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 8항 내지 제 14항 중 어느 하나에 있어서, 제2 아미노산이 인조 아미노산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 절단 가능한 모이어티를 통해 제1 아미노산 서열 및 제2 아미노산 서열이 각각 부착되는 표면을 포함하고, 제2 아미노산 서열이 제1 서열과 동일한 수의 아미노산 잔기를 갖고, 여기서 제2 아미노산 서열은, 제1 아미노산 서열이 제1 동질량의 아미노산을 함유하고, 그리고 제2 아미노산 서열이 제1 아미노산과 다른 분자량을 갖는 제2 아미노산을 함유하는 1 또는 그 이상의 부위를 제외하고, 제1 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 아티클.
  17. 제 16항에 있어서, 절단 가능한 잔기가 메티오닌 모이어티인 것을 특징으로 하는 아티클.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 동질량의 아미노산이 류신 또는 이소류신인 것을 특징으로 하는 아티클.
  19. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 동질량의 아미노산이 리신 또는 글루타민인 것을 특징으로 하는 아티클.
  20. 제 16항 내지 제 19항 중 어느 하나에 있어서, 동질량의 아미노산이 인조 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 16항 내지 제 20항 중 어느 하나에 있어서, 제2 아미노산이 인조 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 질량 분석법을 이용하여, 제1 서열과 동일한 수의 아미노산 잔기를 갖는 제2 아미노산 서열로부터 제1 아미노산 서열을 분별하는 단계를 포함하고, 여기서 제2 아미노산 서열은, 제1 아미노산 서열이 제1 동질량의 아미노산을 함유하고, 제2 아미노산 서열이 제1 아미노산과 다른 분자량을 갖는 제2 아미노산을 함유하는 1 또는 그 이상의 위치를 제외하고, 제1 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 제1 및 제2 아미노산 서열을 질량 분석하기 전에 제1 및 제2 아미노산 서열을 일반 입자로부터 사실상 동시에 절단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 질량 분석법이 MALDI-TOF/TOF를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 하나에 있어서, 제2 아미노산 서열이 제1 아미노산 서열의 모 피크 m/z 값과 다른 모 피크 m/z 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 하나에 있어서, 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 22항 내지 제 26항 중 어느 하나에 있어서, 동질량의 아미노산이 인조 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 22항 내지 제 27항 중 어느 하나에 있어서, 제2 아미노산이 인조 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 표면에 부착된 아미노산 서열을 제1 아미노산 종 및 제2 아미노산 종으로 이루어진 동질량 그룹의 멤버인 동질량의 아미노산을 함유하는 용액에 노출하는 단계를 포함하고, 아미노산 서열에 혼입된 동질량의 아미노산이 제1 아미노산 종일 때, 용액이 아미노산 서열에 혼입 가능하고, 동질량의 아미노산과 다른 분자량을 갖는 엔티티를 더 포함하고, 그리고 아미노산 서열에 혼입된 동질량의 아미노산이 제2 아미노산 종일 때, 용액에 혼입 가능한 엔티티가 사실상 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 아미노산 서열 중 적어도 일부가 절단 가능한 링커에 의해 표면에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 질량 분석법에 의해 아미노산 서열을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 질량 분석법이 MALDI-TOF/TOF를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 아미노산 서열을 분석하는 방법이 아미노산 서열을 서열화 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 29항 내지 제 33항 중 어느 하나에 있어서, 동질량의 아미노산이 인조 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 29항 내지 제 34항 중 어느 하나에 있어서, 엔티티가 인조 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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