CN102648312B - 同质量氨基酸和其它物质的区分 - Google Patents
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Abstract
描述了用于区分同质量物质的技术。一方面,同质量物质被可使用质谱鉴定的标记物质取代。同质量物质可为具有确定序列的第一聚合物的亚单元,例如同质量物质可为蛋白质或肽序列中的氨基酸。标记物质可取代第二聚合物中的同质量物质,所述第二聚合物具有与第一聚合物其它方面相同的序列。例如,第二聚合物可具有与第一聚合物相同数目的序列,和基本上相同的亚单元序列,少数例外为例如代替同质量物质的标记物质。在一些实施方式中,第一聚合物和第二聚合物在相同的反应容器中基本上同时制备。具有确定的亚单元序列且包含同质量物质或标记物质的聚合物(例如蛋白质)可通过质谱分析来测定聚合物的序列。
Description
技术领域
本发明大体上涉及区分同质量物质(isobaric species)。在一些实施方式中,区分同质量氨基酸。
背景技术
拆分和混合(split-and-mix)合成方法已被用于制备小珠上的肽文库,其中每个珠包含单一的肽分子。此类文库被称为一珠一化合物(one-bead-one-compound,OBOC)的文库。OBOC文库通常被用于从文库中鉴定发挥一些目的功能的分子。例如,通过筛选文库中与特定蛋白连接的珠(“命中”珠(“hit”beads)),可使用OBOC文库来鉴定与所述蛋白结合的分子(即肽)。命中珠可与其余文库分离,且可使用肽测序方法来确定特定命中珠上肽的身份。
由于存在无法通过质谱区分的相似质量的氨基酸(即同质量氨基酸(isobaric amino acid)),所以使用质谱的肽测序很复杂。因此,需要有区分同质量氨基酸的方法。
发明内容
本发明大体上涉及区分同质量物质的方法。在一些实施方式中,区分同质量氨基酸。在一些实例中,本发明的主题涉及相关产品、对特定问题的可选方案、和/或一种或多种系统和/或制品的多种不同应用。
一方面,本发明涉及方法。在一组实施方式中,所述方法包括在表面上生长多个氨基酸序列的步骤。在一些实例中,所述氨基酸序列中的至少一个氨基酸为同质量氨基酸。在某些实施方式中,当将同质量氨基酸加入至暴露于待添加氨基酸的序列的介质中时,含有同质量氨基酸的介质还含有可掺入氨基酸序列中的实体,所述实体具有不同于所述同质量氨基酸的分子量。
在另一组实施方式中,所述方法包括使用质谱来区分第一氨基酸序列和与所述第一序列具有相同数目氨基酸残基的第二氨基酸序列。在一些实施方式中,除了在一个或多个位置处第一氨基酸序列含有第一同质量氨基酸外,第二氨基酸序列与第一氨基酸序列相同。在一些实例中,第二氨基酸序列含有具有与第一氨基酸不同的分子量的第二氨基酸。
根据本发明的另一组实施方式,所述方法包括将连接表面的氨基酸序列暴露于含有同质量氨基酸的溶液。在一些实施方式中,所述同质量氨基酸是由第一氨基酸物质和第二氨基酸物质组成的同质量组(isobaric group)的成员。在某些实例中,当掺入氨基酸序列中的同质量氨基酸为第一氨基酸物质时,溶液还包含可掺入氨基酸序列中的实体,所述实体具有不同于所述同质量氨基酸的分子量。在一些实例中,当加入氨基酸序列中的同质量氨基酸为第二氨基酸物质时,溶液基本上不含可掺入的实体。
另一方面,本发明涉及组合物。在一组实施方式中,所述组合物包括第一氨基酸序列和与所述第一序列具有相同数目氨基酸残基的第二氨基酸序列。在一些实例中,除了在一个或多个位置处第一氨基酸序列含有第一同质量氨基酸外,第二氨基酸序列与第一氨基酸序列相同。在某些实例中,第二氨基酸序列包含具有与第一氨基酸不同分子量的第二氨基酸。
另一方面,本发明涉及制品。根据一组实施方式,所述制品包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列分别经由可裂解部分连接的表面。在一些实施方式中,第二氨基酸序列与第一序列具有相同数目的氨基酸残基。在某些实例中,除了在一个或多个位置处第一氨基酸序列包含第一同质量氨基酸外,第二氨基酸序列与第一氨基酸序列相同。在一些实例中,第二氨基酸序列包含具有与第一氨基酸不同的分子量的第二氨基酸。
从以下详述的本发明各种非限定实施方式并结合附图可更清楚本发明的其它优点和新特征。当本申请文件和通过援引加入的文献相冲突和/或不一致时,以本申请文件为准。如果通过援引加入的两篇或更多篇文献彼此冲突和/或不一致时,以有效日在后的文献为准。
附图说明
本发明的非限制性实施方式通过实施例和参考附图来说明,附图为示意图,而并非按比例绘制。在附图中,每个相同或相近的要素通常用同一个附图标记表示。为了清楚说明,未将所有要素标记在每个图中,也未标记本发明每个实施方式的每个要素,这些说明对本领域普通技术人员理解本发明不是必须的。在附图中:
图1A显示了根据本发明实施方式的分析方法;
图1B显示了根据本发明另一实施方式的分析方法;
图1C显示了根据本发明一个实施方式的逻辑树分析流程图;
图2显示了根据本发明另一实施方式的测序流程图;
图3显示了根据本发明实施方式的命中肽和相应母峰质量的表;
图4A显示了根据本发明另一实施方式的包含同质量氨基酸的命中肽的质谱;
图4B显示了根据本发明实施方式的包含同质量氨基酸的命中肽的母峰的MALDI-TOF MS/MS谱;
图4C显示了根据本发明另一实施方式的比母峰低71Da的质量峰的MALDI-TOF MS/MS谱;
图5显示了根据本发明一个实施方式,用bCAII筛选OBOC六聚体肽文库产生的命中序列的表;
图6显示了根据本发明另一实施方式的包含同质量氨基酸的命中肽的质谱;
图7显示了根据本发明实施方式,来自肽的Edman降解测序的HPLC图;和
图8显示了根据本发明实施方式,将HIRYKR-CONH2和bCAII结合的SPR传感图。
具体实施方式
描述了用于区分同质量物质的技术。一方面,同质量物质被可使用质谱鉴定的标记物质取代。同质量物质可为具有确定序列的第一聚合物的亚单元(subunit),例如同质量物质可为蛋白质或肽序列中的氨基酸。标记物质可取代第二聚合物中的同质量物质,所述第二聚合物具有与第一聚合物其它方面相同的序列。例如,第二聚合物可具有与第一聚合物相同数目的序列,和基本上相同的亚单元序列,少数例外为例如代替同质量物质的标记物质。在一些实施方式中,第一聚合物和第二聚合物在相同的反应容器中基本上同时制备。具有确定的亚单元序列且包含同质量物质或标记物质的聚合物(例如蛋白质)可通过质谱分析来测定聚合物的序列。
一方面,本发明能够测定未知的实体,诸如蛋白质或肽。例如,未知的实体可为肽序列,一些肽序列与所关注的蛋白质靶相互作用,而另一些肽序列与所关注的蛋白质靶无相互作用。未知的实体可暴露于所关注的蛋白质靶,通过将与所关注的蛋白质靶结合或相互作用的未知实体从不与所关注的蛋白质靶结合或相互作用的序列中分离并分析未知实体的结合或相互作用(例如使用质谱),可获得关于未知实体的信息。然而,在一些情况中,一些未知的实体可包含同质量物质,例如同质量氨基酸,其不能使用诸如某些质谱技术等特定技术来适当地区分。
同质量物质为具有不同分子结构,但具有无法区分的质量的物质。例如,同质量物质可彼此为结构异构体,或包含不同原子但原子量总和仍为相同。同质量组成员是指无法与同质量组的其它成员区分的成分(composition)(例如,具有相同质量的两种氨基酸)。同质量组的实例包括亮氨酸/异亮氨酸和谷氨酰胺/赖氨酸。同质量组成员可为任何类型的成分。例如,同质量组成员可为单个分子(即氨基酸、核苷酸、糖等)或分子的组(即二聚体、三聚体、四聚体等)。
在一些情况中,在经历化学转化后,同质量物质可能无法与同质量组的其它成员区分。也就是说,在经历化学转化后,同质量物质可能无法充分区分。例如,当掺入聚合物中时,同质量组的两个成员可能是或可能不是同质量(即可通过质量区分);然而,通过诸如质谱等技术的分析,同质量组中的一个或多个成员可经历化学转化(即片段化、离子化等),使得无法基于质量将它们彼此分开。应理解,在一些实施方式中,在通过第一种技术分析可能为同质量的一些物质在通过第二种技术分析时不必然是同质量。
现将描述非限制性实例。图1A显示了颗粒100,其具有经由接头150与颗粒表面连接的探针实体110和标记实体130。应理解,虽然颗粒描述在图1A中,其仅是示例,且在其它实施方式中,可使用其它系统,如探针实体或标记实体可在溶液中、与平面基材连接等。探针实体110包括选自亚单元库的亚单元序列,且包括同质量组成员120(即同质量组成员120与亚单元库中的一种或多种其它亚单元具有相同质量)。标记实体130包括与探针实体110相同的亚单元序列,区别在于同质量组成员被标记物质140取代,所述标记物质140具有与同质量组成员120不同的质量。标记物质编码探针实体110中同质量组成员120的存在。探针实体和标记实体可经由例如接头150从颗粒中裂解下来,如下所述,以形成混合物,所述混合物随后通过质谱(或其它技术)分析以产生质谱180。因为探针实体和标记实体的区别仅为分别存在同质量组成员和标记物质,所以混合物的质谱显示出探针实体母峰182,其与标记实体的母峰184不同,质量差异量通常等于同质量组成员和标记物质之间的质量差。因此,在此实例中,具有此质量差异的两个峰的存在表明探针实体中同质量组成员的存在。探针实体的母峰182随后进行片段化并进行质量分析,以确定探针实体的存在(质谱181)。质谱181显示按照质量从左至右顺序增加的肽160的片段。通常,峰之间质量的差异表明探针实体中亚单元的质量,且允许例如使用已知或容易获得的技术来鉴定亚单元。
在另一非限制性实施例中,包含两个或更多个同质量组成员的探针实体可使用串联质谱测序。现参照图1B,颗粒200显示出具有经由接头250与颗粒表面连接的探针实体210和标记实体230。探针实体210包括选自亚单元库的亚单元序列,且包括具有相同质量,但化学结构不同的两个同质量组成员216和222。标记实体230包括相同的亚单元序列,区别在于同质量组成员216被标记物质240替代,所述标记物质240具有与同质量组成员216和222不同的质量。标记物质编码探针实体210中同质量组成员216的存在。探针实体和标记实体可从颗粒中裂解下来以形成混合物,所述混合物随后通过质谱分析以产生质谱280。混合物的质谱显示出探针实体母峰282,其与标记实体的母峰284不同,质量差异量通常等于同质量组成员和标记物质之间的质量差。通过片段化对母峰282(即探针实体210)的测序(谱281)表明两个同质量组成员的位置,但无法将它们彼此区分。对裂解的母峰284(即标记实体230)的测序(谱283)表明位置2与同质量组成员具有不同质量,这表明同质量组成员216在位置2,且同质量组成员222在位置4。
因此,根据质谱数据的差异和对颗粒以及它们探针和标记实体的知识,可使用质谱或其它技术来分析诸如肽或蛋白质等聚合物,以测定包含或疑似包含诸如同质量氨基酸等同质量物质的序列。因此,在例如基于与未知实体的相互作用或反应来收集颗粒和它们探针的子集后,可分析探针以确定探针的序列,和关于未知实体的信息(例如序列信息)。
因此,在一些情况中,可如下分析作为至少疑似包含同质量物质的颗粒。参照逻辑树分析流程图,图1C提供了用于分析质谱数据的适合技术的一个非限制性实例。在此实例中,探针实体和标记实体为肽,但应理解,其它探针实体和标记实体也可以类似方式分析。此实施例的流程图开始于获取分离肽样品的质谱(MS谱)。分析探针实体母峰和任何附加峰(即标记实体母峰)的质谱。在一些实施方式中,探针实体和标记实体为全部可能质量均已知的实体文库的成员。因此,可通过例如与探针实体可能质量表的比较来鉴定探针实体的母峰。同样,也可鉴定标记实体的母峰。除探针实体母峰外,如果没有峰存在,则可测序母峰以确定母峰的身份(即可使肽的母峰片段化以测定氨基酸序列)。由于没有标记实体存在,这表明探针实体(1)不包含同质量氨基酸,或者(2)包含不被标记物质编码的同质量氨基酸。例如,对于同质量氨基酸对亮氨酸和异亮氨酸,亮氨酸可由丙氨酸编码,且异亮氨酸可不被编码。因此,如果肽样品的质谱不具有对应于标记实体的第二母峰,则探针实体包含异亮氨酸,或者不包含同质量氨基酸。相反地,如果质谱揭示出对应于标记实体的第二母峰,则探针实体包含亮氨酸。
仍参照图1C,如果除探针实体母峰外,还存在第二母峰,这说明在对应于探针实体同质量氨基酸的第二母峰中存在标记物质。随后测序第一母峰。如果探针实体中不存在多于一个同质量氨基酸,则可仅从测序探针实体的母质量来获得探针实体的序列。然而,如果探针实体中存在多于一个同质量氨基酸,则测序标记实体以测定标记物质的位置(即标记的氨基酸)。在一些情况中,如果探针实体中存在更多的同质量氨基酸,这可以重复。
可使用诸如质谱、质量沉降等任何适合的技术以测定实体的质量。涉及质谱的实施方式中可使用任何质谱技术。例如,可使用诸如MALDI、ESI、FAB等技术来离子化物质。可使用诸如飞行时间(TOF)、四极子、傅里叶变换离子回旋共振、Orbitrap、扇形场等分析仪来测定离子化分析物的质量。在一些实施方式中,可片段化离子以产生次级离子。也可使用诸如串联质谱等技术来片段化次级离子。例如,可使用诸如碰撞引起的解离、电子俘获解离、电子传递解离、红外多光子解离、黑体红外辐射解离等方法来片段化离子。
探针实体可为包含同质量组成员的任何成分。例如,探针实体可包含亚单元。在一些实施方式中,探针实体可为肽,且亚单元可为肽的氨基酸残基。肽可包括任意氨基酸,包括丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、吡咯赖氨酸(pyrrolysine)、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、硒代胱氨酸(selenocysteine)、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸等。其它氨基酸,包括非天然存在的氨基酸也可用在一些情况中,且在一些实施方式中,非天然存在的氨基酸也可和例如其它非天然存在的氨基酸和/或天然存在的氨基酸为同质量。因此,可使用本领域已知的技术来修饰肽。例如,可在N-端和/或C-端修饰肽。也可修饰氨基酸的侧基。在一些情况中,可修饰肽的主链。在一些实施方式中,肽可与另一种聚合物,例如生物聚合物,如核酸和/或多糖连接。肽也可连接其它聚合物,例如聚酯(如聚丙交酯、聚乙交酯、PLGA、聚己酸内酯等)、聚酰胺、聚氨酯、聚酸酐等,和它们的组合。
“氨基酸”具有在生化领域使用的普通含义。分离的氨基酸通常但不总是(例如在脯氨酸的情况中)具有通用结构NH2-CHR-COOH。R可为任何适合的部分,例如,R可为氢原子、甲基或异丙基。通过将一个氨基酸的-NH2和另一个氨基酸的-COOH反应形成肽键(-CO-NH-),可连接一系列分离的氨基酸以形成肽或蛋白质。在此情况中,肽或蛋白质上的每个R基团是指氨基酸残基。氨基酸可为自然界中通常发现的20种氨基酸之一(“天然氨基酸”)或非天然氨基酸(即不为天然氨基酸之一的氨基酸)。非天然氨基酸的非限制性实例包括别异亮氨酸、别苏氨酸、高苯丙氨酸、高丝氨酸、高半胱氨酸、5-羟基赖氨酸、4-羟基脯氨酸、4-羧基谷氨酸、磺基丙氨酸、环己基丙氨酸、乙基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、3-氨基丁酸、β-氨基酸(如β-丙氨酸)、N-甲基化的氨基酸(如N-甲基甘氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基缬氨酸、N-甲基亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基正亮氨酸、N-甲基-2-氨基丁酸、N-甲基-2-氨基戊酸)等以及天然氨基酸的D异构体。
标记实体可与探针实体相同,或在其它情况中,标记实体可在一个或多个位置上区别于探针实体。例如,标记实体可包括以相同顺序排列的相同亚单元,但与探针实体的区别为一种或多种对应亚单元被标记物质取代。例如,肽类探针实体可包含来自包含第一氨基酸和第二氨基酸的同质量组的第一氨基酸,而具有区别于同质量组成员的质量的标记物质可取代第一氨基酸(即标记物质“编码”第一氨基酸)。在一些实施方式中,第一标记物质可取代第一氨基酸,且第二标记物质可取代第二氨基酸。
标记物质可为能区分同质量组成员(如通过质量差异)的任何成分。在一些实施方式中,标记物质可为能掺入聚合物中的成分。例如,标记物质可为氨基酸、核苷、糖等。在一些实施方式中,标记物质可为这样的成分,其取代聚合物中的亚单元,但与聚合物中的其它亚单元不属于相同的化学基团。例如,标记物质可具有氨基和羧基,使得其可加入到肽中,但可不为氨基酸。
在一些情况中,探针实体和标记实体可连接至表面,如颗粒的表面、平面基材的表面等。实体可通过任何适合的方法连接。例如,表面可具有与其连接官能团,探针实体和/或标记实体可连接于所述官能团。实体可使用共价键、离子键、范德华力、疏水相互作用等连接至表面。可使用诸如酯、酰胺、醚、酸酐、聚氨酯等化学键将实体与表面连接。在一些实施方式中,可使用金属-硫键(即金-硫)将实体连接至表面。
在一些实施方式中,可使用可裂解接头将实体与表面(即颗粒)连接。此类接头是例如在固相肽合成和固相寡核苷酸合成中本领域技术人员已知的。在一些实例中,可使用甲硫氨酸残基作为接头。甲硫氨酸接头可通过诸如CNBr等试剂裂解,此试剂在甲硫氨酸残基的碳末端裂解肽键。可使用的其它类型接头的实例包括可酸裂解接头、可碱裂解接头、可光裂解接头和可氧化还原裂解接头(如高碘酸盐、2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌(DDQ)、硝酸铈(IV)铵(CAN)介导的那些)等。可裂解接头在对实体为基本上温和的条件下易于裂解。在其它实施方式中,除在接头处被裂解外,实体可在一个或多个位置处被裂解。
在一些方面中,探针实体和标记实体基本上可同时合成。例如,在肽实体的实例中,可使用本领域技术人员已知的固相合成技术,通过向相同反应器中的生长中的肽链顺序加入氨基酸残基来基本上同时合成探针实体和标记实体。当希望向肽链加入特定的非同质量氨基酸时,可将肽链暴露于包含基本上一种非同质量氨基酸的反应混合物。相反,为了向被分配标记物质(即具有不同质量的另一种氨基酸)的肽链中加入同质量氨基酸,可将肽暴露于包含同质量氨基酸和标记物质的组合的反应混合物。同质量氨基酸与标记物质的比例可为任何适合的比例,例如小于约100∶1、小于约10∶1、小于约5∶1、小于约2∶1、小于约1∶1、小于约1∶2、小于约1∶5、小于约1∶10、小于约1∶100等。
在一些实例中,可制备探针实体和标记实体的文库。在一些实例中,实体的文库可与颗粒(即珠)连接。例如,在一些实施方式中可产生一珠一化合物(OBOC)的文库。OBOC文库通常包含多个珠,其中每个珠连接单一化合物(即探针实体)的一个或多个拷贝。例如,第一珠可连接具有第一序列的第一肽,且第二珠可连接具有第二序列的第二肽,所述第二序列通常不同于第一序列。在此实例中,应理解每个珠也可连接对应于与珠连接的探针实体的标记实体。肽OBOC文库可根据本领域技术人员已知的拆分和合并(split-and-pool)合成技术来产生。
在一些实施方式中,希望知道何种文库成员(如果存在)与感兴趣的靶(即蛋白质)相互作用。可使文库成员接触适合的感兴趣的靶,且与感兴趣靶结合的成员可使用诸如荧光分选等本领域已知的技术来富集。此过程可重复一次或多次,以缩小“命中”(即与靶结合的文库成员)的数目。分离的命中物可随后进行上述方法以确定命中物的身份。感兴趣的靶包括生物聚合物,如蛋白质、核酸和多糖,以及特定组合物。
提供以下实施例,其用于说明而非限制本发明。
实施例1
此实施例说明了OBOC六聚体肽文库的合成。肽文库的“拆分和合并”合成使用自动合成仪(Titan 357,AAPPTEC)进行。TentaGel S氨基珠(2.2g,90微米直径,装载NH2:0.24mmol/g)在收集容器(CV)的NMP(27ml)中吸胀2小时。为了掺入100%甲硫氨酸作为接头,在排干溶剂后,向CV中加入fmoc-Met(2当量,0.2M NMP溶液)、TBTU(2当量,0.2M NMP溶液)和DIEA(5当量,0.5M NMP溶液)。将获得的混合物涡旋30分钟。将溶液排干,并使用新制的试剂溶液重复偶联步骤。所得珠用NMP(27ml x 4)充分清洗。随后,加入20%哌啶的NMP(27ml)溶液,并将CV涡旋5分钟。将液体排干,并加入20%哌啶的NMP(27ml)新制溶液,将CV另外涡旋15分钟。将所得珠用NMP(27ml x 4)和DCM(27ml×4)充分清洗,随后等量分配入11个反应容器(RV)中。将作为不同成分的11种所选Fmoc保护的D-氨基酸中的一种(F、H、K、L、R、S、V、W、Y,Q和G的9∶1混合物,I和A的9∶1混合物,每种3当量)、TBTU(3当量)和DIEA(7.5当量)加入到每个RV中。随后将RV涡旋30分钟。在排干溶液后,重复偶联步骤。将每个RV中的所得珠用NMP(2ml×4)清洗。此外,将20%哌啶的NMP(2ml×4)溶液加入每个RV,并涡旋15分钟。将液体排干,并加入20%哌啶的NMP(2ml×4)新制溶液,另外涡旋30分钟。将每个RV中的珠用NMP(2ml×4)和DCM(2ml×4)充分清洗,随后合并到CV。重复全部拆分、偶联、去保护和混合方法,直至珠附带不包括初始甲硫氨酸的六聚体。将珠转移至安装有过滤器的50ml反应器中。将残留物中的保护基团通过在TFA-水-TIS(27ml,94∶3∶3,v/v)中摇动2小时去除。将液体排干,并将所得珠用DCM(27ml×3)、甲醇(27ml×3)、水(27ml×3)、甲醇(27ml×3)、DCM(27ml×3)和二乙醚(27ml)连续充分清洗,随后在减压下干燥24小时。
实施例2
此实施例说明了文库筛选。选择647蛋白标记试剂盒(A20173,Invitrogen)作为用于按照生产商说明标记牛碳酸酐酶(bCAII)的活性染料。简言之,将0.5mL bCAII溶液(0.1M碳酸氢钠(pH~8.3)中的2mg/mL bCAII)转移至活性染料瓶中,将瓶盖好且颠倒数次以完全溶解染料。将反应混合物在室温和黑暗条件下搅拌1小时。使用试剂盒中的排阻纯化树脂从混合物中纯化647标记的bCAII(bCAII-A647)。在SDS-PAGE后,通过NanoDrop(Thermo Scientific)和凝胶记录仪(Typhoon)表征纯化和标记的bCAII-A647。将干燥的文库树脂(200mg)转移至8mLAlltech容器中,并在封闭液,0.05%NaN3、0.1%吐温20和0.1%BSA的PBS缓冲液(pH 7.4)中,在室温360°摇床上预孵育1小时。将缓冲液真空排干,随后将在封闭液中稀释的5mL 50nM染料标记的bCAII加入膨胀的树脂。将所得混合物在360°旋转热摇床上,在25℃孵育15小时。将液体真空排干,并将非特异性结合的蛋白通过连续用封闭液清洗3次和用0.1%吐温20的PBS溶液清洗7次来清除。在严格性清洗后,将200mg测定的文库树脂转移至COPAS Plus样品容器(Union Biometrica)中,并用200mL0.1%吐温20的PBS缓冲液稀释。
使用COPAS Plus将命中珠分选进入96孔板的锥形孔中。定义设门和分选区域,以在COPAS Plus上分选珠。基于珠的飞行时间(TOF)和红色荧光,定义珠的设门区域,且在用bCAII-A647孵育后,基于珠的飞行时间(TOF)和均匀红色荧光,选择分选区域以选择珠。使用两步分选策略以快速和有效的分选。第一次分选在高浓度条件下纯化珠(>1000珠/mL)。在第一阶段分选期间,使用去离子水作为保护溶液(sheath solution)来分选PBS中200mg(约300,000珠)的测定文库珠。使样品杯中的珠通过流动室并以>100对象/s的速率通过流体动力学聚集。珠的TOF、红色荧光和红色荧光峰高度使用红色二极管激光(λ=635nm)检测。由于珠的自发荧光,有意地关闭氩离子激光,以最小化渗透(bleed-through)效应。在第一次分选中收集小于5,000珠(小于珠总数的1.7%)。对于第二步骤的分选,将从第一步骤分选的珠用去离子水充分清洗,转移至COPAS Plus的样品杯中,并用100mL去离子水稀释。使样品杯中的珠以<5对象/s的速率通过流动池。将每个命中珠直接分选到具有锥形孔的96孔板中。
实施例3
此实施例说明了肽的MALDI质谱。将CNBr(10微升,0.2N HCl溶液中0.50M)加入至实施例2的96孔板的每个孔中,且将板用氩气吹洗并微波1分钟。将所得溶液在离心真空下浓缩2小时。
向每个小瓶或孔中加入CHCA(10微升,乙腈/水(70∶30)的0.5%溶液)和然后加入乙腈/水(10微升,70∶30,包含0.1%三氟乙酸(v/v))。将样品离心2分钟,移出2微升并点样至384孔MALDI-MS板上,将所述板静置15分钟以蒸发样品。
实施例4
此实施例说明了使用质谱对包含同质量氨基酸的肽测序。通过使用同质量区分方法,成功对从实施例2中针对bCAII的OBOC六聚体肽文库筛选出的命中肽进行测序。如实施例1所表明,将甘氨酸(G)用作Q的标记以区分K和Q,且将丙氨酸(A)用作I的标记以区分I和L。图2说明了为获得全部肽序列而使用的方案。首先检查使用MALDI-TOF/TOF获得的MS谱以鉴定除母质量峰外的任何其它质量峰。在此实施例中,比母峰小42amu的峰表明I存在于序列中,比母质量峰小71amu的峰表明Q存在于序列中。母峰的序列通过分析其MS/MS谱获得。如果序列仅包含一个L/I或一个K/Q,则L/I将为I,而K/Q将为Q。然而,如果母肽包含大于一个K/Q或一个L/I,则对其它质量峰进行MS/MS片段化以鉴定同质量氨基酸I或Q的位置。
将图2的测序方案应用于图3所示的针对bCAII从六聚体文库筛选出的命中肽。命中肽是指与靶蛋白具有结合作用的肽。在进行质量分析前,来自59个命中珠的肽首先从珠上裂解下来。
图4A-4C说明了测序包含同质量氨基酸的命中肽的实例。在图4A中,释放自单个珠的肽的MS谱显示出除母峰外的两个额外的小峰。具有最高强度的母峰具有911的m/z值。其它两个小峰与母质量的差异m/z-42amu和-71amu。如图2中分析所示,存在具有869m/z值的峰表明I存在于序列中,而存在具有840m/z值的峰表明Q存在于序列中。母肽的序列可通过从头测序从图4B的MS/MS谱中测定。肽序列可通过分别发现产生(I/L)(Q/K)H(Q/K)RF的b-和y-类离子,从上到下或从下到上来测定。因为-42amu峰表明肽序列中有I,所以肽序列应为I(Q/K)H(Q/K)RF。-42amu质量峰并非必须经历MS/MS片段化,因为仅有一个来自母肽序列中存在的I/L同质量对的氨基酸。由于IGHGRF没有-142amu峰,所以此肽应具有一个Q和一个K。为了鉴定序列中Q的位置,对840质量峰进行MS/MS分析。图4C显示来自-71amu峰MS/MS谱的测序(m/z=840)。肽序列中G的存在确定了此位置中Q的存在。因此,最终的序列应为IQHKRF(SEQ IDNO:1)。
实施例5
此实施例表明来自10%可裂解OBOC肽文库的肽的测序,其中所述肽包含同质量氨基酸。从针对bCAII筛选OBOC六聚体肽文库获得的命中肽可通过同质量区分来成功地测序,其中仅有10%的肽具有可裂解的甲硫氨酸接头基团。使珠上仅10%的肽具有接头基团具有重要意义,因为接头基团可影响筛选结果。图5显示了来自筛选的8种命中序列。
图6说明了来自最亮珠的命中肽的质谱的实例。通过MS/MS分析测定的肽(母峰m/z=955)的序列为H(I/L)RY(Q/K)R。比母峰小42amu的m/z 931处的峰表明存在I。因此,此序列为HIRY(Q/K)R。因为没有比母峰小71amu的峰,所以不存在Q。因此,最终肽序列为HIRYKR(SEQ ID NO:2)。
此HIRYKR肽序列可通过回收珠上剩余90%肽的Edman降解来确认,所述回收珠不包含可裂解的接头(图7)。从图7中,肽中存在的氨基酸的类型和位置可通过HPLC确定。通过将停留时间相匹配,将每个单独的HPLC谱与氨基酸标准品进行比较。HPLC分析表明序列中的第一氨基酸为H,且序列中的第二氨基酸为I。对于肽中第二位置,除了对应于I的峰外,在谱中可见到对应于A的较小峰,因为加入10%的A以作为I偶联处的标记。因此,通过Edman降解产生的肽序列匹配通过MALDI-TOF/TOF获得的序列。
再合成HIRYKR的“命中”肽序列,使得可通过表面等离子体共振(SPR)测定肽和蛋白质的亲和力。将Titan 357自动合成仪(AAPPTEC)中的RV孔用作反应器。将Rink Amide树脂(200mg,加入NH2:0.29mmol/g)在NMP(5ml)中吸胀至平衡,持续2小时,随后排干溶液。连续加入Fmoc-d-Arg(Pbf)-OH(2当量,0.2M的NMP溶液)、TBTU(2当量,0.2M的NMP溶液)和DIEA(5当量,0.2M的NMP溶液),并将所得珠涡旋30分钟。在液体沥干后,使用新制的部分试剂溶液重复偶联步骤。所得珠用NMP(3ml x 4)充分清洗。随后,加入20%哌啶的NMP(5ml,v/v)溶液,并将RV涡旋5分钟。将液体排干,并加入20%哌啶的NMP(3ml,v/v)新制溶液,将RV另外涡旋混合15分钟。将所得珠用NMP(3ml x 4)和DCM(3ml×4)充分清洗。连续使用fmoc-d-Lys(Trt)-OH、fmoc-d-Tyr(t-Bu)-OH、fmoc-d-Arg(Pbf)-OH、fmoc-Ile-OH和fmoc-d-His(Trt)-OH进行上述剩余氨基酸的偶联。将珠转移至安装有过滤器的8ml反应器中,并在室温下,3ml三氟乙酸(TFA)/水/三异丙基硅烷(TIS)(94/3/3,v/v/v)中孵育2小时。将裂解溶液与用于润洗珠的另一部分TFA(3ml)一起收集。将合并的溶液通过使用离心浓缩器GeneVac EZ2 Plus来最大程度蒸发,并加入二乙醚(约5ml)来倒出粗肽。使用制备HPLC进行最终的纯化,以产生白色固体状的具有咪唑羧酰胺C-末端的HIRYKR肽(3.5mg,纯度:>99%)。
亲和力测定使用安装有研究级CM5传感器芯片(GE Healthcare)的Biacore 3000系统(GE Heathcare)进行。在用HBS-EP(GE Heathcare)缓冲液装入和灌注仪器后,预处理CM5传感器芯片。将流动室1(或3)用作参照以减去非特异性结合的、偏差和本体折射率(bulk refractive index)。使用20微升/min的流动速率,传感器芯片的4个流动室通过胺偶联试剂盒(0.4M EDC和0.1MNHS的1∶1混合物)(GE Healthcare)的7分钟注射在25℃下活化。为了创建bCAII表面,将1mg bCAII溶解在1mL 10mM乙酸钠(pH 5.0)中并仅注射通过流动室2。约1000响应单位(RU)的bCAII固定在此表面上。最终,将1.0M乙醇胺(pH 8.5)注射通过4个流动室,持续4分钟,以使表面去活化。在bCAII固定后,使用运行缓冲液(1x PBS+3%DMSO)灌注仪器三次。将HIRYKR肽(26.13微克)溶解在18微升DMSO中并用HBS-EP缓冲液稀释,产生50微摩尔肽储备液。肽储备液以2倍连续稀释至390nM浓度。在25℃下以30微升/min的流速将一系列浓度的肽溶液注入流动室2(或4),持续6分钟。在注入每种肽溶液后,流动室2(或4)通过甘氨酸2.5(GE Healthcare)再生。数据处理和动力学分析使用Biaevaluation软件(版本4.1,Biacore)进行。将SPR数据绘制为响应单位(RU)对时间(传感图)的函数(图8)。曲线配有1∶1 Langmuir结合曲线(一分析物对一配体结合),且将解离常数(KD)测定为微摩尔的范围。此实验进一步证明此测序结果,即命中肽HIRYKR与蛋白质bCAII具有显著的结合亲和力。
尽管本文已经描述了本发明的若干实施方式,本领域技术人员将容易预见用于实现本文所述功能和/或获得结果和/或一种或多种优点的多种其他方法和/或结构,且这些变化和/或修改均被认为包括在本发明的范围内。更具体地,本领域技术人员将容易理解本文所述的全部参数、尺寸、材料和结构是示例性的,且实际参数、尺寸、材料和/或结构将取决于使用本发明教导的具体应用。本领域技术人员将认识到或能够确定使用不超出常规实验的本文所述发明具体实施方式的许多等同形式。因此,应理解全部前述实施方式仅为示例且在本发明所附权利要求和等价形式范围内,本发明可不按照具体所述和所要求保护来实施。本发明涉及本文所述的各个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外,如果这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不是相互不一致,则任何两种或多种这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的组合可包括在本发明的范围内。
应理解本文所定义和使用的全部定义包括字典的定义、通过援引加入本文的文献中的定义、和/或此定义术语的普通含义。
除非另有说明,说明书和权利要求中所用不定冠词“一”(“a”和“an”)应理解为至少一个。
说明书和权利要求中所用短语“和/或”应理解是指所联在一起的元素关系为“或者”或“两者均”,即在一些情况中联合存在,而在另一些情况中不联合存在的元素。用“和/或”表示的多种元素应以相同方式解释,即“一种或多种”元素联合。除了用“和/或”具体定义的元素,其它元素可任选地存在,无论其与具体定义的那些元素相关或不相关。因此,作为非限制性实施例,当与开放式表述例如“包括”一起使用时,“A和/或B”在一个实施方式中可仅指A(任选地包括B外的其它元素);在另一个实施方式中可仅指B(任选地包括A外的其它元素);在另一个实施方式中指A和B(任选地包括其它元素)等。
如说明书和权利要求中所用,“或”应理解为具有与上述定义的“和/或”相同含义。例如,当将此词分开时,“或”或者“和/或”应理解为包括的,即包括大量或列举的元素和任选地其它未列出的项目中至少一种,但也包括多于一种。只有与之明确相反的术语,例如“仅有一种”或“刚好一种”,或当用在权利要求的“由...组成”中时,是指包括大量或所列元素中的仅一种元素。通常,当用排除性术语之后时,例如“或者”、“之一”、“仅有一种”或“只有一种”,本文所用术语“或”应仅理解为排除性选择(即“一种或其它,但不包括两者均”)。当用在权利要求中时,“基本上由...组成”具有专利法律领域中所用的普通含义。
如说明书和权利要求中所用,关于列举的一种或多种元素,术语“至少一种”应理解为是指选自所列举元素中任何一种或多种元素的至少一种元素,但不必然包括所列举元素内的各种和每种元素的至少一种,且不排除所列举元素内的任何组合。除了术语“至少一种”所指的元素列表中明确指明的元素外,此定义也允许元素任选地存在,无论是否具体指明与那些元素相关或不相关。因此,作为非限制性实例,“A和B中的至少一种”(或等同地“A或B中的至少一种”,或等同地“A和/或B中的至少一种”)在一个实施方式中是指至少一种,任选地包括多于一种A,而没有B(任选地包括B以外的元素);在另一个实施方式中是指至少一种,任选地包括多于一种B,而没有A(任选地包括A以外的元素);在另一个实施方式中是指至少一种,任选地包括多于一种A,和至少一种,任选地包括大于一种B(任选地包括其它元素)等。
也应理解,除非有相反说明,在本文要求保护的任何方法中包括多于一个步骤或工艺,方法中步骤或工艺的顺序不必须限制为所引述方法中步骤或工艺的顺序。
在权利要求书以及上述说明书中,全部过渡短语例如“包括”、“包含”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“涵盖”等应理解为是开放式的,即指包括但不限于。仅有过渡术语“由...组成”和“基本上由...组成”各自应为封闭式或半封闭式过渡术语,如美国专利局专利审查规定手册2111.03节所述。
Claims (40)
1.一种区分同质量氨基酸的方法,包括:
在表面上生长多个氨基酸序列,其中所述氨基酸序列中的至少一个氨基酸为同质量氨基酸,且其中当所述同质量氨基酸被加入至暴露于待添加氨基酸的所述序列的介质中时,含有所述同质量氨基酸的介质还含有可掺入氨基酸序列中的实体,所述实体具有不同于所述同质量氨基酸的分子量,其中所述表面上的所述氨基酸序列由多个氨基酸形成,所述多个氨基酸定义具有相同长度的氨基酸序列。
2.权利要求1的方法,其中所述氨基酸序列中至少一些通过可裂解接头与所述表面连接。
3.权利要求1或2的方法,还包括通过质谱分析所述氨基酸序列。
4.权利要求3的方法,其中所述质谱包括串联质谱。
5.权利要求3的方法,其中所述质谱包括ESI。
6.权利要求3的方法,其中所述质谱包括MALDI-TOF/TOF。
7.权利要求3的方法,其中分析所述氨基酸序列包括对所述氨基酸序列测序。
8.权利要求1的方法,其中所述同质量氨基酸为非天然氨基酸。
9.权利要求1的方法,其中所述实体包括非天然氨基酸。
10.一种区分同质量氨基酸的组合物,其包括:
与多个氨基酸序列连接的颗粒,所述氨基酸序列由第一氨基酸序列和第二氨基酸序列组成,所述氨基酸序列各自由形成相应序列的多个氨基酸定义,所述第二氨基酸序列与所述第一氨基酸序列具有相同数目的氨基酸残基,其中除了在一个或多个位置处所述第一氨基酸序列含有第一同质量氨基酸而所述第二氨基酸序列含有与所述第一同质量氨基酸相比具有不同分子量的第二氨基酸外,所述第二氨基酸序列与第一氨基酸序列相同。
11.权利要求10的组合物,其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列通过可裂解接头各自与所述颗粒连接。
12.权利要求11的组合物,其中所述可裂解接头为甲硫氨酸残基。
13.权利要求10-12中任一项的组合物,其中所述第一同质量氨基酸为亮氨酸或异亮氨酸。
14.权利要求10的组合物,其中所述第一同质量氨基酸为赖氨酸或谷氨酰胺。
15.权利要求10的组合物,其中所述第一同质量氨基酸为非天然氨基酸。
16.权利要求10的组合物,其中所述第二氨基酸为非天然氨基酸。
17.一种区分同质量氨基酸的制品,其包括:
连接有多个氨基酸序列的表面,所述氨基酸序列由第一氨基酸序列和第二氨基酸序列组成且各自经由可裂解部分连接于所述表面,所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列各自由形成相应序列的多个氨基酸定义,所述第二氨基酸序列与所述第一氨基酸序列具有相同数目的氨基酸残基,其中除了在一个或多个位置处所述第一氨基酸序列含有第一同质量氨基酸而所述第二氨基酸序列含有与所述第一同质量氨基酸相比具有不同分子量的第二氨基酸外,所述第二氨基酸序列与第一氨基酸序列相同。
18.权利要求17的制品,其中所述可裂解部分为甲硫氨酸残基。
19.权利要求17-18中任一项的制品,其中所述第一同质量氨基酸为亮氨酸或异亮氨酸。
20.权利要求17或18的制品,其中所述第一同质量氨基酸为赖氨酸或谷氨酰胺。
21.权利要求17的制品,其中所述第一同质量氨基酸为非天然氨基酸。
22.权利要求17的制品,其中所述第二氨基酸为非天然氨基酸。
23.一种区分同质量氨基酸的方法,包括:
使用质谱来区分第一氨基酸序列和与所述第一氨基酸序列具有相同数目氨基酸残基的第二氨基酸序列,所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列各自由形成相应序列的多个氨基酸定义,其中除了在一个或多个位置处所述第一氨基酸序列含有第一同质量氨基酸而所述第二氨基酸序列含有与所述第一同质量氨基酸相比具有不同分子量的第二氨基酸外,所述第二氨基酸序列与所述第一氨基酸序列相同。
24.权利要求23的方法,所述方法还包括在对所述第一和第二氨基酸序列进行质谱分析前,同时从共同的颗粒上将所述第一和第二氨基酸序列裂解下来。
25.权利要求24的方法,其中所述质谱包括串联质谱。
26.权利要求24的方法,其中所述质谱包括ESI。
27.权利要求24的方法,其中所述质谱包括MALDI-TOF/TOF。
28.权利要求23-27中任一项的方法,其中所述第二氨基酸序列的母峰m/z值与所述第一氨基酸序列的母峰m/z值不同。
29.权利要求23的方法,其中所述质谱包括串联质谱。
30.权利要求23的方法,其中所述第一同质量氨基酸为非天然氨基酸。
31.权利要求23的方法,其中所述第二氨基酸为非天然氨基酸。
32.一种区分同质量氨基酸的方法,包括:
将与表面连接的氨基酸序列暴露于含有同质量氨基酸的溶液中,所述同质量氨基酸为由第一氨基酸物质和第二氨基酸物质组成的同质量组的一员,其中当掺入所述氨基酸序列的同质量氨基酸为所述第一氨基酸物质时,所述溶液还包含可掺入氨基酸序列中的实体,所述实体具有不同于所述同质量氨基酸的分子量,且当掺入所述氨基酸序列的同质量氨基酸为所述第二氨基酸物质时,所述溶液不含所述可掺入的实体,其中所述表面上的所述氨基酸序列由多个氨基酸形成,所述多个氨基酸定义具有相同长度的氨基酸序列。
33.权利要求32的方法,其中所述氨基酸序列中至少一些通过可裂解接头与所述表面连接。
34.权利要求32或33的方法,还包括通过质谱分析所述氨基酸序列。
35.权利要求34的方法,其中所述质谱包括串联质谱。
36.权利要求34的方法,其中所述质谱包括ESI。
37.权利要求34的方法,其中所述质谱包括MALDI-TOF/TOF。
38.权利要求34的方法,其中分析所述氨基酸序列包括对所述氨基酸序列测序。
39.权利要求32的方法,其中同质量氨基酸为非天然氨基酸。
40.权利要求32的方法,其中所述实体包括非天然氨基酸。
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