CN114787630A - 用于抗体分析的疏水相互作用色谱法联用的天然质谱法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于表征肽或蛋白质的快速、灵敏的高通量方法和系统，其使用疏水相互作用色谱‑联用的天然质谱来改进生物制药产品的制造工艺，如在抗体纯化期间鉴定杂质，在生产期间监测翻译后修饰变体，或表征抗体‑药物缀合物的药物与抗体的比率。生成肽或蛋白质的分离概况并进行比较，以鉴定或定量肽或蛋白质。

Description

用于抗体分析的疏水相互作用色谱法联用的天然质谱法
技术领域
本发明总体上涉及使用疏水相互作用色谱法联用的天然质谱法来表征肽或蛋白质的方法和系统。本发明提供了用于表征肽或蛋白质的快速灵敏的高通量方法和系统。
背景技术
治疗性肽或蛋白质在细胞培养悬浮液中表达以用于生产。随后，肽或蛋白质被纯化以去除工艺相关的杂质。对纯化的治疗性肽或蛋白质的产品质量属性进行了广泛表征，以确保其相关的安全性、疗效和与药代动力学相关的保质期概况的保留。
治疗性肽或蛋白质的改变可能发生在肽或蛋白质产生和/或纯化期间和之后的任何时间点。由于多种翻译后修饰、蛋白质降解、酶促修饰和化学修饰，治疗性肽或蛋白质可能变成异质的。生物制药产品的生物物理特性的这些改变可能会影响相关的安全性、疗效和保质期。
应当理解，存在对开发高通量分析方法和系统的需求，所述高通量分析方法和系统提供改进生物制药产品的制造工艺的见解。非常希望该分析方法可以在短的时间段内进行，以获得快速灵敏的高通量分析工具，从而为控制高质量生物制药产品的生产和纯化提供关键改进。
发明内容
开发高通量分析方法和系统对于通过监测生物制药产品的生产和纯化来改善生物制药产品的制造工艺可以是至关重要的。本公开提供了通过提供基于疏水相互作用色谱法联用的天然质谱法的快速灵敏的高通量分析方法和系统来满足上述需求的方法和系统，以改进生物制药产品的制造工艺。
本公开至少部分地提供了用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法。在一个方面中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法包括使样品与固体表面接触，其中所述固体表面包括疏水性基团；使用流动相洗涤固体表面以产生至少一种洗脱液，其中洗脱液包括至少一种肽或蛋白质；以及使用质谱仪在天然条件下表征至少一种洗脱液中的至少一种肽或蛋白质。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括生成至少一种分离概况。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况来鉴定或定量至少一种肽或蛋白质。
在一些方面中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量至少一种肽或蛋白质的翻译后修饰或翻译后修饰变化的水平。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量至少一种肽或蛋白质的糖基化或糖基化变化的水平。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量至少一种肽或蛋白质的质量或相对疏水性的变化。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来分离或鉴定样品中的杂质。
在一些方面中，至少一种肽或蛋白质是药物、抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
在一些示例性实施例中，方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来定量抗体-药物缀合物的药物与抗体的比率。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量抗体-药物缀合物的药物位置、位置异构体或降解的有效载荷。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、抗体-药物缀合物或抗体片段的互补决定区的修饰。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括包括有固体表面和疏水性基团的色谱柱。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括在线联用到色谱柱的质谱仪。
在一些方面中，疏水性基团是苯基、辛基、丁基、己基或丙基。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括用于连接质谱仪和色谱柱的分流器。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括补充流，其被引入到质谱仪与色谱柱之间的流动相中。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括分流器，该分流器用于将低流量转向质谱仪，并将高流量转向检测器。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括质谱仪，该质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪、三重四极质谱仪、四极质谱仪或超高质量范围混合四极质谱仪。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括轨道阱质量分析仪。
本公开至少部分地提供了一种用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统。在一个方面中，用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统包括：包括至少一种肽或蛋白质的样品；包括疏水性基团的色谱柱，其中该色谱柱能够被流动相洗涤以生成洗脱液；能够表征或定量至少一种肽或蛋白质的质谱仪，其中该质谱仪能够在天然条件下运行，并且被在线联用至色谱柱。
在一些示例性实施例中，用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统进一步包括用于连接质谱仪和色谱柱的分流器。
在一些方面中，用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统进一步包括分流器，该分流器用于将低流量转向质谱仪，并将高流量转向检测器。
在一些示例性实施例中，用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统进一步包括流动相，并且使用质谱仪在天然条件下表征所获得的洗脱液。
在一些示例性实施例中，用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统进一步包括补充流，该补充流被引入到质谱仪与色谱柱之间的流动相中。
在一些示例性实施例中，用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统包括二极管阵列检测器或光电二极管阵列检测器。
在一些示例性实施例中，用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统进一步包括至少一种肽或蛋白质，该至少一种肽或蛋白质是药物、抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
在一些方面中，用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统进一步包括质谱仪，该质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪、三重四极质谱仪或超高质量范围混合四极质谱仪。
在一些示例性实施例中，用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统进一步包括轨道阱质量分析仪。
在一些示例性实施例中，用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统包括疏水性基团，该疏水性基团是苯基、辛基、丁基、己基或丙基。
当结合以下描述和附图考虑时，本发明的这些和其他方面将被更好地认识和理解。下面的描述虽然指出了各种实施例及其许多具体细节，但是其是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。
附图说明
图1示出了抗体的分子结构的表面电荷图和表面疏水性图。
图2示出了SigmaMAb抗体药物缀合物模拟物，例如，SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物，其含有通过经由LC-SMCC交联剂将SigmaMAb(MSQC4)(一种IgG1单克隆抗体)缀合到丹磺酰基荧光团上而形成的缀合物。
图3示出了根据示例性实施例的本申请的系统的流路设计，其中质谱仪被在线联用到HIC，并且其中分流器用于连接质谱仪和HIC柱。
图4示出了本申请的流路设计B的变化，例如，根据示例性实施例的流路设计B1和B2。
图5示出了根据示例性实施例的作为关于HIC-UV(紫外线)、HIC-TIC(总离子色谱图)和原始质谱的分离概况的本申请的流路设计A的测试结果。
图6示出了根据示例性实施例的作为关于HIC-UV、HIC-TIC和原始质谱的分离概况的本申请的流路设计B1的测试结果。
图7示出了根据示例性实施例的作为关于HIC-UV、HIC-TIC和原始质谱的分离概况的本申请的流路设计B2的测试结果。
图8示出了根据示例性实施例的作为关于HIC-UV、HIC-TIC和原始质谱的分离概况的本申请的流路设计C的测试结果。
图9示出了根据示例性实施例的使用本申请的在线HIC-天然MS的具有糖形态的基线分辨率和精确质量测量的NISTmAb参考材料的快速筛选。
图10示出了根据示例性实施例的使用本申请的HIC-天然MS来分离和检测含有六种不同单克隆抗体的抗体混合物中的糖基化变化。
图11显示了Sigma提供的SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物的HIC分离概况。
图12示出了根据示例性实施例的使用本申请的HIC-天然MS的设计B2的SigmaMAbCys-连接的ADC模拟物的分离概况。
图13示出了根据示例性实施例的与由Sigma提供的分离概况相比，使用本申请的HIC-天然MS的设计C的SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物的分离概况。
图14示出了根据示例性实施例的使用本申请的HIC-天然MS的设计C的、与ADC的药物与抗体比率(DAR)相对应的SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物的分离概况。
图15示出了根据示例性实施例的使用本申请的HIC-天然MS的设计C的包含降解产物的SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物的分离概况。
图16示出了根据示例性实施例的使用源内解离结合本申请的HIC-天然MS方法来表征SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物(DAR＝2)中的药物位置的分离概况。
图17示出了根据示例性实施例的使用源内解离结合本申请的HIC-天然MS方法来表征SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物(对于降解产物DAR＝2)中的位置异构体的分离概况。
图18示出了根据示例性实施例的使用源内解离结合本申请的HIC-天然MS方法来表征SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物(DAR＝4)中的药物位置的分离概况。
图19示出了根据示例性实施例的使用源内解离结合本申请的HIC-天然MS方法来表征SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物(DAR＝6或8)中的药物位置的分离概况。
图20示出了根据示例性实施例的使用本申请的HIC-天然MS来表征CDR中的修饰的mAb-7的O-糖基化变体的分离概况，包含TIC、原始质谱和解卷积质谱。
图21示出了根据示例性实施例的使用本申请的HIC-天然MS来表征CDR中的修饰的消化的mAb-7的O-糖基化变体的分离概况，包含TIC、原始质谱和解卷积质谱。
图22示出了根据示例性实施例的使用天然SEC-MS分析mAb-7中CDR的O-糖基化变体。
图23示出了根据示例性实施例的使用简化的肽作图分析mAb-7中CDR的O-糖基化变体。
图24示出了根据示例性实施例的使用本申请的HIC-天然MS的mAb-8变体的分离概况，以揭示对应于mAb-8中的CDR中的特定氧化的质量变化。
图25示出了根据示例性实施例的使用简化的肽作图分析mAb-8中CDR的氧化变体。
图26示出了根据示例性实施例的使用源内俘获能量结合本申请的HIC-天然MS方法来表征ADC中的降解的有效载荷的定位的原始质谱的分离概况。SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物用于表征。
图27示出了根据示例性实施例的使用源内俘获能量结合本申请的HIC-天然MS方法来表征ADC中的降解的有效载荷的定位的解卷积质谱的分离概况。SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物用于表征。
图28示出了根据示例性实施例的使用本申请的HIC-天然MS来表征单克隆抗体(例如mAb-9和mAb-10)的分子变体的HIC-TIC概况和质谱。
具体实施方式
生物制药产品的生产和制造被各种工艺和技术所包围。在细胞培养悬浮液中表达和生产治疗性肽或蛋白质后，可以纯化肽或蛋白质以除去工艺相关的杂质。可以对纯化的治疗性肽或蛋白质进行广泛表征，以确保其与药代动力学和产品质量属性相关的安全性、功效和保质期概况的保留。
由于各种翻译后修饰(PTM)、蛋白质降解、酶促修饰和化学修饰，治疗性肽或蛋白质可能变为异质的，这些修饰或降解可以在肽或蛋白质的生产和纯化期间及之后的任何时间点被引入。异质变体的鉴定和表征对于控制生物制药产品的生物物理特性的质量属性至关重要。在生物制药工业中需要快速灵敏的高通量分析方法来控制和监测治疗性肽或蛋白质的生产和纯化，如单克隆抗体或抗体-药物缀合物的生产。
双特异性抗体是非常有价值的生物制药产品，因为它们可以靶向两种不同的抗原。双特异性抗体的设计可以针对靶向多种组织特异性抗体并结合使用小分子药物，如结合多种组织特异性抗体和细胞毒性药物以在肿瘤附近释放药物。小药物分子可以与纯化的双特异性抗体缀合，以产生抗体-药物缀合物(ADC)。由于需要去除杂质，如去除亲本单特异性抗体，双特异性抗体的表达和纯化可能具有挑战性。监测和测定ADC的药物与抗体的比率对于ADC的质量控制也是至关重要的。
本公开提供了通过提供基于在线疏水相互作用色谱法(HIC)-联用的天然质谱法(MS)的高通量分析方法和系统来满足上述需求的方法和系统，以改进生物制药产品的制造工艺，包含在抗体纯化期间鉴定杂质，在生产期间监测翻译后修饰变体，表征ADC的药物与抗体的比率，表征用于共同配制的单克隆抗体混合物，确定相对疏水性，确定完整质量，确定糖基化概况，表征抗体的CDR(互补决定区)的结构变化或修饰，如氧化或O-聚糖。特别地，本申请的分析方法和系统可以是灵敏的，并且可以在短的时间段内进行，以获得快速灵敏的高通量分析工具，用于在控制生物制药产品的生产和纯化方面提供关键的改进。
在观察如图1所示的抗体的分子结构的表面电荷图和表面疏水性图时，存在可用于基于疏水相互作用的分离的各种疏水性小区域。通过HIC分析，可以使用相对保留时间对各种单克隆抗体的疏水性进行排序。HIC中的分离是基于分析物的表面与固定相之间的疏水相互作用。疏水性基团，如苯基、辛基、丁基、己基或丙基，被并入到固定相中以用于色谱分离。HIC是一种广泛应用于纯化和分析单克隆抗体的离线非变性分离技术。HIC也广泛用于表征生物制品，如表征片段化、错误折叠、色氨酸或甲硫氨酸的氧化、天冬氨酸的异构化、琥珀酰亚胺的形成或α酰胺化羧基末端的形成。然而，HIC与天然MS联用在肽或蛋白质的表征和分离方面存在局限性，因为在考虑蛋白质聚集时，高盐浓度(如3M醋酸铵)是蛋白质结合所必需的。先前的在线HIC联用的MS的研究利用了一种特殊的配体，如聚戊基，其具有增加的疏水性，以降低对流动相中高盐浓度的要求。这项HIC-联用的MS研究采用了毛细管柱形式，在流动相A中含有1M醋酸铵(Chen等人的用于分析完整单克隆抗体的在线疏水相互作用色谱法-质谱法(Online hydrophobic interaction chromatography-massspectrometry for the analysis of intact monoclonal antibodies)，《分析化学(Anal.Chem)》2018，90，7135-7138)。
本公开提供了具有不同补充分流的设计的HIC联用的天然MS的各种设计，以实现出色的液相色谱性能和高质量的质谱数据。在经受电喷雾电离(ESI)或纳米ESI之前，可以使用补充水流来稀释流动相的盐浓度。
天然质谱法是一种研究天然或近天然状态下完整生物分子结构的方法。术语“天然的”是指分析物在经受电离之前在溶液中的生物状态。可以控制含有生物分析物的溶液的几个参数，如pH和离子强度，以保持溶液中生物分析物的天然折叠状态。通常，天然质谱法基于电喷雾电离，其中生物分析物从非变性溶剂中喷雾。其他术语，如非共价、天然喷雾、电喷雾电离、非变性、大分子或超分子质谱法也可以描述天然质谱法。(Leney等人，《美国质谱学会杂志(J.Am.Soc.Mass Spectrom)》，2017，28，第5页-第13页，天然质谱法：名字里有什么(Native Mass Spectrometry：what is in the name))。
本申请提供了基于快速在线方法的HIC分离与天然质谱法联用，其为肽或蛋白质的快速灵敏的高通量筛选或鉴定提供了强有力的分析工具。在本申请的方法和系统中，可以基于不同的疏水相互作用生成肽或蛋白质的分离概况，并且随后可以使用质谱法来表征天然或近天然状态的肽或蛋白质的完整的生物分子结构。
在可以与HIC联用的各种检测模式中，质谱法允许精确和准确地鉴定复杂样品中的单独的组分。应该控制含有生物分析物的溶液的几个参数，如pH范围或盐浓度，以保持生物分析物的天然折叠状态，以用于进行天然质谱法。在HIC柱的洗脱之后和在经受质谱法的电离步骤之前，溶液中分析物(如肽或蛋白质)的生物状态被保持在天然或类似天然的折叠状态。
本申请的方法和系统对于提供高通量方法和系统是有利的，该高通量方法和系统提供了用于改进治疗性肽或蛋白质的制造工艺的机理见解。特别是，本申请可以提供通过将HIC与完整的天然质谱法结合来表征抗体、抗体变体或抗体-药物缀合物的快速、灵敏的高通量方法和系统。
在一个方面中，使用本申请的高通量方法和系统，通过将HIC与完整的天然质谱法结合来评估含有特异性翻译后修饰的单克隆抗体或抗体变体。在一些优选的示例性实施例中，本申请的方法和系统可用于鉴定或定量单克隆抗体或抗体变体的翻译后修饰或翻译后修饰变化的水平。
在一个方面中，使用本申请的高通量方法和系统，通过将HIC与完整的天然质谱法结合来评估含有特异性糖基化的单克隆抗体或抗体变体。在一些优选的示例性实施例中，本申请的方法和系统可以用于鉴定或定量单克隆抗体或抗体变体的糖基化或糖基化变化的水平，如揭示CDR中的O-糖基化修饰或氧化。在一些优选的示例性实施例中，本申请的方法和系统可以用于使用基于聚糖的分离或糖形态的改变来鉴定或定量单克隆抗体或抗体变体的糖基化或糖基化变化的水平。
在一个方面中，本申请提供了通过将HIC与完整的天然质谱法结合使用本申请的高通量方法和系统来鉴定或定量抗体-药物缀合物的药物与抗体比率的灵敏的高通量分析方法和系统。在一些优选的示例性实施例中，待分析的抗体-药物缀合物是赖氨酸连接的或半胱氨酸连接的抗体-药物缀合物。本申请通过提供与具有不同药物与抗体比率的物质的均匀洗脱联用的高峰值容量结合在天然条件下的灵敏质谱检测而特别有利。
在一个方面中，本申请提供了通过将HIC与完整的天然质谱法结合来鉴定或定量单克隆抗体、含有特异性糖基化的抗体变体或用于共同配制的单克隆抗体混合物的灵敏的高通量分析方法和系统。
考虑到现有方法的局限性，本文公开的示例性实施例满足了提供基于HIC联用的天然质谱法的快速、灵敏的高通量分析方法和系统以改进生物制药产品的生产工艺的长期感受到的需求，包含在抗体纯化期间鉴定杂质，在生产期间监测翻译后修饰变体，表征抗体-药物缀合物的药物与抗体比率和表征用于共同配制的单克隆抗体混合物。
术语“一(a)”应被理解为是指“至少一个”；并且术语“约(about)”和“约(approximately)”应该理解为允许如本领域普通技术人员理解的标准变化；并且在提供范围的情况下，包含端点。
如本文所用，术语“包含(include)”、“包含(includes)”和“包括(including)”意味着非限制性的，并且被理解为分别表示“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”。
在一些示例性实施例中，本公开提供了一种用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法，其包括：使样品与固体表面接触，其中该固体表面包括疏水性基团；使用流动相洗涤固体表面以产生至少一种洗脱液，其中该洗脱液包括至少一种肽或蛋白质；使用质谱仪在天然条件下表征至少一种洗脱液中的至少一种肽或蛋白质。在一些示例性实施例中，本公开提供了一种用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统，其包括：包括至少一种肽或蛋白质的样品；包括疏水性基团的色谱柱，其中该色谱柱能够被流动相洗涤以产生洗脱液；能够表征或定量至少一种肽或蛋白质的质谱仪，其中质谱仪能够在天然条件下运行，并且被在线联用至色谱柱。
如本文所用，“在天然条件下使用质谱仪”的描述中的术语“天然”是指分析物在经受电离之前在溶液中的生物状态。如本文所用，术语“天然条件”或“天然质谱法”可以包含在保持分析物中非共价相互作用的条件下进行质谱法。对于天然MS的详细综述，参阅以下综述：Elisabetta Boeri Erba和Carlo Petosa的天然质谱法在表征大分子复合物的结构和动力学方面的新兴作用(The emerging role of native mass spectrometry incharacterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes)，24《蛋白质科学(PROTEIN SCIENCE)》1176-1192(2015)。
如本文所用，术语“质谱仪”包含能够鉴定特定分子物质并测量其精确质量的装置。该术语意指包含任何分子检测器，多肽或肽可以洗脱到该分子检测器中以用于检测和/或表征。质谱仪可以包含三个主要部分：离子源、质量分析仪和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或簇可以被转移到气相中并同时被离子化(如在电喷雾离子化中)。离子源的选择在很大程度上取决于应用。
在一些示例性实施例中，在用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法中，至少一种肽或蛋白质是药物、抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
如本文所用，术语“肽”或“蛋白质”包含任何具有共价连接的酰胺键的氨基酸聚合物。蛋白质包括一个或多个氨基酸聚合物链，其在本领域中通常被称为“肽”或“多肽”。蛋白质可以含有一种或多种多肽，以形成单一功能的生物分子。在一些示例性实施例中，蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、宿主细胞蛋白质或其组合。
如本文所用，“蛋白质药物产品”包含本质上可以是完全或部分生物的活性成分。在一些示例性实施例中，蛋白质药物产品可以包括肽、蛋白质、融合蛋白、抗体、抗原、疫苗、肽-药物缀合物、抗体-药物缀合物、蛋白质-药物缀合物、细胞、组织或其组合。在一些其他示例性实施例中，蛋白质药物产品可以包括肽、蛋白质、融合蛋白、抗体、抗原、疫苗、肽-药物缀合物、抗体-药物缀合物、蛋白质-药物缀合物、细胞、组织或其组合的重组的、工程改造的、修饰的、突变的或截短的形式。
如本文所用，“抗体片段”包括含整抗体的一部分，如例如抗体的Fc区、抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fc片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域，以及三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的组合，并且ScFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽接头连接。抗体片段可以通过各种方式产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的片段化以酶促或化学方式产生，和/或其可以从编码部分抗体序列的基因重组产生。可替代地或另外地，抗体片段可以全部或部分合成产生。抗体片段可以任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外地，抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多个链。抗体片段可以任选地包括多分子复合物。
如本文所用，术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”可以指通过具有不稳定键的接头与生物活性药物连接的抗体。ADC可以包括生物活性药物(或有效载荷)的几个分子，这些分子可以与抗体的氨基酸残基的侧链共价连接(Siler Panowski等人的用于癌症疗法的位点特异性抗体药物缀合物(Site-specific antibody drug conjugates for cancertherapy)，6mAbs 34-45(2013))。用于ADC的抗体可以以足够的亲和力结合，以用于在靶位点处选择性累积和持久保留。大多数ADC可以具有在纳摩尔范围内的Kd值。有效载荷可以具有在纳摩尔/皮摩尔范围内的效力，并且能够在ADC分布到靶组织中之后达到可实现的细胞内浓度。最后，在有效载荷与抗体之间形成连接的接头能够在循环中足够稳定，以利用抗体部分的药代动力学性能(例如，长半衰期)，并允许有效载荷在抗体分布到组织中时保持与抗体的连接，但一旦ADC可以被摄取到靶细胞中，应允许生物活性药物的高效释放。接头可以是：在细胞加工期间不可切割的接头和一旦ADC到达靶位点就可切割的接头。在不可切割的接头的情况下，调用中释放的生物活性药物包含有效载荷和在溶酶体中ADC的完全蛋白水解降解后仍与抗体的氨基酸残基(通常为赖氨酸或半胱氨酸残基)连接的接头的所有元件。可切割的接头是其结构包含有效载荷与抗体上的氨基酸连接位点之间的切割位点的接头。切割机制可以包含酸性细胞内隔室中酸不稳定键的水解、细胞内蛋白酶或酯酶对酰胺或酯键的酶促切割，以及细胞内的还原环境对二硫键的还原切割。
如本文所用，“抗体”是指由四条多肽链(通过二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链(L))组成的免疫球蛋白分子。每个重链都具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链都具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH和VL区可以进一步细分成被称作互补决定区(CDR)的超变区，所述区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL可以由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包含任何同种型或亚类的糖基化的和非糖基化的免疫球蛋白。术语“抗体”包含但不限于通过重组手段制备、表达、产生或分离的那些，如从被转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。IgG包括抗体的子集。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量至少一种肽或蛋白质的翻译后修饰或翻译后修饰变化的水平。
如本文所用，通用术语“翻译后修饰”或“PTM”是指多肽在其核糖体合成期间(共翻译修饰)或之后(翻译后修饰)经历的共价修饰。PTM通常由特定的酶或酶途径引入。许多发生在蛋白质骨架内特定特征蛋白质序列(特征序列)的位点。已经记录了几百种PTM，并且这些修饰总是会影响蛋白质的结构或功能的某一方面(Walsh，G.的“蛋白质(Proteins)”(2014)，第二版，由威利父子有限公司(Wiley and Sons，Ltd.)出版，ISBN：9780470669853)。各种翻译后修饰包含但不限于切割、N-末端延伸、蛋白质降解、N-末端的酰化、生物素化(赖氨酸残基与生物素的酰化)、C-末端的酰胺化、糖基化、碘化、辅基基团的共价连接、乙酰化(通常在蛋白质N-末端处添加乙酰基基团)、烷基化(通常在赖氨酸或精氨酸残基处添加烷基基团(例如甲基、乙基、丙基))、甲基化、腺苷化、ADP-核糖基化、多肽链内或之间的共价交联、磺化、异戊烯化、维生素C依赖性修饰(脯氨酸和赖氨酸羟基化和羧基末端酰胺化)、维生素K依赖性修饰(其中维生素K是谷氨酸残基的羧基化的辅因子，导致γ-羧基谷氨酸盐(glu残基)的形成)、谷氨酰化(谷氨酸残基的共价键合)、甘氨酰化(甘氨酸残基的共价连接)、糖基化(将糖基基团添加到天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸上，产生糖蛋白)、异戊二烯化(添加类异戊二烯基团，如法呢醇和香叶基香叶醇)、脂酰化(连接脂质酸官能团)、磷酸泛酸硫基乙胺化(添加来自辅酶A的4′-磷酸泛酸硫基乙胺基部分，如在脂肪酸、聚酮化合物、非核糖体肽和亮氨酸生物合成中)、磷酸化(通常向丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸中添加磷酸基团)和硫酸化(通常向酪氨酸残基中添加硫酸基团)。改变氨基酸的化学性质的翻译后修饰包含但不限于瓜氨酸化(通过脱亚胺基化将精氨酸转化为瓜氨酸)和脱酰胺化(将谷氨酰胺转化为谷氨酸或将天冬酰胺转化为天冬氨酸)。涉及结构变化的翻译后修饰包含但不限于二硫键的形成(两个半胱氨酸氨基酸的共价键合)和蛋白质水解切割(肽键处蛋白质的切割)。某些翻译后修饰涉及添加其他蛋白质或肽，如ISG化(与ISG15蛋白质的共价键合(干扰素刺激基因))、SUMO化(与SUMO蛋白质的共价键合(小泛素相关修饰物))和泛素化(与蛋白质泛素的共价键合)。对于由UniProt策划的PTM的更详细的受控词汇表，参见欧洲生物信息研究所蛋白质信息资源SIB瑞士生物信息研究所、欧洲生物信息研究所Drs-果蝇霉素前体-黑腹果蝇(果蝇)-Drs基因与蛋白质(European BioinformaticsInstitute Protein Information ResourceSIB Swiss Institute ofBioinformatics.European Bioinformatics Institute Drs-Drosomycin precursor-Drosophila melanogaster(Fruit fly)-Drs gene&protein)，http：//www，uniprot.org/docs/ptmlist(最近一次访问是2019年1月15日)。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来分离或鉴定样品中的杂质。
如本文所用，术语“杂质”可以包含存在于蛋白质生物制药产品中的任何不期望的蛋白质。杂质可以包含工艺和产品相关的杂质。杂质可以进一步是已知结构、部分表征的或未鉴定的。工艺相关的杂质可以来自制造工艺，并且可以包含三大类：细胞底物来源的、细胞培养物来源的和下游来源的。细胞底物来源的杂质包含但不限于来源于宿主生物体和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)的蛋白质。细胞培养物来源的杂质包含但不限于诱导剂、抗生素、血清和其他培养基组分。下游来源的杂质包含但不限于酶、化学和生物化学加工试剂(例如溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如单克隆抗体)和其他可滤出物。产品相关的杂质(如前体、某些降解产物)可能是在制造和/或储存期间产生的分子变体，其在活性、功效和安全性方面不具有与所需产品相当的特性。此类变体可能需要相当大的努力来分离和表征，以便鉴定修饰的类型。产品相关的杂质可以包含截短的形式、修饰的形式和聚集体。截短的形式由水解酶或催化肽键的切割的化学品形成。修饰的形式包含但不限于脱酰胺的、异构化的、错配的S-S连接的、氧化的或改变的缀合形式(如糖基化、磷酸化)。修饰的形式也可以包含任何翻译后修饰形式。聚集体包含所需产物的二聚体和更高倍数。(Q6B规格：生物技术/生物产品的测试程序和验收标准(Q6B Specifications：Test Procedures and Acceptance Criteria forBiotechnological/Biological Products)，ICH 1999年8月，美国卫生与公众服务部(U.S.Dept.of Health and Humans Services))。
在一些示例性实施例中，包括疏水性基团的固体表面包含在色谱柱中。
如本文所用，术语“色谱法”是指这样的工艺，其中由液体或气体携带的化学混合物由于化学实体在静止的液体或固体相周围或上方流动时的不同分布而可以被分离成组分。色谱法的非限制性实例包含传统的反相(RP)、离子交换(IEX)、混合模式色谱法和正相色谱法(NP)。
在一些示例性实施例中，在用于鉴定样品中至少一种肽或蛋白质的方法中，质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪、三重四极质谱仪、四极质谱仪或超高质量范围混合四极质谱仪。
如本文所用，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指喷雾电离的过程，其中溶液中的阳离子或阴离子通过在大气压下高度带电荷的液滴流的形成和去溶剂化而被转移至气相，高度带电荷的液滴是通过在含有溶液的电喷雾针的尖端与反电极之间施加电势差而产生的。从溶液中的电解质离子产生气相离子通常有三个主要步骤。这些步骤是：(a)在ES输注尖端处产生带电荷的液滴；(b)通过溶剂蒸发和重复的液滴崩解使带电荷的液滴收缩，导致能够产生气相离子的小的高度带电荷的液滴；和(c)气相离子由非常小的高度带电荷的液滴产生的机理。阶段(a)-(c)通常发生在设备的大气压区域。
如本文所用，术语“纳米电喷雾”是指在非常低的溶剂流速下的电喷雾电离，通常为每分钟数百纳升样品溶液或更低，通常不使用外部溶剂输送。形成纳米电喷雾的电喷雾输注装置可以使用静态纳米电喷雾发射器或动态纳米电喷雾发射器。静态纳米电喷雾发射器在长的时间段内对小的样品(分析物)溶液体积进行连续分析。动态纳米电喷雾发射器使用毛细管柱和溶剂输送系统以在通过质谱仪分析之前对混合物进行色谱分离。
在一些示例性实施例中，质谱仪包括轨道阱质量分析仪。
如本文所用，术语“质量分析仪”包含可以根据物质的质量分离物质(即，原子、分子或簇)的装置。可以用于快速蛋白质测序的质量分析仪的非限制性实例为飞行时间(TOF)、磁电扇区、四极质量过滤器(Q)、四极离子阱(QIT)、轨道阱、傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)以及加速器质谱(AMS)技术。
示例性实施例
本文公开的实施例提供了基于HIC联用的天然质谱法来鉴定样品中至少一种肽或蛋白质的组合物、方法和系统。
在一些示例性实施例中，本公开提供了一种用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法，其包括：使样品与固体表面接触，其中该固体表面包括疏水性基团；使用流动相洗涤固体表面以产生至少一种洗脱液，其中该洗脱液包括至少一种肽或蛋白质；在天然条件下使用质谱仪表征至少一种洗脱液中的至少一种肽或蛋白质。在一些示例性实施例中，本公开提供了一种用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统，其包括：包括至少一种肽或蛋白质的样品；包括疏水性基团的色谱柱，其中该色谱柱能够被流动相洗涤以生成洗脱液；能够表征或定量至少一种肽或蛋白质的质谱仪，其中该质谱仪能够在天然条件下运行，并且被在线联用到色谱柱。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法或系统基于HIC联用的天然质谱法，其中HIC柱被在线联用至天然质谱仪，其中分流器用于连接质谱仪和色谱柱。为了进行HIC，使用配备有HIC柱的HPLC(高效液相色谱法)进行前端分离。含有乙酸铵和/或硫酸铵的流动相用于HIC应用。在一些示例性实施例中，乙酸铵或硫酸铵的浓度为约0.5-5M、约1-4.5M、约2-3.5M、约大于3M或优选的约3M。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法或系统基于HIC-联用的天然质谱法，其中HIC柱在线联用至天然质谱仪，其中分流器用于连接质谱仪和色谱柱，其中补充流被引入到质谱仪与色谱柱之间的流动相中。为了进行HIC，使用配备有HIC柱的HPLC用于前端分离，其中HIC柱包括疏水性基团，如苯基、辛基、丁基、己基或丙基。在一些示例性实施例中，质谱法具有轨道阱质量分析仪并使用电喷雾电离(ESI)。
在一些示例性实施例中，在分流器之前的HIC柱之后加入混合T型管，然后在混合T型管处将补充流引入到流动相中。在一些示例性实施例中，流动相具有约100-500μL/min、约200-400μL/min、约250-350μL/min或优选地约300μL/min的流速用于进入HIC柱。在一些示例性实施例中，在分流器朝向ESI移动后，流动相的流速为约0.1-3μL/min、约0.5-2.5μL/min、约0.5-2μL/min、约0.5-1.5μL/min、约0.5μL/min、约1μL/min、约1.5μL/min、约1.7μL/min或优选的约小于2μL/min。在一些示例性实施例中，补充流具有约100-1500μL/min、约250-1500μL/min、约300-1500μL/min、约800-1500μL/min、约1000-1300μL/min、约1000μL/min、约1100μL/min、约1300μL/min或优选的约1200μL/min的流速，用于在混合T型管处进入流动相。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法或系统基于HIC-联用的天然质谱法，其中HIC柱在线联用至天然质谱仪，其中分流器用于连接质谱仪和色谱柱，其中补充流被引入到质谱仪与色谱柱之间的流动相中。在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量至少一种肽或蛋白质的翻译后修饰或翻译后修饰变化的水平、至少一种肽或蛋白质的糖基化或糖基化变化的水平、至少一种肽或蛋白质的质量的变化、至少一种肽或蛋白质的相对疏水性、样品中的杂质、至少一种肽或蛋白质的片段化、至少一种肽或蛋白质的错误折叠、至少一种肽或蛋白质的色氨酸或甲硫氨酸的氧化、至少一种肽或蛋白质的天冬氨酸的异构化、至少一种肽或蛋白质的琥珀酰亚胺的形成或至少一种肽或蛋白质的α酰胺化羧基末端的形成。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法或系统基于HIC联用的天然质谱法，其中HIC柱被在线联用至天然质谱仪，其中分流器用于连接质谱仪和色谱柱，其中补充流被引入到质谱仪与色谱柱之间的流动相中，其中至少一种肽或蛋白质是抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、抗体-药物缀合物或抗体片段。在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来定量或鉴定抗体-药物缀合物的药物与抗体比率、药物位置、位置异构体或降解的有效载荷。
在一些示例性实施例中，用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法进一步包括基于至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、抗体-药物缀合物或抗体片段的CDR的修饰，其中该修饰是O-糖基化或氧化，如色氨酸的氧化或甲硫氨酸的氧化。
应当理解，本申请的方法或系统不限于任何上述药物产品、肽、蛋白质、抗体、抗体-药物缀合物、生物制药产品、色谱柱或质谱仪。
如本文所提供的用数字和/或字母连续标注方法步骤并不意味着将方法或其任何实施例限制为特定的指示顺序。在整个说明书中引用了各种出版物，包含专利、专利申请、公开的专利申请、注册号、技术文章和学术文章。这些引用的参考文献中的每一篇都通过引用以其整体并入本文并用于所有目的。
通过参考以下实例，将更全面地理解本公开，提供这些实例是为了更详细地描述本公开。它们旨在说明而不应被解释为限制本公开的范围。
实例
材料和工作流程
1.1抗体参考材料
NISTmAb用作抗体参考材料。NISTmAb是在鼠悬浮培养物中表达的重组人源化IgG1κ，其是两条相同轻链和两条相同重链的同型二聚体。NISTmAb具有低丰度的翻译后修饰，包含甲硫氨酸氧化、脱酰胺化和糖基化。NISTmAb的重链具有N-末端焦谷氨酰胺化、C-末端赖氨酸剪切和糖基化。NISTmAb已被广泛表征，并在鼠悬浮细胞培养物中产生，其经历工业标准的上游和下游纯化，以去除工艺相关的杂质。
2.1 ADC参考材料
使用SigmaMAb抗体药物缀合物模拟物(密理博西格玛公司(Millipore SigmaInc.))，如Sigma Cys-连接的ADC模拟物作为ADC参考材料。SigmaMAb抗体药物缀合物模拟物被用作质谱法和高效液相色谱法的标准品，其含有通过将SigmaMAb(MSQC4)(一种IgG1单克隆抗体)经由LC-SMCC交联剂缀合至丹磺酰基荧光团的缀合物，如图2所示。
3.1用于鉴定肽或蛋白质的HIC联用的天然质谱法的工作流程
本申请提供了HIC联用的天然质谱法方法和系统，其中HIC柱被在线联用到具有各种设计的天然质谱仪，其中分流器被用于连接质谱仪和HIC，如图3所示。使用分流器的功能之一是减慢用于进入质谱仪的流速。在经受MS检测之前，有必要稀释液相色谱法的流动相中的高盐浓度。为了降低流动相中的高盐浓度，生成了具有最小死体积和基于乙酸铵的梯度的至少三个工作流程设计，例如，流路设计A、B和C，以结合如图3所示的补充和分流设计。在设计B中存在变化，例如，如图4所示的设计B1和B2。
在设计A中，将补充流引入到分流器与ESI之间的流动相，例如，在分流器之后和在ESI之前。在示例性实施例中，设计A的废物/UV流从分流器中释放。设计A的流动相具有用于进入HIC柱约4.6mm)的约300μL/min(的流速。在设计A中，在分流器朝向ESI移动后，流动相的流速约小于2μL/min(约20μm x 35cm)
在设计B中，使用补充流分流器，并且补充流在分流器处或大约在分流器之后立即被引入到流动相中。设计B的废物/UV(或废物)流从分流器和/或在ESI之前释放。在图4中示出了设计B的变化，例如B1和B2。在设计B中，流动相具有用于进入HIC柱(约4.6mm)的约300μL/min的流速。在设计B中，在分流器朝向ESI移动后流动相的流速为约12μL/min(50μm)。设计B的补充流具有用于进入分流器的约10μL/min的流速。
在设计C中，在分流器之前的HIC柱之后加入混合T型管，然后在混合T型管处将补充流引入到流动相。设计C的废物/UV流从分流器中释放。在设计C中，流动相具有用于进入HIC柱(约4.6mm)的约300μL/min的流速。在设计C中，在分流器朝向ESI移动后流动相的流速为约小于2μL/min(约20μm x 35cm)。设计C的补充流在混合T型管处具有用于进入流动相的1200μL/min的流速。
使用直径约4.6mm的分析级HIC柱与质谱仪联用。含有高浓度的乙酸铵(如大于3M)的流动相A用于在HIC柱上保留单克隆抗体或ADC。应用NanoESI-MS来提高检测灵敏度和耐受高盐浓度。该方法或系统中的质谱分析在天然条件下进行的。
为了进行天然质谱法，使用了Thermo ScientificTM Q-ExactiveTM UHMR(超高质量范围)质谱仪。质谱仪具有轨道阱质量分析仪，并使用电喷雾电离(ESI)。含有乙酸铵的质谱兼容的流动相用于HIC。使用柱后分流器以将低流量转向质谱仪，该质谱仪配备有Nanospray FlexTM离子源，其允许实现纳米喷雾电离源的灵敏度和溶解性。原始质谱数据是使用来自蛋白质计量学公司(Protein Metrics)的INTACT MASSTM软件解卷积的。
实例1.测试流路设计
使用直径为约4.6mm的分析级HIC柱测试了具有不同补充和分流设计的流路设计。设计A的测试结果在图5中显示为关于HIC-UV(紫外线)、HIC-TIC(总离子色谱图)和原始质谱的分离概况。设计A具有通过注射泵的不一致的补充流输送。由于来自补充混合的压力导致从分流器到回流的非流动，其导致不良的TIC。此外，低效的混合导致不良的去溶剂化，其导致不良的质量的MS数据。
设计B1和B2的测试结果分别在图6和图7中显示为关于HIC-UV、HIC-TIC和原始质谱的分离概况。设计C的测试结果在图8中显示为关于HIC-UV、HIC-TIC和原始质谱的分离概况。设计C具有良好的UV和TIC相似性，具有良好的MS数据的质量和灵敏度。由于稀释和分流，UV信号较低。
实例2.NISTmAb的筛选
本申请的HIC-联用的天然质谱法(HIC-天然MS)的方法和系统用于鉴定和筛选NISTmAb。使用质谱仪的分析是在天然条件下进行的。质谱仪被在线联用至HIC柱，其中使用分流器来连接质谱仪和HIC柱，如图3中的设计C所示和如工作流程部分所述。含有乙酸铵的质谱法兼容的流动相用于HIC分离，以生成含有NISTmAb的洗脱液，该洗脱液随后经受天然质谱法分析。用本申请的快速高通量分析方法分离和筛选NISTmAb参考材料。
使用本申请的在线HIC-天然MS(如图9所示)并使用设计C完成了具有糖形态的基线分辨率和准确质量测量的NISTmAb参考材料的快速筛选。NISTmAb是在鼠悬浮培养物中表达的重组人源化IgG1κ，其具有低丰度的翻译后修饰，包含甲硫氨酸氧化、脱酰胺化和糖基化。此外，NISTmAb的重链具有N-末端焦谷氨酰胺化、C-末端赖氨酸剪切和糖基化。NISTmAb的翻译后修饰和糖基化的变化用基线分辨率很好地表征。尽管使用HIC柱需要高浓度的盐，但NISTmAb的类天然电荷状态在整个分离概况被保持，这表明使用本申请的方法和系统的可忽略不计的样品变性。结果显示良好的色谱性能和MS数据质量。
实例3.单克隆抗体混合物的分析
使含有六种不同单克隆抗体的抗体混合物经受本申请的HIC-天然MS。使用质谱仪的分析是在天然条件下进行的。质谱仪被在线联用至HIC柱，其中使用分流器来连接质谱仪和HIC柱，如图3中的设计C所示和如工作流程部分所述。含有乙酸铵的质谱法兼容的流动相用于HIC分离，以生成含有单克隆抗体的洗脱液。如图10所示，单克隆抗体的糖基化变化，如非糖基化的、部分糖基化的、完全糖基化的或氧化，可以以良好的分辨率被分离和检测。
本申请的HIC-天然MS为液相色谱法提供了更短的时间，这可以被视为高通量。测试结果具有良好的峰形状，色谱稳定，适合于方法转换。此外，这些结果为明确的在线检测提供了高质量的MS数据。
实例4.Cys-连接的ADC的分析
SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物的HIC分离概况由Sigma提供，如图11所示。使用本申请的HIC-天然MS的设计B2来测试SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物。测试设计B2的结果显示与由Sigma提供的HIC概况具有良好的UV相似性。然而，如图12所示，在MS信号强度不足的情况下观察到MS峰的拖尾。
使用本申请的HIC-天然MS的设计C来测试SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物，与如图13所示的由Sigma提供的概况进行比较。由本申请的HIC-天然MS生成的HIC-TIC概况类似于由Sigma提供的HIC概况。在足够的MS信号强度下观察到最小的峰拖尾。如图14和图15所示，可以基于对应于DAR或降解产物的质谱来指定所有检测到的TIC峰。
实例5.ADC中的药物位置和位置异构体的表征
为了表征ADC中的药物位置和/或位置异构体，结合本申请的HIC-天然MS方法，使用设计C进行了源内解离。SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物用于表征药物位置和/或位置异构体。可以鉴定得到的分离概况以表征重链或轻链中的缀合的药物的位置，对应于药物与抗体的比率，包含降解产物和位置异构体，如图16(DAR＝2)、图17(对于降解产物DAR＝2)、图18(DAR＝4)和图19(DAR＝6或8)所示。
实例6.CDR中修饰的表征
本申请的HIC-天然MS的方法和系统用于表征单克隆抗体如mAb-7和mAb-8中CDR的修饰。如图20所示，mAb-7的HIC-TIC概况显示了mAb-7的糖基化变体的分离概况，例如主峰、峰1(P1)和峰2(P2)。使用软件对mAb-7的原始质谱数据进行解卷积。mAb-7的解卷积的质谱显示了糖基化变体的分离概况，这揭示了mAb-7中CDR的特异性O-糖基化变体。
结构域特异性修饰的进一步特征在于用FabRICATOR例如IdeS消化mAb-7，IdeS是一种半胱氨酸蛋白酶，其消化铰链下特定位点的抗体以生成F(ab′)2和Fc/2片段。如图21所示，消化的mAb-7的HIC-TIC概况显示了mAb-7的结构域特异性糖基化变体的分离概况。使用软件对原始质谱数据进行解卷积。mAb-7的解卷积的质谱显示了结构域特异性糖基化变体的分离概况，这揭示了mAb-7中CDR的特异性O-糖基化变体。如图22和图23所示，使用包含天然SEC(尺寸排阻色谱法)MS和简化的肽作图在内的正交方法进一步分析mAb-7的O-糖基化变体。
本申请的HIC-天然MS的方法和系统用于表征mAb-8中CDR的修饰，如氧化。如图24所示，mAb-8的HIC-TIC概况显示了mAb-8变体的分离概况，例如主峰和峰1(P1)。使用软件对mAb-8的原始质谱数据进行解卷积。mAb-8的解卷积的质谱显示了质量变体的分离概况，如15.6Da的质量变化，这揭示了mAb-8中CDR的特异性氧化。使用如图25所示的简化的肽作图进一步分析mAb-8的氧化变体。结果揭示在mAb-8的重链中的位置54处甲硫氨酸的氧化。
实例7.表征ADC的降解的有效载荷
为了表征ADC中降解的有效载荷的定位，结合本申请的HIC-天然MS方法执行了源内俘获能量。SigmaMAb Cys-连接的ADC模拟物用于表征。如图26和图27所示，可以鉴定所得到的分离概况以表征降解的有效载荷。
实例8.表征抗体的分子变体
本申请的HIC-天然MS的方法和系统用于表征单克隆抗体例如mAb-9和mAb-10的分子变体。如图28所示，mAb-9和mAb-10的HIC-TIC概况显示了分子变体的分离概况。质谱显示了分子变体的分离概况，这揭示了分子变体中的特定质量变化。

Claims (29)

1.一种用于鉴定样品中的至少一种肽或蛋白质的方法，所述方法包括：
使所述样品与固体表面接触，其中所述固体表面包括疏水性基团；
使用流动相洗涤所述固体表面以产生至少一种洗脱液，其中所述洗脱液包括所述至少一种肽或蛋白质；以及
使用质谱仪在天然条件下表征所述至少一种洗脱液中的所述至少一种肽或蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括生成至少一种分离概况。
3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括基于所述至少一种分离概况来鉴定或定量所述至少一种肽或蛋白质。
4.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括基于所述至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量所述至少一种肽或蛋白质的翻译后修饰或翻译后修饰变化的水平。
5.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括基于所述至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量所述至少一种肽或蛋白质的糖基化或糖基化变化的水平。
6.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括基于所述至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量所述至少一种肽或蛋白质的质量或相对疏水性的变化。
7.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括基于所述至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来分离或鉴定所述样品中的杂质。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一种肽或蛋白质是药物、抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括基于所述至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来定量所述抗体-药物缀合物的药物与抗体的比率。
10.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括基于所述至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量所述抗体-药物缀合物的药物位置、位置异构体或降解的有效载荷。
11.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括基于所述至少一种分离概况或与另一种分离概况的比较来鉴定或定量所述抗体、所述双特异性抗体、所述单克隆抗体、所述抗体-药物缀合物或所述抗体片段的互补决定区的修饰。
12.根据权利要求1所述的方法，其中包括所述疏水性基团的所述固体表面包含在色谱柱中。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述质谱仪被在线联用至所述色谱柱。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水性基团是苯基、辛基、丁基、己基或丙基。
15.根据权利要求13所述的方法，其中分流器用于连接所述质谱仪和所述色谱柱。
16.根据权利要求15所述的方法，其中补充流被引入到所述质谱仪与所述色谱柱之间的所述流动相中。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述分流器用于将低流量转向所述质谱仪，并将高流量转向检测器。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪、三重四极质谱仪、四极质谱仪或超高质量范围混合四极质谱仪。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪包括轨道阱质量分析仪。
20.一种用于鉴定至少一种肽或蛋白质的系统，其包括：
包括所述至少一种肽或蛋白质的样品；
包括疏水性基团的色谱柱，其中所述色谱柱能够被流动相洗涤以生成洗脱液；和
能够表征或定量所述至少一种肽或蛋白质的质谱仪，其中所述质谱仪能够在天然条件下运行，并且被在线联用至所述色谱柱。
21.根据权利要求20所述的系统，其中分流器用于连接所述质谱仪和所述色谱柱。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述分流器用于将低流量转向所述质谱仪，并将高流量转向检测器。
23.根据权利要求20所述的系统，其中使用所述质谱仪在天然条件下表征所述洗脱液。
24.根据权利要求20所述的系统，其中补充流被引入到所述质谱仪与所述色谱柱之间的所述流动相中。
25.根据权利要求20所述的系统，其中所述系统包括二极管阵列检测器或光电二极管阵列检测器。
26.根据权利要求20所述的系统，其中所述至少一种肽或蛋白质是药物、抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
27.根据权利要求20所述的系统，其中所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪、三重四极质谱仪或超高质量范围混合四极质谱仪。
28.根据权利要求20所述的系统，其中所述质谱仪包括轨道阱质量分析仪。
29.根据权利要求20所述的系统，其中所述疏水性基团是苯基、辛基、丁基、己基或丙基。
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