JP2022549875A - 抗体分析のための疎水性相互作用クロマトグラフィー結合ネイティブ質量分析 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗体精製中に不純物を同定すること、産生中に翻訳後修飾バリアントをモニタリングすること、または抗体－薬物コンジュゲートの薬物対抗体比を特徴付けることなどの、疎水性相互作用クロマトグラフィー結合ネイティブ質量分析を使用してペプチドまたはタンパク質を特徴付けして生物学的医薬品の製造プロセスを改善するための、高速高感度ハイスループットの方法およびシステムを提供する。ペプチドまたはタンパク質の分離プロファイルを生成し、比較して、該ペプチドまたはタンパク質を同定または適格とする。【選択図】図１

Description

本発明は、概して、疎水性相互作用クロマトグラフィー結合ネイティブ質量分析を使用してペプチドまたはタンパク質を特徴付けるための方法およびシステムに関する。本発明は、ペプチドまたはタンパク質を特徴付けるための高速高感度ハイスループットの方法およびシステムを提供する。

治療用ペプチドまたはタンパク質は、産生のために細胞培養懸濁液中で発現する。続いて、ペプチドまたはタンパク質を精製して、プロセスに関連する不純物を除去する。精製された治療用ペプチドまたはタンパク質の製品品質属性は、薬物動態に関連するそれらの関連する安全性、有効性、および貯蔵期間プロファイルの保存を確実にするように広範囲に特徴付けられる。

治療用ペプチドまたはタンパク質の改変は、ペプチドまたはタンパク質の産生および／または精製の間および後の任意の時点で生じ得る。治療用ペプチドまたはタンパク質は、様々な翻訳後修飾、タンパク質分解、酵素修飾、および化学修飾により、不均一になり得る。生物学的医薬品の生物物理学的特性のこれらの改変は、関連する安全性、有効性、および貯蔵期間に影響を及ぼす可能性がある。

生物学的医薬品の製造プロセスを改善するための洞察を提供するハイスループット分析方法およびシステムの開発の必要性があることが認識されるであろう。分析方法は、高品質の生物学的医薬品の製造および精製を制御するための重要な改善を提供するための高速高感度ハイスループットの分析ツールを達成するために短時間で実施できることが非常に望ましい。

ハイスループット分析方法およびシステムの開発は、生物学的医薬品の製造および精製をモニタリングすることによって、生物学的医薬品の製造プロセスを改善するために重要であり得る。本開示は、生物学的医薬品の製造プロセスを改善するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー結合ネイティブ質量分析に基づく高速高感度ハイスループットの分析方法およびシステムを提供することによって、前述の要求を満たすための方法およびシステムを提供する。

本開示は、少なくとも部分的に、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法を提供する。一態様では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、疎水性基を含む固体表面に試料を接触させること、少なくとも１つの溶出液を生成するために移動相を使用して固体表面を洗浄することであって、溶出液が少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を含む、こと、および、質量分析計を使用して、ネイティブ条件下で少なくとも１つの溶出液中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を特徴付けることを含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルを生成することをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいて、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定または定量化することをさらに含む。

いくつかの態様では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾または翻訳後修飾バリエーションのレベルを同定または定量化することをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質のグリコシル化またはグリコシル化バリエーションのレベルを同定または定量化することをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の質量または相対的疎水性の変化を同定または定量化することをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、試料中の不純物を分離または同定することをさらに含む。

いくつかの態様では、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質は、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片、またはタンパク質医薬品である。

いくつかの例示的な実施形態では、本方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、抗体－薬物コンジュゲートの薬物対抗体比を定量化することをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、抗体－薬物コンジュゲートの薬物位置、位置異性体、または分解したペイロードを同定または定量化することをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、抗体－薬物コンジュゲート、または抗体断片の相補性決定領域の改変を同定または定量化することをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、固体表面および疎水性基を含むクロマトグラフィーカラムをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、クロマトグラフィーカラムにオンラインで結合される質量分析計をさらに含む。

いくつかの態様では、疎水性基は、フェニル、オクチル、ブチル、ヘキシル、またはプロピルである。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、質量分析計およびクロマトグラフィーカラムを接続するために使用されるスプリッターをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、質量分析計とクロマトグラフィーカラムとの間の移動相に導入されるメイクアップフローをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、低流速を質量分析計に、高流速を検出器に分流するのに使用されるスプリッターをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、三連四重極質量分析計、四重極質量分析計、または超高質量範囲ハイブリッド四重極質量分析計である質量分析計をさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、オービトラップ質量分析器をさらに含む。

本開示は、少なくとも部分的に、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムを提供する。一態様では、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムは、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を含む試料と、移動相によって洗浄されて溶出液を生成することが可能である、疎水性基を含むクロマトグラフィーカラムと、ネイティブ条件下で実行されること、および、クロマトグラフィーカラムにオンラインで結合されることが可能である、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を特徴付けるかまたは定量化することが可能である質量分析計と、を含む。

いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムは、質量分析計およびクロマトグラフィーカラムを接続するために使用されるスプリッターをさらに含む。

いくつかの態様では、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムは、低流速を質量分析計に、高流速を検出器に分流するのに使用されるスプリッターをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムは、移動相をさらに含み、得られた溶出液は、ネイティブ条件下で質量分析計を使用して特徴付けられる。

いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムは、質量分析計とクロマトグラフィーカラムとの間の移動相に導入されるメイクアップフローをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムは、ダイオードアレイ検出器またはフォトダイオードアレイ検出器を含む。

いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムは、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片、またはタンパク質医薬品である少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をさらに含む。

いくつかの態様では、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムは、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、三連四重極質量分析計、または超高質量範囲ハイブリッド四重極質量分析計である質量分析計をさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムは、オービトラップ質量分析器をさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムは、フェニル、オクチル、ブチル、ヘキシル、またはプロピルである疎水性基を含む。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考慮されると、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態および多数の具体的な詳細を示すが、例証としてであって、限定としてではない。多くの置換、修飾、追加、または再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。

抗体の分子構造の表面電荷プロットおよび表面疎水性プロットを示す。 ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるＳｉｇｍａＭＡｂ（ＭＳＱＣ４）をＬＣ－ＳＭＣＣ架橋剤を介してダンシルフルオロフォアにコンジュゲートすることによるコンジュゲートを含む、ＳｉｇｍａＭＡｂ抗体薬物コンジュゲート模倣体、例えば、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体を示す。 例示的な実施形態による、本出願のシステムの流路設計を示し、質量分析計は、ＨＩＣにオンラインで結合され、スプリッターは、質量分析計とＨＩＣカラムとを接続するために使用される。 例示的な実施形態による、本出願の流路設計Ｂのバリエーション、例えば、流路設計Ｂ１およびＢ２を示す。 例示的な実施形態による、ＨＩＣ－ＵＶ（紫外線）、ＨＩＣ－ＴＩＣ（全イオンクロマトグラム）、および質量スペクトル生データに関する分離プロファイルとしての本出願の流路設計Ａの試験結果を示す。 例示的な実施形態による、ＨＩＣ－ＵＶ、ＨＩＣ－ＴＩＣ、および質量スペクトル生データに関する分離プロファイルとしての本出願の流路設計Ｂ１の試験結果を示す。 例示的な実施形態による、ＨＩＣ－ＵＶ、ＨＩＣ－ＴＩＣ、および質量スペクトル生データに関する分離プロファイルとしての本出願の流路設計Ｂ２の試験結果を示す。 例示的な実施形態による、ＨＩＣ－ＵＶ、ＨＩＣ－ＴＩＣ、および質量スペクトル生データに関する分離プロファイルとしての本出願の流路設計Ｃの試験結果を示す。 例示的な実施形態による、本出願のオンラインＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、グリコフォームのベースライン分解および正確な質量測定を有するＮＩＳＴｍＡｂ基準材料の高速スクリーニングを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、６つの異なるモノクローナル抗体を含む抗体混合物中のグリコシル化バリエーションの分離および検出を示す。 Ｓｉｇｍａによって提供されるＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体のＨＩＣ分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの設計Ｂ２を使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体の分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、Ｓｉｇｍａによって提供される分離プロファイルと比較した、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの設計Ｃを使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体の分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの設計Ｃを使用する、ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）に対応するＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体の分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの設計Ｃを使用する、分解生成物を含むＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体の分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせたインソース解離を使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体（ＤＡＲ＝２）における薬物位置を特徴付けるための分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせたインソース解離を使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体（分解生成物についてＤＡＲ＝２）における位置異性体を特徴付けるための分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせたインソース解離を使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体（ＤＡＲ＝４）における薬物位置を特徴付けるための分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせたインソース解離を使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体（ＤＡＲ＝６または８）における薬物位置を特徴付けるための分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、ＴＩＣ、質量スペクトル生データ、およびデコンボリューションした質量スペクトルを含むＣＤＲにおける改変を特徴付けるための、ｍＡｂ－７のＯ－グリコシル化バリアントの分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、ＴＩＣ、質量スペクトル生データ、およびデコンボリューションした質量スペクトルを含むＣＤＲにおける改変を特徴付けるための、消化されたｍＡｂ－７のＯ－グリコシル化バリアントの分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、ネイティブＳＥＣ－ＭＳを使用する、ｍＡｂ－７におけるＣＤＲのＯ－グリコシル化バリアントの分析を示す。 例示的な実施形態による、減少したペプチドマッピングを使用する、ｍＡｂ－７におけるＣＤＲのＯ－グリコシル化バリアントの分析を示す。 例示的な実施形態による、ｍＡｂ－８におけるＣＤＲにおける特異的酸化に対応する質量変化を明らかにするための、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、ｍＡｂ－８バリアントの分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、減少したペプチドマッピングを使用する、ｍＡｂ－８におけるＣＤＲの酸化バリアントの分析を示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせて、インソース捕捉エネルギーを使用する、ＡＤＣにおける分解したペイロードの局在化を特徴付けるための質量スペクトル生データの分離プロファイルを示す。特徴付けには、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体を使用した。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせて、インソース捕捉エネルギーを使用する、ＡＤＣにおける分解したペイロードの局在化を特徴付けるためのデコンボリューションした質量スペクトルの分離プロファイルを示す。特徴付けには、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体を使用した。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、モノクローナル抗体、例えば、ｍＡｂ－９およびｍＡｂ－１０の分子バリアントを特徴付けるためのＨＩＣ－ＴＩＣプロファイルおよび質量スペクトルを示す。

詳細な説明
生物学的医薬品の生産および製造は、様々なプロセスおよび技術に囲まれている。細胞培養懸濁液中の治療用ペプチドまたはタンパク質の発現および産生後、ペプチドまたはタンパク質を精製して、プロセスに関連する不純物を除去することができる。精製された治療用ペプチドまたはタンパク質は、薬物動態および製品品質属性に関連するそれらの関連する安全性、有効性、および貯蔵寿命プロファイルの保存を確実にするように、広範囲に特徴付けられ得る。

治療用ペプチドまたはタンパク質は、様々な翻訳後修飾（ＰＴＭ）、タンパク質分解、酵素修飾、および化学的修飾により不均一になり得、これは、ペプチドまたはタンパク質の産生および精製の間およびその後の任意の時点で導入され得る。不均一バリアントの同定および特徴付けは、生物学的医薬品の生物物理学的特徴の品質属性を制御するために重要である。モノクローナル抗体または抗体－薬物コンジュゲートの産生などの治療用ペプチドまたはタンパク質の産生および精製を制御およびモニタリングするための高速高感度ハイスループットの分析方法が、生物学的薬剤産業において必要とされている。

二重特異性抗体は、２つの異なる抗原を標的とすることができるため、非常に価値のある生物学的医薬品である。二重特異性抗体の設計は、複数の組織特異的抗体および細胞傷害性薬物を組み合わせて、腫瘍に近接して薬物を放出するなど、小分子薬物の使用と組み合わせた複数の組織特異的抗体を標的化することを対象とすることができる。小さな薬物分子を精製された二重特異性抗体にコンジュゲートして、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を産生することができる。二重特異性抗体の発現および精製は、親単一特異性抗体の除去などの不純物の除去の必要性に起因して、困難であり得る。ＡＤＣの薬物対抗体比のモニタリングおよび決定は、ＡＤＣの品質管理にとっても重要である。

本開示は、オンライン疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）結合ネイティブ質量分析（ＭＳ）に基づくハイスループットの分析方法およびシステムを提供して、抗体精製中に不純物を同定すること、製造中に翻訳後修飾バリアントをモニタリングすること、ＡＤＣの薬物対抗体比を特徴付けること、共製剤化のためのモノクローナル抗体混合物を特徴付けること、相対的疎水性を決定すること、インタクトな質量を決定すること、グリコシル化プロファイルを決定すること、酸化またはＯグリカンなどの抗体のＣＤＲ（相補性決定領域）の構造変化または改変を特徴付けることを含む、生物学的医薬品の製造プロセスを改善することによって、前述の要求を満たすための方法およびシステムを提供する。特に、本出願の分析方法およびシステムは、生物学的医薬品の製造および精製を制御する上で重要な改善を提供するための高速高感度ハイスループットの分析ツールを達成するために、高感度であり得、短期間で実施することができる。

図１に示される抗体の分子構造の表面電荷プロットおよび表面疎水性プロットを観察する際、疎水性相互作用に基づいて分離するために利用可能な様々な疎水性パッチがある。様々なモノクローナル抗体の疎水性は、ＨＩＣ分析を通じて相対保持時間を使用してランク付けできる。ＨＩＣにおける分離は、分析物の表面と静止相との間の疎水性相互作用に基づいている。フェニル、オクチル、ブチル、ヘキシル、またはプロピルなどの疎水性基は、クロマトグラフィー分離のために静止相に組み込まれる。ＨＩＣは、モノクローナル抗体を精製および分析するために広く使用されているオフライン非変性分離技術である。ＨＩＣはまた、断片化、ミスフォールディング、トリプトファンもしくはメチオニンの酸化、アスパラギン酸の異性化、スクシンイミドの形成、またはαアミド化カルボキシ末端の形成を特徴付けるなど、生物学的製剤を特徴付けるために広く使用される。しかしながら、タンパク質の凝集を考慮する上で、３Ｍの酢酸アンモニウムなどの高塩濃度がタンパク質結合に必要であるため、ペプチドまたはタンパク質の特徴付けおよび分離のためにネイティブＭＳとカップリングされるＨＩＣの限界がある。オンラインＨＩＣ結合ＭＳの以前の研究は、移動相における高塩濃度の要件を低減するために疎水性を増加させたポリペンチルなどの特殊なリガンドを利用する。このＨＩＣ結合ＭＳ研究は、移動相Ａ中に１Ｍの酢酸アンモニウムを有するキャピラリーカラム形式を利用する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｌｉｎｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１８，９０，７１３５－７１３８）。

本開示は、優れた液体クロマトグラフィー性能および高品質質量分析データを達成するために、異なる設計のメイクアップフロー・分割フローを有するＨＩＣ結合ネイティブＭＳの様々な設計を提供する。水のメイクアップフローは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）またはナノＥＳＩを受ける前に、移動相の塩濃度を希釈するために使用することができる。

ネイティブ質量分析は、ネイティブまたはほぼネイティブの状態でのインタクトな生体分子構造を研究するためのアプローチである。「ネイティブ」という用語は、イオン化を受ける前の溶液中の分析物の生物学的状態を指す。生体分析物を含む溶液のｐＨおよびイオン強度などのいくつかのパラメータは、溶液中の生体分析物のネイティブのフォールディング状態を維持するように制御することができる。一般に、ネイティブ質量分析は、エレクトロスプレーイオン化に基づいており、生体分析物は、非変性溶媒からスプレーされる。非共有結合、ネイティブスプレー、エレクトロスプレーイオン化、非変性、巨大分子、または超分子質量分析などの他の用語は、ネイティブ質量分析を記述することによっても使用することができる。（Ｌｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１７，２８，ｐａｇｅｓ ５－１３，Ｎａｔｉｖｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ｗｈａｔ ｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｍｅ）。

本出願は、高速なオンラインアプローチに基づくネイティブ質量分析と結合したＨＩＣ分離を提供し、これは、ペプチドまたはタンパク質の高速高感度スループットスクリーニングまたは同定のための強力な分析ツールを提供する。本出願の方法およびシステムでは、ペプチドまたはタンパク質の分離プロファイルは、差分疎水性相互作用に基づいて生成することができ、その後、ネイティブまたはほぼネイティブの状態のペプチドまたはタンパク質のインタクトな生体分子構造は、質量分析を使用して特徴付けることができる。

ＨＩＣと結合することができる様々な検出モードのうち、質量分析は、複雑な試料中の個々の成分を的確かつ正確に同定することを可能にする。生体分析物を含む溶液のｐＨ範囲または塩濃度などのいくつかのパラメータは、ネイティブ質量分析を行うための生体分析物のネイティブのフォールディング状態を維持するように制御されるべきである。溶液中の分析物、例えばペプチドまたはタンパク質の生物学的状態は、ＨＩＣカラムの溶出後、および質量分析のイオン化ステップを受ける前に、ネイティブまたはネイティブ様のフォールディング状態で維持される。

本出願の方法およびシステムは、治療用ペプチドまたはタンパク質の製造プロセスを改善するための機械的知見を提供するハイスループットの方法およびシステムを提供するのに有利である。特に、本出願は、ＨＩＣをインタクトなネイティブ質量分析と組み合わせることによって、抗体、抗体バリアント、または抗体－薬物コンジュゲートを特徴付けるための高速高感度ハイスループットの方法およびシステムを提供することができる。

一態様では、特定の翻訳後修飾を含むモノクローナル抗体または抗体バリアントは、ＨＩＣをインタクトなネイティブ質量分析と組み合わせることによって、本出願のハイスループットの方法およびシステムを使用して評価される。いくつかの好ましい例示的な実施形態では、本出願の方法およびシステムは、モノクローナル抗体または抗体バリアントの翻訳後修飾または翻訳後修飾バリエーションのレベルを同定または定量化するために使用することができる。

一態様では、特定のグリコシル化を含むモノクローナル抗体または抗体バリアントは、ＨＩＣをインタクトなネイティブ質量分析と組み合わせることによって、本出願のハイスループットの方法およびシステムを使用して評価される。いくつかの好ましい例示的な実施形態では、本出願の方法およびシステムは、ＣＤＲにおけるＯ－グリコシル化修飾または酸化を明らかにするなど、モノクローナル抗体または抗体バリアントのグリコシル化またはグリコシル化バリエーションのレベルを同定または定量化するために使用することができる。いくつかの好ましい例示的な実施形態では、本出願の方法およびシステムは、グリカンベースの分離またはグリコフォームの変化を使用して、モノクローナル抗体または抗体バリアントのグリコシル化またはグリコシル化バリエーションのレベルを同定または定量化するために使用することができる。

一態様では、本出願は、ＨＩＣをインタクトなネイティブ質量分析と組み合わせることによって、本出願のハイスループットの方法およびシステムを使用して、抗体－薬物コンジュゲートの薬物対抗体比を同定または定量化するための、高感度ハイスループットの分析方法およびシステムを提供する。いくつかの好ましい例示的な実施形態では、分析される抗体－薬物コンジュゲートは、リジン結合またはシステイン結合の抗体－薬物コンジュゲートである。本出願は、ネイティブ条件下での高感度質量分析検出と組み合わせて、異なる薬物対抗体比を有する種の均一な溶出と結合した高いピーク容量を提供することによって特に有利である。

一態様では、本出願は、ＨＩＣをインタクトのネイティブ質量分析と組み合わせることによって、特定のグリコシル化を含むモノクローナル抗体、抗体バリアント、または共製剤化のためのモノクローナル抗体混合物を同定または定量化するための、高感度ハイスループットの分析方法およびシステムを提供する。

既存の方法の制限を考慮すると、本明細書に開示される例示的な実施形態は、抗体精製中に不純物を同定すること、産生中に翻訳後修飾バリアントをモニタリングすること、抗体－薬物コンジュゲートの薬物対抗体比を特徴付けること、および共製剤化のためにモノクローナル抗体混合物を特徴付けることを含む、生物学的医薬品の製造プロセスを改善するために、ＨＩＣ結合ネイティブ質量分析に基づいて高速高感度ハイスループットの分析方法およびシステムを提供するという長く待望された必要性を満たす。

「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」および「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように、標準偏差を許容する理解されるべきであり、範囲が提供される場合、端点が含まれる。

本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、それぞれ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。

いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法であって、疎水性基を含む固体表面に試料を接触させること、少なくとも１つの溶出液を生成するために移動相を使用して固体表面を洗浄することであって、溶出液が少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を含む、こと、および、ネイティブ条件下で質量分析計を使用して、少なくとも１つの溶出液中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を特徴付けることを含む方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムであって、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を含む試料と、移動相によって洗浄されて溶出液を生成することが可能である、疎水性基を含むクロマトグラフィーカラムと、ネイティブ条件下で実行されること、および、クロマトグラフィーカラムにオンラインで結合されることが可能である、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を特徴付けるまたは定量化することが可能である質量分析計と、を含む、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムを提供する。

本明細書で使用される場合、「ネイティブ条件下で質量分析計を使用する」の記載における「ネイティブ」という用語は、イオン化を受ける前の溶液中の分析物の生物学的状態を指す。本明細書で使用される場合、「ネイティブ条件」または「ネイティブ質量分析」という用語は、分析物中の非共有結合性相互作用を保存する条件下で質量分析を行うことを含むことができる。ネイティブＭＳの詳細なレビューについては、以下のレビューを参照されたい：Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ Ｂｏｅｒｉ Ｅｒｂａ＆Ｃａｒｌｏ Ｐｅｔｏｓａ，Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，２４ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ １１７６－１１９２（２０１５）。

本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を同定し、それらの正確な質量を測定することができるデバイスを含む。この用語は、検出および／または特徴付けのためにポリペプチドまたはペプチドが溶出され得る任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計は、イオン源、質量分析器、および検出器の３つの主要な部分を含むことができる。イオン源の役割は、気相イオンを作ることである。分析物の原子、分子、またはクラスターは、気相に移し、同時にいずれかをイオン化することができる（エレクトロスプレーイオン化のように）。イオン源の選択は、用途に大きく依存する。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質は、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片、またはタンパク質医薬品である。

本明細書で使用される場合、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、共有結合アミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、概して「ペプチド」または「ポリペプチド」として当該技術分野で知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。タンパク質は、単一の機能的生体分子を形成するために、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、宿主細胞タンパク質、またはそれらの組み合わせであり得る。

本明細書中で使用される場合、「タンパク質医薬品」は、本質的に完全にまたは部分的に生物学的であり得る活性成分を含む。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質医薬品は、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗原、ワクチン、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、タンパク質－薬物コンジュゲート、細胞、組織、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの他の例示的な実施形態では、タンパク質医薬品は、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗原、ワクチン、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、タンパク質－薬物コンジュゲート、細胞、組織、またはそれらの組み合わせの組換え、操作、修飾、変異、または短縮化バージョンを含むことができる。

本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体のＦｃ領域、抗原結合、または可変領域などのインタクト抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、ならびに抗体断片から形成されるトリアボディ、テトラボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、および多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え一本鎖ポリペプチド分子である。抗体断片は、様々な手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的または化学的に産生され得、かつ／またはそれは、部分的抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生され得る。代替的または追加的に、抗体断片は、完全または部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択で一本鎖抗体断片を含んでもよい。代替的または追加的に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合により一緒に連結された複数の鎖を含んでもよい。抗体断片は、任意選択で多分子複合体を含んでもよい。

本明細書で使用される場合、「抗体－薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」という用語は、不安定な結合を有するリンカーによって生物学的活性薬物に結合された抗体を指すことができる。ＡＤＣは、抗体のアミノ酸残基の側鎖に共有結合され得る生物学的活性薬物（またはペイロード）のいくつかの分子を含むことができる（Ｓｉｌｅｒ Ｐａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，６ ｍＡｂｓ ３４－４５（２０１３））。ＡＤＣに使用される抗体は、標的部位における選択的蓄積および持続的保持に十分な親和性で結合することができる。ほとんどのＡＤＣは、ナノモル範囲内のＫｄ値を有し得る。ペイロードは、ナノモル／ピコモル範囲の効力を有することができ、標的組織へのＡＤＣの分布に続いて達成可能な細胞内濃度に到達することができる。最後に、ペイロードと抗体との間の接続を形成するリンカーは、循環において十分に安定であることができ、抗体部分の薬物動態特性（例えば、長い半減期）を利用し、ペイロードが組織内に分布するときに抗体に結合したままであることを可能にするが、ＡＤＣが標的細胞内に取り込まれ得るようになると、生物学的活性薬物の効率的な放出を可能にすることができるはずである。リンカーは、細胞プロセシング中に切断不可能であるものであり得、ＡＤＣが標的部位に到達すると切断可能であるものであり得る。切断不可能なリンカーでは、呼び出し内に放出される生物学的活性薬物は、リソソーム内でのＡＤＣの完全なタンパク質分解後に、抗体のアミノ酸残基、典型的にはリジンまたはシステイン残基に依然として結合されたペイロードおよびリンカーのすべての要素を含む。切断可能なリンカーは、その構造がペイロードと抗体上のアミノ酸結合部位との間の切断部位を含むものである。切断メカニズムは、酸性細胞内コンパートメント中の酸不安定結合の加水分解、細胞内プロテアーゼまたはエステラーゼによるアミドまたはエステル結合の酵素切断、および細胞内の還元環境によるジスルフィド結合の還元的切断を含むことができる。

本明細書で使用される場合、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された４本のポリペプチド鎖、すなわち２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を指すことが意図される。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶ_Ｈ）および重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３の３つのドメインを含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ）からなる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割され得る。それぞれのＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなることができる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化の両方の免疫グロブリンへの言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたものを含むが、これらに限定されない。ＩｇＧは、抗体のサブセットを含む。

いくつかの例示的実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾または翻訳後修飾バリエーションのレベルを同定または定量化することをさらに含む。

本明細書で使用される場合、「翻訳後修飾」または「ＰＴＭ」という一般的な用語は、ポリペプチドがリボソーム合成の間（共翻訳修飾）またはその後（翻訳後修飾）のいずれかで受ける共有結合修飾を指す。ＰＴＭは、概して、特定の酵素または酵素経路によって導入される。多くは、タンパク質骨格内の特定の特徴的なタンパク質配列（シグネチャー配列）の部位で発生する。数百のＰＴＭが記録されており、これらの修飾は、必然的に、タンパク質の構造または機能のいくつかの態様に影響を及ぼす（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２０１４）ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３）。種々の翻訳後修飾としては、切断、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化（ビオチンによるリジン残基のアシル化）、Ｃ末端のアミド化、グリコシル化、ヨード化、補欠分子族の共有結合、アセチル化（通常、タンパク質のＮ末端でのアセチル基の付加）、アルキル化（通常、リジンまたはアルギニン残基でのアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル）の付加）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内またはポリペプチド鎖間の共有結合、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾（プロリンおよびリジンヒドロキシル化およびカルボキシ末端アミド化）、γ－カルボキシグルタミン酸（ｇｌｕ残基）の形成をもたらすビタミンＫがグルタミン酸残基のカルボキシ化における補助因子であるビタミンＫ依存性修飾、グルタミン酸化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（グリシン残基の共有結合）、グリコシル化（糖タンパク質をもたらす、アスパラギン、ヒドロキシリジン、セリン、またはトレオニンのいずれかへのグリコシル基の付加）、イソプレニル化（ファルネソールおよびゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド基の付加）、リポイル化（リポ酸官能性の付加）、ホスホパンテテイニル化（脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチド、およびロイシン生合成の場合のように、補酵素Ａからの４’－ホスホパンテテイニル部分の付加）、リン酸化（通常、セリン、チロシン、スレオニン、またはヒスチジンへのリン酸基の付加）、ならびに硫酸化（通常はチロシン残基への硫酸基の付加）が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸の化学的性質を変化させる翻訳後修飾としては、シトルリン化（脱イミノ化によるアルギニンからシトルリンへの変換）、および脱アミド化（グルタミンからグルタミン酸またはアスパラギンからアスパラギン酸への変換）が挙げられるが、これらに限定されない。構造変化を伴う翻訳後修飾としては、ジスルフィド架橋の形成（２つのシステインアミノ酸の共有結合）およびタンパク質分解切断（ペプチド結合でのタンパク質の切断）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の翻訳後修飾は、ＩＳＧ化（ＩＳＧ１５タンパク質（インターフェロン刺激遺伝子）への共有結合）、ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯタンパク質（低分子ユビキチン様修飾因子）への共有結合）、およびユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）などの他のタンパク質またはペプチドの付加を伴う。ＵｎｉＰｒｏｔによってキュレーションされたＰＴＭのより詳細な統制語彙については、ヨーロッパバイオインフォマティクス研究所タンパク質情報リソースＳＩＢスイスバイオインフォマティクス研究所、ヨーロッパバイオインフォマティクス研究所Ｄｒｓ－Ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ前駆体－Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）－Ｄｒｓ遺伝子およびタンパク質、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｐｔｍｌｉｓｔ（最終訪問日：２０１９年１月１５日）を参照されたい。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、試料中の不純物を分離または同定することをさらに含む。

本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、タンパク質生物学的医薬品に存在する任意の望ましくないタンパク質を含み得る。不純物には、プロセスおよび製品関連不純物が含まれ得る。不純物は、既知の構造のもの、部分的に特徴付けられたもの、または同定されていないものとすることができる。プロセス関連不純物は、製造プロセスから誘導される可能性があり、細胞基質由来、細胞培養由来、および下流由来の３つの主要なカテゴリを含むことができる。細胞基質由来の不純物としては、宿主生物に由来するタンパク質および核酸（宿主細胞ゲノム、ベクター、または総ＤＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養由来の不純物としては、誘導剤、抗生物質、血清、および他の培地成分が挙げられるが、これらに限定されない。下流由来の不純物としては、酵素、化学的および生化学的処理試薬（例えば、シアノゲンブロミド、グアニジン、酸化および還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、ならびに他の浸出性物質が挙げられるが、これらに限定されない。製品関連不純物（例えば、前駆体、特定の分解生成物）は、活性、有効性、および安全性に関して所望の生成物のものと同等の特性を有しない、製造および／または保管中に生じる分子バリアントであり得る。そのようなバリアントは、修飾の種類を同定するために、単離および特徴付けにおけるかなりの努力を必要とし得る。製品関連不純物には、短縮型、修飾型、および凝集体が含まれ得る。短縮型は、ペプチド結合の切断を触媒する加水分解酵素または化学物質によって形成される。修飾型としては、脱アミド化、異性化、ミスマッチＳ－Ｓ結合、酸化、または変化したコンジュゲート形態（例えば、グリコシル化、リン酸化）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾型はまた、任意の翻訳後修飾形態を含み得る。凝集体には、所望の生成物の二量体およびより多くの多量体が含まれる。（Ｑ６Ｂ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＩＣＨ Ａｕｇｕｓｔ １９９９，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。

いくつかの例示的な実施形態では、疎水性基を含む固体表面は、クロマトグラフィーカラムに含まれる。

本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、液体または気体によって担持される化学混合物が、静止液体または固相の周囲または上を流れる化学物質の差分分布の結果として成分に分離され得るプロセスを指す。クロマトグラフィーの非限定的な例としては、従来の逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、ミックスモードクロマトグラフィー、および正常相クロマトグラフィー（ＮＰ）が挙げられる。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法において、質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、三連四重極質量分析計、四重極質量分析計、または超高質量範囲ハイブリッド四重極質量分析計である。

本明細書で使用される場合、「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」という用語は、溶液中のカチオンまたはアニオンのいずれかが、溶液を含むエレクトロスプレーニードルの先端と対電極との間の電位差を印加することから生じる高電荷液滴の流れの大気圧での形成および脱溶媒和を介して気相に移される、スプレーイオン化のプロセスを指す。一般に、溶液中の電解質イオンからの気相イオンの産生には３つの主要なステップがある。これらは、（ａ）ＥＳ注入先端における荷電液滴の産生、（ｂ）溶媒蒸発による荷電液滴の収縮、および気相イオンを産生することができる小さな高荷電液滴をもたらす液滴崩壊の繰り返し、ならびに（ｃ）気相イオンが非常に小さな高荷電液滴から産生されるメカニズム。段階（ａ）～（ｃ）は、一般的に装置の大気圧領域で発生する。

本明細書で使用される場合、「ナノエレクトロスプレー」という用語は、多くの場合、外部溶媒送達を使用せずに、典型的には試料溶液１分当たり数百ナノリットル以下の非常に低い溶媒流速でのエレクトロスプレーイオン化を指す。ナノエレクトロスプレーを形成するエレクトロスプレー注入設定は、静的ナノエレクトロスプレーエミッタまたは動的ナノエレクトロスプレーエミッタを使用することができる。静的ナノエレクトロスプレーエミッタは、長期間にわたって小さな試料（分析物）溶液体積の連続分析を行う。動的ナノエレクトロスプレーエミッタは、質量分析計による分析の前に、キャピラリーカラムおよび溶媒送達システムを使用して混合物上でクロマトグラフィー分離を行う。

いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、オービトラップ質量分析器を含む。

本明細書で使用される場合、「質量分析器」という用語は、種、すなわち、原子、分子、またはクラスターを、それらの質量に従って分離することができるデバイスを含む。高速タンパク質配列決定に用いられ得る質量分析装置の非限定的な例は、飛行時間（ＴＯＦ）、磁気電気セクター、四重極質量フィルタ（Ｑ）、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、オービトラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、ならびに加速器質量分析（ＡＭＳ）の技術である。

例示的な実施形態
本明細書に開示される実施形態は、ＨＩＣ結合ネイティブ質量分析に基づいて試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための組成物、方法、およびシステムを提供する。

いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法であって、疎水性基を含む固体表面に試料を接触させること、少なくとも１つの溶出液を生成するために移動相を使用して固体表面を洗浄することであって、溶出液が少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を含む、こと、および、ネイティブ条件下で質量分析計を使用して、少なくとも１つの溶出液中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を特徴付けることを含む方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムであって、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を含む試料と、移動相によって洗浄されて溶出液を生成することが可能である、疎水性基を含むクロマトグラフィーカラムと、ネイティブ条件下で実行されること、および、クロマトグラフィーカラムにオンラインで結合されることが可能である、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を特徴付けるまたは定量化することが可能である質量分析計と、を含む、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステムを提供する。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法またはシステムは、ＨＩＣ結合ネイティブ質量分析に基づいており、ＨＩＣカラムは、ネイティブ質量分析計にオンラインで結合され、スプリッターは、質量分析計とクロマトグラフィーカラムとを接続するために使用される。ＨＩＣを実施するためには、フロントエンド分離のためにＨＩＣカラムを備えたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用する。酢酸アンモニウムおよび／または硫酸アンモニウムを含む移動相は、ＨＩＣ用途に使用される。いくつかの例示的な実施形態では、酢酸アンモニウムまたは硫酸アンモニウムの濃度は、約０．５～５Ｍ、約１～４．５Ｍ、約２～３．５Ｍ、約３Ｍ超、または好ましくは約３Ｍである。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法またはシステムは、ＨＩＣ結合ネイティブ質量分析に基づいており、ＨＩＣカラムは、ネイティブ質量分析計にオンラインで結合され、スプリッターは、質量分析計とクロマトグラフィーカラムとを接続するために使用され、メイクアップフローは、質量分析計とクロマトグラフィーカラムとの間の移動相に導入される。ＨＩＣを実施するために、ＨＩＣカラムを備えたＨＰＬＣをフロントエンド分離に使用し、ＨＩＣカラムは、フェニル、オクチル、ブチル、ヘキシル、またはプロピルなどの疎水性基を含む。いくつかの例示的な実施形態では、質量分析は、オービトラップ質量分析器を有し、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用する。

いくつかの例示的な実施形態では、混合Ｔは、スプリッターの前のＨＩＣカラムの後に添加され、次いで、混合Ｔでメイクアップフローが移動相に導入される。いくつかの例示的な実施形態では、移動相は、ＨＩＣカラムに入るための約１００～５００μＬ／分、約２００～４００μＬ／分、約２５０～３５０μＬ／分、または好ましくは約３００μＬ／分の流速を有する。いくつかの例示的な実施形態では、スプリッターの後のＥＳＩに向かって移動した移動相の流速は、約０．１～３μＬ／分、約０．５～２．５μＬ／分、約０．５～２μＬ／分、約０．５～１．５μＬ／分、約０．５μＬ／分、約１μＬ／分、約１．５μＬ／分、約１．７μＬ／分、または好ましくは約２μＬ／分未満である。いくつかの例示的な実施形態では、メイクアップフローは、混合Ｔで移動相に入るための約１００～１５００μＬ／分、約２５０～１５００μＬ／分、約３００～１５００μＬ／分、約８００～１５００μＬ／分、約１０００～１３００μＬ／分、約１０００μＬ／分、約１１００μＬ／分、約１３００μＬ／分、または好ましくは約１２００μＬ／分の流速を有する。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法またはシステムは、ＨＩＣ結合ネイティブ質量分析に基づいており、ＨＩＣカラムは、ネイティブ質量分析計にオンラインで結合され、スプリッターは、質量分析計とクロマトグラフィーカラムとを接続するために使用され、メイクアップフローは、質量分析計とクロマトグラフィーカラムとの間の移動相に導入される。いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾もしくは翻訳後修飾バリエーションのレベル、少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質のグリコシル化もしくはグリコシル化バリエーションのレベル、少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質の質量の変化、少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質の相対的疎水性、試料中の不純物、少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質の断片化、少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質のミスフォールディング、少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質のトリプトファンもしくはメチオニンの酸化、少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質のアスパラギン酸の異性化、少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質のスクシンイミドの形成、または少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質のαアミド化カルボキシ末端の形成を同定または定量化することをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法またはシステムは、ＨＩＣ結合ネイティブ質量分析に基づいており、ＨＩＣカラムは、ネイティブ質量分析計にオンラインで結合され、スプリッターは、質量分析計とクロマトグラフィーカラムとを接続するために使用され、メイクアップフローは、質量分析計とクロマトグラフィーカラムとの間の移動相に導入され、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、抗体－薬物コンジュゲート、または抗体断片である。いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、抗体－薬物コンジュゲートの薬物対抗体比、薬物位置、位置異性体、または分解したペイロードを定量化または同定することをさらに含む。

いくつかの例示的な実施形態では、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法は、少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、抗体－薬物コンジュゲート、または抗体断片のＣＤＲの改変を同定または定量化することをさらに含み、修飾は、Ｏ－グリコシル化またはトリプトファンの酸化またはメチオニンの酸化などの酸化である。

本出願の方法またはシステムは、前述の医薬品、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体－薬物コンジュゲート、生物学的医薬品、クロマトグラフィーカラム、または質量分析計のうちのいずれかに限定されないことが理解される。

本明細書で提供される方法ステップの数字および／または文字による連続した標識は、方法またはその任意の実施形態を特定の指示された順序に限定することを意味しない。特許、特許出願、公開特許出願、アクセッション番号、技術論文、および学術論文を含む様々な刊行物が、本明細書に引用される。これらの引用文献のそれぞれは、参照により、その全体およびすべての目的のために、本明細書に組み込まれる。

本開示は、本開示をより詳細に説明するために提供される以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。これらは、例示することを意図し、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

材料およびワークフロー
１．１ 抗体基準材料
ＮＩＳＴｍＡｂを抗体基準材料として使用した。ＮＩＳＴｍＡｂは、マウス懸濁培養で発現される組換えヒト化ＩｇＧ１κであり、これは、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖のホモ二量体である。ＮＩＳＴｍＡｂは、メチオニン酸化、脱アミド化、および糖化を含む低い存在量の翻訳後修飾を有する。ＮＩＳＴｍＡｂの重鎖は、Ｎ末端ピログルタミン化、Ｃ末端リジンクリッピング、およびグリコシル化を有する。ＮＩＳＴｍＡｂは、広範囲に特徴付けられており、プロセス関連不純物を除去するための業界標準の上流および下流の精製を受けたマウス懸濁細胞培養物中で産生された。

２．１ ＡＤＣ基準材料
Ｓｉｇｍａ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体などのＳｉｇｍａＭＡｂ抗体薬物コンジュゲート模倣体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．）をＡＤＣ基準材料として使用した。図２に示すように、ＳｉｇｍａＭＡｂ抗体薬物コンジュゲート模倣体は、ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるＳｉｇｍａＭＡｂ（ＭＳＱＣ４）をＬＣ－ＳＭＣＣ架橋剤を介してダンシルフルオロフォアにコンジュゲートさせることによるコンジュゲートを含み、質量分析および高速液体クロマトグラフィーの標準として利用された。

３．１ ペプチドまたはタンパク質の同定のためのＨＩＣ結合ネイティブ質量分析のためのワークフロー
本出願は、ＨＩＣカラムを、様々な設計を有するネイティブ質量分析計にオンラインで結合し、図３に示されるように、スプリッターを使用して、質量分析計とＨＩＣとを接続した、ＨＩＣ結合ネイティブ質量分析の方法およびシステムを提供する。スプリッターを使用する目的のうちの１つは、質量分析計に入るための流速を減速することである。ＭＳ検出に供する前に、液体クロマトグラフィーの移動相中の高塩濃度を希釈する必要があった。移動相における高塩分濃度を低減させるために、図３に示されるように、少なくとも３つのワークフロー設計を、最小のデッドボリュームおよび酢酸アンモニウムベースの勾配、例えば、流路設計Ａ、ＢおよびＣを用いて生成し、メイクアップおよび分割フロー設計を組み込んだ。図４に示されるように、設計Ｂにはバリエーション、例えば、設計Ｂ１およびＢ２があった。

設計Ａでは、メイクアップフローをスプリッターとＥＳＩとの間、例えば、スプリッターの後およびＥＳＩの前の移動相に導入した。例示的な実施形態では、設計Ａの廃棄物／ＵＶフローをスプリッターから放出した。設計Ａの移動相は、ＨＩＣカラム（約４．６ｍｍ）に入るための約３００μＬ／分の流速を有した。スプリッターがＥＳＩに向かって移動した後の移動相の流速は、設計Ａにおいて約２μＬ／分（約２０μｍ×３５ｃｍ）未満であった。

設計Ｂでは、メイクアップフロースプリッターを使用し、メイクアップフローをスプリッターで移動相に導入したか、またはスプリッター直後に導入した。設計Ｂの廃棄物／ＵＶ（または廃棄物）フローは、スプリッターから、および／またはＥＳＩの前に、放出された。図４に、設計Ｂのバリエーション、例えば、Ｂ１およびＢ２を示す。移動相は、設計ＢにおいてＨＩＣカラム（約４．６ｍｍ）に入るための約３００μＬ／分の流速を有した。ＥＳＩに向かって移動したスプリッターの後の移動相の流速は、設計Ｂにおいて約１２μＬ／分（５０μｍ）であった。設計Ｂのメイクアップフローは、スプリッターに入るための約１０μＬ／分の流速を有した。

設計Ｃでは、スプリッターの前でＨＩＣカラムの後に混合Ｔを加え、次いで混合Ｔにおいて移動相にメイクアップフローを導入した。設計Ｃの廃棄物／ＵＶフローをスプリッターから放出した。移動相は、設計ＣにおいてＨＩＣカラム（約４．６ｍｍ）に入るための約３００μＬ／分の流速を有した。ＥＳＩに向かって移動したスプリッターの後の移動相の流速は、設計Ｃにおいて約２μＬ／分（約２０μｍ×３５ｃｍ）未満であった。設計Ｃのメイアップクフローは、混合Ｔにおいて移動相に入るための約１２００μＬ／分の流速を有した。

直径約４．６ｍｍの分析スケールＨＩＣカラムを使用して、質量分析計と結合した。３Ｍを超えるなどの高濃度の酢酸アンモニウムを含む移動相Ａを使用して、モノクローナル抗体またはＡＤＣをＨＩＣカラム上に保持した。検出感度を改善し、高塩分濃度に耐えるため、ＮａｎｏＥＳＩ－ＭＳを適用した。方法またはシステムにおける質量分析は、ネイティブ条件下で実施した。

ネイティブ質量分析を実施するために、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＵＨＭＲ（超高質量範囲）質量分析計を使用した。質量分析計は、オービトラップ質量分析器を有し、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用する。酢酸アンモニウムを含む質量分析に適合する移動相をＨＩＣに使用した。ポストカラムスプリッターを使用して、低流速を質量分析計に分流した。質量分析計には、ナノスプレーＦｌｅｘ（商標）イオン源が備えられ、これが、ナノスプレーイオン化源の感度および溶解を達成することを可能にした。質量分析スペクトルの生データは、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭｅｔｒｉｃｓのＩＮＴＡＣＴ ＭＡＳＳ（商標）ソフトウェアを使用してデコンボリューションしたした。

実施例１．流路設計の試験
異なるメイクアップおよび分割フロー設計を有する流路設計は、直径約４．６ｍｍの分析スケールＨＩＣカラムを使用して試験した。設計Ａの試験結果を、ＨＩＣ－ＵＶ（紫外線）、ＨＩＣ－ＴＩＣ（全イオンクロマトグラム）、および質量スペクトル生データに関する分離プロファイルとして図５に示した。設計Ａは、シリンジポンプを介した一貫性のないメイクアップフロー送達を有していた。メイクアップ混合による圧力が、スプリッターから逆流するノンフローを引き起こしたため、劣悪なＴＩＣをもたらした。さらに、非効率的混合は脱溶媒化不良を引き起こし、ＭＳデータの品質不良をもたらした。

ＨＩＣ－ＵＶ、ＨＩＣ－ＴＩＣ、および質量スペクトル生データに関する分離プロファイルとして、設計Ｂ１、Ｂ２の試験結果をそれぞれ図６、図７に示した。設計Ｃの試験結果を、ＨＩＣ－ＵＶ、ＨＩＣ－ＴＩＣ、および質量スペクトル生データに関する分離プロファイルとして図８に示した。設計Ｃは良好なＵＶおよびＴＩＣ類似性を有し、ＭＳデータの良好な品質および感度を伴った。ＵＶシグナルは、希釈および分割のため、より低かった。

実施例２．ＮＩＳＴｍＡｂのスクリーニング
本出願のＨＩＣ結合ネイティブ質量分析（ＨＩＣ－ネイティブＭＳ）の方法およびシステムを使用して、ＮＩＳＴｍＡｂを同定およびスクリーニングした。質量分析計を使用して分析をネイティブ条件下で行った。質量分析計をオンラインでＨＩＣカラムに結合し、ここで、図３の設計Ｃに示されるように、およびワークフローセクションに記載されるように、スプリッターを使用して質量分析計とＨＩＣカラムとを接続した。酢酸アンモニウムを含む質量分析に適合する移動相をＨＩＣ分離に使用して、ＮＩＳＴｍＡｂを含む溶出液を生成し、その後、ネイティブ質量分析に供した。本出願の高速ハイスループット分析法によって、ＮＩＳＴｍＡｂ基準材料を分離し、スクリーニングした。

グリコフォームのベースライン分解能および正確な質量測定を有するＮＩＳＴｍＡｂ基準材料の高速スクリーニングは、図９に示されるように、設計Ｃを使用して、本出願のオンラインＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用して達成された。ＮＩＳＴｍＡｂは、マウス懸濁培養物で発現される組換えヒト化ＩｇＧ１κであり、メチオニン酸化、脱アミド化、および糖化を含む低い存在量の翻訳後修飾を有する。さらに、ＮＩＳＴｍＡｂの重鎖は、Ｎ末端ピログルタミン化、Ｃ末端リジンクリッピング、およびグリコシル化を有する。ＮＩＳＴｍＡｂの翻訳後修飾およびグリコシル化のバリエーションは、ベースライン分解能で十分に特徴付けられた。ＨＩＣカラムを使用するために高濃度の塩が必要とされたにもかかわらず、ＮＩＳＴｍＡｂのネイティブ様の電荷状態は、本出願の方法およびシステムを使用して無視できるほどの試料変性を示す分離プロファイル全体にわたって維持された。結果は、良好なクロマトグラフィー性能およびＭＳデータ品質を示す。

実施例３．モノクローナル抗体混合物の分析
６つの異なるモノクローナル抗体を含む抗体混合物を、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳに供した。質量分析計を使用して分析をネイティブ条件下で行った。質量分析計をオンラインでＨＩＣカラムに結合し、ここで、図３の設計Ｃに示されるように、およびワークフローセクションに記載されるように、スプリッターを使用して質量分析計とＨＩＣカラムとを接続した。酢酸アンモニウムを含む質量分析に適合する移動相をＨＩＣ分離に使用して、モノクローナル抗体を含む溶出液を生成した。図１０に示されるように、非グリコシル化、部分的グリコシル化、完全グリコシル化、または酸化などのモノクローナル抗体のグリコシル化バリエーションは、分離され、良好な解像度で検出され得る。

本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳは、ハイスループットとみなすことができる液体クロマトグラフィーのためのより短い時間を提供した。試験結果は、堅牢なクロマトグラフィーによる良好なピーク形状を有し、方法移行に適していた。さらに、結果は、明確なオンライン検出のための質の高いＭＳデータを提供した。

実施例４．Ｃｙｓ結合ＡＤＣの分析
図１１に示すように、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体のＨＩＣ分離プロファイルはＳｉｇｍａによって提供された。ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体を、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの設計Ｂ２を使用して試験した。試験設計Ｂ２の結果は、Ｓｉｇｍａによって提供されるＨＩＣプロファイルと良好なＵＶの類似性を示した。しかしながら、ＭＳピークのテーリングは、図１２に示すように、不十分なＭＳシグナル強度で観察された。

図１３に示すように、Ｓｉｇｍａによって提供されるプロファイルと比較して、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの設計Ｃを使用して、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体を試験した。本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳによって生成されるＨＩＣ－ＴＩＣプロファイルは、Ｓｉｇｍａによって提供されるＨＩＣプロファイルに類似する。十分なＭＳシグナル強度で最小ピークテーリングが観察された。図１４および図１５に示すように、検出されたすべてのＴＩＣピークは、ＤＡＲまたは分解生成物に対応する質量スペクトルに基づいて割り当てることができる。

実施例５．ＡＤＣにおける薬物位置および位置異性体の特徴付け
ＡＤＣにおける薬物位置および／または位置異性体を特徴付けるために、設計Ｃを使用して、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせて、インソース解離を行った。薬物位置および／または位置異性体の特徴付けのために、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体を使用した。結果として生じる分離プロファイルは、図１６（ＤＡＲ＝２）、図１７（分解生成物についてのＤＡＲ＝２）、図１８（ＤＡＲ＝４）、および図１９（ＤＡＲ＝６または８）に示されるように、分解生成物および位置異性体を含む薬物対抗体比に対応する重鎖または軽鎖中のコンジュゲート薬物の位置を特徴付けるように同定することができる。

実施例６．ＣＤＲにおける改変の特徴付け
本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの方法およびシステムは、モノクローナル抗体、例えば、ｍＡｂ－７およびｍＡｂ－８におけるＣＤＲにおける改変を特徴付けるために使用された。図２０に示すように、ｍＡｂ－７のＨＩＣ－ＴＩＣプロファイルは、ｍＡｂ－７のグリコシル化バリアント、例えば、主要ピーク、ピーク１（Ｐ１）、およびピーク２（Ｐ２）の分離プロファイルを示した。ｍＡｂ－７の質量分析スペクトルの生データを、ソフトウェアを使用してデコンボリューションした。ｍＡｂ－７のデコンボリューションした質量スペクトルは、グリコシル化バリアントの分離プロファイルを示し、これは、ｍＡｂ－７におけるＣＤＲの特異的Ｏ－グリコシル化バリアントを明らかにした。

ドメイン特異的改変は、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲで、例えば、ヒンジの下の特定の部位で抗体を消化してＦ（ａｂ’）２およびＦｃ／２断片を生成するシステインプロテアーゼであるＩｄｅＳで、ｍＡｂ－７を消化することによってさらに特徴付けられた。図２１に示すように、消化されたｍＡｂ－７のＨＩＣ－ＴＩＣプロファイルは、ｍＡｂ－７のドメイン特異的グリコシル化バリアントの分離プロファイルを示した。質量分析スペクトルの生データを、ソフトウェアを使用してデコンボリューションした。ｍＡｂ－７のデコンボリューションした質量スペクトルは、ドメイン特異的グリコシル化バリアントの分離プロファイルを示し、これは、ｍＡｂ－７におけるＣＤＲの特異的Ｏ－グリコシル化バリアントを明らかにした。図２２および図２３に示されるように、ネイティブＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）ＭＳおよび減少したペプチドマッピングを含む直交法を使用して、ｍＡｂ－７のＯ－グリコシル化バリアントをさらに分析した。

本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの方法およびシステムを使用して、酸化などのｍＡｂ－８におけるＣＤＲにおける改変を特徴付けた。図２４に示すように、ｍＡｂ－８のＨＩＣ－ＴＩＣプロファイルは、ｍＡｂ－８バリアントの分離プロファイル、例えば、主要ピークおよびピーク１（Ｐ１）を示した。ｍＡｂ－８の質量分析スペクトルの生データを、ソフトウェアを使用してデコンボリューションした。ｍＡｂ－８のデコンボリューションした質量スペクトルは、１５．６Ｄａの質量変化などの質量バリアントの分離プロファイルを示し、これは、ｍＡｂ－８におけるＣＤＲにおける特異的な酸化を明らかにした。ｍＡｂ－８の酸化バリアントを、図２５に示すように、還元されたペプチドマッピングを使用してさらに分析した。結果は、ｍＡｂ－８の重鎖における位置５４のメチオニンの酸化を明らかにした。

実施例７．ＡＤＣの分解したペイロードを特徴付けること
ＡＤＣにおける分解したペイロードの局在化を特徴付けるために、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせて、インソース捕捉エネルギーを行った。特徴付けには、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体を使用した。結果として生じる分離プロファイルは、図２６および図２７に示されるように、分解したペイロードを特徴付けるように同定され得る。

実施例８．抗体の分子バリアントを特徴付けること
本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの方法およびシステムを使用して、モノクローナル抗体、例えば、ｍＡｂ－９およびｍＡｂ－１０の分子バリアントを特徴付けた。図２８に示すように、ｍＡｂ－９およびｍＡｂ－１０のＨＩＣ－ＴＩＣプロファイルは、分子バリアントの分離プロファイルを示した。質量スペクトルは、分子バリアントの分離プロファイルを示し、分子バリアントにおける特異的な質量変化を明らかにした。

[本発明1001]
以下を含む、試料中の少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法：
疎水性基を含む固体表面に前記試料を接触させること、
少なくとも1つの溶出液を生成するために移動相を使用して前記固体表面を洗浄することであって、前記溶出液が前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質を含む、こと、および、
ネイティブ条件下で質量分析計を使用して、前記少なくとも1つの溶出液中の前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質を特徴付けること。
[本発明1002]
少なくとも1つの分離プロファイルを生成することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記少なくとも1つの分離プロファイルに基づいて、前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質を同定または定量化すること
をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記少なくとも1つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾または翻訳後修飾バリエーションのレベルを同定または定量化すること
をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1005]
前記少なくとも1つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質のグリコシル化またはグリコシル化バリエーションのレベルを同定または定量化すること
をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1006]
前記少なくとも1つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の質量または相対的疎水性の変化を同定または定量化すること
をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1007]
前記少なくとも1つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記試料中の不純物を分離または同定すること
をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1008]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質が、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片、またはタンパク質医薬品である、本発明1002の方法。
[本発明1009]
前記少なくとも1つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記抗体－薬物コンジュゲートの薬物対抗体比を定量化すること
をさらに含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記少なくとも1つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記抗体－薬物コンジュゲートの薬物位置、位置異性体、または分解したペイロードを同定または定量化すること
をさらに含む、本発明1008の方法。
[本発明1011]
前記少なくとも1つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記抗体、前記二重特異性抗体、前記モノクローナル抗体、前記抗体－薬物コンジュゲート、または前記抗体断片の相補性決定領域の改変を同定または定量化すること
をさらに含む、本発明1008の方法。
[本発明1012]
前記疎水性基を含む前記固体表面が、クロマトグラフィーカラムに含まれる、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記質量分析計が、前記クロマトグラフィーカラムにオンラインで結合される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記疎水性基が、フェニル、オクチル、ブチル、ヘキシルまたはプロピルである、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記質量分析計および前記クロマトグラフィーカラムを接続するためにスプリッターが使用される、本発明1013の方法。
[本発明1016]
メイクアップフローが、前記質量分析計と前記クロマトグラフィーカラムとの間の前記移動相に導入される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記スプリッターが、低流速を前記質量分析計に、高流速を検出器に分流するために使用される、本発明1015の方法。
[本発明1018]
前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、三連四重極質量分析計、四重極質量分析計、または超高質量範囲ハイブリッド四重極質量分析計である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記質量分析計が、オービトラップ質量分析器を含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
以下を含む、少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステム：
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質を含む試料、
移動相によって洗浄されて溶出液を生成することが可能である、疎水性基を含むクロマトグラフィーカラム、ならびに
ネイティブ条件下で実行されること、および、前記クロマトグラフィーカラムにオンラインで結合されることが可能である、前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質を特徴付けるかまたは定量化することが可能である質量分析計。
[本発明1021]
前記質量分析計および前記クロマトグラフィーカラムを接続するためにスプリッターが使用される、本発明1020のシステム。
[本発明1022]
前記スプリッターが、低流速を前記質量分析計に、高流速を検出器に分流するために使用される、本発明1021のシステム。
[本発明1023]
前記溶出液が、ネイティブ条件下で前記質量分析計を使用して特徴付けられる、本発明1020のシステム。
[本発明1024]
メイクアップフローが、前記質量分析計と前記クロマトグラフィーカラムとの間の前記移動相に導入される、本発明1020のシステム。
[本発明1025]
ダイオードアレイ検出器またはフォトダイオードアレイ検出器を含む、本発明1020のシステム。
[本発明1026]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質が、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片、またはタンパク質医薬品である、本発明1020のシステム。
[本発明1027]
前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、三連四重極質量分析計、または超高質量範囲ハイブリッド四重極質量分析計である、本発明1020のシステム。
[本発明1028]
前記質量分析計が、オービトラップ質量分析器を含む、本発明1020のシステム。
[本発明1029]
前記疎水性基が、フェニル、オクチル、ブチル、ヘキシルまたはプロピルである、本発明1020のシステム。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考慮されると、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態および多数の具体的な詳細を示すが、例証としてであって、限定としてではない。多くの置換、修飾、追加、または再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。

抗体の分子構造の表面電荷プロットおよび表面疎水性プロットを示す。 ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるＳｉｇｍａＭＡｂ（ＭＳＱＣ４）をＬＣ－ＳＭＣＣ架橋剤を介してダンシルフルオロフォアにコンジュゲートすることによるコンジュゲートを含む、ＳｉｇｍａＭＡｂ抗体薬物コンジュゲート模倣体、例えば、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体を示す。 例示的な実施形態による、本出願のシステムの流路設計を示し、質量分析計は、ＨＩＣにオンラインで結合され、スプリッターは、質量分析計とＨＩＣカラムとを接続するために使用される。 例示的な実施形態による、本出願の流路設計Ｂのバリエーション、例えば、流路設計Ｂ１およびＢ２を示す。 例示的な実施形態による、ＨＩＣ－ＵＶ（紫外線）、ＨＩＣ－ＴＩＣ（全イオンクロマトグラム）、および質量スペクトル生データに関する分離プロファイルとしての本出願の流路設計Ａの試験結果を示す。 例示的な実施形態による、ＨＩＣ－ＵＶ、ＨＩＣ－ＴＩＣ、および質量スペクトル生データに関する分離プロファイルとしての本出願の流路設計Ｂ１の試験結果を示す。 例示的な実施形態による、ＨＩＣ－ＵＶ、ＨＩＣ－ＴＩＣ、および質量スペクトル生データに関する分離プロファイルとしての本出願の流路設計Ｂ２の試験結果を示す。 例示的な実施形態による、ＨＩＣ－ＵＶ、ＨＩＣ－ＴＩＣ、および質量スペクトル生データに関する分離プロファイルとしての本出願の流路設計Ｃの試験結果を示す。 例示的な実施形態による、本出願のオンラインＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、グリコフォームのベースライン分解および正確な質量測定を有するＮＩＳＴｍＡｂ基準材料の高速スクリーニングを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、６つの異なるモノクローナル抗体を含む抗体混合物中のグリコシル化バリエーションの分離および検出を示す。 Ｓｉｇｍａによって提供されるＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体のＨＩＣ分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの設計Ｂ２を使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体の分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、Ｓｉｇｍａによって提供される分離プロファイルと比較した、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの設計Ｃを使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体の分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの設計Ｃを使用する、ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）に対応するＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体の分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳの設計Ｃを使用する、分解生成物を含むＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体の分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせたインソース解離を使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体（ＤＡＲ＝２）における薬物位置を特徴付けるための分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせたインソース解離を使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体（分解生成物についてＤＡＲ＝２）における位置異性体を特徴付けるための分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせたインソース解離を使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体（ＤＡＲ＝４）における薬物位置を特徴付けるための分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせたインソース解離を使用する、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体（ＤＡＲ＝６または８）における薬物位置を特徴付けるための分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、ＴＩＣ、質量スペクトル生データ、およびデコンボリューションした質量スペクトルを含むＣＤＲにおける改変を特徴付けるための、ｍＡｂ－７のＯ－グリコシル化バリアントの分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、ＴＩＣ、質量スペクトル生データ、およびデコンボリューションした質量スペクトルを含むＣＤＲにおける改変を特徴付けるための、消化されたｍＡｂ－７のＯ－グリコシル化バリアントの分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、ネイティブＳＥＣ－ＭＳを使用する、ｍＡｂ－７におけるＣＤＲのＯ－グリコシル化バリアントの分析を示す。 例示的な実施形態による、減少したペプチドマッピングを使用する、ｍＡｂ－７におけるＣＤＲのＯ－グリコシル化バリアントの分析を示す。図２３は、それぞれ出現順に配列番号１～５を開示しており、かつ、それぞれ配列番号６～７および７として「ＧＡＳＳＲＶＴＧＩＰ」、「（Ｒ）ＶＴＧＩＰＤＲ」、「（Ｒ）ＶＴ（＋ＨｅｘＮａｃ－Ｈｅｘ－ＮｅｕＡｃ）ＧＩＰＤＲ」を開示している。 例示的な実施形態による、ｍＡｂ－８におけるＣＤＲにおける特異的酸化に対応する質量変化を明らかにするための、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、ｍＡｂ－８バリアントの分離プロファイルを示す。 例示的な実施形態による、減少したペプチドマッピングを使用する、ｍＡｂ－８におけるＣＤＲの酸化バリアントの分析を示す。図２５は、それぞれ出現順に配列番号８～９を開示している。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせて、インソース捕捉エネルギーを使用する、ＡＤＣにおける分解したペイロードの局在化を特徴付けるための質量スペクトル生データの分離プロファイルを示す。特徴付けには、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体を使用した。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳ法と組み合わせて、インソース捕捉エネルギーを使用する、ＡＤＣにおける分解したペイロードの局在化を特徴付けるためのデコンボリューションした質量スペクトルの分離プロファイルを示す。特徴付けには、ＳｉｇｍａＭＡｂ Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣体を使用した。 例示的な実施形態による、本出願のＨＩＣ－ネイティブＭＳを使用する、モノクローナル抗体、例えば、ｍＡｂ－９およびｍＡｂ－１０の分子バリアントを特徴付けるためのＨＩＣ－ＴＩＣプロファイルおよび質量スペクトルを示す。

Claims (29)

1. 以下を含む、試料中の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するための方法：
   疎水性基を含む固体表面に前記試料を接触させること、
   少なくとも１つの溶出液を生成するために移動相を使用して前記固体表面を洗浄することであって、前記溶出液が前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を含む、こと、および、
   ネイティブ条件下で質量分析計を使用して、前記少なくとも１つの溶出液中の前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を特徴付けること。
2. 少なくとも１つの分離プロファイルを生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも１つの分離プロファイルに基づいて、前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定または定量化すること
   をさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾または翻訳後修飾バリエーションのレベルを同定または定量化すること
   をさらに含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質のグリコシル化またはグリコシル化バリエーションのレベルを同定または定量化すること
   をさらに含む、請求項２に記載の方法。
6. 前記少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の質量または相対的疎水性の変化を同定または定量化すること
   をさらに含む、請求項２に記載の方法。
7. 前記少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記試料中の不純物を分離または同定すること
   をさらに含む、請求項２に記載の方法。
8. 前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質が、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片、またはタンパク質医薬品である、請求項２に記載の方法。
9. 前記少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記抗体－薬物コンジュゲートの薬物対抗体比を定量化すること
   をさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記抗体－薬物コンジュゲートの薬物位置、位置異性体、または分解したペイロードを同定または定量化すること
    をさらに含む、請求項８に記載の方法。
11. 前記少なくとも１つの分離プロファイルに基づいてまたは別の分離プロファイルとの比較に基づいて、前記抗体、前記二重特異性抗体、前記モノクローナル抗体、前記抗体－薬物コンジュゲート、または前記抗体断片の相補性決定領域の改変を同定または定量化すること
    をさらに含む、請求項８に記載の方法。
12. 前記疎水性基を含む前記固体表面が、クロマトグラフィーカラムに含まれる、請求項１に記載の方法。
13. 前記質量分析計が、前記クロマトグラフィーカラムにオンラインで結合される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記疎水性基が、フェニル、オクチル、ブチル、ヘキシルまたはプロピルである、請求項１に記載の方法。
15. 前記質量分析計および前記クロマトグラフィーカラムを接続するためにスプリッターが使用される、請求項１３に記載の方法。
16. メイクアップフローが、前記質量分析計と前記クロマトグラフィーカラムとの間の前記移動相に導入される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記スプリッターが、低流速を前記質量分析計に、高流速を検出器に分流するために使用される、請求項１５に記載の方法。
18. 前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、三連四重極質量分析計、四重極質量分析計、または超高質量範囲ハイブリッド四重極質量分析計である、請求項１に記載の方法。
19. 前記質量分析計が、オービトラップ質量分析器を含む、請求項１に記載の方法。
20. 以下を含む、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定するためのシステム：
    前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を含む試料、
    移動相によって洗浄されて溶出液を生成することが可能である、疎水性基を含むクロマトグラフィーカラム、ならびに
    ネイティブ条件下で実行されること、および、前記クロマトグラフィーカラムにオンラインで結合されることが可能である、前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を特徴付けるかまたは定量化することが可能である質量分析計。
21. 前記質量分析計および前記クロマトグラフィーカラムを接続するためにスプリッターが使用される、請求項２０に記載のシステム。
22. 前記スプリッターが、低流速を前記質量分析計に、高流速を検出器に分流するために使用される、請求項２１に記載のシステム。
23. 前記溶出液が、ネイティブ条件下で前記質量分析計を使用して特徴付けられる、請求項２０に記載のシステム。
24. メイクアップフローが、前記質量分析計と前記クロマトグラフィーカラムとの間の前記移動相に導入される、請求項２０に記載のシステム。
25. ダイオードアレイ検出器またはフォトダイオードアレイ検出器を含む、請求項２０に記載のシステム。
26. 前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質が、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片、またはタンパク質医薬品である、請求項２０に記載のシステム。
27. 前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、三連四重極質量分析計、または超高質量範囲ハイブリッド四重極質量分析計である、請求項２０に記載のシステム。
28. 前記質量分析計が、オービトラップ質量分析器を含む、請求項２０に記載のシステム。
29. 前記疎水性基が、フェニル、オクチル、ブチル、ヘキシルまたはプロピルである、請求項２０に記載のシステム。

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